KR100274185B1 - Human calcitonin fused with ubiquitin - Google Patents
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Abstract
Description
제1도는 인간 칼시토닌 유전자를 단백질 감미료 유전자뒤에 융합시킨 전체 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 합성 프라이머 위치를 나타낸 것이고,Figure 1 shows the nucleotide sequence and the synthetic primer position of the entire gene fusion of the human calcitonin gene behind the protein sweetener gene,
제2도는 유비퀴틴 유전자에 융합된 부분 단백질 감미료 유전자와 인간 칼시토닌 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이고,2 shows the nucleotide sequences of the partial protein sweetener gene and the human calcitonin gene fused to the ubiquitin gene,
제3도는 유비퀴틴 유전자에 융합된 인간 칼시토닌 유전자의 효모 발현 벡터로의 클로닝 과정을 도시한 것이고,3 shows the cloning process of the human calcitonin gene fused to the ubiquitin gene into the yeast expression vector,
제4도는 효모에서 발현된 유비귀틴에 융합된 인간 칼시토닌을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이고,4 shows the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of human calcitonin fused to ubiquitin expressed in yeast,
제5도는 유비퀴틴 유전자에 융합된 인간 칼시토닌 유전자의 대장균 발현 벡터로의 클로닝 과정을 나타낸 것이고,5 shows the cloning of the human calcitonin gene fused to the ubiquitin gene into an E. coli expression vector,
제6도는 대장균에서 발현된 SDS-폴리 아크릴 아미드 젤 전기영동에 의한 융합 인간 칼시토닌의 발현 결과를 나타낸 것이다.Figure 6 shows the results of expression of fused human calcitonin by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis expressed in E. coli.
본 발명은 화학합성한 인간 칼시토닌(human calcitonin, HCT) 유전자를 유비퀴틴 유전자에 융합시킨 융합 인간 칼시토닌 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 벡터로 형질 전환된 미생물, 및 인간 칼시토닌이 유비퀴틴에 융합된 형태인 인간 칼시토닌의 융합 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다.The present invention is a fusion human calcitonin gene fusion of a chemically synthesized human calcitonin (HCT) gene to the ubiquitin gene, an expression vector comprising the gene, a microorganism transformed with the vector, and human calcitonin fused to ubiquitin Fusion protein of human calcitonin in its form and a method for preparing the same.
칼시토닌은 32 개의 아미노산을 함유하는 펩타이드 호르몬으로(Roger K. Craig et at., Nature 295, 345(1982)), 포유류에서는 갑상선(thyroid glands)의 씨-파라폴리큘 세포(C-parafollicular cells)에 의해, 파충류나 조류에서는 얼티보브란 키얼선(Ultimobranchial glands)에 의해서 생산된다. 칼시토닌은 부갑상선 호르몬 및 1,25-디하이드록시콜레칼시페롤 (1,25-dihyroxy cholecalciferol)과 함께 칼슘과 인의 대사조절에 아주 중요한 역할을 한다. 특히 사람에게 있어서는 성장이나 임신, 수유 등의 활동으로 야기되는 칼슘스트레스 기간 동안 뼈체계에서 칼슘이 집적되도록 자극하여 뼈의 공동화 현상을 막는 역할을 한다.Calcitonin is a peptide hormone that contains 32 amino acids (Roger K. Craig et at., Nature 295, 345 (1982)), and in mammals, C-parafollicular cells in the thyroid glands. In reptiles and algae, it is produced by the Ultimobranchial glands. Calcitonin, together with parathyroid hormone and 1,25-dihydroxycholecalciferol, play an important role in regulating calcium and phosphorus metabolism. In particular, the human body stimulates the accumulation of calcium in the bone system during the calcium stress caused by activities such as growth, pregnancy, lactation, and prevents bone cavitation.
칼시토닌은 과칼슘증(hypercaloemia)이나 뼈흡수증(bone resorption)등과 같은 병의 치료에 이용되어 왔다 [Avioli ＆ Gennari, First International Workshop, Floreuce, April 2-3 Elsevier, Amsterdam 1982, P49-54]. 인간의 치료에 최근까지 주로 이용된 것은 연어와 돼지의 칼시토닌이었으나 이들을 6 개월 이상 주입하면 환자에게 거부반응을 일으키며 특히 칼시토닌에 의한 항체 형성과 축적으로 인해 그 후에 계속적으로 주입되는 칼시토닌이 약으로서의 효과를 발휘하지 못하게 된다는 등의 문제점이 있었다[Gennari, First International Workshop, Florence, April 2-3 Elsevier, Amsterdam 1982, P44-48; Hosking, 1982, Ibid. P33-38].Calcitonin has been used to treat diseases such as hypercaloemia and bone resorption [Avioli & Gennari, First International Workshop, Floreuce, April 2-3 Elsevier, Amsterdam 1982, P49-54]. Until recently, the most commonly used human treatment was calcitonin from salmon and swine, but injecting them for more than 6 months caused rejection in patients, especially calcitonin, which is subsequently injected due to the formation and accumulation of antibodies by calcitonin, has the effect as a drug. Problems such as failure to perform [Gennari, First International Workshop, Florence, April 2-3 Elsevier, Amsterdam 1982, P44-48; Hosking, 1982, Ibid. P33-38].
따라서, 칼시토닌을 미생물에서 대량발현시키고, 구조-기능의 관계에 의한 구조적 변경 등을 통하여 인간 치료에 적합한 칼시토닌을 만들기 위한 노력이 있었다[Ivan Ivanov et at., Gene 59, 223-230(1987); Kazuhiro Morimoto, J. Pharmaceutical Sciences 73, 1366-1368(1984); Richard M. Epand et al,, J. Medicinal chemistry 31, 1595-1598(1988)]. 그러나 인간 칼시토닌 자체가 작은 크기의 단백질이므로 세포내에서 분해되는 속도가 너무 빨라 미생물에서의 발현에 의해 단량체의 칼시토닌을 얻기가 쉽지 않았다[Ivan Ivanov et al., Gene 59, 223-230(1987)].Therefore, there has been an effort to mass-calculate calcitonin in microorganisms and to make calcitonin suitable for human treatment through structural alteration by a structure-function relationship [Ivan Ivanov et at., Gene 59, 223-230 (1987); Kazuhiro Morimoto, J. Pharmaceutical Sciences 73, 1366-1368 (1984); Richard M. Epand et al, J. Medicinal chemistry 31, 1595-1598 (1988). However, since human calcitonin itself is a small-sized protein, the rate of degradation in cells is so high that it is difficult to obtain calcitonin of monomer by expression in microorganisms (Ivan Ivanov et al., Gene 59, 223-230 (1987)). .
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 노력하던 중 유비퀴틴이 단백질 분해 효소의 공격에 강하다는 성질을 이용하여 인간 칼시토닌을 유비퀴틴에 융합시킬 경우 단백질 분해 효소로 부터 강한 보호작용을 받을 수 있다는 사실에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors focused on the fact that, while trying to solve the above problems, ubiquitin is resistant to proteolytic enzymes, and when human calcitonin is fused to ubiquitin, it can receive strong protection from proteolytic enzymes. The present invention was completed.
유비퀴틴은 1975년 발견된 분자량 5600 달톤의 단백질로서 전반적으로 진핵세포에서 발견되며 원핵세포에서는 그 유전자가 없는 것으로 보고되고 있다(Goldstein et al., PNAS 72, 11(1975)). 지금까지 동물세포로부터 유래된 유비퀴틴은 동일한 것으로 밝혀졌으며, 유비퀴틴의 역할은 여러가지가 있으나 그 중에서도 단백질 분해공정이 중요한 것으로 알려져 있다(Finley et at., Trends. Biochem. Sci 16, 343(1985)).Ubiquitin is a protein of molecular weight 5600 Daltons discovered in 1975 and is found in eukaryotic cells as a whole. So far, ubiquitin derived from animal cells has been found to be the same, and the role of ubiquitin is known to be various, but among these, proteolysis is known to be important (Finley et at., Trends. Biochem. Sci 16, 343 (1985)).
효모의 유비퀴틴 시스템에서는 76 개의 아미노산으로 구성된 유비퀴틴이 다른 형태의 유비퀴틴보다 세포내에서 절단 공정이 매우 빠르며 아르지닌-글리신-글리신 (Arg-Gly-Gly) 다음에 아주 효율적으로 절단되는 것으로 되어있다(Oxkaynak et al., Nature 312, 603-666(1987)). 또한 세포내에 존재하는 효소가 유비퀴틴에 결합된 외래유전자를 Arg-Gly-Gly 다음에 아주 정확하게 절단하나(Bachmair et at., Science 234, 178-186(1986)), Arg-Gly 뒤에 Gly 이 아닌 다른 아미노산이 올 경우 뒤의 단백질을 절단하지 못하고 비가역적으로 융합된 형태로 세포내에 축적된다고 보고된 바 있다(Robert R.W. Hodgins et al., J.B.C. 267, 8807-8812).In the yeast ubiquitin system, ubiquitin, consisting of 76 amino acids, is much faster in the intracellular cleavage process than other forms of ubiquitin and is very efficiently cleaved after arginine-gly-gly (Oxkaynak). et al., Nature 312, 603-666 (1987)). In addition, the enzyme present in the cell cleaves the foreign gene bound to ubiquitin very precisely after Arg-Gly-Gly (Bachmair et at., Science 234, 178-186 (1986)), but other than Arg-Gly after Gly. It has been reported that amino acids do not cleave the latter proteins but accumulate in cells in irreversibly fused form (Robert RW Hodgins et al., JBC 267, 8807-8812).
그러나 대장균내에는 유비퀴틴 시스템의 결여로 세포내에서는 유비퀴틴 융합 단백질로 발현된 유전자 산물이 분해됨 많이 비가역적 융합단백질 그대로 세포내에 축적된다.However, due to the lack of the ubiquitin system in Escherichia coli, gene products expressed as ubiquitin fusion proteins in cells are degraded.
이러한 비가역적 융합 단백질 시스템은 특히 발현 시키고자 하는 단백질이 세포내에서 불안정할 때, 예를들면 각 세포내의 단백질 분해효소에 의해 분해가 용이하게 되는 경우에 비가역적으로 융합된 유비퀴틴이 단백질의 분해를 억제하므로 매우 유용하다.This irreversible fusion protein system is characterized by the irreversible fusion of ubiquitin, particularly when the protein to be expressed is unstable in cells, for example, when the protein is easily degraded by proteolytic enzymes in each cell. It is very useful because it is suppressed.
따라서 본 발명자들은 C 말단 부위의 염기서열이 아르지닌-글리신(Arg-Gly)인 유비퀴틴 유전자 위에 아르지닌으로 시작하는 단백질 감미료 일부와 그에 융합된 인간 칼시토닌 유전자를 융합시킴으로써 유비퀴틴에 비가역적으로 융합된 인간 칼시토닌 유전자 및 그의 발현벡터를 제조하고, 이를 이용하여 형질 전환시킨 대장균이나 효모 세포에서 재조합 인간 칼시토닌을 생산할 수 있는 방법을 발명하게 되 었다.Therefore, the present inventors have fused irreversibly to ubiquitin by fusing a portion of a protein sweetener starting with arginine and a human calcitonin gene fused to the ubiquitin gene whose nucleotide sequence of the C-terminal region is Arginine-glycine (Arg-Gly). A calcitonin gene and its expression vector were prepared and a method for producing recombinant human calcitonin from transformed Escherichia coli or yeast cells has been invented.
즉, 본 발명의 목적은 미생물 내에서 단독으로 발현될때 분해되기 쉬운 인간 칼시토닌을 비가역적으로 유비퀴틴과 융합된 형태로 발현시킴으로서 단백질 분해효소의 공격에 강한 재조합 인간 칼시토닌을 미생물내에서 대량 발현시키는 데 있다.That is, an object of the present invention is to express a large amount of recombinant human calcitonin resistant to protease attack by expressing human calcitonin, which is easily degraded when expressed alone in a microorganism, in a form irreversibly fused with ubiquitin. .
본 발명은 유비퀴틴에 비가역적으로 융합된 인간 칼시토닌의 재조합 유전자,그의 발현벡터, 형질전환 미생물 및 비가역적으로 융합된 형태의 재조합 인간 칼시토닌의 그의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a recombinant gene of human calcitonin irreversibly fused to ubiquitin, its expression vector, a transforming microorganism and a method for producing recombinant human calcitonin in irreversible fusion form.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
인간 칼시토닌 유전자에 대한 프라이머 1, 2, 3(hct 1, hct 2, hct 3)을 합성하고, 인간 칼시토닌 유전자를 유비퀴틴의 C-말단에 붙이기 위해 필요한 제한효소 SacⅡ 부위의 창출과 Arg-Gly 뒤에 Gly 이 아닌 Arg 이 오게하기 위하여 단백질 감미료 유전자를 이용하는데 상기 단백질 감미료 유전자(PS)와 인간 칼시토닌 유전자를 결합시기기 위한 Pgap 유전자를 합성한다. 우선, 합성된 4 가지 프라이머와 단백질 감미료 유전자를 이용한 PCR(polymerase chain reaction) 반응에 의해 중간부분과 C-말단 각각에 제한효소 SacⅡ, Sal I 부위를 갖는 단백질 감미료 유전자가 융합된 인간 칼시토닌 유전자(PS-HCT)를 먼저 합성하고, 이 유전자를 제한효소 Sac Ⅱ/sal I 으로 처리하여 단백질 감미료의 C-말단 유전자 45 염기쌍이 함유된 인간 칼시토닌 유전자(partial PS-HCT)를 얻는다.Synthesis of primers 1, 2, and 3 (hct 1, hct 2, hct 3) for human calcitonin gene and generation of restriction enzyme SacII site required for attaching human calcitonin gene to C-terminus of ubiquitin and Gly followed by Arg-Gly The protein sweetener gene is used to bring Arg instead of the protein, and the Pgap gene for synthesizing the protein sweetener gene (PS) and the human calcitonin gene is synthesized. First, the human calcitonin gene (PS) is fused to a protein sweetener gene having restriction enzymes Sac II and Sal I at the middle and C-terminus by PCR (polymerase chain reaction) reaction using four synthesized primers and protein sweetener gene. -HCT) is first synthesized and treated with the restriction enzyme Sac II / sal I to obtain a human calcitonin gene (partial PS-HCT) containing 45 base pairs of the C-terminal gene of the protein sweetener.
그후 본 출원인의 대한민국 특허공고 제 92-1745 호에서 기술된 발현벡터[pYLBC A/G-UB-HGH](KFCC-10669 로부터 유래)를 제한효소 Pst Ⅰ/Sac Ⅱ, Pst Ⅰ/sal I 으로 처리하여 얻은 두 헥산 절편과 융합시켜, 상기 유전자가 유비퀴틴의 C-말단에 연결된 발현벡터 [pYLBC A/G-UB-Partial PS-HCT]를 제조하고 이 벡터로 형질전환시킨 효모(Saccharomyces cerevisiae DCO4)를 한국유전자 은행에 1992년 12월 30자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 0067BP).Thereafter, the expression vector [pYLBC A / G-UB-HGH] (derived from KFCC-10669) described in the applicant's Korean Patent Publication No. 92-1745 was treated with restriction enzymes Pst I / Sac II and Pst I / sal I. Fusion with two hexane fragments prepared to produce an expression vector [pYLBC A / G-UB-Partial PS-HCT] linked to the C-terminus of ubiquitin and transformed into the yeast (Saccharomyces cerevisiae DCO4). It was deposited with Korea Gene Bank on December 30, 1992 (Accession No .: KCTC 0067BP).
한편 본 출원인의 대한민국 특허출원 제 91-13603 호의 발현벡터[ptrpH-UBCore 14][ATCC 68642, 기탁일 : 91년 7월 1일]를 제한효소 Pst Ⅰ/Sac Ⅱ, Pst Ⅰ/sal I 으로 절단하여 얻은 두 DNA 절편과 상기 유전자를 접합시켜 트립 작동유전자(trp promoter)-유비퀴틴(Ubiquitin)-부분 단백질 감미료(partial PS)-인간 칼시토닌(HCT)-종료 코오돈(TAATAG)을 가진 발현벡터[ptrpH-UB-partial PS-HCT]를 제조하고, 이 벡터로 형질전환시킨 이. 클라이 W3110 를 1992년 12월 30일자로 한국유전자은행에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC O061BP).Meanwhile, the expression vector [ptrpH-UBCore 14] [ATCC 68642, date of deposit: July 1, 91] of the applicant's Korean patent application No. 91-13603 was cut with restriction enzymes Pst I / Sac II and Pst I / sal I. Two DNA fragments obtained by conjugation to the gene and an expression vector having a trip promoter, ubiquitin, partial PS, partial PS, human calcitonin (HCT), and terminating coadon (TAATAG) [ptrpH -UB-partial PS-HCT] transformed into E. coli. Klai W3110 was deposited with Korea Gene Bank on December 30, 1992 (Accession No .: KCTC O061BP).
본 발명의 융합 인간 칼시토닌 유전자는 Arg-Gly 뒤에 Gly 이 아닌 단백질 감미료 유전자에서 유래한 Arg 이 오도록 단백질 감미료의 C-말단 유전자 일부분에 융합시킨 인간 칼시토닌 유전자를 유비퀴틴 유전자 뒤에 연결시켜 줌으로서, 미생물내에서 단백질 분해효소 공격에 대해 강하며 대량 발현되는 유비퀴틴 유전자 뒤에 인간 칼시토닌 유전자가 위치함으로 인해 융합 인간 칼시토닌을 대량 생산할 수 있도록 한 것이다.The fusion human calcitonin gene of the present invention connects the human calcitonin gene fused to the C-terminal gene portion of the protein sweetener behind the ubiquitin gene such that Arg-Gly is followed by Arg derived from the non-gly protein sweetener gene. The human calcitonin gene is located behind the ubiquitin gene, which is strong against proteolytic enzyme attack, and is capable of mass production of fused human calcitonin.
본 발명에서, 사용된 단백질 감미료 유전자는 본 출원인의 특허출원 [PCT/KR89/00013]에 기술된 것이고, 유비퀴틴 유전자는 대한민국 특허공고 제 92-1745 호와 특허출원 제 91-13603호에 기술된 것이고, 그리고 인간 칼시토닌 유전자는 화학합성된 것이다.In the present invention, the protein sweetener gene used is described in the applicant's patent application [PCT / KR89 / 00013], the ubiquitin gene is described in Korean Patent Publication No. 92-1745 and Patent Application 91-13603 The human calcitonin gene is chemically synthesized.
먼저 32 개 아미노산의 인간 칼시토닌 운전자를 화학합성하는데 8 번째 아미노산이 발린(Val)이 되게끔 하고, 인간 칼시토닌이 활성을 나타내도록 하기 위해 인간 칼시토닌의 C-말단의 프롤린(Pro)을 알파-아미드화 효소에 의해 α-아미드화시킨다. α-아미드화 효소는 Gly 이 Pro 뒤에 있어야 그 앞의 Pro 을 α-아미드화 시키므로 33 번째 아미노산으로 Gly 을 더 첨가한다. α-아미드화 효소의 기질인 Gly 이 첨가된 인간 칼시토닌을 정교하게 제조하기 위해서 Lys-Lys-Arg 을 C-말단에 더 첨가하여 카복시펩티다제의 기질로 작용될 수 있도록 한다. 또한 융합 인간 칼시토닌으로부터 인간 칼시토닌 단량체만을 CNBR (cynogen bromide)로 추출하기 위해 메티오닌(Met)을 칼시토닌 앞-1 번 위치에 첨가한다.First chemical synthesis of 32 amino acid human calcitonin drivers, the eighth amino acid is Valin, and alpha-amidated C-terminal proline (Pro) of human calcitonin to activate human calcitonin. Α-amidation by enzymes. The α-amidase adds Gly as the 33rd amino acid because Gly must be after Pro to α-amid the Pro. Lys-Lys-Arg is further added to the C-terminus to serve as a substrate for carboxypeptidase to precisely prepare human calcitonin added with Gly, a substrate of α-amidase. In addition, methionine (Met) is added to position 1 before calcitonin to extract only human calcitonin monomer from CNF (cynogen bromide) from the fused human calcitonin.
또한 인간 칼시토닌 유전자를 유비퀴틴 유전자의 Sac Ⅱ 인식 부위에 접합시키기 위해 사용하는 단백질 감미료 유전자를 증폭시키는데 필요한 Pgap 프라이머를 합성한다. 이 프라이머는 Gap 작동 유전자의 3'-말단 염기서열 중 윗가닥의 염기서열과 같은 18 개의 염기서열을 가진다. 먼저 단백질 감미료 유전자와 인간 칼시토닌 유전자를 접합시키기 위해서 단백질 감미료 발현벡터[pYGG-MON](PCT/KR89/00013)을 주형으로 하여, 한 튜브에는 Pgap 과 인간 칼시토닌 프라이머 1(hct 1)을 첨가하고 다른 튜브에는 프라이머 2,3(hct 2, hct 3)을 함께 넣어 PCR 반응시켜 두 헥산 생성물을 얻는다. PCR 반응으로 얻어진 두 핵산 생성물을 한 튜브에 넣고 이들을 주형으로 하여 Pgap 과 프라이머 -3(hct 3)을 첨가하여 PCR 반응을 통해 제한효소 Sac Ⅱ, Sal I 부위를 갖는, 단백질 감미료 유전자가 융합된 인간 칼시토닌 유전자를 얻은 후 이를 Sac Ⅱ, Sal I 으로 절단하여 Sac Ⅱ-Sal I 핵산절편을 얻는다.In addition, it synthesizes a Pgap primer required to amplify the protein sweetener gene used to conjugate the human calcitonin gene to the Sac II recognition site of the ubiquitin gene. This primer has 18 nucleotide sequences, such as the nucleotide sequence of the upper strand, of the 3'-terminal sequence of the Gap effector gene. First, the protein sweetener expression vector [pYGG-MON] (PCT / KR89 / 00013) is used as a template to conjugate the protein sweetener gene and the human calcitonin gene. Pgap and human calcitonin primer 1 (hct 1) are added to one tube, and the other is used as a template. Primer 2,3 (hct 2, hct 3) together in the tube PCR reaction to obtain two hexane products. Two nucleic acid products obtained by PCR reaction were put in one tube, and these were used as a template. Pgap and primer -3 (hct 3) were added to the protein sweetener gene. After obtaining the calcitonin gene, it is digested with Sac II and Sal I to obtain a Sac II-Sal I nucleic acid fragment.
한편 유비퀴틴을 함유하고 있는 효모발현 벡터[pYLBC A/G-UB-HGH]를 제한효소 Pst Ⅰ/Sac Ⅱ, Pst Ⅰ/Sal I 으로 절단하여 얻은 두 절편과 연결시켜 유비퀴틴에 융합된, 단백질 감미료 C-말단 일부 유전자와 융합된 인간 칼시토닌 유전자를 함유하는 발현벡터[pYLBC A/G-UB-partial Pg-HCT]을 얻는다. 상기 얻어진 발현벡터로 효모(Saccharomyces cerevisiae DCO4)를 형질전환시켜 재조합 효모(KCTC O067BP)를 만든후 이로부터 유비퀴틴이 융합된 인간 칼시토닌을 생산해 낸다.On the other hand, protein sweetener C fused to ubiquitin by linking two fragments obtained by cleaving the yeast expression vector [pYLBC A / G-UB-HGH] containing ubiquitin with restriction enzymes Pst I / Sac II and Pst I / Sal I An expression vector [pYLBC A / G-UB-partial Pg-HCT] containing a human calcitonin gene fused to the terminal partial gene is obtained. Yeast (Saccharomyces cerevisiae DCO4) is transformed with the obtained expression vector to produce recombinant yeast (KCTC O067BP), from which ubiquitin is fused to produce human calcitonin.
또한 본 출원인의 대한민국 특허출원 제 91-13603 호의 발현벡터[ptrpH-UB-CORE 14]를 Pst Ⅰ/sal Ⅰ, Pst Ⅰ/Sac Ⅱ 로 절단하여 두 헥산절편을 얻고 이를 Sac Ⅱ-Sal I 헥산절편과 융합시켜 대장균 발현벡터[ptrpH-UB-partial PS-HCT]를 얻는다. 이 벡터로 대장균 E. coli W3110(ATCC 27325)를 형질전환시켜 재조합 대장균(KCTC O061BP)을 얻고 이를 발효시켜 융합 인간 칼시토닌을 얻는다.In addition, the expression vector [ptrpH-UB-CORE 14] of the applicant's Korean patent application No. 91-13603 was cut with Pst I / sal I and Pst I / Sac II to obtain two hexane fragments, which were obtained from Sac II-Sal I hexane fragments. And E. coli expression vector [ptrpH-UB-partial PS-HCT]. E. coli W3110 (ATCC 27325) was transformed with this vector to obtain recombinant E. coli (KCTC O061BP) and fermented to obtain fused human calcitonin.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명하고자 하며, 이들로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, and the present invention is not limited thereto.
[실시예 1] 인간 칼시토닌(HCT) 유전자의 올리고뉴클레오티드의 합성Example 1 Synthesis of Oligonucleotides of Human Calcitonin (HCT) Gene
인간 칼시토닌 유전자 염기서열[Roger K. Craig, Nature 295, 345(1982)]을 효모세포에서 선택적으로 사용하는 아미노산 코오돈으로 변경하여 전체 유전자를 유전자 합성기[Applied Biosystem, Model 380A, USA]를 사용하여 포스포아미디트 방법을 실시하여 프라이머 hct-1, hct-2, hct-3 를 화학합성하였다. 이들 올리고뉴클리오티드의 서열 및 유전자에서의 위치를 제 1 도에 나타내었다.The human calcitonin gene sequence [Roger K. Craig, Nature 295, 345 (1982)] was changed to the amino acid codons selectively used in yeast cells, and the entire gene was converted using a gene synthesizer [Applied Biosystem, Model 380A, USA]. The phosphoramidite method was carried out to chemically synthesize primers hct-1, hct-2, and hct-3. The sequence in these oligonucleotide sequences and genes is shown in FIG.
이 올리고뉴클레오티드는 인간 칼시토닌의 32 개 아미노산에 해당하는 운전자 코오돈외에 후속 정제 과정 중에 CNBR 로 추출하기 위하여 인간 칼시토닌 유전자 바로 앞에 ATG (Met 코돈)를 첨가하였으며, 인간 칼시토닌의 발현율을 높이기 위하여 8 번째 아미노산이 Val 이 되게 디자인 했으며, C-말단의 단백질을 α-아미드화시키기 위하여 필요한 Gly 이 더 첨가되도록 하였으며, 또한 카복시펩티다제의 기질로 작용하도록 하기 위한 Lys-Lys-Arg 의 아미노산에 해당하는 코오돈과 2 가지 종결 코오돈 TAA, TAG 및 3'-말단위치에 제한효소 Sal I 부위를 첨가하여 전체 177 개의 염기를 합성하였다. 또한 PCR 방법으로 인간 칼시토닌 유전자를 단백질 감미료 유전자와 융합시키기 위하여 단백질 감미료 발현 벡터[pVGG-MON]의 작동 유전자 부위의 윗가닥과 동일한 염기배열순서를 갖는 18 개 염기의 Pgap 프라이머를 합성하였다.In addition to the driver codons corresponding to the 32 amino acids of human calcitonin, the oligonucleotide was added with ATG (Met codon) immediately before the human calcitonin gene for extraction into CNBR during subsequent purification, and the eighth amino acid to increase the expression rate of human calcitonin. It was designed to be Val, and added Gly needed to α-amidize the C-terminal protein, and also the amino acid of Lys-Lys-Arg to act as a substrate for carboxypeptidase. A total of 177 bases were synthesized by adding the restriction enzyme Sal I site at Don and two terminating codons TAA, TAG and 3'-terminus. In addition, in order to fuse the human calcitonin gene with the protein sweetener gene by PCR, 18 base Pgap primers having the same nucleotide sequence as the upper strand of the working gene region of the protein sweetener expression vector [pVGG-MON] were synthesized.
[실시예 2] 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 인간 칼시토닌 유전자와 유비퀴틴 유전자의 연결Example 2 Linkage of Human Calcitonin Gene and Ubiquitin Gene by Polymerase Chain Reaction (PCR)
단백질 감미료 발현벡터[pYGG-MON] 10ng 에 10㎕ 의 10×Tag 중합효소 완충용액[100mM Tris-HCl(pH 8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.1%(W/V)젤라틴]과 10㎕ dNTP's 혼합용액 (각각 2.OmM 의 dGTP, dATP, dTTP, dCTP), 5㎕ 의 hct-1, 5㎕ 의 Pgap, 증류수 68.5㎕ 및 0.5㎕ 의 Tag DNA 중합효소(5u/λ, Boehringer Mannheim, Germany)를 첨가하여 전체 100㎕ 반응용액을 만든후 잘 혼합시켰다.10 μl of 10 × Tag polymerase buffer [100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.1% (W / V) gelatin] in 10 ng of protein sweetener expression vector [pYGG-MON] dNTP's mixed solution (2.OmM of dGTP, dATP, dTTP, dCTP, respectively), 5 μl of hct-1, 5 μl of Pgap, 68.5 μl of distilled water and 0.5 μl of Tag DNA polymerase (5u / λ, Boehringer Mannheim, Germany ) Was added to make a total 100 μl reaction solution and mixed well.
이때 용액의 증발을 방지하기 위하여 50㎕ 의 미네랄 오일을 반응용액에 첨가하고, 온도순환기(Hybaid, Thermocycler, England)을 사용하여 핵산 증폭반응을 수행하였는데, 온도 순환 프로그램은 94℃ 1분, 40℃ 2분 30초, 55℃ 2분 30초로 5 회, 94℃ 1분 30초, 45℃ 1분 30초, 72℃ 1분 30초로 25 회 반복시키고 마지막으로 72℃ 에서 10분동안 추가반응을 시켰다.At this time, 50 μl of mineral oil was added to the reaction solution to prevent evaporation of the solution, and the nucleic acid amplification reaction was performed using a thermocycler (Hybaid, Thermocycler, England). Repeated 5 times with 2 minutes 30 seconds, 55 ° C 2 minutes 30 seconds, 94 ° C 1 minute 30 seconds, 45 ° C 1 minute 30 seconds, 72 ° C 1 minute 30 seconds, and finally a further reaction at 72 ° C for 10 minutes. .
또다른 튜브에는 5㎕ 의 hct 2, 5㎕ 의 hct 3, 10㎕ 10×Tag 중합효소 완충용액, 10㎕ 의 2mM dNTPs, 69.5㎕ 의 증류수, 0.5㎕ 의 Tag DNA 중합효소를 첨가하여 94℃ 1분, 37℃ 2분, 55℃ 2분으로 2회 반복수행후 94℃ 분, 55℃ 2분, 72℃ 2분으로 4회 반복수행하였다.In another tube, add 5 μl of hct 2, 5 μl of hct 3, 10 μl of 10 × Tag polymerase buffer, 10 μl of 2mM dNTPs, 69.5 μl of distilled water, and 0.5 μl of Tag DNA polymerase. Repeated twice for 2 minutes at 37 ° C., 2 minutes at 55 ° C., followed by 4 times at 94 ° C., 55 ° C. 2 minutes, and 72 ° C. 2 minutes.
증폭된 두 유전자를 7% 폴리아크릴 아미드젤(TBE 완충 용액, 7% 아크릴아미드)에서 전기 영동법으로 분리정제한 후 다음의 중합효소 연결반응에 사용하였다.The two amplified genes were separated and purified by electrophoresis on 7% polyacrylamide gel (TBE buffer solution, 7% acrylamide) and then used for the following polymerase linkage reaction.
분리 정제된 두 유전자 각각을 1㎕ 씩 취한 후 Pgap 5㎕, hct-3 5㎕, 10×Tag 완충용액 10㎕, dNTP's 10㎕, 69㎕ 의 증류수, Tag DNA 중합효소 0.5㎕ 를 가하여 94℃ 1분, 45℃ 1분 30초, 72℃ 1분 30초로 5회, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분으로 25회 증폭 반응을 수행한 결과 연결된 단백질 감미료-인간 칼시토닌 핵산을 얻었다.Take 1 ㎕ of each of the two purified genes, add 5 ㎕ of Pgap, 5 ㎕ of hct-3, 10 10 of 10 × Tag buffer, 10 d of dNTP's, 69 증류 of distilled water, and 0.5 Tag of Tag DNA polymerase. Amplification reaction was performed 5 times at 94 ° C for 1 minute 30 seconds, 72 ° C for 1 minute 30 seconds, for 25 minutes at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and for 72 minutes for 1 minute to 72 ° C to obtain a linked protein sweetener-human calcitonin nucleic acid. .
상기와 같이 7% 아크릴 아미드젤에서 전기 영동법으로 추출 정제하여 이를 M13 계열의 플라스미드에 클로닝하여 메싱등의 방법(Messing et al., Method in Enzymology 101: p20, (1983))으로 뉴클레오티드 서열을 확인하였고 그 뉴클레오티드 서열을 제 1 도에 나타냈다.Extracted and purified by electrophoresis on 7% acryl amide gel as described above and cloned into M13 series plasmid to confirm the nucleotide sequence by Messing et al. (Messing et al., Method in Enzymology 101: p20, (1983)). The nucleotide sequence is shown in FIG.
[실시예 3] 유비퀴틴 융합 인간 칼시토닌 유전자의 효모발현 벡터로의 클로닝 및 상기 벡터로 효모의 형질전환Example 3 Cloning of Ubiquitin Fusion Human Calcitonin Gene into a Yeast Expression Vector and Transformation of Yeast with the Vector
실시예 2에서 확인된 단백질 감미료 유전자가 융합된 인간 칼시토닌 유전자를 제한효소 Sac Ⅱ, Sal I 으로 절단한 후 7% 아가로즈 젤 전기영동법에 의해 유비퀴틴의 Arg-Gly 뒤에 Arg 이 오도록 단백질 감미료의 C-말단 부분 15 개 아미노산에 해당하는 유전자와 인간 칼시토닌 운전자가 Sac Ⅱ 인식 부위에 융합된 핵산절편(partial 95-HCT)을 얻었다.The human calcitonin gene fused with the protein sweetener gene identified in Example 2 was digested with restriction enzymes Sac II, Sal I and then 7% agarose gel electrophoresis followed by Arg-Gly of ubiquitin followed by Arg. A gene corresponding to the terminal 15 amino acids and a human calcitonin driver obtained a nucleic acid fragment (partial 95-HCT) fused to a Sac II recognition site.
본 출원인의 대한민국 특허공고 제 99-1745 호에 기술된 효모 발현 벡터 [pYLBC A/G-UB-HGH]를 제한 효소 kpn Ⅰ/Sac Ⅱ, kpn Ⅰ/sal I 으로 악각 절단한 후, 1% 아가로스 젤에서 전기영동법으로 분리정제하였다. 여기서 얻어진 발현벡터조각들과 상기 HCT 핵산절편을 T4DNA 리가제로 접합반응시킨 다음, 대장균 HB101 를 형질전환시키고 앰피실린-함유 배지에서 선별하였다. 유비퀴틴-부분 단백질 감미료-인간 칼시토닌 유전자가 재조합된 대장균 콜로니로부터 알칼리 분해 방법 (Alkaline lysis, Birnboim ＆ Doly, N.A.R 7, 1513(1979))으로 플라스미드를 추출한 후 제한효소 Sac Ⅱ/Sal I 으로 절단하여 166 염기쌍을 확인함으로써 유비퀴틴이 융합된 인간 칼시토닌의 효모 발현벡터인 pYLBC A/G-UB-partial PS-HCT(KCTC O067BP) 를 얻었다.The yeast expression vector [pYLBC A / G-UB-HGH] described in the applicant's Korean Patent Publication No. 99-1745 was engraved with restriction enzymes kpn I / Sac II and kpn I / sal I, followed by 1% agar. The gels were separated and purified by electrophoresis. The expression vector fragments obtained here and the HCT nucleic acid fragments were conjugated with T 4 DNA ligase, and then transformed into E. coli HB101 and selected in an ampicillin-containing medium. The plasmid was extracted from the ubiquitin-partial protein sweetener-human calcitonin gene recombinant E. coli colonies by alkaline digestion (Alkaline lysis, Birnboim & Doly, NAR 7, 1513 (1979)), and then digested with restriction enzyme Sac II / Sal I. By confirming the base pairs, pYLBC A / G-UB-partial PS-HCT (KCTC 067BP), which is an ubiquitin-fused human calcitonin expression vector, was obtained.
이상과 같은 효모 발현 벡터로 클로닝 시키는 과정을 요약하여 제 3 도에서 도시하였으며 유비퀴틴이 융합된 인간 칼시토닌의 뉴클레오티드서열은 제 2 도에 나타내었다.The procedure for cloning the yeast expression vector as described above is summarized in FIG. 3 and the nucleotide sequence of ubiquitin-fused human calcitonin is shown in FIG.
확인한 재조합 플라스미드를 알칼리분해 방법으로 대장균으로부터 대량 추출한 후 이를 이용하여 제임스 방법(James Hill et at., Nucleic Acids Research 19, 5791)에 의해 효모를 형질전환시키기 위해, 밤새 YEPD 2% 배지(1% 효모추출물, 2% 박토펩톤, 2% 글루코스)에 배양한 효모액(Saccharomyces cerevisiae DCO4) 1㎖을 100㎖의 새 YEPD 2% 배지에 접종하고 0.D.(600nm)가 0.8~0.1 될때까지 30℃ 에서 5 시간 정도 진탕 배양하였다. 상기 배양물을 3000rpm 에서 3 분간 원심분리하여 얻은 세포 침전물을 10㎖ 의 리튬아세테이트 완충 용액(0.1M C2H302Li2H20, 10mM Tris HCl pH 8.0, 1mM EDTA)으로 씻은 다음, 다시 원심분리하여 상층액을 따라내고 침전물에 1㎖ 의 리튬아세테이트 용액을 첨가하여 잘 현탁시켰다. 펠콘 튜브(Falcon tube) 2054 에 100㎕ 의 상기 효모액을 넣고 10㎕ 의 효모 발현벡터를 첨가한 후 5분간 상온에서 방치시켰다. 그후 280㎕ 의 PEG 4000 용액(리튬아세테이트 완충액 중의 50% PEG 4000)을 첨가한 후 30℃ 에서 40분 배양한 후 43㎕ 의 디메틸술폭시드(DMSO)를 가하여 42℃ 에서 5분간 열 쇼크(heat shock)을 준다음 3 초간 3000rpm 으로 원심분리하였다.Identified recombinant plasmids were subjected to mass extraction from Escherichia coli by alkaline lysis and then transformed into yeast by James method (James Hill et at., Nucleic Acids Research 19, 5791), overnight in YEPD 2% medium (1% yeast). 1 ml of Saccharomyces cerevisiae DCO4 incubated in extract, 2% bactopeptone, 2% glucose) was inoculated in 100 ml of fresh YEPD 2% medium and 30 ° C until 0.D. (600 nm) was 0.8-0.1. Shake culture was carried out for about 5 hours. The cell precipitate obtained by centrifuging the culture at 3000 rpm for 3 minutes was washed with 10 ml of lithium acetate buffer solution (0.1MC 2 H 3 0 2 Li 2 H 2 0, 10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA), and then again centrifuged. The supernatant was decanted and the suspension was added well by adding 1 ml of lithium acetate solution. 100 μl of the yeast solution was added to a Falcon tube 2054, and 10 μl of the yeast expression vector was added thereto, followed by standing at room temperature for 5 minutes. Then, 280 μl of PEG 4000 solution (50% PEG 4000 in lithium acetate buffer) was added, incubated at 30 ° C. for 40 minutes, and then 43 μl of dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to heat shock at 42 ° C. for 5 minutes. ) And centrifuged at 3000 rpm for 3 seconds.
상층액을 제거한 후 200㎕ 의 증류수에 세포침전물을 잘 용해시켜 루이신-결핍 평판배지(박토아가(Bacto Agar) 20g, 아미노산이 없는 효모 질소염기 6,7g, Leu-공급물 0.25g, 4㎖ 의 5% 트레오닌, 40㎖ 의 50% 글루코스, 820㎖ 의 증류수)에 도말하여 30℃ 에서 4~7 일간 배양하여 재조합 효모 클로니를 얻었다.After removing the supernatant, the cell precipitate was well dissolved in 200 µl of distilled water, followed by lysine-deficient plate medium (20 g of Bacto Agar, 6,7 g of amino acid-free yeast nitrogen base, 0.25 g of Leu-feed, 4 ml). 5% threonine, 40 ml of 50% glucose, 820 ml of distilled water) and incubated at 30 ° C. for 4 to 7 days to obtain a recombinant yeast clone.
[실시예 4] 효모에서 융합 칼시토닌의 대량발현 및 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의한 확인Example 4 Mass Expression of Fused Calcitonin in Yeast and Identification by SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
실시예 3 에서 얻어진 융합 인간 칼시토닌 발현벡터로 형질전환시킨 효모균주 사카로마이세스 세레비지에 DCO4[pYLBC A/G-UB-partial PS-HCT]을 10㎖ 의 루이신-결핍 배양액(배양액 ℓ당 아미노산이 없는 효모 질소염기(DIFCO, USA) 6.7g, 루이신-결핍 아미노산 혼합물 0.25g 및 5% 글루코스)에서 30℃ 의 온도로 밤새 배양하였다.To yeast strain Saccharomyces cerevisiae transformed with the fused human calcitonin expression vector obtained in Example 3, DCO4 [pYLBC A / G-UB-partial PS-HCT] was added to 10 ml of leucine-deficient culture (per 1 liter of culture). 6.7 g of amino acid-free yeast nitrogen base (DIFCO, USA), 0.25 g of leucine-deficient amino acid mixture and 5% glucose) were incubated overnight at a temperature of 30 ° C.
그후 20㎖ 의 YEPD 1% 배지(1% 효모 추출물, 2% 박토펩톤(Bactopeptone), 1% 글루코스)가 든 3개의 250㎖ 플라스크에 상기 배양물 1㎖ 을 각각 접종한 후 30℃ 에서 각각 24시간, 36시간 및 48시간 배양하였다.Then inoculate 1 ml of the culture in three 250 ml flasks containing 20 ml of YEPD 1% medium (1% yeast extract, 2% Bactopeptone, 1% glucose), and then incubate at 30 ° C for 24 hours each. Incubated for 36 hours and 48 hours.
O.D.(600nm) 10 을 기준으로 배양액 1㎖ 을 취한 후 원심분리하여 상층액을 버리고 침전된 세포에 TE(pH 8.0, Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM)완충용액 200㎕, 0.45mm 유리 구슬 300㎕ 을 가한 다음 비드 비터(Bead Beater; Bioseptic, USA)로 2 분간 강하게 진탕시켜 세포벽을 파괴하였다. 10㎕ 의 추출물을 램리(Laemmli, Nature 277, 680(1970)) 방법에 따라 15% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 후 코마시 브릴리언트 블루 R25O(Coomasie Brilliant Blue R250)로 염색하고, 그 결과를 제 4 도에 나타내었다.Take 1 ml of the culture solution on the basis of OD (600 nm) 10 and centrifuge to discard the supernatant. Then, 200 µl of TE (pH 8.0, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM) buffer solution and 300 µl of 0.45 mm glass beads were added. After the addition, the cell wall was destroyed by vigorous shaking for 2 minutes with a Bead Beater (Bioseptic, USA). 10 μl of the extract was stained with Coomasie Brilliant Blue R250 after 15% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis according to the Laemmli, Nature 277, 680 (1970) method, and the results were obtained. 4 is shown.
제 4 도의 제 1 열은 발현벡터를 포함하지 않은 효모의 24 시간 배양 후의 샘플이고, 제 2 열은 사카로마이세스 세레비지에 DCO4[pYLBC AG-UB-partial PS-HCT(8th Val)]의 24 시간, 제 3 열은 사카로마이세스 세레비지에 DCO4[pYLBC AG-UB-partial PS-HCT(8th Val)]의 24 시간 배양후의 샘플이고, 제 4 열은 발현벡터를 포함하지 않은 효모의 48 시간 배양후의 샘플이고, 제 5 열은 사카로마이세스 세레비지에 DCO4[pYLBC A/G-UB-partial PS-HCT(8th Val)]의 48 시간, 제 6 열은 사카로마이세스 세레비지에 DC04[pYLBC A/G-UB-partial PS-HCT(8th Val)]의 48 시간 배양후의 샘플이고, 제 7 열은 표준 분자량 마커로 위에서부터 97K 달톤, 66K 달톤, 45K 달톤, 31K 달톤, 21.5K 달톤, 14K 달톤을 나타낸다.The first column of FIG. 4 is a sample after 24 hours of cultivation of yeast that does not contain an expression vector, and the second column is of Saccharomyces cerevisiae DCO4 [pYLBC AG-UB-partial PS-HCT (8th Val)]. 24 hours, column 3 is a sample after 24 hours of DCO4 [pYLBC AG-UB-partial PS-HCT (8th Val)] in Saccharomyces cerevisiae, and column 4 is a yeast containing no expression vector. Sample after 48 hours incubation, column 5 is Saccharomyces cerevisiae 48 hours of DCO4 [pYLBC A / G-UB-partial PS-HCT (8th Val)], column 6 is Saccharomyces cerevisiae Is a sample after 48 hours incubation of DC04 [pYLBC A / G-UB-partial PS-HCT (8th Val)], column 7 is 97K Dalton, 66K Dalton, 45K Dalton, 31K Dalton, 21.5 from above with standard molecular weight markers K Dalton, 14K Dalton.
제 4 도의 제 2, 3 열의 유비퀴틴 융합 인간 칼시토닌은 제 1 열의 통상적인 효모와 달리 13,500 달톤 위치에서 밴드를 보여주고 있어 유비퀴틴이 융합된 칼시토닌임을 확인할 수 있었다.The ubiquitin fused human calcitonin in the second and third rows of FIG. 4 shows bands at 13,500 Dalton positions, unlike the conventional yeast in the first row, thus confirming that the ubiquitin is fused calcitonin.
이상과 같이 칼시토닌을 단백질 감미료나 유비퀴틴 뒤에 융합시킴으로써 효모에서 칼시토닌을 대량 제조할 수 있게 되었다.As described above, calcitonin can be fused after protein sweetener or ubiquitin to allow mass production of calcitonin in yeast.
[실시예 5] 융합 인간 칼시토닌 유전자의 대장균 발현벡터로의 클로닝 및 상기 벡터로 대장균의 형질전환[Example 5] Cloning of fusion human calcitonin gene into E. coli expression vector and transformation of E. coli into the vector
실시예 2에서 제조한 단백질 감미료 유전자가 융합된 인간 칼시토닌 유전자를 제한효소 Sac Ⅱ, Sal I 으로 절단한 후 7% 아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 헥산절편을 얻었다.The human calcitonin gene fused with the protein sweetener gene prepared in Example 2 was digested with restriction enzymes Sac II, Sal I and then hexane fragments were obtained by 7% acrylamide gel electrophoresis.
한편 본 출원인의 대한민국 특허공고 제 91-136032 호의 발현 벡터 [ptrpH-UB-CORE 14]를 PstⅠ/Sac Ⅱ, PstⅠ/sac Ⅱ로 절단하여 0.7% 아가로스 젤로 전기영동법에 의해 두 핵산절편을 분리하여 얻고 상기 핵산절편과 함께 세 핵산 절편을 T4 DNA 리가제를 사용해 접합시키고, E. coli HB101(ATCC 3694)에 형질전환시켜 앰피실린-함유 평판 배지에서 선별하였다.Meanwhile, the expression vector [ptrpH-UB-CORE 14] of Korean Patent Publication No. 91-136032 of the applicant was cut with Pst I / Sac II and Pst I / sac II, and the two nucleic acid fragments were separated by electrophoresis with 0.7% agarose gel. Three nucleic acid fragments were conjugated with T4 DNA ligase and transformed into E. coli HB101 (ATCC 3694) and selected in ampicillin-containing plate medium.
형질전환된 E. coli HB101 을 알칼리 가수분해시켜 얻은 플라스미드를 Sac Ⅱ/Sal Ⅰ제한효소로 절단하여 166 염기쌍을 확인하여 대장균 발현벡터[ptrpH-UB-partial PS-HCT](KCTC O067BP)를 제조하였다. 제조과정은 제 5 도에 도시하였으며 유비퀴틴 유전자에 융합된 단백질 감미료의 부분유전자와 인간칼시토닌 유전자는 제 2 도에 도시하였다.The plasmid obtained by alkaline hydrolysis of transformed E. coli HB101 was digested with Sac II / Sal I restriction enzyme to identify 166 base pairs, thereby preparing an E. coli expression vector [ptrpH-UB-partial PS-HCT] (KCTC O067BP). . The manufacturing process is shown in FIG. 5 and the partial and human calcitonin genes of the protein sweetener fused to the ubiquitin gene are shown in FIG.
[실시예 6] 재조합 대장균에서 유비퀴틴 융합 인간칼시토닌의 발현 및 SDS-폴리아크릴아미드겔에 의한 확인Example 6 Expression of Ubiquitin-fused Human Calcitonin in Recombinant Escherichia Coli and Identification by SDS-Polyacrylamide Gel
실시예 5 에서 얻은 대장균 발현벡터[ptrpH UB-partial PS-HCT]를 E. coli W3110(ATCC 27325)에 형질전환시켜 재조합 대장균을 얻었다. 이들을 50㎍/㎖ 의 엠피실린-함유 액체 LB 배지(0.5% 효모 추출물, 1% 박토트립톤(Bacto-tryptone), 1% NaCl)에서 6~7 시간 37℃ 에서 진탕 배양한 다음, 이중 0.2㎖ 을 20㎖ 의 M9 CAA 배지(40mM K2HP04, 22mM KH2P04, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH4Cl, 1% 글루코스, 0.1mM MgS040.1mM CaCl2, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ VitB1, 40㎍/㎖ 엠피실린)으로 옮겨서 37℃ 에서 2~3 시간 배양시켜 0.D.(600nm)가 0.1~0.2 정도가 될때 인돌아르릴산(IAA)를 최종농도 1.4mM이 되게 첨가하여 인간 칼시토닌이 발현되도록 하였다. IAA 를 첨가하기 직전, IAA 첨가후 3 시간, 24 시간째 0.D.(600nm) 1.0 기준으로 1㎖ 씩 세포 배양액을 취한 뒤 원심분리기를 이용해 박테리아 침전물을 수집하였다. 상기 얻은 세포균질액을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 12% SDS-폴리아크릴 아미드겔에서 전기 영동하였다. 전기영동한 결과를 제 6 도에 나타내었다.E. coli W3110 (ATCC 27325) was transformed into E. coli expression vector [ptrpH UB-partial PS-HCT] obtained in Example 5 to obtain recombinant E. coli. They were incubated in 50 μg / ml of empicillin-containing liquid LB medium (0.5% yeast extract, 1% Bacto-tryptone, 1% NaCl) at 37 ° C. for 6-7 hours, followed by 0.2 ml of 20 ml of M9 CAA medium (40 mM K 2 HP0 4 , 22 mM KH 2 P0 4 , 8.5 mM NaCl, 18.7 mM NH 4 Cl, 1% glucose, 0.1 mM MgS0 4 0.1 mM CaCl 2 , 0.4% casamino acid, 10 μg) / Ml VitB1, 40µg / ml Empicillin) and incubated at 37 ° C for 2 to 3 hours to add indolearic acid (IAA) to a final concentration of 1.4 mM when 0.D. (600 nm) is about 0.1 to 0.2. Human calcitonin was expressed. Immediately before the addition of IAA, 3 hours after the addition of IAA, 24 hours were taken for 1 ml cell culture based on 0.D. (600 nm) 1.0 and bacterial precipitates were collected using a centrifuge. The obtained cell homogenate was electrophoresed on a 12% SDS-polyacrylamide gel according to the method of Laemmli, Nature 227, 680 (1970). The result of electrophoresis is shown in FIG.
제 6 도의 제 1 열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균 W3110 숙주이며, 제 2 열 및 5 열은 발현벡터를 함유한 대장균 W3110 의 인돌아크릴산(IAA)을 첨가하기 직전, 제 3 열 및 6 열은 발현벡터를 함유한 대장균 W3110 의 인돌아크릴산(IAA) 첨가후 3 시간, 제 4 열 및 7 열은 발현벡터를 함유한 대장균 W3110 의 인돌아크릴산(IAA) 첨가후 24 시간째 샘플이고, 제 8 열은 평균분자량 마커로 위에서 부터 110K 달톤, 84K 달톤, 47K 달톤, 33K 달톤, 24K 달톤, 16K 달톤을 나타낸다.The first column of FIG. 6 is E. coli W3110 host without plasmid, and the second and fifth columns are just before the addition of indole acrylic acid (IAA) of E. coli W3110 containing the expression vector, and the third and sixth columns are expressed. Three hours after the addition of indole acrylic acid (IAA) of E. coli W3110 containing the vector, columns 4 and 7 are samples 24 hours after the addition of indole acrylic acid (IAA) of E. coli W3110 containing the expression vector, the eighth column averaged. Molecular weight markers represent 110K Daltons, 84K Daltons, 47K Daltons, 33K Daltons, 24K Daltons, 16K Daltons from above.
IAA 첨가후 3 시간, 24 시간에서 대장균 숙주(1열)에서 보이지 않은 밴드가 확실히 보이고 그 크기가 13.5 킬로달톤의 예상 위치에서 나타나고 있어 유비퀴틴이 융합된 인간 칼시토닌임을 확실히 알수 있었다.3 hours and 24 hours after IAA addition, an unseen band was clearly seen in the E. coli host (column 1), and the size was shown at an expected position of 13.5 kilodaltons, indicating that ubiquitin was fused human calcitonin.
이상과 같이 칼시토닌을 유비퀴틴 뒤에 융합시킴으로써 대장균에서 융합 인간 칼시토닌을 제조할 수 있게 되었다.As described above, by fusing calcitonin behind ubiquitin, it is possible to produce fused human calcitonin in E. coli.
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| KR1019930002694A KR100274185B1 (en) | 1993-02-25 | 1993-02-25 | Human calcitonin fused with ubiquitin |
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| KR1019930002694A KR100274185B1 (en) | 1993-02-25 | 1993-02-25 | Human calcitonin fused with ubiquitin |
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| KR100274185B1 true KR100274185B1 (en) | 2000-12-15 |
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| KR (1) | KR100274185B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR960031478A (en) * | 1995-02-14 | 1996-09-17 | 성재갑 | Method for Purifying Ubiquitin-Fused Human Calcitonin |
-
1993
- 1993-02-25 KR KR1019930002694A patent/KR100274185B1/en not_active IP Right Cessation
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| KR960031478A (en) * | 1995-02-14 | 1996-09-17 | 성재갑 | Method for Purifying Ubiquitin-Fused Human Calcitonin |
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