KR100241183B1 - 유청으로부터 phb를 생산하는 재조합 대장균 및 그를 이용한 phb의 제조방법 - Google Patents

유청으로부터 phb를 생산하는 재조합 대장균 및 그를 이용한 phb의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유청(whey)으로부터 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)를 생산하는 재조합 대장균 및 그를 이용한 PHB의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)의 PHB 합성 유전자를 포함한 재조합 플라스미드(plasmid)로 형질전환되어, 유청으로부터 PHB를 효과적으로 생산하는 재조합 대장균 및 그를 유청 함유 배지에서 배양하는 PHB의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 대장균은 저가이면서 환경오염을 일으키는 유청으로부터 PHB를 효과적으로 생산하는 바, PHB의 경제적인 생산 뿐만 아니라, 환경 보호 차원에도 일조하게 된다.

Description

유청으로부터 PHB를 생산하는 재조합 대장균 및 그를 이용한 PHB의 제조방법
본 발명은 유청(whey)으로부터 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)를 생산하는 재조합 대장균 및 그를 이용한 PHB의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)의 PHB 합성 유전자를 포함한 재조합 플라스미드(plasmid)로 형질전환되어, 유청으로부터 PHB를 효과적으로 생산하는 재조합 대장균 및 그를 유청 함유 배지에서 배양하는 PHB의 제조방법에 관한 것이다.
PHB는 미생물에 의해 합성·축적되는 에너지 저장물질로서, 기존의 화학 합성고분자와 물리·화학·기계적 성질이 비슷하고, 생체적합성(biocompatibility) 및 생분해능(biodegradation)이 우수하여, 자연계에서 일정시간 경과하면, 미생물에 의해 물과 이산화탄소로 완전히 분해되므로, 환경친화적인 플라스틱 원료로 각광 받고 있다. 특히, PHB의 분해산물인 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate)는 인간 뿐만 아니라, 동물의 체내에 존재하는 대사산물이어서 수술용 봉합사 및 약물전달 시스템(drug delivery system)등에의 용도로 개발되고 있으나, 높은 생산단가 때문에, 아직까지 범용의 포장재나 용기로는 사용되지 못하고 있다.
따라서, PHB의 경제적인 생산을 위하여, PHB 생산균주로 알려진 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)와 알칼리게네스 레이터스(Alcaligenes latus)등이 집중적으로 연구되었고(참조 : USP 4,433,053; Anderson and Daws, Microbiol. Rev., 54 : 450-472(1990)), 최근에는 몇몇의 연구자들에 의해 알칼리게네스 유트로퍼스의 PHB 합성유전자를 대장균에 클로닝함으로써, 재조합 미생물에 의한 PHB의 생산도 가능하게 되었다(참조 : WO 89/00202; Slater et al., J. Bacteriol., 170 : 4431-4436(1988); Schubert et al., J. Bacteriol., 170 : 5837-5847(1988); Peoples and Sinskey, J. Biol. Chem., 264 : 15298-15303(1989)).
본 발명자 역시 재조합 대장균에 의해 경제적으로 PHB를 생산할 수 있는 방법을 강구하고자, 높은 복제수를 갖는 플라스미드의 개발, 플라스미드의 안정화, 형질전환용 균주의 개발, 재조합 미생물의 고농도 배양기술 개발 및 PHB 합성촉진을 위한 배양조건 확립 등에 대한 연구를 수행하여 왔다.
이러한 연구를 통하여, 복제수가 각기 다른 플라스미드 pSYL101 및 pSYL102, 이들을 안정화시키기 위하여 플라스미드 R1의 parB 영역(참조 : Gerdes, Bio/Technol., 6 : 1402(1988))을 전기 플라스미드에 삽입시켜 제조한 pSYL103과 pSYL104를 대장균 XL1-Blue에 도입하여 PHB 합성능을 비교한 결과, 높은 복제수의 플라스미드를 사용하여야 PHB의 생산이 높음을 확인할 수 있었다(참조 : Lee et al., Ann. NY Acad. Sci., 721 : 43-53(1994); Lee et al., J. Biotechnol., 32 : 203-211(1994)).
또한, 대장균 XL1-Blue, 대장균 DH5α, 대장균 JM109, 대장균 B, 대장균 W, 대장균 K12 등 여러 종류의 대장균에 높은 복제수를 가지면서 안정한 플라스미드 pSYL105를 도입하여, PHB 합성속도 및 수율 등에 대한 연구를 수행한 결과, 균주특성에 따라 PHB 합성속도와 수율 등이 다름을 확인하였다(참조 : Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44 : 1337-1347(1994)).
아울러, 재조합 대장균에 의한 PHB 생산시 균체가 필라멘테이션에 의해 길어져서 세포의 성장이 둔화 혹은 정지되므로, 균체의 배양효율이 떨어질 뿐만 아니라, PHB의 생산성도 낮아진다는 문제점이 노출되어 왔는 바, 이에 본 발명자는 재조합 대장균의 필라멘테이션 현상을 억제 또는 방지하기 위한 연구를 거듭한 결과, 필라멘테이션을 억제할 수 있는 필수 세포분열 단백질(ftsZ)의 유전자 및 PHB 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 pSYL107을 제조하고, 그로 형질전환된 재조합 대장균이 배양시 필라멘테이션 현상을 나타내지 않으며, 고농도로 PHB를 제조할 수 있음을 밝혔다(참조 : S.Y. Lee, Biotechnol. Lett., 16 : 1247-1252(1994); S.Y. Lee, Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 22 : 614-620(1994); Lee and Lee, J. Environ, Polymer Degrad., 4 : 131-134(1996)).
한편, PHB 합성 촉진을 위한 재조합 미생물의 배양조건에 대한 연구를 통하여, 저가의 단순배지에서보다 복합배지에서 PHB 합성능이 높음을 밝혔다. 따라서, 고농도의 PHB를 제조할 수 있는 배양방법으로서, 단순배지에 소량의 복합질소원을 첨가하는 방법이 제시되었으며, 트립톤(tryptone), 카사미노산(casamino acid) 혹은 카제인 가수분해물(casein hydrolysate) 등의 복합질소원을 0.5 내지 5g/L 첨가함으로써, PHB 합성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다(참조 : Lee and Chang, J. Environ. Polymer Degrad., 2 : 169-176(1994). 전기의 복합 질소원 대신에 아미노산이나 올레산(oleic acid)의 첨가로도 PHB 합성을 향상시킬 수 있었다(참조 : Lee et al., J. Ferment. Bioeng., 79 : 177-180(1995)).
또한, PHB의 생산성을 높이기 위하여 유가식 배양법을 개발하여 39시간만에 건조균체 농도 101g/L, PHB 농도 84g/L를 얻을 수 있었으며(참조 : Lee et al., J. Biotechnol., 32 : 203-211(1994), 복합질소원이 소량첨가된 단순배지에서도 유가식 배양에 의해 80g/L의 PHB를 얻어, 재조합 대장균에 의한 PHB의 생산이 매우 효과적임을 확인할 수 있었다(참조 : Lee and Chang, J. Environ. Polymer Degrad., 2 : 169-176(1994)).
그러나, 상술한 연구는 모두 포도당을 주 탄소원으로 하므로, 그의 결과 얻은 PHB의 생산단가는 포도당의 가격에 많이 의존한다. 따라서, 포도당 대신에 저가의 탄소원을 원료로 하여 PHB를 제조하면, 생산단가는 상당히 낮아질 수 있다.
한편, 유청은 치즈나 카제인 제조시에 부수적으로 생성되는 액체물질로서 유당과 유청단백질이 풍부하며, 일반적으로 1kg의 치즈 제조시 약 8kg의 유청이 생산된다. 이러한 유청은 생물학적 산소요구량(BOD)이 높아 하천 등 환경을 크게 오염시키고 있으며, 유용자원의 낭비라는 점에서 그의 효과적인 이용 방안이 요구되고 있다.
지금까지 생분해성 고분자 PHB의 생산을 위해 널리 사용되어온 알칼리게네스 유트로퍼스, 알칼리게네스 레이터스, 메탄올 자화균 등은 유청을 탄소원으로 하여 성장할 수 없으나, 대장균 중의 일부는 그를 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있다.
이에, 본 발명자는 유청으로부터 PHB를 제조하고자 예의 연구노력한 결과, 유청을 탄소원으로 이용할 수 있는 특정의 대장균 6종을 선별하고, 그를 PHB 합성 유전자가 클로닝된 재조합 플라스미드 pSYL107로 형질전환시켜 유청 함유 배지에서 배양하면, PHB가 효과적으로 생산되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 PHB 합성 유전자를 포함한 재조합 플라스미드로 형질전환되어, 유청으로부터 PHB를 제조할 수 있는 특정의 재조합 대장균을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 재조합 대장균을 이용하여 유청으로부터 PHB를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
제1도는 재조합 플라스미드 pSYL105의 유전자 지도를 나타낸다.
제2도는 재조합 플라스미드 pSYL107의 유전자 지도를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
우선, 유청을 탄소원으로 하여 성장이 우수한 대장균을 선별하기 위하여, 단순배지(KH2PO413.5g/L, (NH4)2HPO44g/L, MgSO4·7H2O 1.4g/L, 시트르산(citric acid) 1.7g/L, FeSO4·7H2O 0.1g/L, CaCl2·2H2O 0.02g/L, ZnSO4·7H2O 0.022g/L, MnSO4·4H2O 0.005g/L, CuSO4·5H2O 0.01g/L, (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001g/L, Na2B4O7·10H2O 0.002g/L 및 티아민(thiamine) 0.01g/L으로 구성된 배지)에 유청을 첨가한 배지에서 각종의 대장균(Escherichia coli)을 배양하고 성장정도를 알아보았다. 그 결과, 특정의 6종 대장균(Escherichia coli) 즉, E.coli K12(a wild-type strain, F+), E. coli HMS174(λ-, recA1, IN(rrnD-rrnE), rpoB331, hsdR19, F-), E. coli MG1047(F-, γδ(3X) :: Tn1000, λ-, recA56), E. coli B(a wild-type strain, F-, GCSC #6572), E. coli C-1(a wild-type strain, F-) 및 E. coli B(a wild-type strain, F-, GCSC #2507) 균주가 상대적으로 성장이 우수하였다.
전기 6종의 대장균을 PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 합성유전자가 클로닝된 플라스미드, 바람직하게는 베타-락타메이즈, PHB 합성유전자 및 플라스미드 R1의 parB 영역을 포함하는 플라스미드 pSYL105(참조 : Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44 : 1337-1347(1994)) 또는 전기 pSYL105에 필수 세포분열 단백질(ftsZ)의 유전자를 삽입시켜 제조한 플라스미드 pSYL107(참조 : S.Y. Lee, Biotechnol. Lett., 16 : 1247-1252(1994)), 가장 바람직하게는 상기한 플라스미드 pSYL107로 각각 형질전환시켰다.
이렇게 얻은 형질전환체들을 유청 함유 배지, 바람직하게는 유청을 10 내지 80g/L, 가장 바람직하게는 30 내지 60g/L의 농도로 포함한 상기 단순배지에서 배양하고, 최종 건조균체농도, PHB 농도 및 PHB 함량(건조균체농도당 PHB 농도의 퍼센트(%))을 결정하였다. 그 결과, 6종의 형질전환체 모두는 유청으로부터 PHB를 효과적으로 생산할 수 있었다.
본 발명의 6종 형질전환체는 상기한 단순배지이외에도, 복합 질소원이 소량 첨가된 단순배지에서 보다 높은 PHB 생산능을 나타낼 것이다. 이때, 복합 질소원은 트립톤(tryptone), 효모 추출물, 펩톤(peptone), 카사미노산(casamino acid), 코튼 시드 가수분해물(cotton seed hydrolysate), 육즙 추출물(beef extract), 카제인 가수분해물(casein hydrolysate), 콘스팁리커(corn steep liquor) 또는 소이빈 가수분해물(soybean hydrolysate) 등을 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
유청으로부터 PHB를 합성할 수 있는 재조합 대장균의 제조
유청을 탄소원으로 하는 단순배지에서 성장이 우수한 대장균주(E. coli)를 선별하기 위하여, 하기 표 1의 단순배지에 유청을 30g/L 첨가하고, 각종 대장균주를 플라스크 배양하였다. 그 결과, 성장이 상대적으로 우수한 6종의 대장균주, 즉 E. coli K12(a wild-type strain, F+), E. coli HMS174(λ-, recA1, IN(rrnD-rrnE), rpoB331, hsdR19, F-), E. coli MG1047(F-, γδ(3X) :: Tn1000, λ-, recA56), E. coli B(a wild-type strain, F-, GCSC #6572), E. coli C-1(a wild-type strain, F-) 및 E. coli B(a wild-type strain, F-, GCSC #2507)(참조 : 표 2)를 본 발명의 균주로 선정하였다.
이어, 베타-락타메이즈, PHB 합성유전자, 플라스미드 R1의 parB 영역 및 필수 세포분열 단백질(ftsZ)의 유전자를 삽입시켜 제조한 재조합 플라스미드 pSYL107(참조 : 제1도; S.Y. Lee, Biotechnol. Lett., 16 : 1247-1252(1994))로 상기에서 선별된 6종의 대장균(E. coli)을 각각 형질전환시켜, 하기 표 2와 같은 6종의 형질전환체를 얻었다. 이때, 형질전환은 일렉트로포레이션(electroporation)방법으로 행하였다(참조 : Dower et al., Nucleic Acids Res., 16 : 6127-6145(1988)).
이렇게 얻은 형질전환체에서 플라스미드를 분리하고 제한효소로 절단하여, 형질전환시킨 플라스미드와 동일한 것임을 확인하였다.
Figure kpo00002
Figure kpo00003
[실시예 2]
재조합 대장균을 이용한 유청으로부터 PHB의 제조
유청으로부터의 PHB 성능을 알아보기 위하여, 상기 표 2에 열거한 6종의 재조합 대장균을 유청 35g/L 혹은 70g/L 첨가된 상기 표 1의 단순배지에서 30℃, 250rpm의 조건으로 60시간 배양한 다음, 건조균체농도, PHB 농도 및 PHB 함량을 결정하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
Figure kpo00004
상기 표 3에서 보듯이, PHB 생산량은 균주에 따라 다소 차이가 있으나, 6종의 재조합 균주 모두가 유청으로부터 PHB를 제조할 수 있음을 확인하였다. 또한, 유청의 양을 두배로 증가시킨다고 해서 PHB 생산량이 증가하는 것은 아니며, 실제로 재조합 대장균 2507(pSYL107)을 제외한 모든 균주가 유청농도 증가시 오히려 PHB 농도는 감소하는 경향을 나타내었다.
[실시예 3]
유청 농도 변화에 따른 PHB 생산능 비교
유청의 농도 변화가 PHB 생산능에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 상기 실시예 2에서 PHB 생산능이 가장 우수한 대장균 4401(pSYL107)과 대장균 6576(pSYL107)을 유청이 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70g/L의 농도로 첨가된 상기 표 1의 단순배지에서 30℃, 250rpm의 조건으로 60시간 배양한 다음, 건조균체농도, PHB 농도 및 PHB 함량을 결정하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
Figure kpo00005
상기 표 4에서 보듯이, 두가지 재조합 균주 모두는 유청농도가 30g/L일때 최고의 PHB 농도를 나타내었으며, 10g/L일 때 최저의 PHB 농도를 나타내었다. 대장균 4401(pSYL107)의 경우에는 유청의 농도가 30g/L 이상일 때, PHB 농도가 항상 3g/L보다 높았고, PHB 함량도 모두 78% 이상으로 매우 높음을 알 수 있었다. 또한, 대장균 6576(pSYL107)의 경우에는 유청의 농도가 30g/L∼60g/L일 때, PHB 농도가 3g/L 이상이었고, PHB 함량 역시 79% 이상으로써 매우 높았으며; 유청의 농도가 20g/L일 때, PHB 농도는 3.56g/L로 상대적으로 높았으나 PHB 함량은 56.5%로서 다소 낮음을 알 수 있었다.
따라서, 재조합 대장균 4401(pSYL107)과 대장균 6576(pSYL107)은 유청 함유 단순배지에서 배양시 PHB를 다량으로 제조할 수 있음을 확인하였다.
상기의 재조합 대장균 4401(pSYL107)과 대장균 6576(pSYL107)은 각각 대장균(Escherichia coli)/pSYL107 GCSC 4401 및 대장균(Escherichia coli)/pSYL107 GCSC 6576로 명명하고, 1997년 7월 15일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0350BP 및 KCTC 0351BP로 각각 기탁하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 플라스미드 pSYL107로 형질전환된 6종의 재조합 대장균 즉, 대장균 4401(pSYL107), 6576(pSYL107), 6197(pSYL107), 6572(pSYL107), 3121(pSYL107) 및 2507(pSYL107)은 유청으로부터 PHB를 효과적으로 생산할 수 있으며, 특히 재조합 대장균 4401(pSYL107)과 6576(pSYL107)은 보다 고농도의 PHB를 생산한다. 또한, 본 발명은 저가이면서 환경오염을 일으키는 유청으로부터 PHB를 제조할 수 있으므로 PHB의 경제적인 생산 뿐만 아니라, 환경 보호 차원에도 일조하게 된다.

Claims (4)

  1. PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 합성 유전자를 포함하는 제1도 및 제2도의 유전자 지도를 갖는 플라스미드 pSYL105 또는 pSYL107가 유청을 탄소원으로 이용하는 E.coli K12(a wild-type strain, F+), E. coli HMS174(λ-, recA1, IN(rrnD-rrnE), rpoB331, hsdR19, F-), E. coli MG1047(F-, γδ(3X) :: Tn1000, λ-, recA56), E. coli B(a wild-type strain, F-, GCSC #6572), E. coli C-1(a wild-type strain, F-) 및 E. coli B(a wild-type strain, F-, GCSC #2507) 로 구성된 그룹으로부터 선택되는 대장균(Escherichia coli)에 도입되어, 유청으로부터 PHB를 생산하는 재조합 대장균(recombinant E. coli).
  2. 제2도의 유전자 지도를 갖는 플라스미드 pSYL107로 형질전환되어, 유청으로부터 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)를 생산하는 재조합 대장균(Escherichia coli)/pSYL107 GCSC 4401(KCTC 0350BP).
  3. 제2도의 유전자 지도를 갖는 플라스미드 pSYL107로 형질전환되어, 유청으로부터 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)를 생산하는 재조합 대장균(Escherichia coli)/pSYL107 GCSC 6576(KCTC 0351BP).
  4. 제1항의 재조합 대장균을 KH2PO413.5g/L, (NH4)2HPO44g/L, MgSO4·7H2O 1.4g/L, 시트르산(citric acid) 1.7g/L, FeSO4·7H2O 0.1g/L, CaCl2·2H2O 0.02g/L, ZnSO4·7H2O 0.022g/L, MnSO4·4H2O 0.005g/L, CuSO4·5H2O 0.01g/L, (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001g/L, Na2B4O7·10H2O 0.002g/L 및 티아민(thiamine) 0.01g/L으로 구성된 단순배지 혹은 트립톤(tryptone), 효모 추출물, 펩톤(peptone), 카사미노산(casamino acid), 코튼 시드 가수분해물(cotton seed hydrolysate), 육즙 추출물(beef extract), 카제인 가수분해물(casein hydrolysate), 콘스팁리커(corn steep liquor) 및 소이빈 가수분해물(soybean hydrolysate)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 질소원이 복합질소원으로 첨가된 전기의 단순배지에 유청을 10 내지 80g/L의 농도로 가한 유청 함유 배지에 배양하는 공정을 포함하는 PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 의 제조방법.
KR1019970039966A 1996-12-12 1997-08-21 유청으로부터 phb를 생산하는 재조합 대장균 및 그를 이용한 phb의 제조방법 KR100241183B1 (ko)

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