KR100252380B1 - 한국에서 분리한 일본뇌염 virus의 prm 과 envelope gene을 이용한 재조합 dna 백신 - Google Patents

한국에서 분리한 일본뇌염 virus의 prm 과 envelope gene을 이용한 재조합 dna 백신 Download PDF

Info

Publication number
KR100252380B1
KR100252380B1 KR1019970058165A KR19970058165A KR100252380B1 KR 100252380 B1 KR100252380 B1 KR 100252380B1 KR 1019970058165 A KR1019970058165 A KR 1019970058165A KR 19970058165 A KR19970058165 A KR 19970058165A KR 100252380 B1 KR100252380 B1 KR 100252380B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
korea
japanese encephalitis
vaccine
prm
jev
Prior art date
Application number
KR1019970058165A
Other languages
English (en)
Other versions
KR19990038443A (ko
Inventor
조해월
남재환
고현철
이호동
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1019970058165A priority Critical patent/KR100252380B1/ko
Publication of KR19990038443A publication Critical patent/KR19990038443A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100252380B1 publication Critical patent/KR100252380B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • C07K14/1816—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus), border disease virus
    • C07K14/1825—Flaviviruses or Group B arboviruses, e.g. yellow fever virus, japanese encephalitis, tick-borne encephalitis, dengue

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 국내에서 분리된 일본뇌염 바이러스를 이용하여 국내에 적합한 재조합 DNA 백신의 제조에 관한 것으로, K94P05 분리주의 PrM과 E유전자의 발현벡터 pPCJE-1을 제공하며 이를 사용하여 면역한 마우스혈청에 항체가 형성된 사실을 IFA실험, 중화능 시험 및 웨스턴블롯 분석을 통하여 제시하고 있다.

Description

한국에서 분리한 일본뇌염 Ｖｉｒｕｓ의 ＰｒＭ과 Ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｅｎｅ을 이용한 재조합 ＤＮＡ 백신
본 발명은 국내에서 분리된 일본뇌염바이러스를 이용하여 국내에 적합한 재조합 백신의 생산에 관한 것이다.
일본뇌염바이러스(Japanease encephalitis virus; JEV)는 Flaviviridae속의 positive sense RNA 바이러스로서 모기에 의하여 매개되며 아시아지역에서 매년 공식적으로 35,000명 정도의 일본뇌염 환자를 발생시키고 있다. 국내에서는 1946년 이래 매년 크게 유행하였으나 1983년 이후는 Nakayama-NIH주로 제조된 불활화 백신의 사용으로 환자발생율이 크게 감소하였다. 그러나, 이 불활화 백신은 마우스내에서 유래되었기 때문에 드물게 접종자에게 shock를 일으킬수 있으며, 면역력이 장기간 유지되지 않기 때문에 2년마다 재접종하여야 하며, 마우스를 사용하기 때문에 경제성의 문제가 있다.
따라서, 본 발명은 일본뇌염바이러스에 대한 감염을 효과적의 방어할 수 있으며, 면역력이 장기간 유지될 수 있고 예방접종도 간편한 차세대 재조합 DNA 백신을 제공함을 그 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 우리나에 적합한 새로운 종류의 백신 제조주를 선정하고 일본뇌염바이러스 재조합백신의 생산을 위해 발현벡타를 사용하여 백신 제조주의 구조단백질 PrM과 E 유전자를 발현시킨 다음 일본 뇌염 바이러스에 대한 항체의 특성을 검정하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 구체적인 실험 및 실시에를 통하여 설명하였으나, 본 발명의 권리범위는 하기 실시예에만 제한되지 않는다.
도 1은 JEV 국내분리주의 PrM과 E유전자의 PCR산물의 전기 영동 패턴을 보인 사진도.
도 2은 JEV 국내분리주 K94PO5전체 게놈을 포함하는 PCR산물의 전기영동 패턴을 보인 사진도.
도 3은 JE의 PrM과 E유전자 발현시키기 위한 플라스미드 벡타의 모식도.
도 4는 JEV에 대한 pPCJE-1으로 면역한 마우스 혈청에 항체가 생성되었음을 확인할 수 있는 western Blot 분석 사진.
본 발명은 국내에서 JEV 5주를 분리하고 그의 혈청학적 및 유전학적 특징을 Nakayama-NIH 주 및 다른 아시아지역에서 분리된 JEV와 비교분석하여 국내에 적합한 백신 바이러스주를 선정하는 단계와; 벡타시스템을 이용하여 재조합 백신을 제조하는 단계와; 신규한 재조합 백신을 이용하여 항원 발현과 동물면역에 따른 항체생성 및 방어효과를 확인하는 단계로 구성된다.
국내에서 분리된 5주(K96P20, K94P05, K91P55, K87P39, K82P01)와 일본뇌염 바이러스인 Nakayama-NIH주 사이의 E 유전자내의 염기서열 평균유사도는 92.8%이고 아미노산 서열 평균 유사도는 98.0% 였다. 한편, 1990년대에 국내에서 분리된 바이러스주의 염기서열 평균유사도는 99.3% 이나 1980년대 분리주는 포함한 염기서열 유사도는 92.8%로 낮았다. 이와같은 사실은, 한국에 존재하는 JEV는 경시적으로 돌연변이하고 있음을 나타내며 이 변이는 국내에서 월동에 따른 환경적응으로 인하여 나타나는 것으로 추정되고 있다.
한편, K94P05주로 기니피그(guinea pig)에서 생성된 항체가 상기 국내 분리주에 대하여 Nakayama-NIH주로 만들어진 항체보다 마우스 실험에서 높은 방어능을 나타냈으므로 국내에 적합한 백신 제조주로 선정하였으며 K94P05주의 전체 염기서열을 분석하여 다른 JEV 분리주들과 비교한 결과, genome의 Coding region 전체에서 특정한 고변이는 나타나지 않았으나 Stop codon 바로다음부터 60개의 유전자는 점돌연변이와 유전자 결실이 있음이 확인되어 이 부분이 cis-acting element로 작용할 가능성을 시사하였다.
국내에 적합한 재조합 백신을 개발하기 위하여 K94P05의 PrM과 E 유전자를 pcDNA3.1 운반백터에 도입하여 pcDNA3.1/PrM & E of JEV 발현벡터를 제작한 후 마우스에 intramuscular로 200㎍의 DNA 백신을 10일 간격으로 3회 접종하여 JEV 항체 생성능을 실험한 결과 마지막면역후 3개월후까지도 중화항체값이 1:160을 유지하고 있었다. 또 200㎍의 DNA 백신을 두차례 일주일 간격으로 면역후 K94P05주로 사용하여 challenge 실험을 실시한 결과도 100% 방어 효과를 보였다.
또한, 제조된 DNA 백신(pPCJE-1)으로 면역된 혈청을 사용한 웨스턴 블롯 실험에서 PrM과 envelope유전자가 발현 되었음을 확인하였다. 이는 제조된 DNA 백신(pPCJE-1)이 마우스의 근육속에서 wild type JEV의 envelope 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 기능 및 post-translation과정을 거치는 것으로 볼수 있다.
실시예1 : 일본뇌염 바이러스 배양
국내에서 분리한 JEV는 mouse brain에서 배양하고 각 JE 바이러스 stock은 hemagglutination test에 의하여 구분하였다. 마우스 브레인은 무게를 달고 10volume의 PBS를 넣어 호모게나이징하여 -70℃에서 보관 사용하였다. 표 1은 국내에서 분리한 5개주의 JEV와 여타 virus stock의 hemagglutination titer와 적정 PH를 보인 것이다.
Figure kpo00000
실시예2: HI, Cross-HI 시험
JEV 균주에 대한 다클론 항체를 얻은후 항체를 측정하기 위하여 Clarke and Casals(1958) 방법으로 HI test를 실시하였다. 5마리 기니피그에 각 균주 0.5㎖씩을 3회 접종하고 최종 접종후 3주만에 채혈하였다. 국내 분리주 등의 HI 및 Cross-HI 시험결과는 표2에 기재하여 두었다. 실험결과 국내 분리주에 대한 다클론 항체의 HI titer는 HA항원에 따라 1:80∼1:640이었으며, Nakayama-NIH 균주에 대한 다클론 항체의 HI titer는 1:160∼1:320 이었다.
Figure kpo00001
주: 1 HA unit is equivalent to the HA titer 1:16
국내 분리주 K94P05와 Nakayama-NIH 균주에 대한 다클론 항체능력을 Cross-PRNT 시험으로 확인한 결과는 표 3과 같다. 마우스에서 교차중화능은 Nakayama-HIN주 보다 국내에서 분리된 JEV에 대하여 더 큰 중화항체 반응을 보이는 것으로 나타났다.
Figure kpo00002
주: * Serum dilution yielding 80% reduction in plaque number.
실시예3: 국내분리 JEV 균주의 PrM과 E 유전자의 플라스미드 발현벡터 제작
JEV cDNA의 PrM와 E 유전자를 증폭하기 위해서 PCR을 수행하였다.
분리한 RNA를 포함한 용액을 8㎕. RT buffer(5X) 4㎕, dNTP(2.5mM) 4㎕, Random Heaxamer(50 A260Units, Boehringer Mannheim) 2㎕, DTT(0.1M) 2㎕을 섞고 70℃에서 5분간 반응시키고 얼음에 급속히 넣었다. 이 반응물에 reverse Transcriptase(SuperScriptTMII, 200 units) 1㎕을 첨가한 후 42℃ 온도에서 30분 반응 후 95℃에서 5분간 불활화 시켜 -20℃에 저장하여 사용하였다.
제조된 cDNA 2㎕, mixed dNTP(2.5mM) 16㎕, sense and antisense primer (20um) 5㎕, 10 X PCR buffer 10㎕, Taq polymerase 2.4 units(Boehringer Mannheim)에 pfu enzyme을 0.25 unit을 첨가호 전체 양이 100㎕이 되도록 증류수로 적정하였다. 이 PCR mixture를 Perkin-Elmer-Cetus thermal cycler(Model 9600)로 (94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 3분, 30 cycles) 증폭한 후 마지막 cycle에서 충분한 polymerization time을 주기 위해 72℃에서 10분간 1cycle을 반응하였다. 증폭이 끝난 PCR products는 etidium bromide를 포함한 1.5% agarose gel에서 running하여 확인하였다.
sense primer : AATGAGAATTCGACCATGTGGCTCGCAAGCTTGGC
antisense primer : TTTCTAGATTAAGCATGCACATTGGTCGC
PCR결과 PrM과 E 유전자의 산물은 도 1, K94P05균주의 전체게놈은 도 2와 같다.
K94P05균주의 PrM과 E유전자를 운반벡터 pcDNA3.1에 도입하여 재조합 플라스미드 벡터 pPCJE-1을 제작 하였다(도 3). 이 재조합 플라스미드 벡타 pPCJE-1은 1997년 10월 15일 연세대학교내 한국 종균협회에 기탁번호 KFCC-10991로 기탁하였다.
실시예 4 : 1FA 시험
실시예3에 의해 제작된 JEV의 PrM과 과 E유전자가 포함된 플라스미드 발현벡타 pPCJE-1를 ICR 생쥐에 대하여 200㎍/100㎕씩 10일 간격으로 intramuscular로 3회 연속 접종 실험결과, 초회 접종후 10일까지는 혈청에 IFA항체 titer가 관찰되지 않았으나 초회 접종후 20일에는 1:160, 30일에는 1:320의 항체가 관찰되었다.
실시예 5 : 중화능 시험
중화능을 확인할 기니 피그에서 만들어진 혈청을 56℃에서 30분간 비동화시 킨 후 1:10배 희석부터 2단계 희석하고 200PFU로 조절한 공격용 일본뇌염 바이러스와 동량 혼합한 다음 37℃에서 90분간 중화시킨다. 그리고 6-WELL CULTURE PLATE에서 1차 배양된 계태아세포에 바이러스 혈청 혼합액을 well당 0.3㎖씩 접종하여 37℃ CO2배양기에서 90분간 흡착시킨 후 0.9% agar가 포함된 EMEM배지로 37℃ CO2배양기에서 2일간 배양 후 2.5% neutral red(1:300)가 포함된 2차 중층 배지를 가하고 1∼2일 더 배양하고 플라크를 관찰, 계산하였다. 중화 항체가는 바이러스 플라크 수를 80%이상 감소시키는 최대 혈청 희헉배수의 역수로 결정하였다. cross-neutralization test 실험 결과 국내 분리주로 제조된 항체가 Nakayama-NIH주로 만들어진 항체보다 국내분리주에 대하여 더 높은 중화능을 보이고 있다.(표 3) pPCJE-1인 DNA 백신으로 200㎍을 일주일 간격으로 3회 면역후 면역된 마우스들의 혈청을 눈에서 한달 간격으로 채혈한 결과 표 4와 같이 장기간에 걸쳐서 IFA 항체 및 중화 항체가 지속되고 있음을 확인하였다.
IFA항체 및 중화항체 지속 효과
면역후 기간(Day) 1 10 20 30 120
pPCJE-1 면역 면역 면역
IFA negative negative 1:160 1:320 1:80
중화 negative 1:40 1:320 1:640 1:160
주 : 면역 : 200㎍/100㎕, intramuscular route 사용
실시예 6 : 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석
pPCJE-1으로 면역한 마우스의 40일째 혈청을 이용하여 본 발명 DNA 백신의 JE Virus에 대한 면역효과를 측정하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 실험은 JE 바이러스 wild type으로 면역한 마우스 혈청, pcDNA3.1(+)벡터로만 면역한 마우스 혈청 및 JE 바이러스의 PrM과 E유전자가 클로닝된 재조합 프라스미드 pPCJE-1으로 면역한 마우스 혈청을 이용하여 실시하였다.
실험결과, pPCJE-1으로 면역한 마우스혈청에 항체가 성성되었으며 wild type JEV의 E 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가지는 것으로 확인되었다.(도 4)
이상의 실시예와 실험결과에서 확인되는 바와같이 본 발명은 PCR을 통하여 한국에서 분리한 K94P05 분리주의 PrM와 Envelope 유전자의 발현벡타를 제공하는 효과가 있으며, 재조합 플라스미드 pPCJE-1을 사용하여 면역한 마우스의 혈청을 사용하여 1FA 시험, 중화능실험 등을 통하여 초기접종후 120일 까지 JE 바이러스에 대한 항체를 형성하는 DNA 백신을 제공하는 효과가 있어 차세대 재조합 백신의 제조등 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 국내에서 분리된 일본 뇌염 바이러스 K94P05의 PrM과 E 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡타 pPCJE-1(기탁번호 KFCC 10991).
  2. 발현벡타 pPCJE-1을 이용한 재조합 DNA 백신.
KR1019970058165A 1997-11-05 1997-11-05 한국에서 분리한 일본뇌염 virus의 prm 과 envelope gene을 이용한 재조합 dna 백신 KR100252380B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019970058165A KR100252380B1 (ko) 1997-11-05 1997-11-05 한국에서 분리한 일본뇌염 virus의 prm 과 envelope gene을 이용한 재조합 dna 백신

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019970058165A KR100252380B1 (ko) 1997-11-05 1997-11-05 한국에서 분리한 일본뇌염 virus의 prm 과 envelope gene을 이용한 재조합 dna 백신

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR19990038443A KR19990038443A (ko) 1999-06-05
KR100252380B1 true KR100252380B1 (ko) 2000-04-15

Family

ID=19524170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019970058165A KR100252380B1 (ko) 1997-11-05 1997-11-05 한국에서 분리한 일본뇌염 virus의 prm 과 envelope gene을 이용한 재조합 dna 백신

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100252380B1 (ko)

Also Published As

Publication number Publication date
KR19990038443A (ko) 1999-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6845266B2 (ja) 多価組換型鳥ヘルペスウイルス及び鳥類を免疫化するためのワクチン
Davis et al. West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays
Bourhy et al. Antigenic and molecular characterization of bat rabies virus in Europe
Tsukamoto et al. Complete, long-lasting protection against lethal infectious bursal disease virus challenge by a single vaccination with an avian herpesvirus vector expressing VP2 antigens
Mastrantonio et al. Antigenic variants in Bordetella pertussis strains isolated from vaccinated and unvaccinated children
Oveissi et al. DNA vaccine encoding avian influenza virus H5 and Esat-6 of Mycobacterium tuberculosis improved antibody responses against AIV in chickens
US20100028384A1 (en) Yeast expressed classical swine fever virus glycoprotein e2 and use thereof
CN113226363B (zh) 含有多个外来基因的重组禽疱疹病毒
Liang et al. DNA prime–protein boost strategies protect cattle from bovine viral diarrhea virus type 2 challenge
Dupuy et al. Directed molecular evolution improves the immunogenicity and protective efficacy of a Venezuelan equine encephalitis virus DNA vaccine
US8017317B2 (en) gM-negative EHV-mutants
US6133433A (en) Method for detection and prevention of human cytomegalovirus infection
EP3280438B1 (en) Recombinant lumpy skin disease virus knock-out mutant and uses thereof
CN116376850A (zh) B3基因型嵌合麻疹病毒减毒株和制备方法及用途
BG61066B1 (bg) Авирулентна противобясна ваксина
Hasenkrug et al. Differing T-cell requirements for recombinant retrovirus vaccines
KR100252380B1 (ko) 한국에서 분리한 일본뇌염 virus의 prm 과 envelope gene을 이용한 재조합 dna 백신
Flory et al. Induction of protective immunity against coronavirus‐induced encephalomyelitis: Evidence for an important role of CD8+ T cells in vivo
CN102892428A (zh) 表达兔出血热病毒的vp60主要衣壳蛋白的副痘病毒
Li et al. Enhancement of humoral and cellular immunity in chickens against reticuloendotheliosis virus by DNA prime-protein boost vaccination
US9352032B2 (en) Live attenuated antigenically marked classical swine fever vaccine
Kwang et al. Simian retrovirus-D serotype 1 (SRV-1) envelope glycoproteins gp70 and gp20: expression in yeast cells and identification of specific antibodies in sera from monkeys that recovered from SRV-1 infection
Kalthoff et al. Immunization and challenge experiments with a new modified live bovine herpesvirus type 1 marker vaccine prototype adjuvanted with a co-polymer
CN113896774B (zh) 一种重组蛋白k-s及其制备方法和应用
RU2812979C2 (ru) Рекомбинантные вирусы птичьего герпеса, содержащие несколько чужеродных генов

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
N231 Notification of change of applicant
GRNT Written decision to grant
EXPY Expiration of term