KR100252591B1 - 주목나무로부터 택솔의 분리 및 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 주목나무로부터 택솔을 분리 및 정제하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 택솔의 분리 및 정제 방법은 주목나무로부터 유기용매를 사용하여 택솔의 추출물을 얻는 단계(단계 1); 단계 1의 추출물에 대하여 첫 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 94~100 : 0~6 (부피%)의 혼합 용매, 두 번째 이동상으로 염화 메틸렌 : 아세톤 = 70~90 : 10~30 (부피%)의 혼합 용매를 사용하는 크로마토그래피법으로 불순물을 제거하는 전처리 과정을 거쳐 활성분획을 얻는 단계 (단계 2); 및 단계 2의 활성분획을 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하는 단계 (단계 3)로 이루어지며, 본 발명의 방법에 의해 주목나무로부터 고순도의 택솔을 고수율로 얻을 수 있다.

Description

주목나무로부터 택솔의 분리 및 정제 방법 {Method for separation and purification of taxol from Taxus sp.}

본 발명은 주목나무로부터 택솔을 분리 및 정제하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명에 의한 택솔의 분리 및 정제 방법은 주목나무로부터 유기용매를 사용하여 택솔의 추출물을 얻는 단계 (단계 1); 단계 1의 추출물에 대하여 첫 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 94~100 : 0~6 (부피%)의 혼합 용매, 두 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 70~90 : 10~30 (부피%)의 혼합 용매를 사용하는 크로마토그래피법으로 불순물을 제거하는 전처리 단계를 거쳐 활성분획을 얻는 단계 (단계 2); 및 단계 2의 활성분획을 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하는 단계 (단계 3)로 이루어진다.

택솔 (taxol, 일명 페클리탁셀)은 백혈병의 치료제로서 탁월한 성능을 가지고 있을 뿐만 아니라, 자궁암, 유방암, 후두암 및 불치성 말라리아에 대해서도 효과가 있음이 임상학적 실험을 통해 입증되었다. 그러나 택솔은 매우 고가의 물질이기 때문에, 실험용 또는 치료용으로 널리 사용되기에는 큰 제한이 따르고 있다. 현재 택솔의 표준물질은 주로 미국의 NCI(National Cancer Institute)나 하우저 화학회사 (Hauser Chemical Reasrch Inc.)에서 제공되고 있는데, 1kg당 약 ＄1,200,000 정도로 가격이 매우 비싸며, 혼합물에 포함된 전구체의 가격도 이와 비슷하다. 따라서 저비용으로 택솔을 얻는 방법을 개발하는 것은 매우 중요하다.

한편 택솔은 주로 주목나무로부터 분리하여 얻어지는데, 택솔의 분리 방법을 산업용 규모의 공정에 실제 적용할 수 있기 위해서는 완제품 형태의 시료 혼합물뿐만 아니라 주목나무로부터 직접 얻어낸 추출액이나 주목류의 잎에서 얻은 균주를 배양한 배양액을 시료로 하여 고성능 액체 크로마토그래피에서 분리하는 실험도 수행되어야 한다. 또한 크로마토그래피법에 의한 택솔의 분리 공정을 실제 산업 공정에 적용하기 위해서는, 단순히 분석용 장치에 의한 분리에만 그칠 것이 아니라 그 결과를 제조용 장치에 적용할 필요가 있다.

현재까지 주목나무로부터 택솔을 추출 및 정제하는 여러 가지 방법이 제시되었다. 예를 들어, 유럽 특허 0700910A1에서는 택서스 수마트라나(Taxus sumatrana) 잎에서 택솔을 분리하였는데, 이 방법에서는 다단계의 추출 및 분배 과정이 반복되고 그 때마다 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하기 때문에, 많은 양의 용매와 칼럼의 충진물질이 필요한 단점이 있다.

대한민국 특허 공개번호 96-37670에서는 주목나무의 잎, 껍질에서 또는 조직세포를 배양한 식물 세포의 케이크상 시료로부터 택솔을 분리하였는데, 다단계의 분배 및 추출 과정이 포함되고 원심분리 과정이 포함되기 때문에 분리과정 복잡하고 손이 많이 가는 단점이 있다. 또한 정제 과정에서 역상-고성능 액체 크로마토그래피를 사용하는데, 충진물질이 고가이기 때문에 비경제적이다.

미국 특허 5279949에서는 관상용 주목나무의 배양액에서 택솔을 분리하는데, 원심분리기로 분리하는 과정 및 다단계의 역상-고성능 액체 크로마토그래피로 분리하는 과정이 포함되기 때문에, 많은 양의 용매와 칼럼의 충진물질이 필요하여 비경제적이다.

국제 특허 공개번호 WO 94/12268에서는 주목나무로부터 반투과막과 역삼투압장치를 이용하여 택솔을 분리하고 있다. 그러나 이들 장치에 드는 비용이 너무 비싸서 실용화되기에는 한계가 있다.

국제 특허 공개번호 WO 92/0784에서는 다단계의 추출 공정으로 주목나무로부터 택솔을 추출하고, 이것을 역상-고성능 액체 크로마토그래피를 이용해 분리 및 정제하는 방법을 제시하고 있으며, 국제 특허 공개번호 WO 94/13827에서는 주목나무에서 택솔을 분리하는데, 구체적으로 다단계의 추출 공정을 거친 후 활성탄 또는 숯을 이용해서 정제하고 최종적으로 정상-고성능 액체 크로마토그래피로 분리 및 정제하고 있다. 그러나 상기의 방법들은 복잡한 단계와 비경제성 및 낮은 수율의 문제점을 가지고 있다.

이와 같이 지금까지 주목나무로부터 택솔을 추출하기 위한 여러 가지 방법이 제시되었으나, 단계가 너무 길고 복잡하여 비경제적이었다. 특히 무엇보다도 최종적으로 얻은 택솔의 수율 및 순도가 낮다는 단점이 있었다.

이에 본 발명자들은 주목나무로부터 탁솔을 분리하는데 있어 복잡한 공정과 이로 인한 높은 비용 및 낮은 수율과 순도와 같은 문제점을 해결하기 위해 노력한 결과, 유기용매로 추출한 주목나무 추출물을 전처리하여 지질, 엽록소, 기타 색소 등의 불순물을 제거함에 있어 첫 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 94~100 : 0~6 (부피%)의 혼합 용매, 두 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 70~90 : 10~30 (부피%)의 혼합 용매를 사용하는 크로마토그래피를 통해 불순물제거의 효율을 높일 수 있음을 알아내고, 아울러 이후의 액체 크로마토그래피에서 바람직한 이동상 용매 및 그 조성비를 찾아냄으로써 간단한 정제과정을 거쳐 고순도의 택솔을 고수율로 분리 및 정제할 수 있다는 것을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 주목나무로부터 고순도의 택솔을 고수율로 얻은 방법을 제공하는 것이다.

제1도는 주목나무로부터 유기용매를 사용하여 택솔을 추출하는 공정을 나타낸 것이고,

제2도는 주목나무 추출물을 크로마토그래피로 분리하는데 있어, 첫 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 97 : 3 (부피%)을, 두 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 80 : 20 (부피%)를 사용했을 때 얻어진 4번째 층과 5번째 층의 분획을 각각 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하여 나타낸 크로마토그램이고,

제3도는 표준시료 (택솔, 세팔로마닌, 10-디아세틸택솔)를 일정용매 조성법에서 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하는데 있어, 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 90 : 4 : 6 (부피%)의 혼합 용매를 사용하여 얻은 크로마토그램이고,

제4도는 표준시료 (택솔, 세팔로마닌, 10-디아세틸택솔)를 구배용매 조성법에서 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하는데 있어, 첫 번째 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 86 : 4 : 10 (부피%)의 혼합 용매를, 두 번째 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 92 : 2 : 6 (부피%)의 혼합 용매를 사용하여 얻은 크로마토그램이고,

제5도는 전처리 단계를 거친 주목나무 추출물을 일정용매 조성법에서 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 90 : 4 : 6 (부피%)의 혼합 용매를 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피로 분리 및 정제하는데 있어, 택솔 시료의 주입량을 변화시켜 가며 얻은 크로마토그램이고,

제6도는 전처리 단계를 거친 주목나무 추출물을 구배용매 조성법에서 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하는데 있어, 첫 번째 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 86 : 4 : 10 (부피%)의 혼합 용매를, 두 번째 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 92 : 2 : 6 (부피%)의 혼합 용매를 사용하여 얻은 크로마토그램이고,

제7도는 전처리 단계를 거친 주목나무 추출물을 일정용매 조성법에서 제조용칼럼으로 분리 및 정제하는데 있어, 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 88 : 4 : 8 (부피%)의 혼합 용매를 사용하여 분리하고 다시 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 90 : 4 : 6 (부피%)의 혼합 용매를 사용하여 재분리하여 얻은 크로마토그램이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는

1) 주목나무로부터 유기용매를 사용하여 택솔의 추출물을 얻는 단계 (단계 1);

2) 단계 1의 추출물에 대하여 첫 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤= 94~100 : 0~6 (부피%)의 혼합 용매, 두 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤= 70~90 : 10~30 (부피%)의 혼합 용매를 사용하는 크로마토그래피법으로 불순물을 제거하는 전처리 단계를 거쳐 활성분획을 얻는 단계 (단계 2); 및

3) 단계 2의 활성분획을 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하는 단계 (단계 3)로 구성되는 주목나무로부터 택솔의 분리 및 정제 방법을 제공한다.

이 때, 단계 2에서 첫 번째 이동상은 주입된 시료가 칼럼에 완전히 전개될 때까지 흘려준 뒤 두 번째 이동상으로 교체하는 것이 바람직하다.

또한 단계 3의 고성능 액체 크로마토그래피에서 일정용매 조성법의 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 87~93 : 1~7 : 3~9 (부피%)의 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하다.

또한 단계 3의 고성능 액체 크로마토그래피에서 구배용매 조성법의 첫 번째 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 83~89 : 1~7 : 7~13 (부피%)의 혼합 용매, 두 번째 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 89~95 : 0~5 : 3~9 (부피%)의 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하다.

또한 고성능 액체 크로마토그래피에 있어서, 유속은 0.5~2.0 ㎖/min이고, 첫 번째 이동상을 10~20분 동안 주입시킨 후 두 번째 이동상을 주입시키는 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 1의 추출 과정은 구체적으로 주목나무 분말에서 메탄올을 사용하여 메탄올에 용해되는 부분을 추출하고; 상기 추출물을 클로로포름과 물을 사용한 분배법으로 유기층을 분리한 다음; 분리된 유기층을 농축시키고 건조시키는 단계로 구성된다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

우선 완전히 건조된 주목나무 분말을 메탄올로 추출하여 메탄올에 용해되는 부분을 추출한다. 그리고 이 추출액에서 왁스, 지질 (lipid), 클로로필 (chlorophyl), 염료 (pigment), 스테로이드 등의 불순물을 제거하기 위해, 메탄올 추출액을 클로로포름과 물로 여러 번 추출하여 유기층만을 분리하고 용매를 증발시켜 시료를 농축시키고 건조시킨다. 이렇게 얻어진 택솔 추출물은 이후의 분리공정을 위해 메탄올을 가하여 메탄올 용액으로 제조한다.

다음으로 메탄올 추출물에 여전히 존재하는 지질, 클로로필, 염료 등의 불순물을 제거하기 위한 전처리 단계를 실시하는데, 전처리 단계 최적의 조건으로서 칼럼 크로마토그래피 상의 이동상 용매의 종류와 조성비를 결정한다. 구체적으로 헥산, 염화메틸렌, 클로로포름, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 1-프로판올 또는 이들의 혼합용액을 이동상으로 사용한다.

우선 이동상으로서 가장 적합한 용매의 종류를 결정하기 위하여, 단일 용매 또는 혼합 용매를 사용하여 조합할 수 있는 모든 경우에 대하여 각각 실험을 실시하였다. 혼합 용매의 경우, 극성이 낮은 헥산, 염화메틸렌, 클로로포름을 주성분으로 하고 극성이 높은 아세톤, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 1-프로판올을 부가성분으로 하였다. 또한 이동상을 시간 별로 바꾸어 가며 사용한 경우, 첫 번째 이동상은 주입된 시료가 칼럼에 완전히 전개될 때까지 흘려준 뒤, 바로 두 번째 이동상으로 교체하고, 택솔이 포함된 색깔층을 분취한 뒤에는 메탄올을 세 번째 이동상으로서 교체하였다.

그 결과, 가장 적합한 이동상 용매는 염화메틸렌과 아세톤의 혼합 용매인 것으로 나타났으며, 이 때 7개의 층이 나타나는데 4번째 층에서 택솔이 확인되었고 5번째 층에서도 미량의 택솔이 확인되었다. 이 경우 각 층의 구분이 뚜렷하고 용출속도도 빠르다. 더욱이 이렇게 분리된 택솔은 순도가 높아 불순물 제거 효과가 가장 우수하다. 따라서 이 혼합 용매의 가장 적합한 조성비를 결정하기 위하여, 가능한 조합의 모든 경우에 대하여 첫 번째 이동상과 두 번째 이동상의 조성비를 바꾸어가며 실험하였다.

그 결과, 첫 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 94~100 : 0~6 (부피%)의 혼합 용매, 두 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 70~90 : 10~30 (부피%)의 혼합 용매를 사용한 경우에 각 층의 구분이 가장 선명하고 불순물 제거 효과가 우수하며 용출속도도 빠르게 나타났다.

염화메틸렌은 극성 지수가 3.1이고 아세톤은 5.1으로, 염화메틸렌의 함량이 많아지면 이동상의 극성은 작아지면서 용출속도는 느려지지만 층의 구분은 명확해진다. 반면 아세톤의 함량이 많아지면 이동상의 극성은 커지면서 용출속도가 빨라지지만 층의 구분은 불명확해진다. 따라서 염화메틸렌과 아세톤의 함량을 적절히 변화시키는 것에 의해 최적의 분리조건을 얻을 수 있다. 구체적으로 염화메틸렌에 의해 추출액 속의 물질과 칼럼 내의 충질물질 사이의 흡착, 탈착 속도가 조절되어 층의 구분이 명확해지고, 아세톤에 의해 용출속도가 빨라지게 된다.

다음으로 전처리 단계를 거친 택솔 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography)로 분리하기 위해, 최적의 실험 조건을 결정한다. 구체적으로 이동상으로 헥산, 1-프로판올, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올의 용매를 2성분계 또는 3성분계로 만들어 각각의 조성을 바꾸어 가며, 표준시료로 물리적 특성이 비슷한 택솔, 세팔로마닌, 10-디아세틸택솔을 사용하여 분리 양상을 조사한다.

그 결과, 일정용매 조성법으로 고성능 액체 크로마토그래피를 실시한 경우에는 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 87~93 : 1~7 : 3~9(부피%)인 혼합 용매에서 가장 좋은 분리도가 얻어졌다. 또한 구배용매 조성법으로 고성능 액체 크로마토그래피를 실시한 경우에는 첫 번째 이동상과 두 번째 이동상으로서 각각 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 83~89 : 1~7 : 7~13(부피%)의 혼합 용매와 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 89~95 : 0~5 : 3~9 (부피%)의 혼합 용매를 사용했을 때 가장 좋은 분리도가 얻어진다. 특히 첫 번째 이동상을 10~20분 흘려준 후 두 번째 이동상으로 교체하였을 때 분리도가 가장 좋다.

상기와 같이 결정된 메탄올에 의한 택솔의 추출, 전처리 단계 및 고성능 액체 크로마토그래피의 최적의 실험 조건을 실제 주목나무에 적용하여 택솔을 분리하는데, 고성능 액체 크로마토그래피에서 일정용매 조성법으로 실시한 결과 주목나무로부터의 택솔의 수율은 0.0063%였으며 순도는 99.2%였다.

반면, 최초의 추출에서 메탄올 대신에 에탄올을, 클로로포름 대신에 염화메틸렌을 사용하여 택솔을 추출한 경우, 고성능 액체 크로마토그래피를 거치고 최종적으로 얻은 택솔의 수율은 0.0022%로서 메탄올을 사용한 것보다 낮다.

한편, 본 발명의 방법에 의해 분리할 수 있는 최대 택솔량을 알아보기 위하여, 고성능 액체 크로마토그래피에서 주입되는 택솔 시료의 양을 변화시켜 가며 실험을 실시한 결과, 본 발명의 방법에 의해 주목나무로부터 택솔을 효과적으로 분리하기 위해서는 한 번에 주입되는 시료의 양이 택솔 기준으로 약 2.6㎍을 넘으면 안된다는 것을 알 수 있다.

또한 상기와 같이 결정된 메탄올에 의한 택솔의 추출, 전처리 단계 및 고성능 액체 크로마토그래피의 최적의 실험 조건을 실제 주목나무로부터 택솔을 분리하였다.

또한 상기 분석용 고성능 액체 크로마토그래피로 결정된 택솔의 분리 조건을, 제조용 칼럼에 적용하여 주목나무로부터 택솔을 분리한다. 이 때, 전처리 단계를 거친 시료를 주입한 후, 첫 번째 이동상으로서 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 87~93 : 1~7 : 3~9 (부피%)의 혼합 용매를 주입한다. 그리고 35~100분 사이에 나오는 용액을 모아 회전식 증발기에서 농축시키고, 이 농축액을 다시 칼럼에 주입하고 두 번째 이동상으로서 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 87~93 : 1~7 : 3~9 (부피%)의 혼합 용매를 주입한다. 그 결과, 이 방법에 의한 주목나무로부터의 택솔의 수율은 0.0063%였고, 순도는 99.2%였다.

이와 같이, 본 발명의 방법에 의하면 단순한 과정에 의해 순도가 높은 택솔을 고수율로 얻을 수 있어, 복잡한 단계로 높은 비용을 발생시키며 수율이 낮았던 종래의 방법보다 본 발명의 방법이 우수함을 알 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[주목나무로부터 택솔의 추출]

완전히 건조된 주목나무 분말 (임목육종연구소에서 제공됨) 10.0g을 메탄올 1ℓ에 24시간 두어 메탄올에 용해되는 부분을 추출하였다. 이 추출액에서 왁스, 지질, 클로로필, 염료, 스테로이드 등의 불순물을 제거하기 위해, 추출액 125㎖를 클로로포름 100㎖, 물 100㎖와 혼합하여 30분 동안 교반한 후, 분별깔대기에서 10시간 이상 침강시켰다. 이 공정을 두 번 이상 반복하고, 분별깔대기의 아래층 100㎖를 분리하였다. 분리된 유기층은 회전식 증발기 (rotary evaporator)로 용매인 클로로포름을 증발시켜 시료를 농축시키고 감압식 오븐에서 24시간 동안 건조시켰다. 이렇게 얻어진 택솔 추출물은 최종적으로 10㎎의 시럽 형태로 얻어졌으며, 다음 실험을 위하여 여기에 메탄올 100ml를 가하여, 0.1㎎/㎖ 농도로 만들었다 (제1도 참조).

또한, 메탄올 대신에 에탄올을 사용하고 클로로포름 대신에 염화메틸렌을 사용한 것을 제외하고 나머지는 상기와 똑같은 방법으로 주목나무 분말로부터 택솔을 추출하였다.

[실시예 2]

[주목나무 추출물의 전처리 단계의 이동상 용매 결정]

주목나무 추출물에 포함된 불순물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 제거하기 위한 최적의 전처리 조건으로서, 이동상 용매의 종류와 조성비를 하기와 같이 결정하였다.

헥산, 염화메틸렌, 클로로포름, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 1-프로판올 또는 이들의 혼합용액을 이동상으로 사용하였다. 유리 칼럼의 충진물로는 YMC-GEL silica 60 (10/40㎛) (YMC Co. 일본)을 사용하였다. 이동상을 시간별로 바꾸어 가며 사용한 경우, 첫 번째 이동상은 주입된 시료가 칼럼에 완전히 전개될 때까지 흘려주었고 그 뒤에 바로 두 번째 이동상으로 교체하였다. 택솔이 포함된 색깔층을 분취한 뒤에는 메탄올을 세 번째 이동상으로서 교체하였다.

한편 각각 다른 이동상을 사용하여 용출된 용출액은 색깔층별로 분취하여 크로마토그래피에서 택솔 존재 여부를 확인하였다. 이 때, 칼럼은 Lichorospher Si 60 (15㎛) (Merck Co. 독일)을 충진시켜 사용하였고, 이동상으로는 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 90 : 4 : 6의 혼합 용매를 사용하였다. 시료의 주입량은 25㎕, 유속은 1.5㎖/min으로 고정하였고, 228㎚에서의 흡광도를 측정하여 용출물질의 검출하였다.

[(2-1) 이동상 용매의 구성성분 결정]

우선 이동상으로서 가장 적합한 용매의 종류를 결정하기 위하여, 단일 용매 또는 혼합 용매를 사용하여 조합할 수 있는 모든 경우에 대하여 각각 실험을 실시하였다. 혼합 용매의 경우, 극성이 낮은 헥산, 염화메틸렌, 클로로포름을 주성분으로 하고 극성이 높은 아세톤, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 1-프로판올을 부가성분으로 하였다. 그 중 대표적인 이동상 용매의 종류 및 조성비를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

[이동상 용매의 종류 결정]

첫 번째 및 두 번째 이동상으로 메탄올을 사용한 경우, 4개의 색깔층이 나타났으며 이 중 4번째 층에서 택솔을 확인할 수 있었으며, 3번째 층에서도 미량의 택솔이 용출되었다. 그러나 각각의 층의 구분이 명확하지 않았기 때문에 분리에 적합하지 않은 것으로 판단되었다.

첫 번째 및 두 번째 이동상으로 클로로포름을 사용한 경우에는 충진물질과의 상호작용 때문에 용출 속도가 너무 느려서 택솔의 분리방법을 상업적으로 이용하기에는 비효율적이었다.

1-프로판올과 이소프로판올을 사용한 경우에는 용매의 점도가 크기 때문에 용출 속도가 지나치게 느렸다. 또한 용매의 끓는점이 높아서 용출액을 농축하기 위한 온도가 높아지므로 전처리 용매로는 부적당한 것으로 판단되었다.

염화메틸렌과 메탄올, 에탄올과 아세톤 또는 에탄올과 메탄올의 혼합 용매를 이동상으로 사용한 경우, 모두 첫 번째 층에서 택솔이 확인되었다. 그러나 분리된 택솔의 순도가 낮아 전처리 단계에서 요구되는 불순물 제거 효과는 미비하였으므로, 이들 혼합 용매는 전처리 단계에서 사용하기에는 부적합한 것으로 판단되었다.

헥산과 에탄올 또는 헥산과 아세톤의 혼합 용매를 이동상으로 사용한 경우, 헥산과 에탄올의 혼합 용매에서는 4번째 층에서, 헥산과 아세톤의 혼합 용매는 3번째 층에서 택솔이 확인되었으며 층의 구분도 뚜렷하였다. 그러나 이 경우에도 분리된 택솔의 순도가 낮았기 때문에 이들 혼합 용매는 전처리 단계에서 사용하기에는 부적합한 것으로 판단되었다.

반면 염화메틸렌과 아세톤의 혼합 용매를 이동상으로 사용했을 때에는 7개의 층이 나타났는데, 이 때 4번째 층에서 택솔이 확인되었으며 5번째 층에서도 미량의 택솔이 확인되었다. 이 경우 각 층의 구분이 뚜렷하였고 용출속도도 빨랐다. 더욱이 분리된 택솔의 순도가 높아 불순물 제거 효과가 가장 우수했기 때문에, 이 혼합 용매는 전처리 단계에서 사용하기에 가장 적합한 것으로 판단되었다.

[(2-2) 이동상 용매의 조성비 결정]

실시예 (2-1)에서 가장 적합한 이동상 용매로 결정된 염화메틸렌과 아세톤 혼합 용매의 최적의 조성비를 결정하기 위하여, 가능한 조합의 모든 경우에 대하여 첫 번째 이동상과 두 번째 이동상의 조성비를 바꾸어가며 실험하였다. 그 중 대표적인 예를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

[이동상 용매의 조성비 결정]

실험 결과, 첫 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 94~100 : 0~6 (부피%)의 혼합 용매, 두 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 70~90 : 10~30 (부피%)의 혼합 용매를 사용한 경우에 각 층의 구분이 가장 선명했고 불순물 제거 효과가 우수했으며 용출속도도 빨랐다 (예, 표 2의 2번 조성).

[실시예 3]

[주목나무 추출물의 고성능 액체 크로마토그래피 단계의 이동상 결정]

실시예 2에서 결정된 이동상의 용매를 사용한 전처리 단계를 통해 불순물이 제거된 주목나무 추출물로부터, 고성능 액체 크로마토그래피로 택솔을 분리하기 위한 가장 적합한 분리조건을 하기와 같이 결정하였다.

칼럼은 내경이 3.9㎜, 길이 300㎜인 것을 사용하고, 충진제로는 Lichrospher Si 60 (15㎛)을 사용하여 상기 칼럼에 2.13g을 충진시켰다. 이동상으로는 헥산, 1-프로판올, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올의 용매를 2성분계 또는 3성분계로 만들어 각각의 조성을 바꾸어 가며 분리 양상을 조사하였다. 이동상의 유속은 1.5㎖/min으로 하였고, 228㎚에서의 흡광도를 측정하여 용출물질을 검출하였다. 표준시료로는 물리적 특성이 비슷한 택솔, 세팔로마닌, 10-디아세틸택솔을 사용하였으며, 각각의 화합물에 대해 0.033㎎/㎖의 농도로 표준시료를 만들어 각각 25㎕씩 주입하였다.

[(3-1) 일정용매 조성법]

일정용매 조성법으로 고성능 액체 크로마토그래피를 실시한 경우에는 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 87~93 : 1~7 : 3~9 (부피%)인 혼합 용매에서 가장 좋은 분리도를 얻을 수 있었다. 제3도는 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 90 : 4 : 6 (부피%)의 혼합 용매를 사용하여 일정용매 조성법으로 표준시료 혼합물로부터 택솔을 분리한 크로마토그램을 보여주고 있다.

[(3-2) 구배용매 조성법]

구배용매 조성법으로 고성능 액체 크로마토그래피를 실시한 경우에는 첫 번째 이동상과 두 번째 이동상으로서 각각 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 83~89 : 1~7 : 7~13 (부피%)의 혼합 용매와 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 89~95 : 0~5 : 3~9 (부피%)의 혼합 용매를 사용했을 때 가장 좋은 분리도를 얻을 수 있었다. 특히 첫 번째 이동상을 10~20분 흘려준 후 두 번째 이동상으로 교체하였을 때 분리도가 가장 좋았다. 제4도는 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 83~89 : 1~7 : 7~13 (부피%)의 혼합 용매를 17분간 흘려준 후 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 89~95 : 0~5 : 3~9 (부피%)의 혼합 용매로 교체했을 때의 표준시료 혼합물로부터 택솔을 분리한 크로마토그램을 보여주고 있다.

[실시예 4]

[일정용매 조성법에 의한 택솔의 분리]

실제 주목나무로부터 하기와 같은 방법에 의해 택솔을 분리하였다.

우선 실시예 1의 방법에 의해 주목나무로 2.5g으로부터 메탄올 250㎖로 택솔을 추출하고, 이 추출액 250㎖를 클로로포름 250㎖와 물 250㎖를 사용하여 분배하여 클로로포름에 녹는 유기층만을 분리하였다. 분리된 유기층은 회전식 증발기로 용매인 클로로포름을 증발시켜 시료를 농축시키고 진공 오븐에서 약 24시간동안 건조시켰다. 이렇게 0.347g의 시럽을 얻어 메탄올 34.7㎖를 첨가하였다.

이 시료는 실시예 2의 방법에 의한 전처리 단계를 거쳐 추출물 내의 불순물을 제거하였다. 즉, 첫 번재 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 97 : 3, 두 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 75 : 25의 혼합 용매, 세 번째 이동상으로 메탄올을 사용하여 크로마토그래피법으로 택솔이 포함된 활성분획을 분리하였다. 이 때 세 번째 층에서 분리된 분획은 회전식 증발기에서 용매를 증발시켜 0.069g의 농축액을 얻었고, 여기에 염화메틸렌 34.7㎖를 첨가하여 고성능 액체 크로마토그래피에 사용하기 위한 시료를 만들었다.

이렇게 제조된 시료 50㎕를 주입하여 실시예 (3-1)에서와 같은 방법에 의해 고성능 액체 크로마토그래피를 실시하여 택솔을 분리하였다. 구체적으로 칼럼은 내경이 3.9㎜, 길이 300㎜인 것을 사용하고, 충진제로는 Lichrospher Si 60 (15㎛)을 사용하여 칼럼에 2.13g을 충진시켰다. 이동상 용매로는 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 90 : 4 : 6 (부피%)의 혼합 용매를 사용하였으며, 이동상의 유속은 1.5㎖/min으로 하였다.

그 결과 얻어진 크로마토그램에서 택솔의 피크 면적 (peak area)를 구하여, 이로부터 수학식 1의 식을 사용하여 택솔의 수율을 계산하였다.

[수학식 1]

택솔의 무게(㎍)=1.9183x10^-6x(피크 면적(mVㆍmin))-0.20105

이 때, 수학식 1은 0.1㎎/㎖의 택솔 표준시료를 각각 15, 30, 50㎕를 주입하여 얻은 크로마토그램으로부터 피크 면적을 측정하여 얻은 것이다 (표 3 참조).

[표 3]

상기 수학식 1에 의하면 추출액 50㎕에 포함된 택솔의 양은 0.227㎍인 것으로 계산되었다. 따라서 전체 주목나무 분말 2.5g으로부터 0.16㎎의 택솔을 분리해낸 것이므로, 이 방법에 의한 주목나무로부터의 택솔의 수율은 0.0063%로 계산되었다.

한편, 실시예 1에서 메탄올 대신에 에탄올을, 클로로포름 대신에 염화메틸렌을 사용하여 택솔을 추출하고, 전처리 단계에서 세 번째 이동상으로 메탄올 대신에 에탄올을 사용한 것을 제외하고 나머지는 상기 방법과 똑같이 하여 택솔을 분리하였다. 이 때 고성능 액체 크로마토그래피를 거치고 최종적으로 얻은 택솔은 전체 주목나무 분말 2.5g을 사용한 것에 대하여 수율이 0.0022%로서 메탄올을 사용한 것보다 낮았다.

[실시예 5]

[일정용매 조성법에 의한 택솔의 분리 - 주입량 결정]

본 발명의 방법에 의해 한번에 분리할 수 있는 최대 택솔량을 알아보기 위하여, 고성능 액체 크로마토그래피에서 주입되는 택솔 시료의 양을 변화시켜가며 실험을 실시하였다.

실시예 1의 방법에 의해 주목나무 분말 28.48g으로부터 택솔을 추출하고, 실시예 2의 방법에 의한 전처리 단계를 거쳐 추출물 내의 불순물을 제거하였다. 즉, 첫 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 97 : 3, 두 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 75 : 25의 혼합 용매, 세 번째 이동상으로 메탄올을 사용하여 크로마토그래피법으로 택솔이 포함된 활성분획을 분리하였다. 이 때 세 번째 층에서 분리된 분획은 회전식 증발기에서 용매를 증발시켜 3.95g의 농축액을 얻었고, 여기에 염화메틸렌 34.7㎖를 첨가하여 고성능 액체 크로마토그래피에 사용하기 위한 시료를 만들었다.

고성능 액체 크로마토그래피의 구체적인 실험 조건은 실시예 4에서 사용한 것과 같다. 시료는 각각 25, 50, 75, 100㎕씩 주입하여 그 분리 양상을 비교하였다 (제5도 참조). 그 결과, 택솔의 분리가 가능한 최대의 주입량은 약 50㎕로 나타났으며, 이를 택솔의 양으로 보면 2.58㎍이다. 따라서 본 발명의 방법에 의해 주목나무로부터 택솔을 효과적으로 분리하기 위해서는, 한 번에 주입되는 시료의 양이 택솔 기준으로 약 2.6㎍을 넘으면 안된다는 것을 알 수 있다.

[실시예 6]

[구배용매 조성법에 의한 택솔의 분리]

주목나무 분말로부터 택솔의 추출 및 전처리 단계의 과정은 실시예 4에서와 같은 방법에 의해 실시하였다.

이렇게 제조된 시료를 각각 25, 50, 80㎕씩 주입하여 실시예 (3-2)에서와 같은 방법에 의해 고성능 액체 크로마토그래피를 실시하여 택솔을 분리하였다. 구체적으로 칼럼은 내경이 3.9㎜, 길이 300㎜인 것을 사용하고, 충진제로는 Lichrospher Si 60 (15㎛)을 사용하여 칼럼에 2.13g을 충진시켰다. 첫 번째 이동상과 두 번째 이동상으로는 각각 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 86 : 4 : 10 (부피%)의 혼합 용매와 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 92 : 2 : 6 (부피%)의 혼합용맹을 사용하였다. 이 때, 첫 번째 이동상을 17분 주입시킨 뒤, 두 번째 이동상으로 교체하였다. 그리고 이동상의 유속은 1.5㎖/min으로 하였다.

수학식 1에 의해 추출액 50㎕에 포함된 택솔의 양을 계산한 결과, 택솔은 3.0㎍ 포함된 것으로 나타났다. 따라서 전체 주목나무 분말 2.5g으로부터 0.16㎎의 택솔을 분리해낸 것이므로, 이 방법에 의한 주목나무로부터의 택솔의 수율은 0.0063%로 계산되었다.

[실시예 7]

[제조용 칼럼에서 택솔의 분리]

실시예 1~6에서 분석용 방법으로 결정된 택솔의 분리 조건을, 제조용 칼럼에 적용하여 주목나무로부터 택솔을 분리하였다.

주목나무 분말로부터 택솔의 추출 및 전처리 단계의 과정은 실시예 4에서와 같은 방법에 의해 실시하였다. 이 때 전체 주목나무 분말 12.84g으로부터 추출과정과 전처리 과정을 거쳐 0.36g의 시료를 얻었고, 여기에 5㎖의 염화메틸렌을 첨가하였다.

이렇게 제조된 시료는 주입량을 각각 50㎕에서 5㎖까지 변화시켜가며 실험하였다. 칼럼은 내경이 10㎜, 길이 250㎜인 것을 사용하고, 충진제로는 Lichrospher Si 60 (15㎛)을 사용하여 칼럼에 10.9g을 충진시켰다. 이동상의 유속은 8㎖/min으로 하였다.

우선 시료를 주입한 후, 첫 번째 이동상으로서 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 88 : 4 : 8 (부피%)의 혼합 용매를 주입하였다. 그리고 35~100분 사이에 나오는 용액을 모아 회전식 증발기에서 농축시켰다. 이 농축액 5㎖를 다시 칼럼에 주입하고 두 번째 이동상으로서 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 90 : 4 : 6 (부피%)의 혼합 용매를 주입하였다. 제7도는 시료 10㎕를 주입했을 때 얻어진 크로마토그램을 나타낸 것이다.

한편, 10㎕의 시료를 주입하여 얻어진 택솔의 양은 0.81㎎이었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에서는 주목나무로부터의 유기용매 추출물에 대하여 본격적으로 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 분리 및 정제를 실시하기 전에 미리 적합한 이동상을 사용한 크로마토그래피로 추출물에 포함된 불순물을 제거하기 때문에, 종래의 방법에 비하여 주목나무로부터 고순도의 택솔을 고수율로 얻을 수 있다. 더욱이 본 발명의 방법은 종래의 방법에 비하여 경제적이고, 공정의 단계가 줄어들었기 때문에 실용화하기 쉬운 장점을 갖는다.

Claims (6)

1) 주목나무로부터 유기용매를 사용하여 택솔의 추출물을 얻는 단계; 2) 단계 1의 추출물에 대하여 첫 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 94~100 : 0~6 (부피%)의 혼합 용매, 두 번째 이동상으로 염화메틸렌 : 아세톤 = 70~90 : 10~30 (부피%)의 혼합 용매를 사용하는 크로마토그래피법으로 불순물을 제거하는 전처리 과정을 거쳐 활성분획을 얻는 단계; 및 3) 단계 2의 활성분획을 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하는 단계로 구성되는 주목나무로부터 택솔의 분리 및 정제 방법.

제1항에 있어서, 단계 1은 주목나무 분말에서 메탄올을 사용하여 메탄올에 용해되는 부분을 추출하고; 추출물을 클로로포름과 물을 사용하는 분배법으로 유기층을 분리한 다음; 분리된 유기층을 농축시키고 건조시키는 과정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 주목나무로부터 택솔의 분리 및 정제 방법.

제1항에 있어서, 단계 2의 첫 번째 이동상은 주입된 시료가 칼럼에 완전히 전개될 때까지 흘려준 뒤 두 번째 이동상으로 교체하는 것을 특징으로 하는 주목나무로부터 택솔의 분리 및 정제 방법.

제1항에 있어서, 단계 3의 고성능 액체 크로마토그래피에서 일정용매 조성법의 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 87~93 : 1~7 : 3~9 (부피%)의 혼합 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 주목나무로부터 택솔의 분리 및 정제 방법.

제1항에 있어서, 단계 3의 고성능 액체 크로마토그래피에서 구배용매 조성법의 첫 번째 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 83~89 : 1~7 : 7~13 (부피%)의 혼합 용매, 두 번째 이동상으로 헥산 : 이소프로판올 : 메탄올 = 89~95 : 0~5 : 3~9 (부피%)의 혼합 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 주목나무로부터 택솔의 분리 및 정제 방법.

제4항에 있어서, 유속은 0.5~2.0㎖/min이고, 첫 번째 이동상을 10~20분동안 주입시킨 후 두 번째 이동상을 주입시키는 것을 특징으로 하는 주목나무로부터 택솔의 분리 및 정제 방법.

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