KR100260100B1

KR100260100B1 - 황체형성호르몬 방출호르몬과 리보뉴클레아제의 결합제 및 그를 이용한 세포성장의 저해방법

Info

Publication number: KR100260100B1
Application number: KR1019970044680A
Authority: KR
Inventors: 고용송; 채치범
Original assignee: 허일섭; 주식회사녹십자; 정명식; 학교법인포항공과대학교
Priority date: 1997-08-30
Filing date: 1997-08-30
Publication date: 2000-07-01
Also published as: KR19990021168A

Abstract

본 발명은 황체형성호르몬 방출호르몬(luteinizing hormone releasing hormone)과 리보뉴클레아제(RNase)의 결합체(conjugate) 및 그를 이용한 세포 성장의 저해방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 황체형성호르몬 방출호르몬 수용체를 발현하는 세포의 성장을 저해하는, 황체형성호르몬 방출호르몬과 리보뉴클레아제의 결합체 및 그를 황체형성호르몬 방출호르몬의 수용체를 발현하는 세포에 주입하여 전기 세포의 성장을 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 황체형성호르몬 방출호르몬과 리보뉴클레아제의 결합체는 황체형성호르몬 방출호르몬 수용체를 발현하는 암세포에만 선택적으로 작용하여 그의 성장을 억제시키고, 그 억제능 또한 장기간 지속되는 바, 전기 암세포의 치료제로서 효과적으로 이용될 수 있을 것이다.

Description

황체형성호르몬 방출호르몬과 리보뉴클레아제의 결합제 및 그를 이용한 세포성장의 저해방법

제1도는 황체형성호르몬 방출호르몬과 리보뉴클레아제 A의 결합체(LHRH-RNase A)의 리보뉴클레아제 활성도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

제2도는 LHRH-RNase A가 LHRH 수용체를 발현하는 인간 전립선 암세포이 성장을 농도의존적으로 저해하는 결과를 나타내는 그래프이다.

제3도는 LHRH-RNase A가 LHRH 수용체를 발현하는 인간 유방 암세포의 성장을 농도의존적으로 저해하는 결과를 나타내는 그래프이다.

제4도는 LHRH-RNase A가 선택적으로 LHRH 수용체를 발현하는 세포의 성장을 저해하는 결과를 나타내는 그래프이다.

제5도는 LHRH-RNase A가 LHRH 수용체를 발현하는 인간 전립선 암세포와 유방 암세포의 성장을 장기간 저해한다는 결과를 나타내는 그래프이다.

[발명의 목적]

[본 발명이 속하는 기술 분야 및 그 분야의 종래 기술]

본 발명은 황체형성호르몬 방출호르몬(luteinizing hormone releasing hormone)과 리보뉴클레아제(RNase)의 결합체(conjugate) 및 그를 이용한 세포 성장의 저해방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 황체형성호르몬 방출호르몬 수용체를 발현하는 세포의 성장을 저해하는, 황체형성호르몬 방출호르몬과 리보뉴클레아제의 결합체 및 그를 황체형성호르몬 방출호르몬의 수용체를 발현하는 세포의 주입하여 전기 세포의 성장을 저해하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 성호르몬인 안드로겐과 에스트로겐은 각각 전립선(prostate)과 유방(breast)의 기능을 조절할 뿐만 아니라, 호르몬 의존성(hormone dependent) 전립선암과 유방암 세포의 성장에 필수적이다. 이들 안드로겐과 에스트로겐의 분비는 각각 황체형성호르몬(luteinizing hormone, 이하, 편의상 'LH'라 함)과 난포자극호르몬(follicle stimulating hormone, 이하, 편의상 'FSH'라 함)에 의해 조절되고, LH 및 FSH의 분비는 황체형성호르몬 방출호르몬(luteinizing hormone releasing hormone, 이하, 편의상 'LHRH'라 함)에 의해 조절된다.

현재, 호르몬 의존성 전립선암과 유방암의 치료는 외과적인 종양제거와 더불어 호르몬치료(hormonal therapy)의 병행에 의해 수행되고 있는데, 호르몬 치료법이란 황체형성호르몬 방출호르몬이나 그 유도체의 지속적인 투여로 야기된 향생식선세포(gonadotroph)의 탈감작성(desensitization)에 의해 LH와 FSH의 분비를 억제시켜, 안드로겐과 에스트로겐의 분비를 감소시킴으로써 전기 암세포의 성장을 억제하는 방법이다. 그러나, 이러한 호르몬치료법은 호르몬 비의존성(hormone independent) 전립선암과 유방암에 대해서는 적용되지 못하였다.

그리하여, 아직도 호르몬 비의존성 전립선암과 유방암에 대해서는 일반적인 암 치료법인 화학요법 등이 사용되고 있으나, 전기 암세포들이 항암제에 대해 빠른 내성을 획득하고, 항암제에 의한 부작용으로 인해, 새로운 암 치료제의 개발이 절실히 요구되었다.

한편, 호르몬독소(hormone-toxin) 또는 면역독소(immunotoxin)는 특정 세포를 인지하는 호르몬 또는 세포 표면에 발현되는 물질에 대한 항체와 독소의 결합으로 이루어진 물질인데, 호르몬 또는 항체를 통해 특정 암세포에 선택적으로 결합하고, 세포내이입(endocytosis)과정을 통해 세포내로 전달된 독소가 암세포를 사멸시키는 새로운 개념의 암치료제이다(참조: Vitetta, E.S. etal., Science, 219:644(1983)).

독소 물질에는 단백질 합성을 저해하는 박테리아 독소인 디프테리아 독소(diphtheria toxin)나 녹농균 독소(Pseudomonas exotoxin), 또는 식물 독소인 리신(ricin)등이 있다. 그러나, 이들 독소 물질을 이용하여 제조한 호로몬독소 또는 면역독소들은 실험실적 조건에서는 그 결과가 성공적이었으나, 이들 독소 물질들이 강한 면역원성(immunogenicity)과 간에 대한 독성(livertoxicity)을 갖고 있는 것으로 동물실험과 임상실험에 의해 밝혀졌다.

이와 같은 종래의 독소들이 가진 문제점을 해결하고자, 인간 혈청에 존재하는 리보뉴클레아제(RNase) 또는 엔지오제닌(angiogenin)과 같은 리보뉴클레아제 계통(RNase superfamily)의 단백질이 독소 물질로 개발되었으며, 그를 이용한 호르몬 독소 또는 면역독소들도 개발되었다(참조: Rybak, S.M. et al., J. Biol. Chem., 266:21202(1991); Rybak, S.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3165(1992)).

[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 성호르몬 의존성 혹은 비의존성의 인간 전립선암과 유방암 세포, 인간 난소암(ovarian caner)세포, 신암(renal cancer) 세포들이 LHRH수용체를 발현하고 있다는 사실(참조: Fekete, M. et al., Prostate, 14:191(1989); Miler, W.R. et al., Nature, 313:231(1985); Yano, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1701(1994); Sion-Vardi, N. et al., J. Urol., 148:1568(1992))에 착안하고, LHRH와 혈청 RNase 혹은 다른 RNase계통의 독소를 연결시킨 결합체가 종래 독소들의 문제점인 강한 면역원성과 간에 대한 독성의 염려 없이 그리고 성호르몬 의존성 여부에 관계없이, LHRH수용체를 발현하는 각종 암세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있을 것으로 예측하였다.

이에, 본 발명자들은 LHRH-RNase결합체를 제조한 다음, 이 결합체가 LHRH수용체를 발현하는 각종 암세포의 성장은 장기간 저해하나, 이를 발현하지 않는 세포의 성장에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 LHRH수용체를 발현하는 세포의 성장을 저해하는 LHRH-RNase 결합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 LHRH-RNase 결합체를 이용하여, LHRH 수용체를 발현하는 세포의 성장 저해방법을 제공하는 것이다.

[발명의 구성 및 적용]

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 LHRH와 RNase의 호르몬독소를 제조하기 위한 바람직한 일 실시예로서 LHRH와 RNase A를 화학적으로 결합시켰다. 즉, LHRH의 카르복시 종단이 카르복실기를 갖도록 하고, 화학물질을 이용하여 전기 카르복실기를 활성화시킨 다음, 활성화된 카르복실기와 RNase A의 리신 아미노산 곁사슬에 위치한 1차 아민과 반응시켜, 두 물질간의 화학적 결합체 LHRH-RNase A를 제조하였다. 한편, 본 발명의 결합체는 유전자 재조합 기술에 의해 제조될 수도 있다.

상기 LHRH-RNase A 결합체는 LHRH에 의해 암세포 표면에 존재하는 LHRH 수용체와 결합하고, 세포내이입 과정을 통해 RNase A가 세포내로 전달되어 단백질 합성을 억제하여 암세포의 성장을 저해하는 바, LHRH-RNase A 결합체를 LHRH수용체를 발현하는 암세포, 바람직하게는 전립선 암세포 또는 유방 암세포에 처리한 결과, 전기 암세포의 성장이 결합체의 처리농도에 비례하여 저해되는 것으로 나타났으며, 그의 저해능 또한 장시간 지속되었다.

상기에서, RNase A는 상술한 암세포의 RNA를 절단하는 활성을 갖는 효소로서, 본 발명에서는 이 RNase A외에 표적 세포의 종류에 따라, 그 세포의 RNA를 절단할 수 있는 다른 RNase가 사용될 수 있다.

LHRH-RNase A는 LHRH 수용체를 발현하는 세포의 성장을 농도의존적으로 저해하나, 이를 발현하지 않는 세포의 성장에는 영향을 거의 주지 않는 바, LHRH 수용체를 발현하는 세포에만 선택적으로 작용함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 LHRH-RNase A 결합체는 효과적인 항암제 치료제로서 개발될 수 있다. 또한, 본 발명의 결합체에서 유래된 유도체들도 LHRH 수용체를 발현하는 세포의 성장을 선택적으로 억제하는 활성을 나타내는 한, 항암제로서 효과적으로 이용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는 다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1: LHRH와 Rnase A의 호르몬독소 제조]

LHRH는 피로글루탐산(pGlu)을 아미노 종단으로 하고 Gly-NH₂을 카르복시 종단으로 하는 10개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 호르몬(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)으로, 카르복실기를 갖는 아미노산(아스파르트산과 글루탐산)과 1차 아민을 갖는 아미노산(리신)을 갖고 있지 않아, 카르복시 종단에 카르복실기를 갖는 유도체를 사용하였다(Bachem California, USA).

이와 같이 카르복시 종단에 카르복실기를 갖는 LHRH와 EDC[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/HCI, Pierce, USA]를 반응시켜, LHRH의 카르복실기를 활성화시킨 다음, 활성화된 카르복실기와 RNase의 리신 아미노산 곁사슬에 위치한 1차 아민과 반응시켜, 두 물질간의 화학적 결합체 LHRH-RNase A를 제조하였다.

즉, 소췌장 RNase A(Sigma, USA) 2mg과 카르복시 종단에 카르복실기를 갖는 LHRH(Bachem California, USA) 5mg을 0.8ml의 물에 용해시킨후, pH를 7.5로 조절하였다. 어어, 0.2ml의 물에 용해시킨 100mg의 EDC를 가하여 상온에서 2시간 동안 결합반응시키고, 겔여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography, PD 10 column, Pharmacia, USA) 및 물에 대한 투석(dialysis)을 이용하여 미반응의 EDC와 LHRH를 제거한 다음, 적당량씩 분주하여 영하 70℃에 보관하였다.

[실시예 2: LHRH-RNase A의 리보뉴클레아제 활성도 측정]

실시예1에서 제조된 LHRH-RNase A의 리보뉴클라아제 활성도를 본드(Bond)등의 방법으로 측정하였다(참조: Bond, M.D. et al., Anal. Biochem., 173:166(1988)). 즉, 4mg/ml의 효모 tRNA(yeast tRNA, Sigma, USA)와 0.1mg/ml의 인간 혈청 알부민(human serum albumin, Calbiochem, USA)이 포함된 0.1ml의 HEPES 완충용액(33mM NaCl을 포함하는 33mM HEPES/NaOH, pH 7.5)에 여러 농도의 RNase A 또는 120ng의 LHRH-RNase A 결합체를 가하고, 37℃에서 15분간 반응시켰다. 이어, 0.24ml의 3.4% 과염소산(perchloric acid)을 가하여 반응을 종료시키고, 얼음에 10분간 방치한 다음, 4℃에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액의 흡광도를 260nm의 파장에서 측정하였다.

제1도는 RNase A의 양을 변화시켜가면서 리보뉴클레아제 활성도에 대한 검정곡선(standard curve)을 만들고, 이를 이용하여 LHRH-RNase A의 리보뉴클레아제 활성되를 결정한 그래프이다. 제1도에서 보듯이, 120ng의 LHRH-RNase A 결합체에 의한 흡광도 변화는 약 2.6으로, 이는 12ng의 RNase A에 의한 흡광도 변화와 비슷함을 알 수 있는 바, LHRH-RNase A 결합체의 리보뉴클레아제 활성도가 RNase A의 경우보다 10배 정도 낮음을 의미한다. 이로부터, RNase A의 촉매중심부위(catalytic cemter)에 위치한 리신(lysine)이 EDC에 의해 비활성화되었음을 추론할 수 있었다.

[실시예 3: LHRH-RNase A가 LHRH 수용체를 발현하는 인간 전립선 암세포의 성장을 저해하는 능력의 검정]

LHRH-RNase A 결합체가 인간 전립선 암세포의 성장에 미치는 영향을 다음과 같은 실험을 통해 조사하였다. 즉, 인간 전립선 암세포 LNCapFGC 세포(ATCC CRL-1740)1 x 10⁴개를 96공(well) 플레이트(Nunc, USA)에 넣고 이를 동시에 배양시킨 후, 여러 농도의 LHRH-RNase A 결합체가 포함된 배지(RPMI 1640 + 10% 우태아혈청)를 가하였다. 2일 동안 배양한 후, 20㎕ 테트라졸리움 염색약(Cell Titer 96 Non-Radioactive Proliferation assay kit, Promega, USA)을 가하여 37℃에서 4시간 배양하고, 살아있는 세포에 의해 생성된 포마잔 양을 0.2ml의 용해 용액(Promega, USA)에 넣어 용해시키고, 570nm에서 흡광도를 측정하여 살아있는 세포수를 결정하였다(참조: 제2도). 이때, 용해된 포마잔에 의한 흡광도는 살아있는 세포 수에 비례한다.

제2도에서 보듯이, 인간 전립선 암세포의 성장은 LHRH-RNase A에 의해 농도의존적으로 저해되었는데, 약 0.5μM의 농도에서 50%가 저해되었고, 또한 LHRH-RNase A의 전립선 암세포 성장에 대한 억제 정도는 10nM의 LHRH에 의해 감소되었다. 아울러, LHRH와 RNase A 자체는 10μM 농도에서도 전립선 암세포의 성장에 영향을 주지 않았다.

따라서, LHRH-RNase A의 전립선 암세포 성장 억제능력은 LHRH와 RNase A간의 화학적 결합에 의한 것이고, 이 화학적 결합체는 LHRH에 의해 전립선 암세포 표면에 존재하는 LHRH 수용체와 결합하고, 세포내이입 과정을 통해 RNase A가 세포내로 전달되어 단백질 합성을 억제함으로써, 암세포의 성장을 저해하는 것으로 추론할 수 있었다.

[실시예 4: LHRH-RNase A가 LHRH 수용체를 발현하는 인간 유방 암세포의 성장을 저해하는 능력의 검정]

LHRH-RNase A 결합체가 인간 유방 암세포의 성장에 미치는 영향을 인간 유방 암세포 MCF7 세포(ATCC HTB-22) 및 10% 우태아혈청이 포함된 EMEM 배지를 사용하여, 실시예3과 동일한 방법으로 알아보았다(참조:제3도).

제3도에서 보듯이, 인간 유방 암세포의 성장은 LHRH-RNase A에 의해 농도의존적으로 저해되었는데, 약 0.7μM의 농도에서 50%가 저해되었고, 또한 LHRH-RNase A의 유방 암세포 성장에 대한 억제 정도는 10nM의 LHRH에 의해 감소되어 전립선 암의 경우와 비슷한 결과를 나타내었다. 아울러, LHRH와 RNase A 자체는 10μM 농도에서도 유방 암세포의 성장에 영향을 주지 않았다.

따라서, 실시예 3의 결과에서와 마찬가지로, LHRH-RNase A에 의한 유방 암세포의 성장 저해는 이들 암세포 표면에 존재하는 LHRH 수용체를 통해 RNase A가 세포내로 전달됨으로써 나타나는 것으로 추론할 수 있었다.

[실시예 5: LHRH-RNase A가 선택적으로 LHRH 수용체를 발현하는 세포의 성장을 저해하는 능력의 검정]

LHRH-RNase A가 LHRH 수용체를 발현하는 세포의 성장을 선택적으로 저해하는지에 대한 여부를, TM3 마우스 라이디히세포(mouse Leydig cell, ATCC CRL-1714), TM4 마우스 서툴라이세포(mouse Sertoli cell, ATCC CRL-1715) 및 FRTL5 래트 갑상선세포(rat thyroid cell, ATCC CRL-8305)를 사용하여, 실시예 3과 동일한 방법으로 알아보았다(참조: 제4도). 이때, TM3 마우스 라이디히세포 및 TM4 마우스 서톨라이세포의 경우에는 Ham's F 12 배지(Gibco BRL, USA)와 5% 말 혈청 및 5% 우태아혈청이 포함된 DMEM 배지가 1:1(v/v)로 혼합된 배지를 사용하였고, FRTL5 래트 갑상선 세포의 경우에는 5% 송아지 혈청이 포함된 Coon's modified Ham's F 12 배지(Gibco BRL, USA)를 사용하였다.

제4도에서 보듯이, LHRH-RNase A는 실시예3 및 4에서와 같이 LHRH 수용체를 발현하는 TM3 마우스 라이디히세포의 성장을 농도의존적으로 저해하였으나, 이를 발현하지 않는 TM4 마우스 서톨라이세포와 FRTL5 래트 갑상선세포의 성장에는 영향을 거의 주지 않았다.

이상의 실시예 3∼5의 결과로부터, LHRH-RNase A는 LHRH 수용체를 발현하는 세포들의 성장을 선택적으로 저해하는데, 이는 화학적 결합체의 LHRH와 세포 표면에 존재하는 LHRH 수용체간의 결합을 통해 RNase A가 세포내로 전달됨으로써, 이들 세포의 성장을 저해하기 때문임을 알 수 있었다.

[실시예 6: LHRH-RNase A의 인간 전립선 암세포와 유방 암세포의 성장에 대한 저해능력의 지속성 검정]

LHRH-RNase A의 인간 전립선 암세포와 유방 암세포의 성장에 대한 저해 능력의 지속성을 알아보기 의해 다음과 같은 실험을 실시하였다. 즉, 10³개의 LNCapFGC 인간 전립선 암세포(ATCC CRL01740)와 MCF7 유방 암세포(ATCC HTB-22)를 96 공 플레이트에 넣고 이틀 동안 배양시킨 다음, 1μM농도의 LHRH-RNase A가 포함된 배지에서 각각 2일, 5일 및 9일 동안 배양한 후에 살아 있는 세포수를 실시예 3과 동일한 방법으로 산정하였다(참조: 제5도).

제5도에서 보듯이, LHRH-RNase A는 인간 전립선 암세포와 유방 암세포의 성장을 9일 동안 지속적으로 저해하여, LHRH-RNase A의 활성도가 장기간 유지되고 있음을 알 수 있었다.

[발명의 효과]

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 LHRH-RNase 결합체는 LHRH 수용체를 발현하는 암세포에만 선택적으로 작용하여 그의 성장을 억제시키고, 그 억제능 또한 장시간 지속되는 바, 전기 암세포의 치료제로서 효과적으로 이용될 수 있을 것이다.

Claims

황체형성호르몬 방출호르몬(luteinizing hormome releasing hormome) 수용체를 발현하는 세포의 성장을 저해하는, 황체형성호르몬 방출호르몬과 리보뉴클레아제(RNase)의 결합체(conjugate).
제1항에 있어서, 세포는 전립선암, 유방암, 난소암 또는 신암(renal cancer)세포인 것을 특징으로 하는 결합체.
제1항에 있어서, 항체형성호르몬 방출호르몬의 카르복시 종단에 있는 카르복실기와 리보뉴클레아제의 리신 아미노산 곁사슬에 위치한 1차 아민과의 펩티드 결합에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 결합체.
제1항 또는 제3항에 있어서, 리보뉴클레아제는 황체형성호르몬 방출호르몬 수용체를 발현하는 세포의 RNA를 절단하는 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 결합체.
제1항에 있어서, 황체형성호르몬 방출호르몬과 리보뉴클레아제가 화학적으로 연결되어 제조되는 것을 특징으로 하는 결합체.
제1항의 결합체를 황체형성호르몬 방출호르몬의 수용체를 발현하는 인간을 제외한 포유동물의 세포에 주입하는 단계를 포함하는 전기 세포의 성장 저해방법.