KR100220091B1 - Novel microorganism separated from korean nephila clavata, and produced protease - Google Patents

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Abstract

본 발명은 한국산 무당거미(Nephila clavata)의 장으로부터 분리된 신규 미생물 및 이로부터 생산된 단백질분해효소에 관한 것으로, 단백질 분해 활성을 나타내는 본 발명의 신규 미생물 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3는 20 내지 40 ℃의 온도 및 6 내지 10의 pH에서 안정하며 약 51.5 kd의 분자량을 갖는 단백질분해효소를 생산한다.The present invention relates to a novel microorganism isolated from the intestine of Nephila clavata of Korea and a protease produced therefrom, the novel microorganism of the present invention showing proteolytic activity Aranicola proteolyticus HY −3 is stable at a temperature of 20-40 ° C. and a pH of 6-10 and produces a protease having a molecular weight of about 51.5 kd.

Description

한국산 무당거미의 장으로부터 분리된 신규 미생물 및 그로부터 생성된 단백질분해효소Novel Microorganisms Isolated from the Intestines of Korean Sugarless Spiders and Proteolytic Enzymes Produced therefrom

본 발명은 한국산 무당거미(Nephila clavata)의 장으로부터 분리된 신규 장내세균류인 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3 및 이에 의해 생산된 단백질분해효소에 관한 것이다.The present invention relates to a new enterobacteriaceae isolated from the intestine of Korean nephila clavata (Aranicola proteolyticus) HY-3 and the protease produced thereby.

단백질분해효소는 그 특이성을 기초로 하여 다양하게 구분되며 각각의 특성에 따라 산업적 용도도 달라진다. 예를 들어, 작용 양상별로는 효소의 특이성에 맞는 단백질을 무작위로 절단하여 펩타이드를 형성시키는 엔도펩티다제와 펩타이드 쇄를 따라 아미노산 단위로 분해하는 엑소펩티다제가 있으며, 산도 특성에 따라서는 호산성, 호알칼리성, 중성으로 구분하고, 온도에 따라 내열성, 중온성, 고온성 등으로 구분하며, 효소의 구조에 따라 금속이온을 함유하는 메탈로프로타제, 아미노산 중 세린(serine) 잔기를 활성부위에 함유하는 세린프로타제 등으로 구분하기도 한다.Proteolytic enzymes are classified based on their specificity, and their industrial uses vary according to their characteristics. For example, there are endopeptidases that randomly cleave proteins suitable for the specificity of enzymes to form peptides, and exopeptidases that break down amino acid units along the peptide chain, depending on the acidity characteristics. It is classified into alkaline and neutral, and it is classified into heat resistance, mesophilic and high temperature according to temperature, and contains metalloprotase containing metal ions and serine residue in amino acid according to the structure of enzyme. It is also divided into serine proteases.

한편, 곤충류에 속하는 거미의 경우, 그 섭생의 특징이 강력한 독성 물질을 분비하여 포식하고자 하는 먹이를 죽인 다음 그의 체내를 액화시킨 후 섭취하는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 거미의 장내에는 외래의 단백질을 분해할 수 있는 다양한 효소 체계가 존재하고 있을 것이며 이들 효소 체계는 거미에 공생하고 있는 미생물에 의해서도 발현될 수 있을 것으로 생각되어, 거미의 장내 미생물 중 단백질 분해 활성을 나타내는 미생물을 탐색하였다. 수종의 거미를 대상으로 탐색하던 중 한국산 무당거미(Nephila clavata)의 장으로부터 단백질분해 능력이 뛰어나며, 특히 저온에서도 상당한 단백질 분해 활성을 나타내는 미생물을 분리하여 본 발명의 완성에 이르게 되었다.On the other hand, in the case of spiders belonging to insects, the characteristics of the regimen is well known to secrete a powerful toxic substance to kill prey to eat and then liquefy its body and consume it. Therefore, the present inventors believe that there are various enzyme systems capable of degrading foreign proteins in the intestines of spiders, and these enzyme systems are thought to be expressed by microorganisms living in spiders. The microorganisms showing proteolytic activity were searched. During the search for several spiders, microorganisms having excellent proteolytic ability from the intestine of Nephila clavata made in Korea, and in particular, have isolated microorganisms that exhibit significant proteolytic activity even at low temperatures, leading to the completion of the present invention.

본 발명의 목적은 한국산 무당거미의 장으로부터 분리된, 단백질 분해 활성이 우수한 신규 미생물 및 이로부터 생산된 단백질분해효소를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a novel microorganism having excellent proteolytic activity and protease produced therefrom, isolated from the intestine of Korean sugarless spiders.

도 1은 본 발명에 따라 한국산 무당거미의 장으로부터 분리된 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3의 전자현미경 사진이고,1 is an electron micrograph of Aranicola proteolyticus HY-3 isolated from the intestine of a Korean sugarless spider according to the present invention,

도 2는 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3의 분류학적 유연관계도를 나타낸 것이며,Figure 2 shows the taxonomic flexibility diagram of Aranicola proteoritis HY-3 of the present invention,

도 3은 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3에 의해 생산된 단백질분해효소의 활성을 중성 폴리아크릴아미드겔 상에서 확인한 결과이다.Figure 3 is the result of confirming the activity of the protease produced by the Aranicola proteoricicus HY-3 of the present invention on a neutral polyacrylamide gel.

도 4는 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3의 16S rRNA의 염기서열을 나타낸 것이다.Figure 4 shows the nucleotide sequence of the 16S rRNA of the Aranicola proteoricicus HY-3 of the present invention.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 한국산 무당거미의 장으로부터 분리된 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3를 제공한다.In accordance with the above object, the present invention provides Aranicola proteolyticus HY-3 isolated from the intestine of the Korean sugarless spider.

본 발명에서는 또한 20 내지 40 ℃의 온도 및 6 내지 10의 pH에서 안정하며 약 51.5 kd의 분자량을 갖는, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3로부터 생산된 단백질분해효소를 제공한다.The present invention also provides proteolytic enzymes produced from Aranicola proteolyticus HY-3, which are stable at a temperature of 20-40 ° C. and a pH of 6-10 and have a molecular weight of about 51.5 kd. .

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 미생물은 한국산 무당거미의 장으로부터 다음과 같이 분리할 수 있다. 먼저, 무당거미의 머리 부분을 제거하고 몸통 부분 만을 70 % 알콜에 10 분간 담구어 표면을 살균한다. 배를 절개하여 체표 부분을 제외한 장을 생리식염수와 함께 균질기에 넣고 균질화한 다음, 1 % 탈지분유를 첨가한 고체배지 상에 도말하여 투명환을 형성하는 균주를 선별한다.The microorganism of the present invention can be separated from the intestine of Korean sugarless spiders as follows. First, the head of the sugarless spider is removed, and only the torso is soaked in 70% alcohol for 10 minutes to sterilize the surface. The stomach is excised and the intestine except for the body surface is placed in a homogenizer with physiological saline and homogenized. Then, the strain is formed on a solid medium to which 1% skim milk powder is added to form a transparent ring.

상기와 같이 선별된, 단백질 분해 활성을 갖는 본 발명의 미생물은 그 균주적 특성, 형태적, 생리적 및 균체화학적 특성을 조사한 결과, 포자를 생성하지 않는 그람 음성균이며, 0.3 내지 0.5 ㎛의 세포 크기와 0.7 내지 1.2 ㎛의 세포 길이를 갖는 막대형의 세포로서, 운동성이 강하여 장내 세균류(Enterobacteriaceae)와 유사한 형태적 특징을 갖는 것으로 나타났으며, β-갈락토시다제, 우레아제 및 오르니틴 디카르복실라제를 생산하고, 구연산을 이용하며, 만니톨, 이노시톨, 솔비톨 등의 알콜성 탄수화물로부터 산을 생성하고, 질산염을 아질산염으로 환원하고 옥시다제 음성을 나타내는 생리·생화학적 특성을 가져 장내 세균류의 일반적인 특성과는 차이가 있었고, 균체내 지방산 조성은 탄소수 16 개의 포화 지방산(32%) 및 탄소수 17 개의 고리형 포화 지방산(12%), 그리고 탄소수 16 개 및 15 개의 복합체(20%)가 주지방산으로 존재하였다.As described above, the microorganism of the present invention having proteolytic activity is a gram-negative bacterium that does not produce spores as a result of examining its strain characteristics, morphological, physiological and biochemical characteristics, and has a cell size of 0.3 to 0.5 μm. It is a rod-shaped cell having a cell length of 0.7 to 1.2 μm, and exhibits strong motility and similar morphological characteristics to enterobacteriaceae, β-galactosidase, urease and ornithine decarboxylase. It has the physiological and biochemical properties that produce citric acid, use citric acid, produce acid from alcoholic carbohydrates such as mannitol, inositol, sorbitol, reduce nitrate to nitrite, and show oxidase negative. The fatty acid composition in the cells was 16 saturated fatty acids (32%) and 17 cyclic saturated fatty acids (12%). And 16 and 15 carbon complexes (20%) were present as main fatty acids.

본 발명의 미생물은 상기와 같은 형태학적, 생리학적 및 균체학적 특성에 의거할 때 지금까지 전혀 알려지지 않은 신규의 장내 세균으로 밝혀졌으며 기존의 장내 세균으로는 동정이 불가하여, 본 발명의 미생물 동정을 위해 리보좀 소단위 유전자를 분리하여 그 염기서열을 분석한 결과, 기존의 장내 세균과 94 내지 97 % 정도의 유사성을 나타내었다. 이상과 같은 형태적, 생리적 및 균체화학적 특성 및 염기서열 분석 결과에 의거하여 본 발명의 미생물을 신규의 장내 세균류인 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3로 명명하였다.Based on the above morphological, physiological and microbiological characteristics, the microorganism of the present invention has been identified as a novel intestinal bacterium, which is not known at all until now, and it is impossible to identify the existing intestinal bacteria, thereby identifying the microorganism of the present invention. The ribosome subunit gene was isolated and analyzed for its nucleotide sequence, which showed 94-97% similarity to the existing intestinal bacteria. Based on the above morphological, physiological and biochemical characteristics and sequencing results, the microorganism of the present invention was named Aranicola proteolyticus HY-3, a novel intestinal bacterium.

본 발명에 따라 한국 무당거미의 장으로부터 분리된 신규 미생물 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3는 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자 은행에 1996년 8월 1일자 수탁번호 KCTC 0268BP로 기탁되었다.According to the present invention, the novel microorganism Aranicola proteoricicus HY-3, isolated from the intestine of the Korean shaman spider, was deposited with the accession number KCTC 0268BP dated August 1, 1996 to the Gene Bank in the Biotechnology Research Institute of the Korea Institute of Science and Technology.

상기와 같이 단백질 분해 활성을 나타내는 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3로부터 생산되는 단백질분해효소를 분리하기 위해, 먼저 상기 미생물을 배양 배지(박토 트립톤 0.5 %, 효모 추출물 0.5 %, 염화칼륨 0.05 %, 황산마그네슘 0.02 %, pH 7.0)에서 25 ℃로 30 시간 동안 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 단백질을 농축하여 일부 정제된 조효소액을 제조한다. 조효소액을 10 % 중성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하여 밴드를 분리하고 효소 활성 분획을 확인하기 위해 탈지분유 만을 함유한 순수한 평판배지 상에서 단백질 분해 활성을 조사하였을 때 상온에서 즉시 투명환을 형성하였으며, 다시 밴드를 용출하여 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기영동하여 단백질분해효소의 보조단위를 확인한 결과, 본 발명의 미생물에서 분리된 단백질분해효소는 단일 밴드로서 보조단위로 구성되어 있지 않으며 그 분자량은 약 51.5 kd이었다. 분리된 단백질분해효소는 4 ℃의 냉장조건에서도 즉시 투명환을 생성하며 하룻밤 방치하였을 때 직경 10 cm의 평판배지의 탈지분유를 모두 분해한다. 이와 같이 본 발명의 미생물에 의해 생산되는 단백질분해효소는 저온에서 활성을 나타내며 비교적 용이하게 정제할 수 있다.In order to isolate the protease produced from the Aranicola proteoriticus HY-3 of the present invention exhibiting proteolytic activity as described above, the microorganism is first cultured in a culture medium (bacto tryptone 0.5%, yeast extract 0.5%, potassium chloride). 0.05%, magnesium sulfate 0.02%, pH 7.0), and incubated at 25 ° C. for 30 hours, the culture was centrifuged to obtain a supernatant, and the protein was concentrated to prepare some purified coenzyme. The crude enzyme solution was electrophoresed on a 10% neutral polyacrylamide gel to form a transparent ring immediately at room temperature when the proteolytic activity was examined on pure plate medium containing only skim milk powder to separate the bands and to confirm the enzyme active fraction. The eluted band was electrophoresed with 10% SDS-polyacrylamide gel to confirm the subunit of the protease. As a result, the protease isolated from the microorganism of the present invention was not composed of the subunit as a single band and its molecular weight was About 51.5 kd. The separated protease immediately creates a transparent ring even under refrigerated conditions at 4 ° C., and when it is left overnight, it decomposes all the skim milk powders of a plate medium of 10 cm in diameter. As described above, the protease produced by the microorganism of the present invention shows activity at low temperature and can be purified relatively easily.

이하, 하기 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples. However, these Examples are only for illustrating the present invention, the present invention is not limited to these.

<실시예 1> 한국산 무당거미로부터 미생물의 분리 및 동정Example 1 Isolation and Identification of Microorganisms from Korean Sugarless Spiders

(단계 1) 미생물의 분리(Step 1) Separation of Microorganisms

대한민국 대전 및 충청지역에서 채집한 한국산 무당거미를 먼저 머리 부분을 제거한 다음 몸통 부분 만을 70 % 알콜에 10 분간 담구어 표면을 살균하였다. 살균된 거미의 몸통 부분에서 배를 절개하여 체표 부분을 제외한 장을 취하여 생리식염수와 함께 균질기에 넣고 균질화하였다. 균질액을 1 % 탈지분유를 첨가한 고체배지 상에 도말하여 투명환을 형성하는 콜로니를 선별하여 단백질 분해 활성을 나타내는 균주를 얻었다.Korean shaman spiders collected from Daejeon and Chungcheong, Korea were first removed from the head and then the body was immersed in 70% alcohol for 10 minutes to sterilize the surface. The stomach of the sterilized spider was dissected and the intestines except the body surface were taken and placed in a homogenizer with physiological saline and homogenized. The homogenate was spread on a solid medium to which 1% skim milk powder was added, and colonies forming transparent rings were selected to obtain strains showing proteolytic activity.

(단계 2) 분리된 균주의 특성 조사(Step 2) Characterization of Isolated Strains

본 발명에 따라 분리된 단백질분해효소를 생산하는 균주의 미생물학적 특징은 아래와 같다.The microbiological characteristics of the strain producing the protease isolated according to the present invention are as follows.

1) 형태학적 특성1) Morphological characteristics

단계 1에서 얻은 균주를 최적생육배지 조건에서 배양한 후 그람 염색(gram staining) 및 포자 염색 (spore staining)을 실시한 결과, 포자를 생성하지 않는 그람 음성균으로 확인되었다. 전자현미경으로 그 형태를 관찰한 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 0.3 내지 0.5 ㎛의 세포 크기와 0.7 내지 1.2 ㎛의 세포 길이를 갖는 막대형(rod)이었으며, 균체의 몸체 전체에 분포하는(peritrichous) 3개 이상의 편모(flagella)를 함유하는 운동성이 강한 세균으로, 질산염을 아질산염으로 환원시킬 수 있는 질산염환원효소를 생산하는 전형적인 장내 세균류가 갖는 형태적 특징과 일치하였다.After culturing the strain obtained in step 1 under optimal growth medium conditions, gram staining and spore staining were confirmed to be gram-negative bacteria that do not produce spores. As a result of observing the morphology with an electron microscope, as shown in Fig. 1, it was a rod having a cell size of 0.3 to 0.5 μm and a cell length of 0.7 to 1.2 μm and distributed throughout the body of the cell (peritrichous). It is a highly mobile bacterium containing three or more flagella, consistent with the morphological characteristics of typical intestinal bacteria that produce nitrate reductase that can reduce nitrate to nitrite.

2) 생리·생화학적 특성2) Physiological and biochemical characteristics

생리·생화학적 특성은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 β-갈락토시다제, 우레아제 및 오르니틴 디카르복실라제를 생산하고, 구연산을 이용하며, 만니톨, 이노시톨, 솔비톨 등의 알콜성 탄수화물로부터 산을 생성하고, 질산염을 아질산염으로 환원하고 옥시다제 음성을 나타내었다. 이와 같은 생리·생화학적 특성은 장내 세균류가 갖는 일반적인 특성으로 간주할 수 없었다.The physiological and biochemical properties of β-galactosidase, urease and ornithine decarboxylase are produced as shown in Table 1 below, citric acid is used, and acid from alcoholic carbohydrates such as mannitol, inositol, sorbitol, etc. Resulting in reduction of nitrate to nitrite and oxidase negative. Such physiological and biochemical characteristics could not be regarded as general characteristics of intestinal bacteria.

특 성Characteristics 반응성Responsive 운동성(Motility), 36℃Motility, 36 ℃ ++ 카탈라제Catalase ++ 옥시다제(Kovac's)Oxidase (Kovac's) -- β-갈락토시다제β-galactosidase ++ 아르기닌 디하이드롤라제Arginine dehydrolase -- 라이신 디카르복실라제Lysine decarboxylase -- 오르니틴 디카르복실라제Ornithine decarboxylase ++ 페닐알라닌 디아미나제Phenylalanine Deaminase -- 인돌 생성Indole generation -- 보게스-프로스카우어 반응(Voges-Proskauer reaction)Vogues-Proskauer reaction ++ 황화수소 생성Hydrogen sulfide generation -- 우레아 가수분해Urea Hydrolysis ++ 젤라틴 가수분해Gelatin hydrolysis ++ 시트레이트 이용Citrate ++ D-글루코즈, 산D-glucose, acid ++ 락토즈 발효Lactose Fermentation ++ 슈크로즈 발효Sucrose fermentation ++ D-만니톨 발효D-mannitol fermentation ++ 미오-이노시톨 발효Myo-inositol fermentation ++ D-솔비톨 발효D-sorbitol fermentation ++ L-아라비노즈 발효L-arabinose fermentation ++ 라피노즈 발효Raffinose Fermentation ++ L-람노즈 발효L-Rhamnose Fermentation -- 말토즈 발효Maltose fermentation ++ 트레할로즈 발효Trehalose Fermentation ++ 셀로비오즈 발효Cellobiose Fermentation -- 에리트리톨 발효Erythritol fermentation -- 멜리비오즈 발효Melibiose Fermentation -- D-아라비톨 발효D-Arabitol Fermentation -- 글리세롤 발효Glycerol Fermentation ++ 아미그달린 발효Amigdaline Fermentation ++

3) 균체화학적 특성3) Cell Chemical Characteristics

균체를 수확하여 균체내의 지방산 조성, (G+C) 함량 및 이소프로노이드 퀴논의 형태를 분석한 결과, 표 2에 나타낸 바와 같았으며, 균체내 지방산의 경우 탄소수 16 개의 포화 지방산 32 %, 탄소수 17 개의 고리형 포화 지방산 12 %, 그리고 탄소수 16 개 및 15 개를 가지는 복합체 20 %가 주 지방산으로 존재하였다.As a result of analyzing the fatty acid composition, (G + C) content and morphology of isopronoid quinone in the cell, the cells were harvested as shown in Table 2.For the fatty acid in the cell, 32% saturated fatty acid and 16 carbon atoms 12% cyclic saturated fatty acids and 20% complex with 16 and 15 carbon atoms were present as main fatty acids.

특 성Characteristics G+C 함량 (%)G + C content (%) 56.656.6 이소프레노이드 퀴논(Isoprenoid quinone)Isoprenoid quinone Q-8Q-8 균체 지방산(major fatty acid, %)Major fatty acids (%) C12iOC12iO 3.53.5 C14iOC14iO 5.05.0 C16iOC16iO 32.032.0 C17iO cycloC17iO cyclo 12.012.0 C16il isoI/C14iO 3OHC16il isoI / C14iO 3OH 10.010.0 C16il w7c/C15iO 2OHC16il w7c / C15iO 2OH 21.521.5 C18il w7c/w9t/w12tC18il w7c / w9t / w12t 11.511.5 (w9c/w12t/w7c ; w12t/w9t/w7c)(w9c / w12t / w7c; w12t / w9t / w7c)

4) 리보좀 소단위 유전자의 염기서열4) Nucleotide sequence of ribosomal subunit gene

리보좀 소단위 유전자(16S rDNA)는 균체로부터 DNA를 분리한 후 레인(Lane, D. J., 16S/23S rRNA Sequencing, Nucleic acid techniques in bacterial systematics, E. Stackebrandt and M. Goodfellow[eds.], Wiley, 115-175(1991))이 추천하는 프라이머 (8F, 1492R)를 사용하여 Taq DNA 중합효소로 PCR(연쇄중합반응)법에 의해 합성하였다.The ribosomal subunit gene (16S rDNA) was isolated from the cells and then lanes (Lane, DJ, 16S / 23S rRNA Sequencing, Nucleic acid techniques in bacterial systematics, E. Stackebrandt and M. Goodfellow [eds.], Wiley, 115- 175 (1991)) was synthesized by PCR (chain polymerization) method using Taq DNA polymerase using primers (8F, 1492R) recommended.

합성된 리보좀 소단위 유전자를 순수분리하여 pGEM-T 벡터(Promega사)에 클로닝한 후, 대장균(E.coli) JM109 세포에 형질전환시키고, 푸른색 클론 함유 균주를 선별하여 태그 다이디옥시 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(Tag Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystem사)를 사용하여 그 염기서열을 결정하였다.Synthesized ribosomal subunit genes were isolated purely, cloned into pGEM-T vector (Promega), transformed into E. coli JM109 cells, strains containing blue clones were selected, and tagged tagioxy terminator cycle sequencing. The base sequence was determined using a kit (Tag Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystem).

조사된 리보좀 소단위 유전자는 1406 bp로, 그 결과는 도 4에 나타난 바와 같다.The ribosome subunit gene investigated was 1406 bp, and the results are shown in FIG. 4.

(단계 3) 미생물의 동정(Step 3) Identification of Microorganisms

상기 단계 2에서 조사한 형태적, 생리·생화학적 및 균체화학적 특성으로는 미생물의 정확한 동정은 불가능하였다. 장내 세균과(family Enterobacteriaceae)에 속하는 세라티아(Serratia) 속 또는 라넬라(Rhanella) 속으로 분류되었으나, 보다 정확한 동정을 위하여 리보좀 소단위 유전자의 염기서열을 조사하여 이를 분석하기 위하여 미국 국립보건원(NIH)에서 운영하는 GenBank 및 리보좀 소단위 유전자 만을 모아서 계통수와 함께 제공하는 리보좀 데이타베이스(RDP, 미국 일리노이 대학교)의 자료와 비교분석한 결과, 본 발명의 미생물 균주는 진딧물(Acyrthosiphon pisum)의 내생공생균(endosymbiont)과 분류학적으로 가장 근접한 신종의 미생물로 밝혀졌다. 도 2는 이러한 본 발명의 미생물 균주의 분류학적 유연관계도를 나타낸 것이다.The morphological, physiological, biochemical and cellochemical properties investigated in step 2 were impossible to accurately identify the microorganisms. Although it is classified into the genus Serratia or Rhanella belonging to the family Enterobacteriaceae family, the National Institutes of Health (NIH) analyzes the nucleotide sequence of the ribosome subunit gene for more accurate identification. As a result of comparing the data of the ribosome database (RDP, University of Illinois, USA), which collects only the GenBank and ribosomal subunit genes operated by the phylogenetic tree, the microbial strain of the present invention is an endosymbiont of aphid (Acyrthosiphon pisum). ) And the taxonomically closest to the newest microbe. Figure 2 shows the taxonomy of the microbial strain of the present invention.

따라서, 본 발명의 미생물 균주는 학명의 명명체계에 따라 거미에서 유래된 단백질분해효소를 생산하는 세균이라는 뜻으로 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3라 명명하고, 1996년 8월 1일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁되어 수탁번호 KCTC 0268BP를 부여받았다.Therefore, the microbial strain of the present invention is named as Aranicola proteolyticus HY-3, which means a bacterium that produces protease derived from spiders according to the scientific naming system, August 1, 1996. As of date, it was deposited with the Gene Bank within the Biotechnology Research Institute, affiliated with the Korea Institute of Science and Technology, and was given accession number KCTC 0268BP.

<실시예 2> 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3으로부터 단백질분해효소의 생산 및 활성 측정Example 2 Measurement of Production and Activity of Protease from Aranicola Proteoriticus HY-3

(단계 1) 단백질분해효소의 생산(Step 1) Production of Protease

실시예 1에서 분리, 동정된 미생물 균주를 효소 생산 배지(박토 트립톤 0.5 %, 효모 추출물 0.5 %, 염화칼륨 0.05 %, 황산마그네슘 0.02 %)에서 pH를 7.0으로 조정한 후 25 ℃에서 30 시간 배양하였다. 배양액을 원심분리한 후 상등액을 취하고, 아미콘사의 센트리콘-30(Centricon-30)을 사용하여 단백질을 농축하여 조효소액을 얻었다. 조효소액을 함유한 평판배지 상에서 무균조작으로 단백질 분해 활성을 조사한 결과, 5 분후 바로 투명환을 형성하기 시작하였다. 도 3은 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3에 의해 생산된 단백질분해효소의 활성을 중성 폴리아크릴아미드겔 상에서 확인한 결과이다. 다시 이 부분을 용출시켜 10 % SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 결과 단일 밴드로서 보조단위로 구성되어 있지 않으며 그 분자량이 30 kd 이상, 구체적으로 약 51.5 kd임을 확인하였다. 분리된 단백질분해효소는 4 ℃의 냉장조건에서도 즉시 투명환을 생성하며 하룻밤 방치하였을 때 직경 10 cm의 평판배지의 탈지분유를 모두 분해하였다. 이와 같이 하여 실시예 1의 미생물 배양액으로부터 단백질분해효소의 생산을 비교적 용이하게 확인할 수 있었다.The microorganism strains isolated and identified in Example 1 were incubated at 25 ° C. for 30 hours after adjusting the pH to 7.0 in an enzyme production medium (0.5% of bland tryptone, 0.5% of yeast extract, 0.05% of potassium chloride, 0.02% of magnesium sulfate). . After centrifugation of the culture solution, the supernatant was taken, and protein was concentrated using Amicon's Centricon-30 (Centricon-30) to obtain a crude enzyme solution. The proteolytic activity was examined aseptically on the plate medium containing the crude enzyme solution. As a result, a clear ring was formed immediately after 5 minutes. Figure 3 is the result of confirming the activity of the protease produced by Aranicola proteoricicus HY-3 on the neutral polyacrylamide gel. The part was eluted again and subjected to electrophoresis on a 10% SDS-polyacrylamide gel. As a result, it was confirmed that the molecular weight was not more than 30 kd, specifically about 51.5 kd. The separated protease immediately produced a transparent ring even under refrigerated conditions at 4 ° C., and when it was left overnight, all the skim milk powders of the plate medium of 10 cm in diameter were decomposed. In this way, the production of protease from the microbial culture medium of Example 1 could be confirmed relatively easily.

(단계 2) 단백질분해효소의 열 및 pH에 대한 활성 및 안정성 측정(Step 2) Determination of activity and stability of heat and pH of protease

온도 및 pH가 저온성 단백질분해효소의 활성 및 안정성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시예 2 단계 1에서 얻은 조효소액을 이용하여 온도 및 pH에 따른 활성 변화를 조사하였다.In order to investigate the effect of temperature and pH on the activity and stability of the low-temperature protease, the activity change according to temperature and pH was investigated using the crude enzyme solution obtained in Step 1 of Example 2.

단백질분해효소의 활성은 상기 실시예 2 단계 1에서 얻은 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3의 배양액을 사용하여 브라운 및 쉬미츠의 방법(Braun, V. and Schmitz, G., Excretion of a protease by Serratia marcescens, Arch. Microbiol., 124, 55-61(1980))에 따라 측정하였다.The activity of protease was measured by Brown and Schmidz's method (Braun, V. and Schmitz, G., Excretion of a protease by Serratia marcescens, Arch. Microbiol., 124, 55-61 (1980)).

즉, 아조카세인 1.2 g을 50 mM 인산 완충액(pH 7.5) 50 ㎖에 녹여 기질 용액을 제조하고, 기질 용액 600 ㎕와 세포 배양액 100 ㎕를 혼합하여 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 반응액에 10 % 삼염화초산 600 ㎕를 첨가하고 상온에서 1 시간 방치하였다. 7000 rpm으로 원심분리하여 얻은 상등액 600 ㎕에 10 N 수산화나트륨 300 ㎕를 첨가하고 414 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 역가는 1 분 동안 기질과 반응하여 티로신 1 ㎍에 해당하는 아미노산을 방출할 때의 효소량을 1 단위로 하였다.That is, 1.2 g of azocasein was dissolved in 50 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) to prepare a substrate solution. 600 μl of substrate solution and 100 μl of cell culture were mixed and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. 600 µl of% trichloroacetic acid was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. 300 μl of 10 N sodium hydroxide was added to 600 μl of the supernatant obtained by centrifugation at 7000 rpm, and the absorbance was measured at 414 nm. The titer of the enzyme was 1 unit of the amount of enzyme when reacting with the substrate for 1 minute to release an amino acid corresponding to 1 μg of tyrosine.

먼저, 열에 대한 안정성 확인을 위해, 5 ℃에서 80 ℃까지 각 온도별로 2 시간씩 처리하고 상기 방법에 따라 잔존 활성을 측정한 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 20 내지 40 ℃에서 활성이 높았으며, 40 ℃ 이상에서는 급격히 활성이 감소하여 50 ℃에서는 활성이 거의 없는 것으로 확인되었다. 최적 온도는 40 ℃로 나타났다.First, in order to confirm the stability to heat, the treatment was performed for 2 hours at each temperature from 5 ℃ to 80 ℃ and the residual activity was measured according to the above method, the activity was high at 20 to 40 ℃ as shown in Table 3, It was confirmed that the activity rapidly decreased above 40 ° C. and almost no activity at 50 ° C. The optimum temperature was found to be 40 ° C.

온도(℃)Temperature (℃) 55 1010 1515 2020 2525 3030 활성activation 15.303715.3037 23.392223.3922 24.939424.9394 32.067032.0670 31.056431.0564 42.312242.3122 온도(℃)Temperature (℃) 3535 4040 5050 6060 7070 8080 활성activation 50.448550.4485 50.448550.4485 5.64395.6439 5.53655.5365 5.37925.3792 00

다음으로, pH 의존성을 알아보기 위해, 구연산·인산(pH 5), 인산나트륨(pH 6∼7), 트리스-염산(pH 8∼9), 글리신-가성소다(pH 10-11) 등의 완충액에 기질을 녹여 기질 용액을 제조하고, 상기 단계 1에서 얻은 조효소액을 첨가하여 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 활성을 측정하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 여기에서 보듯이, 6 내지 10의 광범위한 pH에서 80 % 이상의 역가를 유지하였다.Next, to examine the pH dependence, buffers such as citric acid and phosphoric acid (pH 5), sodium phosphate (pH 6-7), tris-hydrochloric acid (pH 8-9), glycine-caustic soda (pH 10-11) After dissolving the substrate in to prepare a substrate solution, the reaction was added for 30 minutes at 37 ℃ by adding the coenzyme solution obtained in step 1, the activity is measured and the results are shown in Table 4 below. As seen here, a titer of at least 80% was maintained at a broad pH of 6-10.

pHpH 55 66 77 88 99 1010 1111 활성activation 6.97226.9722 26.376926.3769 37.455037.4550 40.060440.0604 37.337237.3372 28.529728.5297 9.16819.1681

이상에서와 같이, 한국산 무당거미의 장으로부터 분리 동정된 본 발명의 신규 미생물 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3는 20 내지 40 ℃의 온도 및 6 내지 10의 pH에서 안정하며 약 51.5 kd의 분자량을 갖는 단백질분해효소를 생산한다.As described above, the novel microorganism Aranicola proteolyticus HY-3 of the present invention, isolated from the intestine of Korean sugarless spider, is stable at a temperature of 20 to 40 ° C. and a pH of 6 to 10 and is about 51.5. Proteolytic enzymes having a molecular weight of kd are produced.

Claims (2)

한국산 무당거미(Nephila clavata)의 장으로부터 분리한 단백질 분해효소를 생산하는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3(수탁번호 : KCTC 0268BP)Aranicola proteolyticus HY-3, which produces proteolytic enzymes isolated from the intestine of Korean Nephila clavata (Accession No .: KCTC 0268BP) 20 내지 40 ℃의 온도 및 6 내지 10의 pH에서 안정하며 약 51.5 kd의 분자량을 갖는, 제1항의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주가 생산하는 단백질 분해효소.A protease produced by the aranicola proteoricicus HY-3 strain of claim 1, which is stable at a temperature of 20-40 ° C. and a pH of 6-10 and has a molecular weight of about 51.5 kd.
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