KR100274305B1 - 신경교의 미토겐 인자, 이들의 제조 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SDS-PAGE에 의하여 분리하였을 때, 각각 분자량 30 내지 36 킬라달톤 및 53 내지 63 킬로달톤의 새로운 시반세포 미토겐인자을 제공한다.

또, 본 발명은 새로운 인자로 구성되는 치료학적 처방 및 인자들의 용도 및 인자민감성 또는 인자응답성 세포유형을 포함하는 조건을 치료하는 처방을 제공한다.

Description

신경교의 미토겐 인자, 이들의 제조 및 용도

본 발명은, 척추동물의 종에서 발겨된 새로운 폴리펩티드에 관한 것으로, 미토겐 성장인자, 즉 배양된 시반세포(Schwann cell)에 대하여 활성을 갖는 새로운 폴리펩티드에 관한 것이다.

또한 본 발명은 특히, 상기 인자를 제조할 수 있는 새로운 분리방법 및 상기 인자의 치료적 응용에 관한 것이다.

본 발명은 상기 인자의 유용한 펩티드특성을 더욱 포함한다.

척추동물의 신경교 세포는 중추 신경계 및 말초 신경계의 특수 결합조직을 구성한다. 주요 신경교 세포는 뉴우론의 축색둘레에 미엘린초를 마련하고, 이에 의하여, 개개의 신경 섬유를 형성하는 시반 세포를 포함한다.

시반 세포는 축색 둘레에서 트위스트하게 발육하게 되지만, 인접하는 뉴우론축색 둘레에 막의 동축층을 형성함으로써 초효과(sheath effect)를 제공한다. 이들 미엘린초는 많은 신경 섬유의 느끼기 쉬운 요소이고, 시반세포에의 손상, 또는 성장 및 발육 부전증은 많은 말초 신경계 질병 및 장해의 상당한 수초탈락 또는 신경 변성에 관련이 될 수 있다.

신경계의 발육에 있어서, 세포는 이들의 분열 및 성장을 조절하도록 여러가지 인자를 필요로 하며, 최근에 상기 여러가지 인자들이 확인되었고, 일부는 시반 세포분열 또는 발육에 영향을 미친다는 것을 발견하였다.

따라서, Brockes등은 특히, J. Neuroscience, 4(1984), No 1, 75-83에서, 소위 신경교 성장인자(GGF; Glial Growth Factor)라고 부르는, 소의 뇌 및 뇌하수체 조직으로부터 나온 추출물내에 존재하는 단배질 성장인자를 개시하고 있다. 이러한 인자는 10% 송아지 태아혈청을 함유하는 백그라운드(BG; background)배지에 대하여 분열되도록 배양된 쥐의 시반세포를 자극시켰다.

인자는 도한 31,000의 분자량을 가지며 용이하게 이량화되는 것으로 기재되어 있다. Brockes는 Meth. Enz., 147 (1987), 217-25에서, 인자에 대해 시반 세포를 기초로 한 분석을 개시하고 있으며, 생물학적 활성을 유지하려고 하면, 인자의 정제시 이온 쌍화제(ion pairing agent)로서 트리플루오로아세트산을 이용하여 역상(逆相) HPLC의 사용은 피해야 한다는 것을 강조하고 있다.

Brockes등의 J. Neuroscience 내용은 외관상의 균질성에 대한 GGF의 정제 방법을 개시하고 있다. 요컨대, 개시된 대규모적인 정제방법은 CM-셀룰로오스로부터의 NaCl 경사 용출을 이용하여 얻은 물질의 크로마토그래피 및 동결 건조된 소전엽의 추출을 포함한다.

울트로겔 컬럼(Uitrogel column)으로 겔여과를 행한 다음, 포스포셀룰로오스 컬럼으로부터 용출하고, 마지막으로 소규모의 SDS 겔 전기영동을 행하였다.

또한, CM-셀룰로오스 물질을 포스포셀룰로오스 컬럼에 직접 가하여, 컬럼으로부터의 분획을 준비된 천연겔 전기영동으로 푸울(pool) 및 정제하고, 계속해서, 최종 겔 전기영동으로 하였다.

Brockes등은, 이전에 보고된 겔여과실험에 있어서 (Brockes 등, J. Biol. Chem. 255(1980), 8374-8377), 성장인자활성의 최대 피이크가 56,000의 분자량으로 이동하는데 관찰되는 반면, 상기 개시된 과정중 첫번째에서는 분자량 31,000에서 활성이 탁월하게 관찰되었다는 것을 말하고 있다.

이 과정중에서 CM- 셀룰로오스로부터의 경사 용출의 결과로 GGF이량체 대부분 제거되는 것으로 보고되어 있다.

Benveniste등은 PNAS, 82 (1985), 3930-3934에서, T 임파구가 유도된 신경교 성장촉진인자를 개시하고 있다.

이러한 인자는, 환원 조건하에서, SDS겔로 명백한 분자량의 변화를 나타낸다.

기무라등은 Nature, 348 (1990), 257-260에서, 좌골신경초 종양으로부터 얻은 시바노마 유도 성장인자(SDGF: Shcwannoma-derived growth factor)라고 부르는 인자를 개시하고 있다.

저자들은, 반대로, GGF를 함유하는 부분 정제 뇌하수체 분획이 활성인 조건하에서, 배양된 시반세포로, 삼중수소 라벨이 붙여진 TdR의 결합을 SDGF가 자극하지 않는다고 언급하고 있다.

SDGF는 외관상 31,000 내지 35,000의 분자량을 가진다.

Davis등은, J. Cell. Biol., 110(1990), 1353-1360에서, 많은 후원자 미토겐의 선별법(Screening)을 개시하고 있다.

쥐의 시반세포가 사용되며, 선택된 후원자 물질은 이들 능력에 대해 폴스콜린(forskolin)과 함께 그리고 폴스콜린 없이, 10% FCS(송아지 태아혈청)의 존재하에서 시반세포의 DNA 합성을 자극하는 것으로 조사되었다.

시험된 인자들중 하나는 폴스콜린과 함께 또는 폴스콜린 없이 FCS의 존재하에서 유사분열성이 있는 GGF-카르복시메틸 셀룰로오스 분획(Fraction)이었다.

폴스콜린의 존재하에서 특히, 혈소판 유도성장인자(PDGF : Platelet derived growth factor)는 시반세포를 위한 강한 미토겐이고, PDGF가 이전에 시반세포에 대하여 영향을 받지 않는 것으로 효과를 나타났다.

본 발명의 한 형태는 상기 내용을 포함하여 공지된 인자들으로부터 구별시키는 새로운 신경교성장인자들로서, 이 인자들은 송아지 태아 플라즈마(FCP)의 백그라운드에 대한 시반세포에 관해 분열유사성징(mitogenic)이 있다.

또한 본 발명은 이들 인자의 제조방법 및 이들 인자 및 다른 인자들의 활성을 정의하는 개량된 방법을 제공한다.

이들 인자의 치료응용은 본 발명의 또한 중요한 형태이다.

따라서, 본 발며의 중요한 형태는 :

(a) 송아지 태아 플라즈마의 존재 하에서 시반세포의 분열을 자극하는 미토겐 활성을 가지며, 약 30kD 내지 약 36kD의 분자량을 가지며, 하기의 펩티드 배열의 1종 또는 2종 이상을 그의 아미노산 배열 내에 포함하는 염기성 폴리펩티드 인자;

및

(b) 송아지 태아 플라즈마의 존재하에서 시반세포의 분열을 자극하는 미토겐 활성을 가지며, 약 55kD 내지 약 63kD의 분자량을 가지며, 하기의 펩티드 배열의 1종 또는 2종 이상을 그의 아미노산 배열 내에 포함하는 염기성 폴리펩티드 인자

이다.

새로운 펩티드 배열은, 저분자량 폴리펩티드 인자로부터 유도된 12 및 고분자량 폴리펩티드 인자로부터 유도된 9로서, 상기 언급하였으며, 또한 당연히 본 발명의 형태들이다.

이들 배열은 본 발명의 폴리펩티드 인자의 프로우브 원(原)으로서, 특히, 다른종의 범위로부터 조사, 분리 또는 제조하거나 재조합기술에 의하여 상기 인자들을 제조하는데 유용하며, 종래 기술에 의하여, 대응하는 항체들, 바람직하게는 모노클로날 항체들의 생성에 있어, 이 항체들은 본 인자들과 관련하여 이들 스스로 유용한 조사기구이며 약제로서 유요하다. 상기 항체들은 본 발명내에 포함된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 새로운 펩태드 배열을 사용함으로써 얻을 수 있는, 유전자배열을 암호화 하는 분리된 신경교 세포미토겐 활성 또는 그 절편을 포함한다.

본 발명의 고 순도 인자들로부터의 짧은 펩티드의 유효성은, 후술하는 바와같이 부가 배열을 결정하게 할 수 있다.

따라서, 본 발명은,

(a) 제 28a도, 제 28b 도 또는 제 28c 도중 어느 하나에 나타낸 DNA배열;

(b) 제 22 도에 나타낸 DNA 배열;

(c) 제 28a 도에 나타낸 배열의 뉴클레오티드 281-557에 의하여 나타내어진 DNA 배열; 또는

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)에 의한 DNA배열중 어느 하나에 혼성 가능한 (hybridizable) DNA 배열에 의하여 암호화된 아미노산 배열을 포함하고, 신경고 세포 미토겐 활성을 가지는 폴리펩티드 인자를 더욱 포함한다.

본 발명은 잡종 형성조건의 특정규정에 한정되는 것은 아니며, 다음 프로토콜은, 필요에 따라서, 수반될 수 있는 통상의 지치믈 부여한다.

따라서, DNA 프로우브는, Schowalter 및 sourer(Anal. bischen.) 177, 90-94, 1989)에 따라 PCR반응에 의하여 또는 니크 트랜스레이션(nicktranslation)에 의하여 높은 비활성(대략 10⁸내지10^{9 32}p.dmp/μg)으로 라벨링 되어 있고, g-150 세파덱스 컬럼(sephadex column)으로 탈염함으로써 정제된다.

프로우브는 변성되고(끓는물 중에서 10분 계속해서 빙수내로의 침수), 다음에 10⁶/dpm³²p/ml에서 10% 텍스트란 설페이트를 함유하는 80% 완충제 B(폴리비닐피롤리딘 2g, 피콜(Ficoll)-400 2g, 소의 혈청 알부민 2g, 1M 트리스 HCL(pH7.5) 50ml, NaCl 58g, 소디움 피로포스페이트 1g, 소디움도데실설페이트 10g, H₂O 950ml)의 교잡용액에 첨가되어, 60℃에서 하룻밤(즉, 16시간) 인큐베이트하였다.

필터를 먼저, 15분동안 완충용액 60℃에서 세척하고, 이어서 2×SSC, 0.1% SDS에서 3 시간 20분 세척한 다음, 1×SSC, 0.1% SDS에서 20분동안 세척하였다.

본 발명은, 다른 형태로서,

(a) 하기 분자량 기준:

리소자임(암탉 계란 흰자위) 14,400

콩 트립신 억제제 21,500

탄산 탈수효소(소) 31,000

오발부민(암탉 계란 흰자위) 45,000

소의 혈청 알부민 66,200

가인산 분해효소 B(토기근육) 97,400

을 이용하여 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 약 30 kD 내지 약 36 kD의 관찰된 분자량을, 환원 조건 또는 비환원 조건에서, 소의 뇌하수체 물질로부터 얻은 경우에, 가지는 폴리펩티드 인자로서, 상기 인자는 송아지 태아 플라즈마의 존재하에서 쥐 시반 세포의 분열을 자극하는 미토겐 활성을 가지며, 역상 HPLC를 이용하여 분리하였을때, 4℃의 0.1% 트리플루오로아세트산내에서 10주 인큐베이션한 후, 약 50%이상의 상기 활성을 유지하는 염기성 폴리펩티드 인자; 및

(b) 하기 분자량 기준:

리소자임(암탉 계란 흰자위) 14,400

콩 트립신 억제제 21,500

탄산 탈수효소(소) 31,000

오발부민(암탉 계란 흰자위) 45,000

소의 혈청 알부민 66,200

가인산 분해효소 B(토기근육) 97,400

을 이용하여 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 약 55 kD 내지 약 63 kD의 관찰된 분자량을, 비환원 조건에서, 소의 뇌하수체 물질로부터 얻은 경우에, 가지는 폴리펩티드 인자로서, 상기 인자는 송아지 태아 플라즈마의 존재하에서 쥐 시반 세포의 분열을 자극하는 미토겐 활성을 가지며, 역상 HPLC를 이용하여 분리하였을때, 4℃의 0.1% 트리플루오로아세트산에서 4일 인큐베이션한 후, 약 50%이상의 상기 활성을 유지하는 염기성 폴리펩티드 인자를 제공하는 것이다.

설명을 편리하게 하기 위하여, 본 발명의 저분자량 인자 및 고분자량 인자는 각각 이후 "GGF-I" 및 "GGF-II″으로 나타낸다.

인용된 분자량 범위한계는 정확하지는 않지만, 특정 폴리펩티드 인자의 소완에 좌우되는 약간의 변화를 받는것으로 이해된다.

예컨대, 즉 약 10%의 변화는 또 다른 소오스로부터 물체에 있을 수 있다.

본 발명의 또다른 중요한 형태는, 신경교세포 미토겐활성을 갖는 폴리펩테트를 암호화하는 DNA 배열이며,

(a) 제28a 도, 제 28b 도 또는 제 28c 도중 어느 하나에 나타낸 DNA배열;

(b) 제22 도에 나타낸 DNA 배열;

(c) 제 28a 도에 나타낸 비열의 뉴클레오티드 281-557호 나타내어진 DNA배열; 또는

(d) 상기 (a),(b) 또 (c)에 의한 DNA배열중 어느 하나에 교잡가능한 DNA 배열로 구성되어 있다.

본 발명은, 현저히 감소된 활성을 나타내지 않는 상기 2 폴리펩티등인자의 변형물 또는 등가물을 포함한다. 예컨대, 아미노산 함량 또는 배열이 실질적으로 악영향을 받지 않고 변경되는 변형물을 포함한다.

실례로서, EP-A-109748에서는 천연 단백질의 뮤테인이 중성아이노산과 생물학적 활성으로서 불필요한 본래의 배열로 시스테인을 바꿈으로써 원하지 않은 S-S-결합 가능성을 피할 수 있다는 것을 개시하고 있다.

본 발명의 일부인 상기 변형 인자 또는 등가인자를 이용하는 상기 용도 및 효과와 여기 포함된 용도 및 효과의 상세를 설명한다.

본 발명의 새로운 배열에 대해 재조합기술의 이점을 개시한다.

따라서, 본 발명을 다음 형태를 포함한다.

(a) DNA구조에 의하여 그 형질전환 후, 선택된 숙주세포중에서 상기 배열의 발현을 허용하도록 대조 배열의 제어하에서 백터의 조작가능한 해독프레임 위치로 사기 정의된 바와같은 DNA 배열로 구성되는 DNA 구조.

(바람직하게는 상기 대조배열은 조절가능한 프로모터 즉 Trp)를 포함한다)-조절가능한 배열 및 프로모터의 선택은 이 기술분야에서 통상의 식을 가진 자를 위한 선택사항임을 언급한다.

(b) 상기 DNA 배열이 상기 숙주세포-숙주의 선택은 한정되지 않으며-에 발현될 수 있고, 선택된 세포는 전핵이나 진핵일 수 있고, 이 기술분야에서 공지된 방법에 의하여 상기 구조를 결합화하는데 유전적으로 변경될 수 있도록 즉시 상기(a)에서 정의된 바와 같은 구조를 결합화함으로써 변형된 숙주세포; 및

(c) 상기 DNA 배열의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 변형된 숙주세포를 배양하여 되는 상기 정의된 인자의 제조방법으로서 상기 조건은 재조합 DNA 기술의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 특정의 구체예로서, 신속히 결정될 수 있다.

본 발명에서는 이 방법에 의해 제조된 신경교 세포 미토겐을 포함한다.

이 기술에서 기술된 인자들은 본 발명의 새로운 폴리펩티드 인자들에 의해 지니게 된 특징의 조합을 가지고 있지 않다.

지적한 바와같이, 본 인자들의 특징으로 기술하는데 사용되는 일부 시반세포분석은 송아지태아 플라즈마의 백그라운드를 사용한다.

다른 모든점에서 분석은 10% FEX를 FCP로 바꾼것 이외에는 Meth, Enz.에서 Brockes들에 의해 기술된 것과 동일하다.

송아지태아 플라즈마의 혈소판 유도인자의 결여로 시반세포에 대한 엄격한 한계의 활성을 다른 인자들로부터 잠재적으로 의사물건을 제거함으로써 제공할 수 있기 때문에, 분석기술의 차이점은 현저하다.

본 발명의 또다른 형태는 상기 정의한 바와같은 폴리펩티드의 제조방법으로서, 비환원조건하에서 상기 고분자량 분획의 경우 및 환원조건 또는 환원조건이 아닌 조건하에서, 상기 저 분자량 분획의 경우에 있어서, 단백질을 얻기 위하여 척추동물 뇌를 꺼내고, 히드록실애퍼타이트 HPLC로 구성되는, 이 꺼낸 것을 크로마토프래피 정제를 받고, 다음 분자량 기준을 사용하여 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 받는 경우, 약 30KD 내지 36KD의 관찰된 분자량을 가지는 그의 분획 및/또는 약 55KD 내지 63KD의 관찰된 분자량을 가지는 분획을 모아서 되는 구성이 된다.

리소자임(암탉계란 흰자위) 14,400

콩트립신 억제제 21,500

탄산 탈수효소(소) 31,000

오발부민(암탉 계란 흰자위) 45,000

소의 혈청 알부민 66,200

가인산분해효소 B(토끼근육) 97,400

바람직하게는, 상기 제조방법은, 소위 뇌하수체로부터, 카드복실메틸셀루로오스 크로마토그래피에 의해 얻어진 상기 분혹을 분리함으로써 개시된다.

또한, 리드록실애퍼타이트 HPLC후, 양이온 교환 크로마토그래피, 겔여과, 및/또는 역상 HPLC를 SDS폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동 이전에 사용하는 것이 바람직하다.

제조방법의 각 단계에서, 10% FCS 대신에 10% FCP로 바꿈으로써 변형한 것이외에는 앞서 Meth, Enz.에서 Brockes에 의하여 기술된 바와같이, 보통 분석측정으로서 방사성 이오도데옥시우리딘의 시반세포를 사용하여 활성을 결정할 수 있다.

이미 언급한 바와같이, 분석등은 당연히 CNS 나 PNS세포, 즉 시반세포로 어떤물질의 분석에 미토겐 물체를 적응하였을 때, 본 발명의 한 형태이다.

따라서, 본 발명은, 신경교세포의 DNA합성을 평가하기 위하여 분석하의 물질에 의해 자극된 것에 대하여 송아지태아 플라즈마의 백그라운드가 사용되는 신경교세포 미토겐 활성의 분석을 또한 포함한다.

본 발명의 또 다른 형태는, 각각 선택적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 함께 및/또는 단위복용량 형태로, 제약용 또는 가축병 치료용으로 처방된 상기 인자로 구성되는 제약학적 또는 가축병치료 처방이다.

본 발명의 인자를 사용함에 있어서, 적당한 처방 또는 조성물을 제공하는데, 종래 제약학적 또는 가축병 치료 실무가 응용될 수 있다.

그러므로, 본 발명의 처방은, 비경구적 투여, 예컨대, 정맥내 투여, 피하투여, 근육내투어, 안와내 투여, 눈내 투여, 뇌 또는 심장등의 실내투여, 두개내 투여, 낭내 투여, 척수내 투여, 지방 막하 조내 투여, 복강내 투여, 국소 투여, 코내 투여, 연무질 투여, 난절투여 및 경구투여, 볼 투여, 직장 투여, 질 투여에 적용할 수 있다.

처방을 위한 기술에서 주지된 방법은, 예를들면 "리밀통의 약제학"에서 찾아볼 수 있다.

비경구 투여용 처방은 예컨대, 부형제로서 살균수 또는 식염, 폴리에틸렌 글리콜등의 폴리알킬렌, 원식물유, 또는 수소화된 나프탈렌을 포함할 수 있다.

생체 적합성, 생분해성 락티드 폴리머, 락티드/글리폴리드 코폴리머는 본 발명의 인자의 해제를 제어하는데 사용될 수 있다.

인자들을 위하여 잠재적으로 유용한 다른 비경구 계통은 에틸렌 비닐아세테이트 코폴리머 물품, 삼투압 펌프, 이식조직편 주입계통 및 리포소옴을 포함한다.

흡입용 처방은, 부형제로서 예컨대 락토오스를 포함할 수 있으며, 예컨대, 폴리옥시에틸린-9-라울릴에테르, 글리코콜산염 및 데옥시콜산염을 포함하는 수용액일 수 있으며, 코점적제의 형태로 또는 코내에 사용되는 겔로서 투여용 유상용액일 수 있다.

비경구투여용 처방은 또한 볼 투여용 글리코콜산염, 직장투여용 메톡시살리신산염, 또는 질투여용 구연산을 포함할 수 있다.

본 인자들은 단독의 활성제로서 사용될 수 있거나, 다른 활성성분, 즉 신경확상의 질병의 뉴로날 생존을 촉진할 수 있는 다른 성장인자, 또는 펩티다제 또는 프로테아제 억제제와 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 처방에서 본 인자들의 농도는 투여되는 투여량을 포함하는 타농(issues)의 수, 및 투여경로에 따라서 변한다.

본 발명의 인자들은 비경구투여용 약 0.1 내지 10% W/V 화합물을 함유하는 수용성 생리학적 완충용액에 제공할 수 있다.

통상의 투여범위는 체중 약 1μg/Kg 내지 1g/Kg/일(日)이며, 바람직한 투여범위는 체중 약 0.01mg/Kg 내지 100mg/Kg/일이다. 바람직한 투여량은 어드레스되는 병리 생리학적 조건 진행의 유형 및 크기, 처방의 구성 및 투여경로에 따라서 변할 수 있다.

상기 지적한 바와같이, 시반세포(말초신경계의 신경교세포)는 본 발명인자들의 존재하에서 분열하도록 자극되었다. 감각 수용체로부터, 그리고 근육의 전기맥박의 적당한 전도로서 중요한 개개의 신경섬유둘레에 미엘린초를 만드는데 말초신경계의 시반세포가 포함된다.

1차적 또는 2차적으로 시반세포 및 신경섬유가 손상되는 여러종류의 말초신경병이 있다.

감각 및 운동섬유의 많은 신경병이 있다. (Adams 및 Victor, 신경학의 원리) 이들 신경병은, 대부분 아마 당뇨병이 결부된 신경병, 비화농성뇌염, 암에 야기되는 신경병 및 독성시약에 의해 야기되는 신경병이다.(그의 일부는 암을 치료하는데 사용됨).

그러나, 본 발명은, 신경계 손상이 염기성 원인, 즉 질병 또는 손상에 의하여 가져오는 상태의 예방 또는 치료를 언급한다. 따라서, 시반세포의 손실 또는 수초탈락이 있는 신경계의 질병 또는 장해의 치료에 있어서 본 인자들의 사용에 더하여, 신경교 성장인자는 말초신경에 손상에 의해 야기된 신경계 장해치료에 가치가 있다.

말초신경의 손상을 수반하고, 재생법은, 시반세포의 회복/또는 성장에 의하여 유도되고, 그 타게트 뒤의 신경섬유의 향상에 의하여 유도된다.

또한, 신경교 세포의 여러가지 종양이 있는데, 대부분은 아마 신경섬유종중이고, 신경교 세포의 과잉성장에 의해 만들어진 반점형소종양이다.

또한, GGF를 좋아하는 활성은 시반세포종양에서 발견할 수 있고, 따라서 이들 수용체에 대한 본 인자들의 억제제 작용이 신경교 종양치료를 제공한다는 것을 발견하였다.

본 발명은 특히 신경교 종양의 예방 또는 치료방법을 포함하는데, 이 방법은 숭요체에 상기 정의된 인자의 결합을 억제하는 물질의 유효량을 투여하는 것을 포함하여 구성된다.

일반적으로, 본 발명은, 인자 민감성 또는 인자 응답성 세포유형이 포함되는 신경계의 병리 심리학적 상태의 예방 또는 치료의 본 폴리펩티드인자의 용도를 포함한다.

본 발명의 폴피펩티드 인자들은 또한 표준기술을 수반하며, 모노클로날 항체등의 항체를 만들기 위한 모노클로날 항체들의 항체를 만들기 위한 면역원으로 사용할 수 있다.

이러한 항체들은 본 발명에 포함된다.

이들 항체는 진단목적을 위해 사용할 수 있다.

따라서, 인자의 이상 레벨이 결합된 조건들은 이러한 항체들을 사용함으로서 밝혀진다.

생체외 기술이 사용될 수 있으며, 표준방법을 이용하는 분리된 샘플에 분석을 적용한다.

항체들이 예컨대 종양 이미지의 기술에 사용되는 기술들을 이용하여 몸체 밖으로 이미지 할 수 있는 방사성 동위원소로 체포된다는 이미지 방법을 또한 이용할 수 있다.

본 발명은 또한 생체내 또는 생체외에서 신경교 세포 미토겐으로서 본 인자들의 일반적인 용도 및 이들 사용을 위한 인자들을 포함한다.

특별한 구체예는, 본 발명 인자의 유효량을 투여함으로써 척추동물에 신경교 세포미토겐 물질을 제조하는 방법이다.

바람직한 구체예는 신경계 질병 또는 장해의 예방 또는 치료방법이다.

본 발명의 다른 일반적인 형태는, 약제의 제조에 본 발명의 인자를 사용되는 것이며 바람직하게는 신경재생 또는, 회복 또는 신경질병 또는 회복 또는 신경질병 또는 장해의 치료를 위한 용도인 것이다.

상기 폴리페티드의 것들과 일치하는 특성을 결합하는 수용체를 가지는 분자를 확인하거나 양을 측정하는데 경쟁분석으로 본 발명 인자들을 사용하는 것이 본 발명에 포함된다.

폴리페티드는 선택적으로 방사선 동위원소를 라벨링될 수 있다. 경쟁 분석은 만타고니스트(antagonist) 및 관련 수용체의 어고니스트를 확인할 수 있다.

본 발명은, 또다른 형태로, 각각 일치하는 수용체의 분리를 위하여, 어피니트 분리법, 또는 어피니트 크로마토그래피로 본 발명의 인자중 각각의 용도를 제공하는 것이다.

특이 단백질에 일치하는 수용체의 분리법은 이 기술분야에서 공지되었으며, 많은 기술이 이용가능하며, 본 발명의 인자들에 이용할 수 있다.

예컨대, IL-6 및 IFN-감마와 관련하여 Novick, D등, J, Chromatogr ; 1990년 6월 27일, 510,33-7,에 언급되어 있고,; 호르몬을 이완하는 고나도트로핀(gonadotropin)과 관련하여; Hazum.E., J.Chromatogr., 1990년 6월 27일, 510,233-8이 언급되어 있고; G-CSF와 관련하여, Fukunaga, R. 등. J.Biol.Chem.; 1990년 8월 15일, 265(23), 14008-15, 에 언급되어 있고; 혈관 활성 장 펩티드가 관련하여 couvineau, A등, J.Biol.Chem.; 1990년 8월 5일. 265(22), 13386-90에 언급되어 있고; IL-2와 관련하여 Smart,J.E. 등 J.Invest. Dermatol., 1990년 6월, 94(6 suppl.), 158S-63S에 언급되어 있고; 사람 IFN-감마와 관련하여 Stefanos,S.3등, J.Interferon Res.,; 1989년 12월, 9(6), 719-30에 언급되어 있다.

다음 실시예들은 본 발명에 한정되는 것은 아니며 이들을 도시하여 유효한 제조 기술들의 특정한 안내를 제공하는 것이다.

하기 실시예 3에서 알 수 있는 바와같이, 본 인자들은 세포유형의 범위에 대한 미토겐 활성을 나타내고 있다.

섬유아세포와 관련한 활성은 상처회복능력을 가르치며, 본 발명은 이러한 용도를 포함하는 것이다.

처방 및/또는 약제 및 이들의 제조와 관련하여 상기 본 발명의 일반적인 명세가 적절한 제품 및 용도를 포함하도록 분명하게 구성한다.

이것은 특히 FGF의 유사한 활성의 기록을 가지는 본 발명에 대한 합리적인 기대값이다. 문헌, 예컨대 Sporn등, "펩티드 성장인자 및 이들의 수용체 I", 페이지 396(Baird 및 bohlen)의 "상처치유 및 조직회복의 FGF"의 언급되어 있다.

제 1 도 내지 제 8 도는 하기 실시예 1에 관한 것으로 하기 간단히 기술한다.

제 1 도는 카르복시메틸 셀룰로오스 크로마토그래피로 부터의 제품의 프로파일이며,

제 2 도는 히드록실 애퍼타이트 HPLC로 부터의 제품의 프로파일이며,

제 3 도는 모노 S FPLC로 부터의 제품의 프로파일이며,

제 4 도는 겔여과 FPLC로 부터의 제품의 프로파일이다.

제 5 도 및 제 6 도는 역상 FPLC로 부터의 2개의 부분정제 폴리펩티드제품의 프로파일이다.

제 7 도 및 제 8 도는 송아지 태아 혈청 또는 송아지 태아플라즈마 BG를 상요하는 역상 HPLC로 부터의 GGF-I 및 GGF-II 분획(fraction)에 대한 투영응답곡선이다.

제 9 도 내지 제 12 도는, GGF-I 및 GGF-II로 부터 유도된 펩티드를 나타내며 (실시예 2 참조), 제 10 도 및 제 12 도는 특히 새로운 배열을 나타낸다.

제 12 도는 특히 새로운 배열을 나타낸다.

제 10 도 패널 A에서 배열은 퇴행성 올리고 뉴클레오티드 프로우브 및 퇴행성 PCR프라이머를 설계하는데 사용된 GGF-I 펩티드를 나타내고 있다. 패널 A중에서 이들 배열의 일부는 또한 합성 펩티드를 설계하는데 사용되었다.

패널 B는 퇴행성 프로우브 또는 PCR프라이머의 설계로서 너무 짧은(6 이하의 아미노산) 새로운 펩티드를 나타낸다.

제 12 도, 패널A에서, 배열은 퇴행성 올리고뉴클레오티드 프로우브 및 퇴행성 PCR 프라이머를 설계하는데 사용된 GGF-II 펩티드를 나타내고 있다. 패널 A 중 이들 배열의 일부는 또한 합성펩티드를 설계하는데 사용되었다.

패널 13는 퇴행성 프로우브 또는 퇴행성 PCR 프라이머의 설계로서 매우 짧은 (6이하의 아미노산) 새로운 펩티드를 나타낸다.

제 13 도 내지 제 20 도는 하기 실시예 3에 관한 것으로, 본 발명 인자들의 미토겐 활성의 여러가지 형태를 나타낸다.

제 21 도 내지 제 28 도(a, b, 및 c)는 하기 실시예 4에 관한 것으로, 하기 간단히 기술한다.

제 21 도는 제 10 도 패널 a 및 제 12 도 패널 A에서 리스트된 새로운 펩티드 배열로부터 설계되는 퇴행성 올리고뉴클레오티드 프로우브를 리스트하고 있다.

제 22 도는 퇴행성 올리고뉴클레오티드 프로우브 609 및 650(제 21 도 참조)의 결합 부위(binding site)를 포함하는 재조합 소의 게노파아지 GGF2 BG으로부터 추정상의 소 GGF-II 유전자 배열의 신장을 나타낸다. 제 3 해독 프레임에서 유도된 아마노산배열 및 DNA배열의 암소스트랜드를 나타내고 있다. 인자 2로 부터 펩티드 12의 배열은 66 아미노산 해독 프레임(open reading frame)(뉴클레오티드 75-272)의 일부이다.

제 23 도 후엽 뇌하수체로 부터 RNA에 존재하는 소의 GGF-II 아호배열의 절편을 분리하는데 실험에서 사용된 퇴행성 PCR 프라이며 (패널A)및 유일 PCR프라이며(패널B)를 리스트하고 있다.

제 24 도는 후엽 뇌하수체로부터 RNA에 대하여 제 7 도 패널 A 및 B에서 프라이머의 리스트를 사용하여 PCR증폭 실험에서 얻어진 9개의 명확한 연속 소 GGF-II CDNA 구조 및 배열을 요약하고 있다. 도면의 상부라인은 특징이 있는 CDNA 구조에 기여하는 엑손배열의 도해를 나타낸다.

제 15 도는 GGF 2 BG의 소 재조합 파지의 물리적인 지도이다. 소의 절편은 소의 GGFII 운전자의 2 엑손(bold)을 포함한다. 길이가 대충 20Kb이고, 효소 Xbal, SpeI, Ndel, EcoRI, Kpnl 및 SstI의 제한 부위는 이 물리적인 지도에 배치되어 있다. 차광부는 배열을 위하여 서비클론된 절편 상응한다.

제 26 도는 추정상의 소 GGF-II 유전자의 3선택 유전자 제품의 구조를 개략적으로 나타내고 있다.

엑손은 이들 발견의 배열에서 A내지 E가 리스트되어 있다. 선택 접합패턴 1,2 및 3은 여러 도면 제 28 도에 나타난 3개의 중첩추론 단백질구조)GGF#BPP1, 2 및 3)를 생성한다.

제 27 도는 제 10 도 및 제 12 도에 리스트된 새로운 펩티드 배열과 제 28a 도, 제 28b 도 및 제 28c 도에 나타낸 유도된 단백질 배열에서 동일시된 GGF-I 및 GGF-II 배열을 비교한다.

도면은 9개의 새로운 GGF-II 펩티드 배열중 6은 이들 유도된 단백질 배열에서 계수되는 것을 타나내다. GGF-I 배열과 유사한 2개의 단백질 배열이 또한 발견되었다.

제 28a 도는 제 26 도에 나타낸 접합 패턴번호 1로 부처 얻어진 CNDA의 유도된 아미노산 배열 및 암호 스틀내드 DNA 배열을 나타낸다. 추정상의 소 GGF-II 유전자의 이 부분 CDNA는 길이 207 아미노산의 단백질을 암호화 한다.

bold에 나타낸 펩티드는 제 10 도 및 제 12 도에 있는 리스트로부터 동일시된 것들이다. 포텐션 글리콕실화 부위는(폴리아데닐화 시그날 AATAAA를 따라서) 밑줄 그어져 있다.

제 28b 도는 제 26 도에 나타낸 접합 패턴번호 2로 부터 얻은 CDNA의 추론 아미노산배열 및 암호스트랜드 DNA배열을 나타낸다.

이러한 추정상의 소 GGF-II 유전자의 일부 CDNA는 길이가 264 아미노산의 단백질을 암호화하고 있다.

bold에 나타낸 펩티드는 제 10 도 및 제 12 도에 리스트로부터 동일시된 것들이다. 포텐션 글리코실화 부위는 (폴리아데닐화 시그날 AATAAA를 따라서) 밑줄 그어져 있다.

제 28c 도는 제 26 도에 나타낸 접합 패턴번호 3로 부터 얻은 CDNA의 추론 아미노산배열 및 암호스트랜드 DNA배열을 나타낸다.

이러한 추정상의 소 GGF-II 유전자의 일부 CDNA는 길이가 258 아미노산의 단백질을 암호화하고 있다.

bold에 나타낸 펩티드는 제 10 도 및 제 12 도에 있는 리스트로 부터 동일시된 것들이다. 포텐션 글리코실화 부위는 (폴리아데닐화 시그날 AATAAA를 따라서) 밑줄 그어져 있다.

제 28a 도, 제 28b 도 및 제 28c 도에 나타낸 DNA배열은 각각 본 발명의 다른 형태이며 본 발명은 상기 배열들로 암호화된 폴리펩티드를 더욱 포함한다.

제 29 도는, 하기 실시예 6에 관한 것으로 Southern 블로트(bolt)에 대한 여러 포유동물 DNA가 추정상의 소 GGF-II 유전자 배열의 교차 잡종분석의 방사선도를 나타낸다. 필터는 도면에 리스트된 교로부터 EoRI-소화 DNA(5 마이크로그람/레인)의 레인을 포함한다.

프로우브는 제 25 도의 물리적인 지도에 의하여 기대되는 바와같이 4개의 Kb절편을 포함하는, 각 DNA 샘플의 단일 강밴드(band)를 검출한다. 비교적 작은 강도의 밴드는 관련된 DNA배열을 나타낼 수 있는 것으로 관찰되고 있다. 각각의 다른 포유동물 DNA 샘플에서의 상동물(相同物)을 나타낸다.

하기 실시예 1에서는, 달리 언급하지 않는한, 모든 조작이 4℃에서 수행되며, 제 1 도 내지 제 6 도를 참조하여 다음 변형과 Brockes(Meth.Enz.이전)기술을 이용하여 각 단계의 활성이 결정된다.

따라서, 시반세포의 제조시, DMEMC Dulbcco 변형된 Eagle의 배지), FCS 및 GGF에 추가로 5μm 폴스콜린을 가하였다. 분석에서 사용되는 세포는 10이하의 통과 번호의 섬유아세포가 없는 시반세포이며, 이들 세포는 트립신으로 플라스크로부터 제거되고 300세포/마이크로웰의 편평한 바닥 96-웰판로 판으로 만들어졌다.

[125I]IUR은 실험용액 부가후 최종 24시간동안 가하여졌다. 각각의 분석에 대한 BG(자극하지 않은)결합도는 100cpm이고, 최대 결합도는 시반세포 배치 및 통과번호에 좌우된 BG에 대하여 0내지 200배 이었다.

하기 실시예 1에서 기술하는 바와같이 역상 HPLC로 부터의 GGF-I 및 GGF-II의 경우에는, 각각의 인자에 대한 곡선중 하나에 대해 상기 방법, 및 각각의 인자에 대한 다른 곡선을 얻기 위하여 오로지 송아지태아 플라즈마를 송아지태아 혈청으로 바꿈으로써, 분석과정에서 변형된 상기 방법을 정확히 사용하여 각각의 인자에 대하여 2개의 투여 응답곡선을 또한 얻었다. 그 결과는 제 7 도 및 제 8 도에 나타낸다.

(A)인자 CM 분획의 제조.

4,000 냉도된 전체 소뇌하수체(C,A,12Kg0을 하룻밤 해빙시키고, 물로 간단히 세척한 다음, 웨어링 혼합기(Waring Blender)내에서 배치로 동일 부피의 0.15M 암모늄 설페이트로 균질화 한다.

균질물을 0.1M HCL를 이용하여 pH4.5로 조정하고, 80분동안 4,900g으로 원심분리 하였다. 상등액 지방물질을 글라스 율을 통과함으로써 제거하였다. 1.0M NaOH를 사용하여 상등액의 pH를 6.5로 조절한후, 고상 암모늄 설페이트를 가하여 36% 포화용액을 얻었다. 수시간 교반한 후, 서스펜젼을 80분 동안 4,900g으로 원심분리하여 침전물을 버렸다. 글라스울로 여과한 후, 고상 암모늄 설페이트를 상등액에 더욱 가하고 수시간 교반한 후 80분 동안 4,900g으로 다시 한번 원심 분리하여 75% 포화용액을 얻었다.

펠리트를 0.1m인산 나트륨 c.a. 2L pH6.0하에서 재현탁하고 같은 완충제 3×40L을 투석하였다.

투석물의 도전성이 20.0m siemens이하 인 것을 확인한 후, 2ml/min의 유량으로 카르복시메틸 셀룰로우스(CM-52, Pharmacia)가 채워진 Biprocess 컬럼(120×113mm, Pharmacia)상에 채워 넣었다.

0.1M 인산나트륨 pH6.0 2 부피로 컬럼을 세척하고, 이어서 50mM NaCl 2부피, 마지막에 동일한 완충제에서 0.2M NaCl 2부피로 세척하였다. 마지막 공정중에 10ml(5분)분획을 얻었다. 분획 7ㄷ 내지 118를 포함하여 푸울하였고, 10mM 인산나트륨 pH 6.0 10부피에 대하여 투석하고, 60분동안 100,000g으로 원심분리하여 정제하였다.

(B) 히드록실 애퍼타이트 HPLC

히드록실 애퍼타이트 PHLC는 신경교 성장인자를 사용하는데 사용되는 기술이 아니라, 본 발명에서 특시 효과가 있는 것으로 입증되었다.

상기 CM-셀룰로오스 크로마토그래피로부터 얻은 물질은 0.2μm필터(Nalgene0를 통하여 여과되고, 가드컬럼(15×25mm, Biorad)이 장착된 고성능 히드록실 애퍼타이트 컬럼(50×50mm, Biorad) 상에 채워 넣고서, 10mM 이산칼륨 pH6.0으로 평행 상태로 하였다.

다음 프로그램 직선 경사도를 이용하여 2ml/분의 유량으로 실온에서 용출하였다.

시간(분)

0.0 B% 용매 A : 0.1mM 인산칼륨 pH 6.0

5.0 0% 용매 B : 1.0M 인산칼륨 pH 6.0

7.0 20%

70.0 20%

150.0 100%

180.0 100%

5.0 0%

6.0mml(3분)분획을 경사·용출중에 얻었다. 분획 39∼45를 푸울하고, 50mM 인산칼륨 10부피 pH 6.0에 대하여 투석하였다.

(C) 모노 S FPLC

모노 SFPLC으로 연속 겔여과로 제조되는 더 농축된 물질이 제조될 수 있었다.

1.0mL/분의 유량으로 실온에서 50mM 인산나트륨 pH6.0으로 다시 평형상태로 제조한 HR10/10 모노 S 양이온 컬럼(100×10mm Pharmacia)상에 채우기 전에 60분동안 100,000g으로 정제스핀에 의하여, 히드록실애퍼타이트컬럼으로부터 푸울물질내의 특정물질을 제거하였다.

이들 조건하에서 다음 프로그램된 직선 경사도를 사요하여 제한 단백질을 용출하였다.

시간(분) B% 용매 A : 50mM 인산칼륨 pH6.0

0. 0 용매 B : 1.2M 염화나트륨

70. 30

240.0 100

250.0 100

260.0 0

이 경사프로그램법으로 1ml(1분)분획을 얻었다.

분획 99 내지 115는 포함하여 푸울하였다.

(D) 겔여과 FPLC

이 단계는 최종 정제하기 전에 본 발명의 2인자의 분리를 시작하고, 농축된 분획을 제조하였다.

이 단계의 목적을 위해 제조자의 지시에 따라서 제조 Superose 12 FPLC 컬럼(510×20mm, Pharmacia)를 채웠다.

이 컬럼으 표준화하기 위하여, 제조자의 지시에 따라서 이론상의 판측정을 하여, 9,700 이론 판의 값을 얻었다.

1.0ml/분의 유량으로 사전에(18역상 컬럼(Sep-pak, millipore)을 통과함)50mM 인산나트륨, 0,75 NaCl pH 6.0내에 이 컬럼에 2.5ml aliguot로실온에서 모노 S용물줄질의 푸울을 사용하였다. 각 샘플을 컬럼에 이용한 후 35분부터 1ml(0.5분)분획이 얻어졌다.

분획 27 내지 41(GGF-II) 및 42 내지 57 (GGF-I)은 각 런(run)에서 함께 포함하여 푸울하였다.

(E) 역상 HPLC

상기 superose 12런으로부터의 GGF-I 및 GGF-II 푸울을 3개의 동일 aliquot로 각각 나누었다. 각 aliquot을 가드 카트리지(RP-8, 15×3.2mm, Applied Biosystem)에 의하여 보호된 C8 역상컬럼(Aquapore BP-300, 7μ C8 ×4.6mm, Applied Biosystem)상에 채워넣었다.

이들 조건하에서 다음 프로그램 직선경사도를 사용하여 단백질를 용출하였다.

시간(분) B% 용매 A : 0.1% 트리플루오로 아세트산(TFA)

0 0 용매 B : 90% 아세토니트릴, 0.1% TFA

60 66.6

62.0 100

72.0 100

75.0 0

프로그램 경사도를 시작한 후 1.52 분부터 200μl(0.4분)분획이 실리콘류브내에 얻어졌다.

(F) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동

이 단계에서는, bio-Rad Laboratories사, Watford, 영국으로부터 단백질 분자량 기준, 낮은 범위, 카타로그 번호 161-0304을 사용하였다.

사용되는 실제 단백질 및 이들의 분자량 기준은 상기에서 리스트 하였다.

역상 런으로부터 포함하는 분획 47 내지 53 (GGF-I) 및 분획 61 내지 67(GGF-II)은 각각 푸울하였다. 0.02M 트리스-Cl, 4% SDS 20% 글리세롤 및 GGF-I에 대한 10% β-메르캅토에탄올의 동일부피내에서 7μl의 푸울물질을 5분동안 끓이고, 4%스태킹 겔(stacking gel)과 11% 폴리아크릴아미드 리믈리 겔(Leammli gel)로 채우고, 16시간 동안 50V의 일정한 전압으로 run하였다.

이겔을 고정하거 은착색통(silver Staining kit)(Amersham)을 이용하여 착색하였다.

이들 조건하에서, 분자량 기준으로 정의된 바와같이 상대 분자량 30,000 내지 36,000 달톤(GGF-I) 및 55,000 내지 63,000 달톤(GGF-II)에서 약간 확산밴드로서 각각 인자들을 볼수 있다.

겔착색으로부터, 역상런에서 푸울된 물질에 GGF-I 및 GGF-II종과 동등한 수준으로 존재하는 소량의 다른 단백질 종이 있다는 것은 명백하다.

트리플루오로 아세트산내의 안정성

안정성 데이타는 다음과 같이 트리플루오로아세트산의 존재하에서 본 인자들에 대해 얻어졌다.

GGF-I

아크릴로니트릴 및 0.1% TFA의 존재하에서, 역상 HPLC로부터의 물질을 컬럼런 완성의 12시간이내에, 그리고 그다음 4℃애서 10주 인큐베이션한 후에, 분석하였다.

인큐베이션을 하였더니, GGF-I는 컬럼에서 직접 분석된 50%이상의 물질의 활성을 가졌다.

GGF-II

0.1% TFA 및 아세토니트릴의 존재하에서, -20℃로 저장된 역상 HPLC로부터의 물질은, 해방한 후, 그리고 그다음 4℃에서 4일후에, 분석하였다.

인큐베이션을 하였더니, GGF-II는 해빙된 50%이상의 물질의 활성을 가졌다.

상기 연구에서 사용된 트리플루오로아세트산 농도는 대부분 보충역상크로마토그래피로 보통 사용된 것임을 알 수 있다.

[실시예 2]

아미노산 배열분석연구는 고순도의 소태아 GGF-I 및 GGF-II를 사용하여 행하였다.

종래의 단일 문자 암호는 배열을 기술하는데 사용되었다.

11% SDS-PAGE (상기 인용된 표기에 관련되는 MW)의 55-65KD지역으로 용출된 물질에 대하여 수행되는 GGF-Ii의 리실 엔도펩티다아제 소화물과, 환원 및 카르복시메틸화된 샘플에 대하여 수행되는, 리실 엔도펩티다아제 및 프로테아제 U8 소화물에 의하여 펩티드를 얻었다.

12 펩티드(제 10 도 참조)가 현재 단백질 데이타베이스내에 존재하지 않고 따라서 단일 배열을 나타내는, GGF-I용으로 전체 21 펩티드 배열(제 9 도 참조)을 얻었다.

10 펩티드(제 12 도 참조)가 현재 단백질 데이타 베이스에 존재하지 않고 따라서 단일배열을 나타내는, GGF-II용으로 전체 12펩티드 배열(제 11 도 참조)을 얻었다.

주어진 적은 잔여물인 많은 단백질내에서 동일배열을 나타내는 펩티드 GGF-II 06은 제외)

이들 새로운 배열은 GGF-I 및 Ii의 실제 아미노산 배열의 일부와 거의 대응한다.

매우 관계가 있는 GGF-I 07 및 GGF-II 12의 배열에 특별히 주의를 끌 수 있다.

이들 펩티드의 배열은 거의 GGF종의 것들이며 오염된 단밸질로부터 거의 유도될 가능이 없다는 것을 가르친다.

뿐만 아니라, 펩티드 GGF-II 02에 있어서, 배열 X SS는, X로 나타낸 위치에서 아스파라긴에 대한 N결합 탄수화물의 존재와 일치한다.

일반적으로, 제 9 도 및 제 11 도에서, X는, 주기에 동일한 크기의 1 이상의 시그날이거나 시그날이 없기 때문에 확실성있게 단일위치라고 부를수 없는 배열 주기를 나타내는 미지의 잔기를 나타낸다.

별표는 소위 마지막 아미노산이 그 펩티드에 존재하는 마지막 아미노산과 일치하는 이들 펩티드를 나타낸다. 남아 있는 펩티드에서, 소위 마지막 아미노산 뒤의 시그날 강도는 그 펩티드의 끝이라고 생각하는 배열을 연속하는데 불충분하였다.

오른쪽 컬럼은 NBRF 및 EMBL 배열 데이타베이스를 분석하기 위하여 GCG 패키지 FASTA 및 TFASTA를 사용하여 컴퓨터 데이타 베이스의 조사 결과를 나타낸다. 이 컬럼의 단백질 이름은 2개의 부적정쌍(mismatches)의 최대를 허용하는 소위 펩티드아미노산 배열과 함께 그 배열의 일부 동일함을 나타낸다.

물음 마커는 허용된 3개의 부적정쌍을 나타낸다.

사용되는 약어는 다음과 같다.

HMG-1 고이동도 그룹 단백질-1

HMG-2 고이동도 그룹 단백질-2

LH-알파 황체형성호르몬 알파 서브유니트

LH-베타 황체형성호르몬 베타 서브유니트

[실시예 3]

단일 미량배양물이 DNA합성, 세포형태, 세포수 및 세포항원의 발현애 대해 조사되게 하는, GGFS I 및 II를 함유하는 고순도 샘플의 미토겐 활성을 정량법을 이용하여 연구하였다.

이 방법은 "분석 생화학 185,377,382,1990", Muir D등에 의해 이전에 보고된 방법에서 변헝되었다.

주된 변형내용은 1) 비도포 마이크로타이터판, 2) 세포수 well 3) 10%송아지 태아혈청(FCS) 대신에 5% 소태아 플라즈마(FBP)의 사용 4) 배양물에 동시에 첨가되는, 브로모데옥시우리딘(Brdu) 및 미토겐의 존재하에서의 인큐베이션 시간이다.

뿐만아니라, 세포단일층은 세포의 손실을 피하기 위하여 고정화하기전에 세척하지 않고, 모노클로날 마우스 안티-Brdu 항체 미 퍼옥시다아제 공액 염소 안티-마우스 면역글로블린(Ig G)항체의 인큐베이션 시간을 두배로 하여 분석물의 감도를 증가시켰다. 쥐의 좌골신경시반세포에 최적거인, 분석물은 또한 세포 배양조건에 대해 적당한 변경을 한후, 수개의 세포라인에 사용되었다.

[방법]

1일에, 5% FBP/Dulbecco의 변경된 이이글 배지(DMEM)(5,000/세포/well)내에서 정제된 시반세포를 비도포된 96 well판에 판으로 만들었다. 2일에, 10μM의 최종농도로 Brdu 뿐 아니라, 배양물에 GGF 및 다른 시험인자를 가하였다.

48시간 후(4일) 배지를 흡인함으로써 Brdu 일체를 종결하고, 실온에서 20분동안 70% 에탄올 200μl/well로 세포를 고정한다. 다음에, 세포는 물로 세척하고, 37℃에서 10분 동안 2N HCL 100μl로 인큐베이션 함으로써 DNA를 변질하였다.

흡인하고, 0.1M 붕산염완충제로 well을 충전함으로써 나머지 산을 중성화하고, 세포를 인산염 완충염(buffered saline)(PBS)로 세척하였다. 다음에 37℃에서 15분동안 블록킹 완충제(0.1% Triton×100 및 2% 노트말 염소혈청을 함유하는 PBS) 50μl로 세포를 처리하였다.

흡인후, 모노클로날 마우스 안티 Brdu 항체(Dako 사, Santa Barbara, CA)(블록킹 완충제에 희석된 50μl/well, 1.4μg/ml)를 가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이트하였다.

0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS에서 3회 세척에 의하여 언바운드 항체를 제거하고, 퍼옥시다아제 공액 염소 안티-마우스 IgG항체(Dako사, Santa Barbara, CA)(블로킹을 완충제에 희석된 50μl/well, 2μg/ml)를 가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트하였다. PBS/Triton에서 3회 세척 및 PBS에서 최종 린스후 well은 0.05% 가용성 크로모겐 O-페닐렌디아민(OPD) 및 0.02% H₂O₂를 함유하는, 50μM 인산염/구연산 완충제 100μl/well를 받았다.

2N 황산 40μl/well을 함유하는 세정판에 각 웰로부터 80μl을 피펫으로 옮김으로써, 실온에서 5-20분에 반응을 종료하였다. 판 해독기(plate reader)(Dynatech Labs)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 기록하였다.

세포단일층을 함유하는 분석판을 PBS로 2회 세척하고, 불용성 제품을 생성시키기 위하여 0.02% H₂O₂및 기질 디아미노벤지딘(DAB) 100μl/well을 가함으로써 Brdu-DNA에 대해 면역 세포 화학적으로 착색하였다.

10-20분후, 물로 세척하여 착색반응을 중단하고, 변형된 전자현미경을 이용하여 Brdu-정핵을 관찰 및 계수하였다. 때때로, 0.001% 톨루이딘블로시약으로 부핵을 반대착색하였다.

세포라인

Swiss 3T3 섬유세포아

대기내 10% CO₂의 습한 분위기하에서 37℃에서 10% FCS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM내에 "Flow Labs사"의 세포를 유지하였다. 2일마다 세포를 공급하거나 재배양하였다.

미토겐분석을 위해서, 세포를 완전배지에서 5,000세포/well의 밀도로 판으로 만들고, 세포가 융합되어 정지되기까지 1주 동안 인큐베이트하였다. 배지를 함유하는 혈청을 제거하고, 세포 단일층을 혈청이 없는 무혈청배지에서 2회 세척하였다. 각각의 well에 50μM Brdu 및 미토겐을 함유하는 무혈청의 100μl을 가하여 48시간 동안 인큐베이트하였다. GGF 및 혈청 또는 PDGF에 대한 투여 응답 (정(正)에 제어로서)을 실행하였다.

BHK(작은 쥐의 신장)21 Cl₃섬유 아세포

동물 세포 배양의 유로피언 콜렉션(ECACC)으로부터의 세포 공기 내 5% CO₂의 습한 분위기 하에서 37℃에서 5% 트립토제 포스페이스 브로드9tryptose phosphate broth), 5% FCS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 글라스 고우 변형 이이글 배지(GMEM)에서 동물 세포 배양의 유로피언 콜렉션(ECACC)로부터의 세포를 유지하였다. 세포를 3일에 매 2회 재배양하거나 공급하였다. 미토겐 분석을 위하여 24시간 동안 완전배지에서 2,000세포/well의 밀도로 세포를 판으로 만들었다.

배지를 함유하는 혈청을 제거한 다음, 무혈청 배지를 세척한 후, GMEM 또는 GMEM 단독을 함유하는 0.1% FCS 100μm로 바꾸었다. GGFS 및 FCS 또는 bFGF를 가하여, 10μm Brdu에 부합하고, 48시간 동안 인큐베이트하였다. 시반 세포로서 기술한 바와 같은 세포 배양을 처리하였다.

C₆쥐 신경교 세포라인

통과번호 39에서 얻은 세포를 공기내 10% CO₂의 습한 분위기 하에서 37℃에서 5% FCS 5% 말의 혈청 CHsL, 페니실린 및 스틀베토마이신을 함유하는 DMEM내에서 세포를 2일 마다 재배양하거나 공급하였다. 미토겐 분석을 위하여 세포가 융합 및 정지되기 전에 완전배지내에서 5,000 세포/wll의 밀도로 세포를 판으로 만들고, 24시간 동안 인큐베이트하였다. 무혈청배지 내에서 세척한 후, 0.1% FCS를 함유하는 FL 무혈청 및 DMEM 1:1의 혼합물을 배지를 바꾸었다.

GGF, FCS 및 aFGF에 대한 투여 응답은 수행된 후, 다른 세포 유형으로 이전에 기술한 ELISA를 통하여 세포를 통과시켰다.

PC 12 (쥐 부신 호크롬성 세포종 세포)

세포를 공기내 5% CO₂의 습한 분위기 하에서 37℃에서 콜라겐 도포플라스크에 10% HS, 5% FCS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에서 ECACC로부터의 세포를 유지하였다.

세포를 배지 80%를 바꿈으로서 3일 마다 공급하였다. 미토겐 분석을 위하여 콜레간 도포판(37℃에서 30분, 1:50으로 희석된 50μm/well 콜라겐 vitrogen Collagen사)으로 완전 배지내에서 3,000 세포/well의 밀도로 세포를 판으로 만들고, 24시간 동안 인큐베이트하였다.

다음에, 1% FCS 또는 1μm인슐린을 함유하는 싱싱한 RPMI 도는 RPMI 단독으로 배지를 바꾸었다. GGF에 대한 투여응답 및 정의 제어로서 FCS/HS (1:2)에 대한 투여 응답을 앞에서와 같이 행하였다.

48시간 후 세포를 고정하고, 상술한 바와같이 ELISA를 행하였다.

결과

본 실시예에 존재하는 모든 실험은 GGF-I 및 GGF-II (GGF)의 혼합물을 함유하는 Suprose 12 크로마토그래피 정제 단계(실시예 1, 섹션 D 참조)로부터 매우 정제된 샘플을 사용하여 행하였다.

먼저 J.P.Brockes(Mothods Enzymol. 147.217, 1987)에 기술된 분열세포의 DNA로[125] I-UdR결합을 기초로 한 시반세포용 전형적인 미토겐 분석과 Brdu 결합 분석법(icorporation assay)으로 얻은 결과를 비교하였다.

제 13 도는 동일한 세포배양조건(48시간 동안 GGF의 존재하에서 인큐베이트 된 5% FBP/DMEM에서 5,000 세포/well)에서 수행된 2 분석법으로 얻은 데이타 비교를 나타낸다. 나타낸 바와같이 그 결과를 비교할 수 있는 데, Brdr 결합 분석법은, 그래프의 왼쪽 즉, 저농도의 GGF 로 곡선의 이동에 의하여 암시된 바와 같이 Brdu 결합 분석법이 약간 더 민감한 것으로 나타났다.

섹션 "방법"중에서 기술한 바와 같이 OPD 퍼옥시다아제 반응의 가용성 제품의 강도를 해독함으로써 면역 반응성 Brdu-DNA의 양을 측정한 후, 세포 단일 층으로 함유하는 원래의 분석판은 Brdu-증의 핵을 착색하는 불요성 DAB 제품을 가져오는 2차 반응을 할 수 있다.

다음에 마이크로 배양물을 변형된 전자 현미경으로 조사할 수 있고, Brdu-정핵 및 부핵의 수, 및 세포 형태를 관찰할 수 있다.

제 14a 및 제 14b 도에서 490nm에서 흡광도를 해독함으로써 평가된 Brdu-DNA 면역 반응성을 전체 세포수/well에 대한 Brdu-정핵의 백분율(%) 및 Brdu-정핵의 수와 비교하여 동일한 배양물 내에서 계수하였다. 표준편차는 10% 미만이었다. 2 평가방법은 매우 우수한 상관간계를 나타내며, GGF의 최고 투여량에서의 값사이의 불일치는 Brdu-정으로 검지된 세포내에서 DNA 합성의 다른 크기로 설명할 수 있다.

따라서, Brdu 결합 분석법은 [125] I-UdR 결합분석법과 비교하였을때, 시반세포에 대한 GGF의 생물학적 활성에 관하여 유용한 정보를 추가로 제공할 수 있다.

예컨대, 제 15 도에 기록된 데이타는 GGF가 DNA 합성을 유도하기 위하여 시반세포에 대하여 작용할 수 있으나 낮은 투여량으로 부의 세포를 증가시키기 위하여 48시간 후 마이크로 배양물 내에 존재하는 것을 나타낸다.

다른 기원의 여러 세포라인에 대하여 이 분석법을 사용하였다. 제 16 도에서는 GGF에 대한 Swiss 3T3 섬유아세포 및 시반세포의 미토겐 응답을 비교하고 있으며, 3T3 섬유아세포에서 얻은 약한 응답에도 불구하고, Brdu-양 핵이 이들 배양물내에서 검지되었다.

세포는 적당한 자극에 응답할 수 있는 것(도시하지 않음)을 나타내는 사람의 재조합 PDGF 또는 FCS의 여러 투여량의 존재하에서 평행하게 제어 배양물을 런하였다.

GGF에 응답하기 위하여 BHK 21 C13 세포라인을 이용하여 섬유아세포의 능력을 더욱 조사하였다. 신장으로부터 유도된 이들 섬유아세포는 융합정지상태에 도달하거나 접촉저지를 나타내지 않는다.

따라서 실험 조건은 세포 생존율(cell viability)로 구성하지 않고, 매우 낮은 BG 증식곡선을 가지도록 설계하였다. GGF는 제 17 도 및 제 18 도에 의하여 나타내어진 바와 같이 BHK 21 C 13 세포에 대한 미토겐 활성이 현저하다.

제 17 도는 0.1 FCS의 존재하에서 GGF에 의해 자극된 BHK21 C 13 세포에 의한 DNA 로의 Brdu 결합도를 나타낸다. FCS에 대한 우수한 미토겐 응답은 세포배양 조건이 한정되지 않음을 나타낸다. 제 18 도에서는 GGF의 미토겐의 효과를 Brdu-정세포 및 Brdu-부세포의 수로 그리고, 전체 계수된 세포수/well로 나타내고 있다.

데이타는 중복된 2 실험의 표본이며, 적어도 3필드/well가 계수되었다. 저 투여량으로 증식효과에 대한 시반 세포에 대해 관찰된 바와 같이 GGF는 무반응 세포 생존수를 증가시킨다. Brdu-정세포의 %는 배양에 가해진 GGF의 증가량과 비례한다.

GGF는 BHK 21 C 13 세포내에서 증식 및 DNA 합성을 유도하는 것을 확인하였더니 GGF의 투여량의 존재하에서 48시간 후의 전체 세포수는 2배 이상이었다.

동일 조건하에서 2% FCS의 존재하에서 48시간 동안 유지시킨 세포는 약 6배의 증가를 나타내었다.

(도시 하지 않음)

C6 신경 교종 세포는 신경교 세포특성을 연구하기 위하여 유용한 모델을 제공하였다. 발현된 표현형(phenotype)은 세포통로에 좌우되는 것으로 보이며, 세포는 초기 단계에서는 신경교성상 세포 표현형을, 최종단계에서는 핍지 신경고 세포(oligodendrocyte)표현형과 매우 유사하다. (통로 70이상). 이들 실험에 사용된 C6 세포는 통로 39에서 52까지이다.

C6세포는 고증식 집단이며, 따라서 Brdu 결합의 매우 낮은 BG를 가지도록 실험조건을 최적화하였다.

0.1% 혈청의 존재는, FCS에 대한 투여응답(제 19 도)에 의해 나타낸 바와 같이 미토겐 응답에 거의 영향을 받지 않고, 세포생존율을 유지하는 데 필요하다.

제 20 도에서 GGF 및 aFGF(섬유아세포 성장 인자)에 대한 미토겐 응답은 FCS(8%)의 존재하에서 얻어진 최대 Brdu 결합의 %로 나타낸다. 값은 중복된 2 실험의 평균 값이다. GGF의 효과는 aFGF의 정제제조의 것과 비교할 수 있다.

aFGF는 C6에 대한 특이 성장 인자로 기술되어 있으며, (Lim R. 등 cell Regulation. 1:741-746, 1990) 그 이유로는 정의 제어로 사용되었다. Brdu-정세포 및 부세포의 직접적인 계수는 마이크로 배양물내의 세포 고밀도 때문에 불가능하였다.

지금까지 기록된 세포라인과 대조적으로 PC 12 세포는 혈청(세포 유지에 사용되는 FCS 및 HS의 혼합물)에 응답할 수 있는 배양 조건하에서 처리되었을 때, GGF에 대한 명백한 반응도를 나타내지 않았다.

그럼에도 불구하고, 판으로 된 세포수/well는 PC 12 세포의 운동에 영향을 받으며, 따라서 더욱 실험을 필요로 한다. 펩티드 배열 정보법 및 라이브러리 스크리닝법 (library screening)을 이용하여 GGF-II 뉴클레오티등 배열의 분리 및 클로닝을 하기 기술하는 바와 같이 행하였다.

제 9 도 및 제 10 도의 펩티드는 설명된 기술법을 따라 GGF-배열의 클로닝 및 분리를 위한 출발점으로 사용될 수 있다.

실제로는 제 21 도는 이러한 목적을 위하여 퇴행성올리고뉴클레오티드프로우브를 나타내고 있으며, 제 23 도 PCR 프리머를 리스트 하고 있다.

DNA 배열 및 폴리펩티드 배열은, GGF를 가지고서 이러한 수단으로 얻을 수 있으며, 또한 DNA 배열을 결합하는 발현 벡터 및 DNA 구조, 상기 DNA구조/벡터를 결합함으로써 유전자 공학적으로 변질된 숙주세포 및 이 숙주세포를 배양함으로써, 얻을 수 있는 단백질을 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 주 내요을 살펴본다.

1. 올리고뉴클레오티드 프로우브 및 프리머의 설계 및 합성

퇴행성 DNA 올리고머 프로우브는 뉴클레오티드 배열로 아미노 배열(정제된 GGF 단백질로부터 생성된 펩티드로부터 유도욈을 역번역함으로써 설계된다.

올리고머는 DNA배열의 암호 스트래드 도는 비암호스트랜드를 나타내었다. 세린, 아르기닌, 또는 류신이 올리고머 설계에 포함되었을 때, 모호한 표현을 피하기 위하여 2분리 합성을 준비하였다.

예컨대, 세린은 537 및 538 또는 609 및 610 에서 처럼 TCN 또는 AGY에 의하여 암호화되어 있다.

아르기닌 또는 류신(즉 544,545)에 대해 유사한 코돈 분리를 하였다. 0.2 마이크로 몰 규모의 합성으로 조작된 β-시아노에틸 화학작용을 이용하여 Biosearch 8750 4 - 칼럼 DNA 신시사이저로 DNA 올리고모를 합성하였다.

올리고머는 컬러으로 쪼개고(500Å GPG 레진) 55∼60℃에서 6∼24시간 동안 진한 수산화암모늄내에서 방치하였다.

방치된 올리고머를 진공(speedvac)하에서 건조하고, 7M 요소를 함유하는 트리스-붕산염-EDTA 완충제 50mM, 15% 아크릴 아미드 겔(20모노 :1비스)에서 전기영동으로 정제하였다.

충분한 길이의 올리고머를 UV 차폐에 의하여 갤 내에서 검출한 다음, 밴드를 잘라내고 DNA 올리고머를 흔들면서 4∼16시간 동안 H₂O 1.5ml로 용출하였다. 용출 물을 건조하고, H₂O 0.1ml에서 다시 용해하고, 260nm에서 흡광도를 측정하였다.

하기 식에 의해 농도를 결정하였다.

(A₂₆₀×유니트/ml)(60/6/길이=×μM)

모든 올리고머를 H₂O를 가하여 농도 5μM로 조정하였다.

상기 설계된 퇴생성 프로우브는 제 21 도에 나타낸다. 하기 변경으로 프로우브에 사용되는 실질적으로 동일한 과정으로 PCR 프리머를 제조하였다. 벡터로 클로닝에서 사용하는 퇴행성 올리고머의 5말단에, 제한 부위가 함유된 30 뉴클레오티드의 링커(Linker)를 포함한다.

1,000Å GpG 수지를 사용하여 1 마이크로 몰 비율에서 DNA 합성을 행하였다. PCR 프리머의 정제는 겔전기 영동 정제를 수반하는 에탄올 침전을 포함한다.

2. 라이브러이 구조 및 스크리닝

Stratagene(카타로그 No : 95701)에서 소의 게놈 DNA 라이브러리를 구입하였다. 이 라이브러리는 벡터 람다 데쉬II로, 클로된 2×10⁶15-20Kba Sau 3AI 부분소의 DNA절편을 포함하였다. 소의 전체 뇌 cDNA 라이브러리를 Clonetech(카타로그 NO : BL 10139)에서 구입하였다.

소의 전체 뇌, 소의뇌하수체 및 소의 후엽 뇌하수체로부터 제조된 mRNA로부터 보충 DNA 라이브러리를 구성하였다. (Vitrogen:Stratagen에서)

Vitrogen에서 2 cDNA라이브러리를 제조하였으며: 한 라이브러리는 벡터 람다 gt 10 내에 있고, 다른 라이브러리는 벡터 pCDNAI(폴라스미드라이브러리)에 있었다.

Stragene 라이브러리는 벡터 lanbda unizap에서 제조되었다. 공동으로 CDNA 라이브러리는 1400만 기본 재조합 파이지를 포함하였다.

소의 게놈 라이브러리는 150,000 내지 200,000 파이지 플라크/판로 23×23cm판 CNuno)상의 E. codl K12 숙주 스트레인(host strain)에 판으로 만들었다. 각 판은 하나의 소 게놈 등가물을 대략 나타낸다. 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, 판을 냉각하고, Grustein 및 Hogness의 순서에 의해서 복제 필터를 제조하였다. [PNAS(USA(1975) 72 : 3961] 비전하된 나일론 막상의 각 판으로부터 4 플라그 리프트를 제조하였다. (Pall Bidyne A 또는 MSI Nitropure) 80℃에서 구움으로써 막에 DNA를 고정하였다.

서플라이어(supplier)의 명세서에 의하여 감마 32p ATP(뉴잉글랜드 원자핵 : 6500Ci/mmol)와 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(뉴잉글랜드 Biolabs)를 이용하여 DNA 프로우브를 라벨화하였다.

요컨대, 37℃에서 30분 동안 5 유니트 T4 폴리뉴클레이티드 키나제 및 600μCi r-32p-ATP의 존재하에서 퇴행성 DNA올리고모 50pmol을 인큐베이트하였다.

반응을 종료하고, 겔 전기영동 부하 완충제(loading buffer)를 가한 다음 전기 영동으로 식별용 방사성 동위원소 라벨링 프로우브를 정제하였다. 32p 방사성 동위원소 프로우브를, 겔 슬라이스로부터 잘라내어 물로 용출하였다. 또한 Anal. Biochem 177:90-94, (1989), Schowalter 및 sommer의 포로토콜에 따라 α-32P-dATP 도는 α 32P dCTP의 결합에 의하여 PCR 증폭을 경유하여 DNA 프로우브를 라벨화하였다.

PCR 반응에 라벨화된 프로우브는 Sehadex G-150 컬럼으로 탈염함으로써 정제되었다.

GMC 완충제(0.52M Napi, SDS 7%, 1%m BSA, 2.5mM, EDTA, 0.1M NaCl, tRNA 10mg/ml 사전 교잡(prehybridization) 및 교잡을 행하였다.

완충제 A oligowash(1M Na₂HPO₄160ml, 20% SDS 200ml, 0.5 EDTA 8.0ml, 5M NaCl 10ml, h₂O 3632ml)에서 세척을 하였다.

대표적으로 퇴행성 올리고뉴클레이티드 프로우브(128-152 fold degenerate) 100pmol과 교잡용액 200ml에서 소의 게놈등가물의 복제물을 나타내는 20 필터(각각 400m²)를 인큐베이트하였다.

교잡은 퇴행성 프로우브에 배양되는 최소 용융 온도 아래의 5℃에서 하룻밤 일으키도록 하였다. 최소 용융 온도의 계산은 AT 쌍에서 2℃, go 상에서 4℃ 취한다.

필터를 4내지 5시간 교잡온도에서 소수세척(oligowash)의 반복된 변화로 세척하고, 마지막에 3.2M 염화 테트라메틸암모늄, 1% SDS에서 DNA 프로우브길이에 좌우되는 온도에서 30분 동안 2회 세척하였다. 20mrs에 대해 최종세척온도는 60℃이었다. 필터를 준비한 다음, 증강 스크린(intensifying screen) (Dupont Crones Lightening Plus)를 이용하여 x-레이필름(koda XAR5)에 노출시였다.

통상, -80℃에서 3내지 4일 필름 노출하면, 이들 라이브러리 스크린에서 복제 시그날을 검출하는데 충분하다. 그 결과 분석을 하고, 필터를 벗겨서 재시험하였다.

10mM EDTA pH8을 함유하는 1% SDS 용액에 충분한 전력으로 마이크로파 오븐에서 15분의 2 연속주기를 통하여 인큐베이트함으로써 필터를 벗겼다. 여러 프로우브로 벗기기 및 제시험의 3 내지 4 주기 이상을 통하여 필터를 취하였다.

3. 재조합 파지 분리, 성장 DNA 제조

이들 과정은 재조합 DNA 에서 기술된 기준 프로토콜을 따랐다.(Maniatis emd 2 : 60-2:81)

4. DNA 소화 및 서던블로트를 이용한 분리클론의 분석

재조합 파지 DNA 샘플(2마이크로 그람)을 제한엔도뉴클레아제 서플라이어(뉴잉글랜드 Biolabs)에 의해 권장되는 조건에 따라서 소화를 하였다. 37℃에서 4시간 인큐베이션을 한후, 에탄올 3부피 및 0.1M 아세트산 나트륨의 존재하에서 반응물을 침전시켰다.

침전된 DNA를 원심분리로 수집하고, 75% 에탄올 내에서 헹군후, 건조시켰다. 모든 재현탁된 심플은 agarose gel에 채웠다. (대표적으로는 TAE 완충제에 1% ; 0.04M 트리스 아세테이트, 0.002M EDTA) 4 내지 20시간, 1볼트/cm 에서 겔 run을 하였다. 마커는 lanbda Hind III DNA 절편(뉴잉글랜드 Biolabs)을 포함하였다.

에티디움 브로마이드 0.5 마이크로그람/ml으로 겔을 착색하고, 촬영하였다.

서던블로트를 위하여 먼저 DNA를 0.125M HCl로 처리하여 겔에서 탈퓨린화하고, 0.5N NaOH로 변형시킨 후, 20×SSC(3M 염화나트륨, 0.03M R구연산 나트륨)내에서, 비전하는 나일론 막으로 전이하였다.

6내지 24시간 동안 블로트를 한 다음, 피터롤 트리스 NaOH pH 7.5, 0.15M 염화나트륨에 필터를 증가시키고, 계속해서 50mM 트리스-붕산염 EDTA에서 간단히 헹궜다. 가교를 위하여, 먼저 투명한 플라스틱 랩으로 필터를 싸고, 쬐었다. 라이브러리 스크리닝에 대해 기술된 바와 같이 교잡 및 세척을 행하였다. (본 실시예 섹션 2 참조)교잡분석을 위해서 유사 게놈이 다른 종에 존재하는 가를 결정하기 위하여 약간의 변형을 하였다. DNA 필터를 Clonetech(카타로그 No 7753-1)에서 구입하였는데, 이 필터는 여러 종/레인으로부터 EcoRI 소화 DNA 5 마이크로그람을 함유한다.

상기 섹선 2에서 기술된 바와같이 PCR증폭 반응에 의해 프로우브를 라벨화하고, 10% 덱스트란 설페이트를 함유하는 80% 완충제 B(폴리비닐피롤리딘2g, Ficoll-400 2g, 소혈청 알부민2g, 1M트리스-HCI(pH7.5)50ml, NaCl 58g, 소디움 피로포스페이트 1g, 소디움 피로포스페이트 1g, 소디움 도데실 설페이트 10g, H₁O 950ml)으로 교잡을 하였다. 10분동안 끓인후 빙수로 급속냉각하여 프로우브를 변성시켰다.

10⁶dpm 32P/ml의 교잡을 완충제에 프로우브를 가하고, 60℃에서 하룻밤 인큐베이트 하였다.

먼저, 필터를 완충제 B로 60℃에서 세척하고, 2×SSc, 0.1%SDS에서 이어서 1×SSc, 0.1% SDS에 이어서 1×SSC, 0.1% SDS에 세척하였다. 높은 절박성, 실험을 위하여, 0.1%×SSC, 1% SDS에 마지막 세척을 하고, 온도는 65℃올렸다.

서던블로트 데이타를 이용하여, 게놈클론의 제한 지도를 마련하고 서브절편이 GGH 프로우브(서브클로닝을 위한 후보)에 교잡되는 것을 나타내었다.

5. 교잡프로우브의 DNA상동물의 편의 서브클로닝

DNA소화제를 (죽 5마이크로그람) 1% agarose gel에 채운 다음, 착색을 수반하는 겔로부터 적절하게 절편을 잘랐다.

DNA를, 글라스 비이드(bead)에 흡수함으로써 정제하고, 서플라이어(Bio 101)에 의하여 기술된 프로토콜을 이용하여 용출하였다. 회복된 DNA절편(100-2000ng)은, T4리가제(뉴잉글랜드 Biolabs)를 이용하여, pUC18의 유도체인, 선형의 디포스포릴레이트화된 벡터(dephosphorylate vector), 즉 PT3T7(Ambion)로 결착한다.

이 벡터는 E.coli β 락타마제를 유전자를 운반하며, 따라서 암피실린(ampicillin)을 함유하는 파느로 형질전환체(transformant)를 선택할 수 있다.

벡터는 또한 숙주세포에 β 갈락토시다제 보체(補體)(complementation)를 공급하며, 따라서, 이소프로필티오 갈락토시드 및 bluogal(Bethesda Research Labs)을 이용하여 비 재조합체(blue)를 검지하였다. 리가 반응(ligation rection)의 일부를 이용하여 E.coli K12×L1블루 유능세포(competent cell)를 형질 전환한 다음, 형질전환체를 50마이크로그람/암피실린ml를 함유하는 LB판으로 선택하였다.

화이트 콜로니를 선택하고, DNA소화 및 DNA 배열분석을 위하여 플라스미드 미니프렙(mini preps)을 제조하였다.

이들 삽입체 DNA(insert DNA)가 GGF 프로우브로 교잡되었는가를 결정하기 위하여 선택된 클론을 재시험하였다.

6. DNA 배열

이중 스트랜드된 플라스미드 DNA주형은 표준 프로토콜에 따라서 배양물 5ml에서 분리된 이중스트랜드된 플라스미드로부터 제조하였다. 제조자 플로토콜에 따라서 디데옥시뉴클레오티드 배열 키드(US biochemical) 및 Seguenase 2.0을 이용하여 디데옥시사슬구획법(dideoxy chain termination method)으로 배열을 하였다.

[Sanger 등의 변형. PNAS; USA 74: 5463(1977)]

또한, 주기배열 키트를 이용하여 DNA열 사이클로(cycler)(Perkin Elmer, 모델 4800)에서 배열을 행하고, (뉴잉글랜드 biolabs; Bethesda Research Laboratories) 5'-말단 라벨링된 프리머를 잉요하여 제조자 지식에 따라 행하였다. 배열 프리머는 배열 키트로 공급된 것들로서, 클론으로부터 결정된 배열에 따라서 합성된다.

배열 반응물은 6% 폴리아실아미드 0.4mm 두께의 배열겔에 채워져 용해되었다.

겔을 건조한 후 X-레이 필름에 쬐었다.

대표적으로 표준배열 키트가 사용되었을 때 35S가 결합되었고, 주기배열반응을 위하여 32P말단 라벨링된 프리머를 사용하였다.

겔의 저부에서 상부까지(5' 방향에서 3'방향까지) DNA배열 에티터(editor)로 배열을 해독하고 Genetics Computer Group(GGF, 위스콘신대학교)에 의하여 제공된 프로그램을 이용하여 데이타를 분석하였다.

7. RNA 제조 및 PCR 증폭

게놈 DNA에서 검지된 해독프레임 및 GGF펩티드를 암모화하는 배열을 포함한 것은, 뇌하수체 RNA의 PCR증폭을 거쳐 확대되었다.

구아니딘 중성-CsCl 클로라이드 과정에 의하여 동결된 소의 조직(Pelfreeze)으로 부터 RNA를 제조하였다[Chirgwin 등, Biochemistry 18 : 5294(1979).]. 올리고-dT 셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피에 의하여 폴리아데릴화된 RNA를 선택하였다.

[Aviv and PNAS(USA) 69; 1408(1972)]. Perkin Ekmer PCR/RNA 키트 No.: N808-0017을 이용하여 cDNA로 전환된 폴리아데닐화된 RNA 또는 전체 RNA로 시작하여, 특이성 DNA 타게트 배열을 증폭하였다.

첫번째 스트랜드 역전사반응은 1μg 주형 RNA 및 부착된 제한효소 식별부위 여결구를 가지는 올리고 dT의 프리머 또는 부착된 제한 부위를 가지는 클론된 배열로부터 결정되는 특이성 무감각 프리머를 사용하였다.

두번째 스트랜드를 제조하기 위하여, 프리머는, 3'RACE 반응에서 사용된 바오같이 플러스스트랜드 단독배열이거나 [Frohman 등, PNAS(USA)85'8988(1988)] dATP를 가진 첫번째 스트랜드 반응물을 붙이는 종지전이 효소에 의하여 두번째 타게트 부위를 가하였을 경우 부착된 제한부위를 가지는 올리고 dT프리머였다. (즉 5'race 반응,d frohman 등, ibid).

또한, 앵커 PCR 반응에서와 같이, 두번째 스트랜즈 프리커가 퇴화되며, 따라서 특이한 펩티드 배열을 나타낸다.

증폭 프로파일은 하기 일반적인 개요 : 1) 95℃에서 5분 침지파일(file); 2) 95℃에서 1분 열주기 파일; 45℃, 50℃ 또는 55℃의 어니일링 온도까지 아래로 경사, 1분; 1분동안 어니일링온도유지; 1분에 걸쳐 72℃까지 경사 ; 10초 자동연장 1분동안 또는 1분 이상동안 72℃에서 연장;

3) 4분, 72℃에서 연장 주기, 및 ; 4) 무한시간 동안 침지 파일 4℃.

보통 열적주기 파일(#2)를 30주기 3동안 런하였다.

3시간 동안 4볼트/Cm로 TAE환충제에서 런된 2% Nusiev 1%agarose gel의 전기영동으로 겔을 착색한다음, 프리머의 내부에 있던 라벨링된 DNA프로우브로 조사되는 비전하 나일론막에 블로트하였다.

DNA증폭 제품의 특히 세트를 블로드 실험으로 확인 할 수 있고 이들 위치를 정제 및 재증폭의 가이드로서 사용할 수 있다. 적절할 때, 선택된 샘플이 잔여부를 제조겔상에 채운다음, 전기 영동을 하고 0.5mm 두께의 4내지 5 슬라이스(특히 제품의 기대되는 위치를 괄호로 묶음)를 겔에서 취하였다.

agarose를 으깬다음, 40℃에서 2-16시간 으로부터 전기영동 완충제 0.5ml에 담그었다.

으깬 agarose를 2분 동안 원심분리한 후 수용상(相)을 새로운 튜브로 옮겼다. 최조 반응에서와 같이 반응 프로파일 및 프리머의 동일세트를 사용하여 용출된 물질 5마이크로리터(대략 제품1%)로 재증폭을 하였다.

재증폭 반응이 완성되었을 때 클로로포름으로 샘플을 추출하고 새로운 튜브에 옮겼다. 연결구에 존재하는 제한 부위에 부착하기 위하여, 농축된 제한효소 완충제 및 효소를, 반응물에 가하였다. 소화된 PCR제품을 겔 전기영동으로 정제한 다음 상기 서브클로닝에서 기술한 바와같이 벡터로 서브클론하였다. DNA배열은 상기 기술된 바와같이 하였다.

8. DNA배열분석

절편조립 프로그램을 이용하여 DNA배열을 조립하고, GCG 프로그램 겔어셈블, 지도 및 번역에 의하여 아미노산 배열을 유도하였다. 유도된 단백질 배열은 Word Search를 이용하여 조사하였다.

VMS 5.1하의 VAX스테이션 3100 워크 스테이션으로 부석을 하였다. GXG Version 7.0을 이용하여 베이스 조사를 행하였다.

9. 결과

지적한 바와같이, 소의 ggf-II를 암호화하는 DNA배열을 확인하기 위하여, GGF-II펩티드 배열로 부터 퇴행성 올리고뉴클레오티드 프로우블 설계하였다.

정제된 GGF-II제조의 리실 엔도펩티다제 소화를 경유하여 생성된 펩티드인, GGF-II12(제 11도 및 제 12 도 참조)정제된 GGF-I제조로부터 생성된 트립신페티드 인, GGF-I 07과 함께, 강한 아미노산 배열 상동을 나타내었다.

GGFII 12는 10 퇴행성 올리고뉴클레이티드 프로우브를 만드는데 사용하였다.(제 21 도 올리고 609,610; 세트 2=649-656)로 필터의 중복 세트를 조사하였다. 46교잡 시그날을 조사하였으나, 오로지 한 클론만이 프로우브 세트와 교잡하였다. 클론(GGF 2 BG1 지정)을 정3제하였다. 파지클론 GGF 2BG1 으로부터 DNA의 아랫쪽 블로트분석은, 프로우브 양세트가, 그소의 DNA 그 소의 DNA배열로 교잡하였음을 확인하였고, 클론내에 DNA 절편의 동일한 세트로 반응하였음을 더욱 나타내었다. 이들 실험을 기초로 하여 최초 클론의 4KB Eoo Ri 서브 절편을 확인하고 서브 클론하여 부분적으로 배열하였다. 제 22 도는, 프로우브 609 및 초기 DNA배열의 유도된 암노산 배열 및 뉴클레오티드 배열을 나타내며, 이 소게놈 DNA일부가 펩티드 12CKASLADSGEYM)를 암호화 하였음을 확인 하였다.

더욱이, 추정상의 소 GGFII 유전자 및 cDNA를 나타내는 오버랩배열의 분리를 위하여 초점이 되는 66 아미노산 해독프레임(하기 참조)상에 GGF-II 12가 남아 있음을 배열분석으로 증명하였다.

추정상의 소 GGF-II 유전자를 위하여, 부가적인 암호배열을 얻는데 열러 PCR과정이 사용되었다. 전체 RNA 및 올리고 DT선택(푤리 A 함유) RNA 샘플은, 소의 전체 뇌하수체, 전엽 뇌하수체, 후엽 뇌하수체 및 시상하부로 부터 제조되었다.

제 23 에서 나타낸 리스트로 부터의 프리머를 이용하여, 3' 및 5' 방향으로 cDNA말단을 증폭하는데 한측면 PCR반은(RACE)이 사용되었으며, 앵커된 PCR반응은 부가 GGF-II펩티드를 나타내는 퇴행성 올리고 뉴클레오티드 프리머와 함께 행하였다.

제 24 도는 이들 실험으로 얻은 인접한 DNA구조 및 배열을 요악하고 있다. 3' RACE반응으로 부터, 선택적으로 슬라이스된 3 cDNA배열이 제조 되었는데, 이것을 클론하여 배열 되었다. 5' RACE 반응은, 적어도 52 아미노산을 위하여 암호 배열을 포함하는 부가적인 엑손의 발견을 유도하였다.

아미노산 배열을 유도한 것이 분석은 GGF-I-18과 유사한 배열 및 펩티드 GGF-II-6를 나타내었다. 앵커된 PCR반응은 부가적인 300bp의 CDNA 절편에 포함된 펩티드-II-,1,2,3 및 10의 (CNA) 암호배려의 확인의 확인을 유도하였다.

따라서, 이러한 클론은, 존재하는 전체의 새로운 9 GGF-II 펩티드 배열 밖으로 6을 함호하는 뉴클레오티드배열을 함유한다.

암호 배열을 발견하였다 하더라도 위치에 대해 허용된 GGF 2 BG1의 물리적 지도를 구성함으로서 클론된 유전자를 특징지었다.(제 25 도 참조) 상기 함호배열로 부터 DNA 프로우브는, 이러한 파지 클론상의 엑손을 함유하는 DNA절편을 확인하고, 양방향으로 오버랩하는 클론을 확인하는데 사용되었다.

추정상의 소 GGF-II유정자는 적어도 5 엑손으로 나누어지지만, 엑소 A 및 V만이 지도로 만들어졌다.

학인된 인접 암호배열위 요약은 제 26 도에 나타내었다.

엑손들은, 이들의 발견 순서로 알파베트로 리스트되었다.

엑손 A 및 엑손 E를 결합하는 cDNA에 엑손 B가 포함될수 있다는 것은 인트론/엑손 경계로부터 분명하다.

즉, 엑손 B는 헤독프레임으로 구성하지 않고는 접합할 수 없다.

그러므로, 3 선택 접합 패턴의 추정상의 소 GGF-II cDNA 배열 1,2 및 3을 제조할수 있다는 것을 제안한다.

지적된 이들 GGF·2BPPI·CDS, FFG 2 BPP2·CDS 및 GGF2 BPP3·CPS 각각의 암호배열은 각각 제 28a 도, 제 28b 도 제 28c 도에 주어진다.

3 cDNA의 유도된 아미노산 배열은, 또한 제 28a 도, 제 28b 도 및 제 28c 도에 주어진다.

유도된 3구조는 길이 207, 258 및 264 아미노산의 단백질은 암호화 한다. 유도된 단백질 배열의 첫번째 183 잔기는 모든 3 유전자 제품에 동일하다. 위치 184에서 클론은 상당히 다르다.

또한 GGF2 BPP2에서 글리신 GGT에 대해 코돈은, 엑손 C 및 D 도는 c, C/d 및 D 각각에 선택적으로 가하는 GGF2 BPP2 및 GGF2 BPP3의 접합 공여체로서 기여한다. GGFII bPP1전사 기본 AATAAA폴리아데닐화 배열에 인접하는 말단으로서, 이 끝이 잘린 유전자 제품이 진실한 성숙 전사를 나타낸다는 것을 제시한다. 다른 긴 2 유전자 제품은 동일한 3 키전역 배열 및 폴리아데닐화 부위를 분배한다. 즉, 마지막 부분은 2 오버랩 해독 프레임에 의하여 암호화한다.

이들분자중 3개는 새로운 9 GGF-II 펩티드 배열(제 12 도 참조)의 6을 포함하며, 다른 펩티드는 GGF-I-18과 매우 상종하다. 이러한 발견은 재조합체 분작 소의 GGF-II의 적어도 일부분을 암호화 한다는 높은 개연성을 주고 있는 것이다.

더욱이, 3펩티드에 대한 계산된 동일전기점 Cisoelectric point)는, GGF-I 및 II의 물리적 성질이 일치한다.

GGf-II의 분자 크기가 대략 60kd이기 때문에, 가장 3 cDNA는 예상되는 아미노산수의 거의 1 1/2로 단백질을 암호화 한다.

상기 것들에 대한 유사한 과ㅈ어은 충분한 길이의 클론으로 나머지 배열을 얻는데 사용될 수 있다.

[실시예 5]

GGF 접합 변형

패턴 1 (제 28a 도 및 실시예 4 참조)을 접합함으로써 나타내어진 짧은 유전자 제품은 GGF수용체를 결합 할 수 있으며 시반 세포미토겐 활성이 부족할 수 있다. 따라서 이것은 GGF-I 및 GGF-II의 천연 억제제를 나타낸다.

최근, Chan 등은, Science 254:1382, (1992)에서 잘린 분자를 제조하는 선택적인 전사에 의하여 암호화된 헵파토세포 성장인자의 경쟁 반대자를 확인하였다.

그러므로, 천연 반대자로서 작용하는 잘린 성장인자에 대한 생물학적 선조가 있다.

이러한 분자는 치료학적으로 유용할 수 있다.

예컨데, 천연 억제제는 GG-I 및/또는 GG-II의 과 발현에 의해 야기되는 다른 분치병 또는 시바노마를 치료하는데 유용할수 있다.

예버 교잡 및 DNA 배열 데이타는 일부 접합 변화가 유전자내 다른 곳에 존재할수 있고, 따라서 GGF의 접합 변형이 존재하여 3이상의 전체수를 적용할수 있다는 것을 가르킨다.

[실시예 6]

여러종의 GGF 배열

데이타 조사는 공지된 단백질 배열로 상당한 유사점을 나타내지 않았다.

이것은 GGF-II가 단백질의 새로운 패밀리 또는 수퍼 패밀리의 제 1 의 일원임을 의미한다. 다른 포유 동물의 DNA로 교차 교잡연구 (DNA 블로트 실험)연구함에 있어, 이러한 소의 재조합분자로부터의 DNA 프로우브가 시험된 여러 샘플로 특히 배열을 용이하게 검출할 수 있다는 것을 분명히 나타냈다.

또한, 사람의 게놈 DNA로 상동 배열이 검출되었다. 방사성 그램은 제 29 도에 나타낸다. 더욱이 블로트 실험은 프로우브가 관련된 유전자, GGF패밀리의 다른 포테셜 일원을 나타낼 수 있는 낮은 강도의 밴드를 검출하는 것을 나타낸다.

[실시예 7]

뉴클레오티드 배열 정보를 이용하는클로닝 GGF-II

GGF-II를 암호화하는 유전자는, 여기 개시된 암호배열이 일부와 일치하는프리머 또는 단독 프로우브를 이용함으로서 소의 게놈 또는 뇌하수체 cDNA 라이브러리로부터 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의하여 용이하게 클론화 될 수 있다.

더욱이, 척추동물(사람포함)의 GGF-II는 상기 기술한 접근법(상기 소의배열을 위해)을 이용하거나 적당한 종으로부터 제조된 게놈 또는 뇌하수체 라이브러리를 이용함으로써 클론화 될 수 있다.

따라서, 후염 뇌하수체로부터 분리된 polyA DNA를 이용하여 구성된 cDNA라이브러리는 실시예 4에서 기술한 바와같이 판으로 만들고, 플라크 리프트는 GGF-II DNA의 한쪽 방사성 라벨링된 절편(즉, Eco RI로 클론된 GGF 2BG1 DNA를 소화함으로써 해제된 4K6절편)으로 조사하였다.

또한 단독합성 프로우브 프리머는, GGF 2BG1 엑손 배열로부터 제조되고,말단 라벨링된 후, 상기 실시예 4에 기술한 바와같이 라이브러리를 스트린하는데 사용될 수 있다.

여러 헥산 원(즉 polyA-RNA, 게놈 또는 cDNA 라이브러리 DNA)으로부터 특이제품을 증폭하기 위하여, 세번째 접근을 단독 PCR 프리머 세트(상기 기술된 프로우브에 유사한 형태로 제조)을 사용하는 것이다.

이들 제품은, GGF-II를 암호화하는 충분한 길이배열을 만들기 위하여 서브클론 및 어셈블리 될 수 있다.

[실시예 8]

GGF의 번역후 변형

소의 GF-II의 배열은 일치하는 전령 RNA의 번역을 수반하는 단백질에 탄수화물을 가하는데 세포에 의하여 잠재적으로 사용될 수 있는 여러 부위를 나타낸다.

아미노산 배열×(P제외) NXT/SX(P제외)은 N 결합 탄수화물 일부를 부가하기 위한 시그날이며, 세포내에서 잠재적으로 변할 수 있다.

아미노산내에서 잔기 1 내지 183(3유도 단백질 배열에 의해 분배)포텔셜 글리코실화 부위로부터의 신장이 4회, 잔기 50,123,170,176에서 발생한다.

다섯번째 부위는 GGF 2Bpp.PEP 및 GGF 2Bpp3.PEP의 잔기 183에서 존재한다.

이러한 부위는 선택접합 이벤트에 의하여 GGF 2Bpp1.PEP에서 제거된다.

잔기 50 및 123에서 포텐셜 글리코실화 부위는 아마 GGF-II 단백질에서 글리코실화된다. 이러한 결론은 펩티드 배열 데이타로부터 도출된다. 잔기 50 및 123을 에워싸는 실제 펩티드 배열(펩티드 GGF-II-2 및 GGFI-18)의 조사에서, 각 배열내 탄수화물 변형가능 잔기(N)가 확인가능한 암시가 없으며, 즉, 이들 잔기는 실제로 글리코실화되어 배열방법에서 검출되지 않는 것으로 나타났다.

[실시예 9]

GGF-II의 일부에 대해 정해지는 항혈청의 제조

단백질 수준에서 GGF-II를 특징화하는데 GGF-II에 대해 정해지는 항체가 사용될 수 있다.

이러한 목적을 위해서, 115 잔지 아미노산 배열을 암호화하는 GGF-II배열(뉴클레오티드 281 내지 653(제 28a 도))의 일부를 박테리아 융합단백질 발현계에서 발현시켰다.

이러한 펩티드를 암호화하는 DNA절편을 벡터 pMAL-C2C(뉴잉글랜드 Biolabs)에 삽입되고, 이 융합유전자가 발현되어, 단백질이 제조자의 지시에 따라서 제조되었다.

이 융합 단백질은, 정제컬럼으로부터 용출되어, 효소인자 Xa(펩티드의 GGF-II부분을 해제하는것)로 쪼개지고, 폴리아크릴아미드게겔로 전기영동하고, 겔로부터 잘라내어 토끼를 면역화하는데 사영되었다.

각 부스트(boost)를 수반하는 이들 토끼로부터 얻은 혈청은, 과잉생산 플라스미드를 숨기는 박테이아로부터 제조된 추출물의 Western blot 분석(Burnette, Anal. Biochen, 112 : 195-203, 1983)으로 시험할 수 있다.

이러한 분석은 박테리아로 제조된 면역원을 식별하는 항테가 제조된 것을 나타낼 수 있다.

결정된 바와 같이 상당한 정의 응답이 달성되기 까지 동물을 부스트할 수 있다.

[실시예 10]

재조합 세포로부터 GGF의 정제

생물학적 활성을 위한 분석에 대해 GGF의 충분한 길이 및 부분을 얻기 위하여 클론된 DNA를 이용하여 단백질을 과잉생산할 수 있다. 여러 접근법이 사용될 수 있다. 상기 실시예 4(결과)에서 기술한 배열을 포함하는 재조합 E.Coli 세포를 구성할 수 있다.

pNH 8a 또는 pHH 16a (Stratagene 사) 등의 발현제가 제조자의 과장에 따라 이러한 목적을 위하여 사용될 수 있다. 또한 이들 배열은 포유동물 발현 벡터에서 삽입될 수 있으며 과잉생산 세포라인은 구성될 수 있다. 일예로서 이러한 목적을 위하여 부착된 상동 또는 외부 비밀 시그날 배열과 함께, GGF를 암호화하는 DNA는 PMSXND 발현 넥터(Lee 및 Nathans, J. Biol. Chem. 263:3521-3527, 1981)를 이용하여 중국의 Hamster Ovary 세포에서 발현될 수 있다.

GGF DNA 배열을 포함하는 이 벡터는 설립된 과정을 이용하여 CHO세포로 형질전환(transfect)될 수 있다.

G418-내성 클론은 dhfr 유전자(PMSXND벡터에 호함)를 증폭하고, 그 제조에 있어서, 배열을 담호화하는 인접 GGF 단백질을 공동 증폭하는 세포에 대해 선택하도록, 메타트렉세이트(methotrexate)의 존재하에서 성장될 수 있다.

CHO 세포가 전체 단백질이 없는 배지(Hamilton 및 Ham. In Vitro 3:537-547, 1977)에서 유지될 수 있기 때문에, 원하는 단백질을 배지로 부터 정제할 수 있다.

실시예 8에서 제조된 항혈청을 이용하는 Western 분석이 과잉 생선세포의 조건배지에서 원하는 단백질의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다.

원하는 단백질은 실시예 1에서 기술한 과정을 이용하여 DHO 세포조건배지 또는 E. coli lysate로부터 정제 할 수 있다.

단백질은 실시예 9에 기술한 Western 블로트 분석을 이용하는 과정의 여러점으로 분석하였다.

또한, 시반 세포 마도겐 분석은 그 생물학적 활성 부분 또는 충분한 길이의 클론의 발현 제품을 분석하는데 사용될 수 있다.

Claims (25)

1. (a) 제 28a 도, 제 28b 도 또는 제 2c 도중 어느 하나에서 나타낸 DNA배열 ;

   (b) 제 22 도에 나타낸 DNA 배열;

   (c) 제 28a 도에 나타낸 배열의 뉴클레오티드 281-557에 의하여 나타내어진 DNA 배열에 의하여 암호화된 아미노산 배열을 포함하고, 신경교 세포 미토겐 활성을 가지는 폴리펩티드 인자
2. 하기 분자량 기준:

   리소자임(암탉 계란 흰자위) 14,400

   콩 트립신 억제제 21,500

   탄산 탈수효소(소) 31,000

   오발부민(암탉 계란 흰자위) 45,000

   소의 혈청 알부민 66,200

   가인산 분해효소 B (토끼근육) 97,400

   을 이용하여 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 약 30kD 내지 약 36kD의 분자량을, 환원 조건 또는 비환원 조건에서, 가지는 폴리펩티드 인자로서, 상기 인자는 송아지 태아 플라즈마의 존재하에서 쥐 시반 세포의 분열을 자극하는 미토겐 활성을 가지며, 역상 HPLC를 이용하여 분리하였을때, 4℃에서 0.1% 트리플루오로아세트산에서 10주 인큐베이션한 후, 약 50% 이상의 상기 활성을 유지하며, 상기 인자의 아미노산 배열이 도 9, 10, 11, 12 또는 27에 나타낸 배열의 하나 이상의 아미노산 배열을 포함하여 구성하는 것을 특징으로 하는 염기성 폴리펩티드 인자.
3. 하기 분자량 기준:

   리소자임(암탉 계란 흰자위) 14,400

   콩 트립신 억제제 21,500

   탄산 탈수효소(소) 31,000

   오발부민(암탉 계란 흰자위) 45,000

   소의 혈청 알부민 66,200

   가인산 분해효소 B (토끼근육) 97,400

   을 이용하여 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 약 55kD 내지 약 63kD의 분자량을, 비환원 조건에서, 가지는 폴리펩티드 인자로서, 상기 인자는 송아지 태아 플라즈마의 존재하에서 쥐 시반 세포의 분열을 자극하는 미토겐 활성을 가지며, 역상 HPLC를 이용하여 분리하였을때, 4℃에서 0.1% 트리플루오로아세트산에서 4일 인큐베이션한 후, 약 50% 이상의 상기 활성을 유지하며, 상기 인자의 아미노산 배열이 도 9, 10, 11, 12 또는 27에 나타낸 배열의 하나 이상의 아미노산 배열을 포함하여 구성하는 것을 특징으로 하는 염기성 폴리펩티드 인자.
4. 비환원 조건하에서 고분자량 분획의 경우 및 환원 조건인지 아닌지 모르는 조건하에서의 저분자량 분획의 경우에 있어서, 단백질을 얻기 위하여 척추동물의 뇌물질을 추출하고, 이 추출물을 히드록실 애퍼타이트 HPLC로 구성되는 크로마토그래피의 정제후, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 하고, 하기 분자량 기준 :

   리소자임(암탉 계란 흰자위) 14,400

   콩 트립신 억제제 21,500

   탄산 탈수효소(소) 31,000

   오발부민(암탉 계란 흰자위) 45,000

   소의 혈청 알부민 66,200

   가인산 분해효소 B (토끼근육) 97,400

   을 이용하여 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동을 하면, 어느 한쪽의 경우에, 약 30kD 내지 약 36kD의 관찰된 분자량을 가지는 그 분획 또는 약 55kD 내지 약 63kD의 관찰된 분자량을 가지는 그 분획을 얻도록 구성되는, 제 2 항 또는 제 3 항에 정의된 폴리펩티드의 제조방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 뇌 물질은 뇌하수체 물질인 폴리펩티드의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 뇌하수체 물질의 소오스는 소인 폴리펩티드의 제조방법.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 뇌 물질로부터 최초로 추출된 단백질은 카르복시메틸 셀룰로오스 크로마토그래피를 최초로 행하는 폴리펩티드의 제조방법.
8. 제4항에 있어서, 히드록실 애퍼타이트 HPLC후, 양이온 교환 크로마토그래피, 겔여과, 또는 역상 HPLC 더욱 포함하는 폴리펩티드의 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 역상 HPLC는 이온 쌍화제로서 트리플루오로 아세트산을 사용하여 적용되는 폴리펩티드의 제조방법.
10. 제4항에 있어서, 각 단계에서 얻어진 물질의 생물학적 활성은 송아지 태아 플라즈마의 백그라운드에 대하여 쥐시반세포의 분열을 자극하는 미토겐 활성의 수준으로서 평가되는 폴리펩티드의 제조방법.
11. 송아지 태아 플라즈마의 존재 하에서 시반세포의 분열을 자극하는 미토겐 활성을 가지며, 약 30kD 내지 약 36kD의 분자량을 가지며, 하기의 펩티드 배열의 1종 또는 2종 이상을 그의 아미노산 배열 내에 포함하는 염기성 폴리펩티드의 인자.
12. 송아지 태아 플라즈마의 존재하에서 시반세포의 분열을 자극하는 미토겐 활성을 가지며, 약 55kD 내지 약 63kD의 분자량을 가지며, 하기의 펩티드 배열의 1종 또는 2종 이상을 그의 아미노산 배열 내에 포함하는 염기성 폴리펩티드 인자.
13. 송아지 태아 플라즈마의 백그라운드가 신경교세포 내에서 DNA합성을 분석하기 위하여 제1항, 제2항, 제3항, 제11항, 제12항 또는 제19항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드 인자에 의하여 자극되는 것에 대해 사용되는 신경교세포 미토겐활성의 에세이(assay).
14. 제13항에 있어서, 신경교 세포는 시반세포인 신경교세포 미토겐활성의 에세이.
15. (a) 제 28a 도, 제 28b 도 또는 제 28c 도 중 어느 하나에 나타낸 DNA 배열;

    (b) 제 22 도에 나타낸 DNA배열;

    (c) 제 28a 도에 나타낸 배열의 뉴클레오티드 281-557로 나타내어지는 DNA배열로 구성되며, 신경교세포 미토겐활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA배열.
16. 제15항에 정의된 바와 같은 DNA배열로 구성되는 DNA 구조로서, 상기 구조에 의하여 상기 세포의 형질전환 후, 선택된 숙주세포 내에서 상기 배열의 발현을 허용하는 대조배열의 제어하에서 벡터의 조작가능한 헤독프레임 위치에서 구성되는 DNA구조.
17. 신경교 세포 미토겐이고, 제15항에 정의된 바와 같은 DNA배열에 의하여 암호화되는 폴리펩티드.
18. 다위 투여형태로 되는 선택적으로 각각 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 함께 제약용으로 처방된 제1항, 제2항, 제3항 제11항, 제12항 또는 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하여 구성되는 약제학적 조성물.
19. 신경교세포 미토겐으로서 사용하는 제1항, 제2항, 제3항, 제11항, 제12항 또는 제17항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드.
20. 신경교 세포 미토겐 또는 그에 대응하는 유전자 배열을 조사, 분리 또는 제조하거나 대응하는 항체를 생성시킴에 있어, 하기의 펩티드배열로부터 선택된 펩티드의 용도.
21. 제 28a 도, 제 28b 도 및 제 28c 도 중 어느 하나에 나타낸 DNA 배열.
22. 제21항에 정의된 바와 같은 DNA 배열에 의하여 암호화된 폴리펩티드.
23. 제1항 제2항, 제3항, 제11항, 제12항, 제17항 또는 제22항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩티드의 항체.
24. 하기의 펩티드배열로부터 선택된 펩티드에의 항체.
25. 신경교 세포 미토겐 또는 그에 대응하는 유전자 배열을 조사, 분리 또는 제조하거나 대응하는 항체를 생성시킴에 있어, 하기의 펩티드배열로부터 선택된 펩티드에 대응하는 핵산 배열의 용도.