KR100811744B1 - Pharmaceutical composition containing arazyme for the prevention and treatment of cancer - Google Patents

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Abstract

A composition comprising arazyme produced by Aranicola proteolyticus is provided to increase body weight, inhibit tumor cells and show the infiltration reduction when administered to a human lung cancer cell line transplanted mouse and decrease the expression amount of MMP-9, NF-kappaB and PCNA, thereby being usefully used as a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer. A pharmaceutical composition for preventing and treating cancer comprises arazyme as an effective ingredient. In the composition, the arazyme is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID : NO. 1 and is isolated from a culture solution of Aranicola proteolyticus which is Aranicola proteolyticus HY-3(deposition no. KCTC 0268BP). Further, the cancer is lung cancer.

Description

아라자임을 유효성분으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물{pharmaceutical composition containing arazyme for the prevention and treatment of cancer} Cancer prevention and treatment of pharmaceutical composition for the Arazyme as an active ingredient, {pharmaceutical composition containing arazyme for the prevention and treatment of cancer}

도 1은 인간 폐암 세포주(A549)가 이식된 누드(Nude) 마우스에 아라자임을 투여한 후, 체중의 변화를 나타낸 그래프이다: Figure 1 following administration of Ara atom in nude (Nude) of the human lung cancer cell line (A549) implanted mouse, and a graph showing changes in weight:

대조군: 아라자임 0 ㎎/㎏, 경구투여; Control group: Arazyme 0 ㎎ / ㎏, oral administration; T1: 아라자임 150 ㎎/㎏, 경구투여; T1: Arazyme 150 ㎎ / ㎏, oral administration; T2: 아라자임 300 ㎎/㎏, 경구투여; T2: Arazyme 300 ㎎ / ㎏, oral administration; 및 T3: 아라자임 600 ㎎/㎏, 경구투여. And T3: Arazyme 600 ㎎ / ㎏, oral administration.

도 2는 인간 폐암 세포주(A549)가 이식된 누드 마우스에 아라자임을 투여한 후, 종양크기를 나타낸 그래프이다: Figure 2 following administration of Ara atom in nude with a human lung cancer cell line (A549) implanted mouse, showing a graph of tumor size:

대조군: 아라자임 0 ㎎/㎏, 경구투여; Control group: Arazyme 0 ㎎ / ㎏, oral administration; T1: 아라자임 150 ㎎/㎏, 경구투여; T1: Arazyme 150 ㎎ / ㎏, oral administration; T2: 아라자임 300 ㎎/㎏, 경구투여; T2: Arazyme 300 ㎎ / ㎏, oral administration; T3: 아라자임 600 ㎎/㎏, 경구투여; T3: Arazyme 600 ㎎ / ㎏, oral administration; * : p<0.05; *: P <0.05; ** : p<0.01. And **: p <0.01.

도 3은 인간 폐암 세포주(A549)가 이식된 누드 마우스에 아라자임을 투여한 후의 조직학적 사진이다(13배율 및 33배율): 3 is a histology picture after the administration of Ara atom in nude mice of a human lung cancer cell line (A549) implant (13 and 33, the magnification ratio):

대조군: 아라자임 0 ㎎/㎏, 경구투여; Control group: Arazyme 0 ㎎ / ㎏, oral administration; T1: 아라자임 150 ㎎/㎏, 경구투 여; T1: Arazyme 150 ㎎ / ㎏, female-to-Oral; T2: 아라자임 300 ㎎/㎏, 경구투여; T2: Arazyme 300 ㎎ / ㎏, oral administration; 및 T3: 아라자임 600 ㎎/㎏, 경구투여. And T3: Arazyme 600 ㎎ / ㎏, oral administration.

도 4는 인간 폐암 세포주(A549)가 이식된 누드 마우스에 아라자임을 투여한 후, MMP-9의 면역조직학적 사진이다(33배율 및 66배율): Figure 4 following administration of Ara atom in nude mice of a human lung cancer cell line (A549) transplantation, and immunohistochemical photographs of MMP-9 (33 and 66 magnification ratio):

대조군: 아라자임 0 ㎎/㎏, 경구투여; Control group: Arazyme 0 ㎎ / ㎏, oral administration; T1: 아라자임 150 ㎎/㎏, 경구투여; T1: Arazyme 150 ㎎ / ㎏, oral administration; T2: 아라자임 300 ㎎/㎏, 경구투여; T2: Arazyme 300 ㎎ / ㎏, oral administration; 및 T3: 아라자임 600 ㎎/㎏, 경구투여. And T3: Arazyme 600 ㎎ / ㎏, oral administration.

도 5는 인간 폐암 세포주(A549)가 이식된 누드 마우스에 아라자임을 투여한 후, MMP-9의 면역 조직화학적 발현 정도를 나타낸 그래프이다: Figure 5 after administration of Ara atom in nude mice of a human lung cancer cell line (A549) transplantation is a graph showing the degree of immunohistochemical expression of MMP-9:

대조군: 아라자임 0 ㎎/㎏, 경구투여; Control group: Arazyme 0 ㎎ / ㎏, oral administration; T1: 아라자임 150 ㎎/㎏, 경구투여; T1: Arazyme 150 ㎎ / ㎏, oral administration; T2: 아라자임 300 ㎎/㎏, 경구투여; T2: Arazyme 300 ㎎ / ㎏, oral administration; 및 T3: 아라자임 600 ㎎/㎏, 경구투여. And T3: Arazyme 600 ㎎ / ㎏, oral administration.

도 6은 인간 폐암 세포주(A549)가 이식된 누드 마우스에 아라자임을 투여한 후, NF-κB의 면역조직학적 사진이다(33배율 및 66배율): Figure 6 following administration of Ara atom in nude mice of a human lung cancer cell line (A549) transplantation, and immunohistochemical photographs of NF-κB (33 magnification, and the magnification 66):

대조군: 아라자임 0 ㎎/㎏, 경구투여; Control group: Arazyme 0 ㎎ / ㎏, oral administration; T1: 아라자임 150 ㎎/㎏, 경구투여; T1: Arazyme 150 ㎎ / ㎏, oral administration; T2: 아라자임 300 ㎎/㎏, 경구투여; T2: Arazyme 300 ㎎ / ㎏, oral administration; 및 T3: 아라자임 600 ㎎/㎏, 경구투여. And T3: Arazyme 600 ㎎ / ㎏, oral administration.

도 7은 인간 폐암 세포주(A549)가 이식된 누드 마우스에 아라자임을 투여한 후, NF-κB의 면역 조직화학적 발현 정도를 나타낸 그래프이다: Figure 7 following administration of Ara atom in nude mice of a human lung cancer cell line (A549) transplantation is a graph showing the degree of immunohistochemical expression of NF-κB:

대조군: 아라자임 0 ㎎/㎏, 경구투여; Control group: Arazyme 0 ㎎ / ㎏, oral administration; T1: 아라자임 150 ㎎/㎏, 경구투여; T1: Arazyme 150 ㎎ / ㎏, oral administration; T2: 아라자임 300 ㎎/㎏, 경구투여; T2: Arazyme 300 ㎎ / ㎏, oral administration; 및 T3: 아라자임 600 ㎎/㎏, 경구투여. And T3: Arazyme 600 ㎎ / ㎏, oral administration.

도 8은 인간 폐암 세포주(A549)가 이식된 누드 마우스에 아라자임을 투여한 후, PCNA의 면역조직학적 사진이다(66배율 및 132배율): Figure 8 after administration of Ara atom in nude mice of a human lung cancer cell line (A549) transplantation, and immunohistochemical photographs of PCNA (66 magnifications and 132 magnifications):

대조군: 아라자임 0 ㎎/㎏, 경구투여; Control group: Arazyme 0 ㎎ / ㎏, oral administration; T1: 아라자임 150 ㎎/㎏, 경구투 여; T1: Arazyme 150 ㎎ / ㎏, female-to-Oral; T2: 아라자임 300 ㎎/㎏, 경구투여; T2: Arazyme 300 ㎎ / ㎏, oral administration; 및 T3: 아라자임 600 ㎎/㎏, 경구투여. And T3: Arazyme 600 ㎎ / ㎏, oral administration.

도 9는 인간 폐암 세포주(A549)가 이식된 누드 마우스에 아라자임을 투여한 후, PCNA의 면역 조직화학적 발현 정도를 나타낸 그래프이다: 9 is following administration of Ara atom in nude mice of a human lung cancer cell line (A549) transplantation is a graph showing the degree of immunohistochemical expression of PCNA:

대조군: 아라자임 0 ㎎/㎏, 경구투여; Control group: Arazyme 0 ㎎ / ㎏, oral administration; T1: 아라자임 150 ㎎/㎏, 경구투여; T1: Arazyme 150 ㎎ / ㎏, oral administration; T2: 아라자임 300 ㎎/㎏, 경구투여; T2: Arazyme 300 ㎎ / ㎏, oral administration; 및 T3: 아라자임 600 ㎎/㎏, 경구투여. And T3: Arazyme 600 ㎎ / ㎏, oral administration.

본 발명은 아라자임을 유효성분으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아라니콜라 프로테오리티쿠스( Aranicola proteolyticus )가 생산하는 아라자임(arazyme)을 함유하는 폐암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. The invention lung containing relates to a pharmaceutical composition for cancer treatment and prevention that the Arazyme as an active ingredient, and more particularly ARA Nicolas proteosome utility kusu Arazyme (arazyme) to produce (Aranicola proteolyticus) preventing and for the treatment relates to a pharmaceutical composition.

폐암은 예후가 매우 불량하며 최근에 전 세계적으로 발생빈도가 급격히 증가하는 추세에 있으며, 국내에서도 이미 암 사망률 제 2위를 차지하고 있다(Bae JM, et Lung cancer is the trend, and that the prognosis is very poor, and the incidence is increasing rapidly in recent years around the world, is already accounted for in the country's second largest cancer mortality (Bae JM, et al ., Cancer al., Cancer Res Res Treat , 34:319-325, 2002). Treat, 34: 319-325, 2002) . 그중에서 폐암의 75% 이상을 차지하는 비소세포 폐암은 진단될 때 65% 이상에서 이미 절제 수술이 불가능한 상태로 발견된다(Scientific Committee of Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory disease, Tubere Non-small cell lung cancer accounts for more than 75% of lung cancer which is found in non-surgical resection is already at least 65% when the diagnostic status (Scientific Committee of Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory disease, Tubere Respir Respir Dis , 46:455-465. Dis, 46: 455-465. 1999). 1999). 최근 외과적 수술 및 방사선요법의 발전, 새로운 항암요법의 개발과 여러 치료법의 복합 적용으로 인하여 더불어 암 환자의 일부 생존율을 향상시키고 있다. Recently, to improve the survival rate of cancer patients, with some due to the development and application of complex treatment of several developments, new chemotherapy of surgery and radiation therapy. 그러나 방사선요법의 경우 피부에 직접적인 영향을 주어 방사선 피부염을 일으킬 수 있으며, 이미 개발된 대부분의 항암제의 경우 강한 항암 치료효과는 가지지만 독성으로 인한 부작용이 크며 재발의 위험이 높은 것으로 알려져 있다. However, can cause radiation dermatitis, given the direct impact on the skin if the radiation therapy, chemotherapy has a strong effect in most cases of cancer are already known to be at high risk of developing the large and only have toxic side effects due to recurrence. 그러므로 부작용이 없거나 적으며 암의 치료효과가 큰 물질을 찾고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 이러한 목적으로 천연물의 생리활성에 대하여 국내외적으로 많은 연구들이 진행되고 있다. So were the side effects, or ever has studied the treatment of cancer to find a great material being actively pursued, there are ongoing studies at home and abroad for the natural bioactive this purpose.

암의 발병에는 유전적 소인도 깊이 관여하지만 환경적 요인 또한 큰 영향을 미치며 선진국일수록 암의 발병이 증가하는 경향을 보이고 있다. There is also deeply involved in the onset of cancer, genetic predisposition, but the more environmental factors also significantly affect developed countries has shown a tendency to increase the incidence of cancer. 이에 관해 가능한 원인으로는 농약, 살충제 등의 사용량 및 식품 내 잔유량 증가, 식품 보존제, 방부제, 착색제 등이 첨가된 가공식품의 소비 증가, 수질, 토양, 대기오염의 증가, 현대인의 스트레스 증가, 활동량의 감소 그리고 풍요로운 식생활을 통한 비만 등이 보고되어 있다(kim HJ, et Thus as about the possible causes are pesticides, increased usage and food within janyuryang such as pesticides, food preservatives, preservatives, and the increased consumption of the added processed food coloring agents, etc., water, soil, increase of the air pollution, the increase in modern stress, the amount of activity and reducing obesity has been reported by the affluent diet (kim HJ, et al ., Liv al., Liv Sci Sci of of Tj Tj Univ . Univ. 3:99-130, 1997; 3: 99-130, 1997; Jacobs MM, Nutr Tod , 28(3):19-23, 1993) . Jacobs MM, Nutr Tod, 28 ( 3): 19-23, 1993).

종양이 성장과 전이를 하기 위해서는 신생혈관 형성이 필수 과정이다(Folkman J, J Natl To the tumor growth and metastasis is a required process angiogenesis (Folkman J, J Natl Cancer Inst , 82:4-6, 1990). Cancer Inst, 82: 4-6, 1990 ). 신생혈관 형성은 증식하는 종양에 영양분과 산소를 공급해 줄 뿐만 아니라 원발병소로부터 혈관벽을 통한 종양세포의 관통과 원격장기에 전이를 가능하게 한다(Kim KJ, et al ., Nature , 362:841-844, 1993). Angiogenesis is not only to supply nutrients and oxygen to the tumor growth can be a transition to the tumor cells through the remote organs through the blood vessel wall from the primary site (Kim KJ, et al, Nature , 362:. 841-844 , 1993). 폐암은 조직학적으로 정상 기관지 상피세포가 증 식(hyperplasia), 화생(metaplasia), 이형성(dysplasia), 상피내 암종(carcinoma in situ)의 변화를 거쳐서 암으로 발생하면서(Mulshine JL, et Lung cancer, while in normal bronchial epithelial cells histologically via the change in the increase expression (hyperplasia), metaplasia (metaplasia), dysplastic (dysplasia), intraepithelial carcinoma (carcinoma in situ) caused by cancer (Mulshine JL, et al ., Oncology , 5:25-32, 1991) 점진적으로 많은 대립유전자들의 소실이 증가하는 것으로 잘 알려져 있다(Wistuba II, et al, Oncology, 5:. 25-32 , 1991) It is well known that a gradual increase in the loss of many alleles (Wistuba II, et al ., Oncogene , 18:643-650, 1991). al, Oncogene, 18:. 643-650 , 1991).

한편, 본 발명자들은 새로운 단백질 분해효소를 개발하고자 노력한 결과, 한국산 무당거미( Nephila clavata )로부터 신규 미생물인 아라니콜라 프로테오리티쿠스( Aranicola On the other hand, the present inventors to develop a new protease sought results, Korean spider novel microorganism of Ara Nicolas proteosome utility kusu from (Nephila clavata) (Aranicola proteolyticus ) HY-3 균주(수탁번호 : KCTC 0268BP; WO 01/57222호)를 분리하였으며, 본 균주로부터 신규한 단백질 분해효소인 아라자임(arayzme)을 분리하였다. proteolyticus) HY-3 strain (accession number: KCTC 0268BP; WO 01/57222 was to remove the call), and separating the novel protease of Arazyme (arayzme) from this strain. 아라자임(arazyme)은 저온과 높은 염 농도에서 안정된 단백질 분해 활성을 나타낼 뿐 만 아니라 사람의 체온인 37℃에서 가장 높은 활성을 보였으며 넓은 pH 범위에서도 안정된 활성을 나타내는 것을 발견하고 본 단백질 분해효소의 유전자를 확인하였다(WO 01/57222호). Arazyme (arazyme) is found and the protease that indicates a low temperature and at a high salt concentration but they represent a stable proteolytic activity, but showed the highest activity at the temperature of 37 ℃ human stable activity over a wide pH range it was confirmed the gene (WO 01/57222 call).

본 발명자들은 아라니콜라 프로테오리티쿠스( Aranicola The present inventors Ara Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus ) 균주에서 유래한 아라자임(arazyme)의 효과를 조사한 결과, 아라자임이 인간 폐암 세포주(A549)를 이식한 누드(Nude) 마우스에서 체중의 증가와 종양세포 억제작용을 일으키며 MMP-9, NF-κB 및 PCNA의 발현양상을 감소시키는 것을 확인하고 암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다. results of the investigation of the effect of Arazyme (arazyme) derived from proteolyticus) strain, Arazyme yi in the nude (Nude) mouse transplanted with human lung cancer cell line (A549) causes an increase in the tumor inhibitory action of the weight MMP-9, NF as confirmed in reducing the expression of PCNA and balhim -κB and that may be useful as a pharmaceutical composition for cancer treatment and prevention, thereby completing the present invention.

본 발명의 목적은 폐암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로서 아라니콜라 프로테오리티쿠스( Aranicola proteolycius )가 생산한 아라자임(arazyme)의 새로운 용도를 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide a new use of ARA Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolycius) is a Arazyme (arazyme) production as an active ingredient of a pharmaceutical composition for lung cancer treatment and prevention.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention ARA provides a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer containing the atom (arazyme) as an active ingredient.

또한, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 유효성분으로 함유하는 암 예방용 건강식품을 제공한다. In addition, Ara Nicolas Pro culture medium or a separation therefrom Arazyme Theo utility kusu provides health food for preventing cancer containing as an active ingredient.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 조성물을 제공한다. Further, the cancer metastasis provides a composition for preventing and inhibiting Arazyme containing as an active ingredient.

또한, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 유효성분으로 함유하는 암전이 예방용 건강식품을 제공한다. In addition, Ara Nicolas proteosome cancer metastasis containing the liquid culture or the separated Arazyme therefrom as an active ingredient of the utility kusu provides health food for prevention.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 MMP-9 발현 억제제를 제공한다. It also provides the expression of MMP-9 inhibitor comprising, as an active ingredient Arazyme.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 발현억제제를 제공한다. Also provides NF-κB expression inhibitors containing Arazyme as an active ingredient.

아울러, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 PCNA 발현억제제를 제공한다. In addition, ARA provides PCNA expression inhibitors containing an atom as an active ingredient.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. The invention Ara provides a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer containing the atom (arazyme) as an active ingredient.

상기 암은 폐암인 것을 특징으로 한다. The cancer is characterized in that lung.

본 발명의 아라자임은 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주가 생산하는 효소로서, 1) 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 배양하여 배양액을 얻는 단계; Arazyme of the present invention ARA Nicolas proteosome kusu utility as an enzyme to produce a strain, 1) Ara Nicolas proteosome to afford a culture medium by culturing the utility kusu strain; 2) 상기 배양액을 여과하여 상등액을 얻는 단계; 2) obtaining a supernatant and the culture solution was filtered; 및 3) 상등액내 포함된 상기 아라자임을 수지를 이용하여 정제하는 단계로 제조할 수 있다(WO 01/57222호). And 3) can be manufactured according to the Arazyme contained within the supernatant by purifying using a resin (WO 01/57222 call). 아라자임을 생산하는 미생물로서 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 이용하는 것이 바람직하며, 한국생명공학연구원 유전자은행에 1996년 7월 29일자로 기탁된 수탁번호 KCTC 0268BP호의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3를 이용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. A microorganism that produces Arazyme Ara Nicolas pro Theo and desirable to use a utility Syracuse strains, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology The accession number of the deposit as of July 29, 1996 in the gene bank KCTC 0268BP favor Ara Nicolas proteomic utility Syracuse HY-3 it is not the one that is more preferably limited to this use. 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주는 거미 장내에서 분리한 호기성의 그람 음성 세균으로서, 0.5 ~ 0.8 ㎜ 크기의 구형이고 운동성을 가지고 있으며 카탈라아제(catalase)에는 양성 반응을, 옥시다아제(oxidase)에는 음성반응을 나타낸다(대한민국 특허 제 0220091호). Ara Nicolas proteosome utility kusu HY-3 strain is a Gram-negative bacteria of the aerobic isolated from spider intestine, have a spherical and mobility of 0.5 ~ 0.8 ㎜ size, and catalase (catalase) has tested positive, oxidase (oxidase), the voice shows the reaction (Republic of Korea Patent No. 0220091). 본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 수득된 아라자임을 이용하였다. In the present invention, using the Arazyme obtained in the same manner as described above.

본 발명의 아라자임은, (a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; Arazyme of the present invention, polypeptides comprising the amino acid sequence represented by (a) SEQ ID NO: 1; (b) 서열번호 1과 70% 이상 상동성을 가지며, (a)의 폴리펩티드와 생물학적으로 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드; (B) has the SEQ ID NO: 1 with at least 70% homology to a polypeptide having the same function as the polypeptide with the biological of (a); 및 (c) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 서열을 가지나, (a)의 폴리펩티드와 생물학적 으로 동등한 폴리펩티드를 포함하는 단백질이어도 무방하다. And (c) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 gajina the polypeptide sequence has one or a plurality of amino acids consisting of substitution, deletion, addition and / or inserted amino acid sequence, including the same polypeptide as the polypeptide with the biological of (a) It may be a protein but may.

상기 아라자임(arazyme)의 폐암에 대한 항암 효능을 검정하기 위하여, 인간 폐암 세포주(A549)를 이식한 누드(Nude) 마우스를 대조군(아라자임 0 ㎎/㎏ 투여), T1(아라자임 150 ㎎/㎏ 투여), T2(아라자임 300 ㎎/㎏ 투여) 및 T3(아라자임 600 ㎎/㎏ 투여)의 4개의 그룹으로 나누어 아라자임을 반복 경구 투여하였다(표 1 참조). In order to test the anti-cancer efficacy for cancer of the Arazyme (arazyme), control group (Arazyme 0 ㎎ / ㎏ administration) to a nude (Nude) mouse transplanted with human lung cancer cell line (A549), T1 (Arazyme 150 ㎎ / ㎏ administration), T2 (Arazyme divided into four groups of 300 ㎎ / ㎏ administration) and T3 (Arazyme 600 ㎎ / ㎏ administration) the Arazyme repeatedly orally administered (see Table 1).

아라자임은 멸균 주사용수에 용해시켜 주 6회 경구 투여용 존대(zonde)를 이용하여 강제 투여를 실시하였다. Arazyme is forced administration was carried out using a dissolving state jondae (zonde) 6 times for oral administration, in sterile water for injection. 아라자임 투여 후 체중 측정 및 일반 증상을 관찰하였으며 종양의 발생정도를 주 1회씩 관찰하고, 그 크기를 측정하였고 아라자임 투여 12주 후 부검을 실시하였다. Arazyme after administration was observed for weight measurement and general symptoms were observed around the main tumor occurs once, and measuring the size Arazyme administration autopsy was performed at the 12 week. 육안 병리 소견에서는 전 장기에서 특별한 이상 소견이 관찰되지 않았고, 현미경 관찰에 있어서도 아라자임 투여에 의한 실질장기의 이상소견은 모든 개체에서 관찰되지 않았다. The gross pathology was not observed any special abnormality in all organs, abnormalities of the organs due to the substantial Arazyme also administered to the microscope was not observed in any object. 체중은 아라자임을 300 ㎎/㎏(T2) 및 600 ㎎/㎏(T3) 투여한 그룹에서 증가하였다(표 2 및 도 1참조). Weight was increased in the Arazyme 300 ㎎ / ㎏ (T2) and 600 ㎎ / ㎏ (T3) administration group (see Table 2 and Figure 1). 인간 폐암 세포주(A549)를 이식한 누드 마우스에서 채취한 종양조직의 크기측정 및 헤마톡살린-에오신 염색(Hematoxylin-eosin staining, H&E 염색)으로 면역 조직화학적 관찰을 실시한 결과 300 ㎎/㎏(T2) 및 600 ㎎/㎏(T3)의 아라자임을 투여한 그룹에서 아라자임의 농도 의존성으로 종양발생 억제 효과 및 종양세포 침윤현상의 감소가 관찰되었다(도 2 및 도 3 참조). Human lung cancer cell line (A549) size measurements of the tumor tissue taken from the nude mouse-transplanted and the hematoxylin saline-eosin staining (Hematoxylin-eosin staining, H & E staining) in the result 300 ㎎ / ㎏ (T2) subjected to immunohistochemical observation and in the administration of Arazyme group of 600 ㎎ / ㎏ (T3) in a dose-dependent inhibitory effect of Arazyme the tumorigenesis and tumor cells reduced the invasion was observed (Fig. 2 and 3).

매트릭스 매탈로프로테인아제(matrix metalloproteinases; MMPs)는 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)을 분해하는 단백분해 효소로서(Matrisan LM, Trends Protein Kinase maetal a matrix (matrix metalloproteinases; MMPs) are extracellular matrix; as proteolytic enzymes that break down (extracellular matrix ECM) (Matrisan LM , Trends Genet , 6:121-125, 1990) MMPs의 생성이 증가하면 염증과 더불어 여러 종류의 암에서 침윤도와 전이가 증가하는 것으로 알려져 있다(Stearns MA, et Genet, 6: 121-125, 1990) if the increased production of MMPs are known to the chimyundo with inflammation and metastasis increases in several types of cancer (Stearns MA, et al ., Cancer al., Cancer Res , 53:878-883, 1993). Res, 53: 878-883, 1993) . 종양의 전이과정 중 혈관 기저막의 가장 중요한 구조물인 콜라겐 타입(collagen type) Ⅳ의 분해가 이루어져야 비로소 체내 혈류로의 전이가 가능하며 이러한 콜라겐 타입 Ⅳ의 분해는 MMPs 중에서 주로 MMP-9 및 MMP-2에 의해서 이루어진다(Liotta LA, et Mainly MMP-9 and MMP-2 in a blood vessel most important structure of the collagen type of basement membrane (collagen type) made the decomposition of Ⅳ finally enable the transition to the body, blood flow, and degradation of these collagen type Ⅳ was MMPs in tumor metastasis It made by (Liotta LA, et al ., Cell , 64:327-336, 1991). al, Cell, 64:. 327-336 , 1991). MMP는 또한 신생혈관형성에서 혈관 내피세포의 이동과 발아에 필요한 물질로 인식되고 있다(Fisher C, et MMP is also being recognized as a material for the mobile and sprouting of vascular endothelial cells in angiogenesis (Fisher C, et al ., Devel al., Devel Biol , 162:499-510, 1994). Biol, 162: 499-510, 1994) . MMP의 활성은 1) MMP 유전자의 전사 조절; Activities of MMP 1) transcriptional regulation of MMP genes; 2) 전구체의 활성; 2) The activity of the precursor; 3) 지질특이성의 차이; 3) differences in lipid specificity; 및 4) 알파-매크로 글로블린(a-macroglobulins)과 조직 매트릭스 매탈로프로테인아제 저해제(tissue matrix metalloproteinases inhibitor; TIMPs)와 같은 MMP 억제물질 등에 의해 조절된다(Birkedal-Hansen. H, J periodontol , 64:474-484, 1993). And 4) alpha-macro globulin (a-macroglobulins) and tissue matrix maetal a protein inhibitor (tissue matrix metalloproteinases inhibitor; TIMPs) and is controlled by a MMP inhibitor such as (Birkedal-Hansen H, J periodontol , 64:. 474 -484, 1993). MMP-9의 발현을 조절하는 상위 신호전달 기전에는 미토겐-활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinases; MAPKs)를 포함하는 성장인자, 사이토카인, 종양촉진인자 등이 관여한다. Top signaling mechanism to regulate the expression of MMP-9, the mitogen-activated protein kinase; involved the like (mitogen-activated protein kinases MAPKs) growth factors, cytokines, tumor promotion factors including the. 이 중 p38 키나아제(kinase) 및 세포 외부의 신호에 의해 조절된 단백질 키나아제(extracellular signal-regulated protein kinase; ERK)는 염증 사이토카인이나 아포토시스 관련신호 및 성장인자 등에 의하여 활성화된다. Of the p38 kinase (kinase) and protein kinase A cell controlled by a signal from an external (extracellular signal-regulated protein kinase; ERK) is activated by inflammation, such as cytokines or growth factors, and apoptosis-related signal. 활성화된 MAPKs는 핵으로 이동하여 MMP 시발체 주변의 전사인자 결합부와 반응하여 다양한 전사인자를 활성화시킴으로써 하위 표적 단백질의 발현을 조절한다. Activated MAPKs regulates the expression of the target protein by the lower, go to the nucleus by reaction with MMP primer around the transcription factor binding portion of a different transcription factor activation. 대부분 암은 암세포의 기질 침습, 원발병소에서 혈관계로의 이동, 혈관에서 이차 병소로의 이동, 이차 종양의 형성이라는 과정을 통하여 원발병소에서 이차병소로 전이된다. Most cancer metastases are in movement to vascular invasion in the substrate, primary site of cancer, the primary tumor through the process of movement, the formation of secondary tumors to the secondary lesion in the blood vessel as a secondary lesion. 암세포의 기질 침습에는 단백 분해효소에 의한 세포 외기질의 분해가 요구되는데 MMPs는 세포 외기질을 분해하는 가장 핵심적인 효소이다. Temperament invasion of cancer cells, the ambient air quality degradation by proteolytic enzymes are required MMPs is the key enzyme that degrades the extracellular matrix. 다양한 MMPs중에서 MMP-2 및 MMP-9는 각각 72 및 92 kDa의 콜라겐아제(collagenase)로서 세포의 기저막을 형성하는 콜라겐을 분해하여 암의 침습과 전이를 촉진한다(Himelstein BP, et And by a variety of collagen dehydratase (collagenase) of 72 and 92 kDa MMP-2 and MMP-9 in MMPs are each decomposing collagen to form the basement membrane of the cell facilitate the invasion and metastasis of cancer (Himelstein BP, et al ., Invasion al., Invasion Metastasis , 14:246-258, 1994). Metastasis, 14: 246-258, 1994) .

본 발명에서는 암의 침습과 전이를 촉진하는 MMP-9의 발현이 아라자임에 의해 감소됨을 확인할 수 있었고(도 4 및 도 5 참조) 이는 아라자임의 항암 효능을 나타낸다. In the present invention, of MMP-9 for promoting invasion and metastasis of cancer expression it could determine the reduced by Arazyme (see Figs. 4 and 5) which indicates the antitumor efficacy of Arazyme.

핵 전사 인자-카파B(nuclear transcription factor-κB; NF-κB)는 다양한 환경적 자극에 대한 반응으로 활성화되는 유도전사 인자이다( Baeuerle, PA and Baichwal, VR, Adv Nuclear transcription factor-kappa B (nuclear factor-κB transcription; NF-κB) is a derived transcription factors that are activated in response to various environmental stimuli (Baeuerle, PA and Baichwal, VR , Adv Immunol 65:111-137, 1997; Immunol 65: 111-137, 1997; Auphan, N, et Auphan, N, et al ., Science , 270:286-290, 1995). al, Science, 270:. 286-290 , 1995). 잠정적 형태의 NF-κB는 세포질(cytoplasm)에 있는 억제단백질, I-κB에 결합되어 있다. NF-κB in the interim shape is coupled to the inhibitory protein, I-κB in the cytoplasm (cytoplasm). 다양한 NF-κB 활성인자, 즉 종양괴사인자(tumor necrosis factor), IL-1, 리포다당체(lipopolysaccharides) 및 UV(ultraviolet) 등의 자극은 억제단백질인 I-κB의 인산화반응(phosphorylation) 및 유비퀴틴이 표지되는 과정(ubiquitination)을 통하여 분해(degradation)를 유도하게 된다. The various NF-κB activity factor, i.e., TNF (tumor necrosis factor), IL-1, Lipo polysaccharide (lipopolysaccharides) and UV (ultraviolet) stimulation phosphorylation (phosphorylation) and ubiquitination of I-κB inhibitory protein, such as is induced decomposition (degradation) throughout the process (ubiquitination) are labeled. 이러한 과정은 I-κB와 분리된 NF-κB를 핵으로 이동시켜 표적 유전자의 프로모터 부위에 있는 NF-κB-결합 자리(NF-κB-binding site)와의 결합을 가능하게 하여, 표적 유전자의 발현을 촉진시킨다(Baldwin, AS, Annu To make this process enables binding to NF-κB- binding site (NF-κB-binding site) in the promoter region of target gene to go to the nucleus NF-κB and I-κB separation, the expression of the target gene facilitates (Baldwin, AS, Annu Rev Immunol , 14:649-683, 1996; Rev Immunol, 14: 649-683, 1996 ; Huxford T, et Huxford T, et al ., Cell , 95:759-770, 1998). al, Cell, 95:. 759-770 , 1998). NF-κB는 약물 불응성의 또 다른 영향인자이다. NF-κB is another factor affect the drug refractory Province. 이는 사이토카인 합성의 중요한 조절인자이며, 면역반응이나 염증반응에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 증가시키는 전사인자로 활성화되면 핵 내로 이동하여 염증 유전자의 발현을 증가시킨다. This is an important regulator of the synthesis cytokines when activated by transcription factors that increase the expression of various genes involved in the immune response or inflammatory reaction to move into the nucleus and increases the expression of inflammatory genes.

본 발명에서는 이러한 NF-κB의 발현이 아라자임의 투여에 의해 감소되었으며(도 6 및 도 7 참조) 이는 아라자임에 의한 종양세포의 감소를 의미한다. In the present invention, is of such NF-κB expression was reduced by the administration of Arazyme (see Figs. 6 and 7) which means a decrease of the tumor cells by Arazyme.

PCNA는 세포주기 중 G0 단계(G0 phase)에는 존재하지 않으며, G1 단계(G1 phase) 동안에 증가하기 시작해서 S 단계(S phase)에 가장 많이 합성되고 G2 단계(G2 phase)에 감소되는, 36 kDa의 세포내 DNA 폴리머라제 델타(DNA polymerase delta)의 보조적인 단백질로, 세포의 DNA 합성과 세포의 증식에 필수적인 것으로 알려져 있다(Miyagawa S, et PCNA is, it does not exist in G0 phase (G0 phase) of the cell cycle, G1 phase (G1 phase) starts to increase during the most widely synthesized in step S (S phase) is reduced in the G2 phase (G2 phase), 36 kDa of cells with the DNA polymerase delta auxiliary protein (DNA polymerase delta), known to be essential for DNA synthesis and cell proliferation of the cells (Miyagawa S, et al ., J Invest al., J Invest Dematol , 93:678-681, 1989). Dematol, 93: 678-681, 1989) . 일반적으로 PCNA의 조직면역형광법은 종양조직에서 성장에 관여하는 부분이 얼마 만큼인지 알려주는 척도로 작용한다. Typically, organizations immunofluorescence of PCNA acts as the scales tell us whether as a part involved in tumor growth in some time. PCNA 발현은 각질세포의 증식상태, 신경교증, 착색된 피부병변, 폐의 비소세포성암의 조직 병리학적 등급과 관련 있다고 알려져 왔다(Underhill C, J Cell PCNA expression was known to keratinocyte proliferation conditions, glial syndrome, pigmented skin lesions, histopathological grade and non-small cell carcinoma of the lung has been associated (Underhill C, J Cell Sci , 103:293-298, 1992). Sci, 103: 293-298, 1992) .

아라자임의 투여에 의해 PCNA의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며(도 8 및 도 9 참조) 종양조직의 성장이 감소하였음을 의미한다. It was found that the decrease in expression of PCNA by administration of Arazyme (see Figs. 8 and 9) means that the tumor growth is reduced hayeoteum.

인간 폐암 세포주(A549)를 이식한 누드 마우스에 본 발명의 아라자임(arazyme)을 투여한 결과 체중의 증가와 종양부피가 감소되는 양상을 보임으로써 항암 효과를 나타냈으며 조직병리학적으로는 종양세포의 침윤현상이 약한 것을 관찰 할 수 있었고 면역 조직화학적으로는 MMP-9, NF-κB 및 PCNA의 발현양상이 감소된 것을 관찰할 수 있었다. Exhibited an anti-cancer effect by showing an increase in tumor patterns which volume reduction of the results of administration of Arazyme (arazyme) of the present invention weight the nude mouse transplanted with human lung cancer cell line (A549) of histopathological to the tumor cells It was observed that the saturation phenomenon in the weak immunohistochemical was observed that the expression of MMP-9, NF-κB and PCNA reduced.

이상의 결과는 아라자임이 항암 및 암 예방 효능의 잠재력을 가지고 있음을 의미한다. These results mean that Arazyme has the potential of anti-cancer and cancer prevention benefits. 또한 아라자임을 암컷 위스터(Wistar) 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 0, 1250, 2500 및 5000 ㎎/㎏ 농도에서 일반증상과 육안 병리 소견에서 아무런 이상 소견이 나타나지 않았다. Also it did not show any abnormalities in general signs and gross pathology results from oral administration to a female Arazyme above requester (Wistar) rats by performing a toxicity test, 0, 1250, 2500 and 5000 ㎎ / ㎏ concentration. 이상과 같이 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD 50 )은 적어도 5,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단된다. As described above, a 50% lethal dose by oral administration toxicity test (LD 50) is determined to be a safe substance is at least 5,000 ㎎ / ㎏. 그러므로 본 발명의 아라자임은 암 예방 및 치료용 약학적 조성물로서 제공될 수 있다. Therefore Arazyme of the invention may be provided as a pharmaceutical composition for cancer treatment and prevention.

본 발명의 아라자임에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. The active ingredient having the same or similar function in addition to the Arazyme of the present invention may contain one or more. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. For administration can be produced to include additional pharmaceutically acceptable carriers to at least one. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따 라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. Carrier capable pharmaceutically acceptable saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and may be used by mixing these ingredients one-component or more of antioxidants, as needed buffer , it may be added other conventional additives such as bacteriostatic agents. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화 할 수 있다. In addition, it can be formulated diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants by the addition added in an aqueous solution, suspension, emulsion state using dosage forms such as liquid, powder, tablets, capsules, pills, granules, injection solutions, or zero. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. Using a more suitable way to the field or Remington's Pharmaceutical Science of sugar addition method disclosed in (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990) can be preferably formulated according to each disease or component according to.

본 발명의 암 예방 및 치료용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. Parenteral administration according to a method for the prevention of cancer and therapeutic pharmaceutical composition of the invention is the purpose (for example, intravenous application to, subcutaneous, intraperitoneal, or topical), or can be administered orally, and the dose weight of the patient, depending on age, gender, health condition, diet, administration time, administration method, excretion and severity of the disease varies in scope. 본 발명에 따른 아라자임의 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏ 이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다. The daily dosage of Arazyme according to the present invention is 0.01 ~ 5000 ㎎ / ㎏, preferably 0.01 ~ 10 ㎎ / ㎏, it is more preferred to divide the daily dose once to several times.

또한, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 유효성분으로 함유하는 암 예방용 건강식품을 제공한다. In addition, Ara Nicolas Pro culture medium or a separation therefrom Arazyme Theo utility kusu provides health food for preventing cancer containing as an active ingredient.

본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 식품 첨가물로 이용할 경우, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 상기의 아라자임을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 이용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 이용될 수 있다. When using the ARA Nicolas proteosome culture of utility kusu or separated therefrom Arazyme of the present invention as a food additive, as it was added to the culture medium or the in Arazyme Ara Nicolas proteosome utility Syracuse, or used in conjunction with other foods or food ingredients It may be, may be suitably used in a conventional manner. 아라자임은 상기와 같은 동일한 방법으로 수득하여 이용한다. Arazyme is used to give the same manner as described above. 유효 성분의 혼합양은 이용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. The amount of mixture of the active ingredients can be regulated according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다. In general, in the manufacture of a food or beverage include Ara Nicolas proteosome culture or the Arazyme separation therefrom of utility kusu of the present invention is 0.01 to 10 parts by weight based on the raw material, it is preferably added in an amount of 0.05 to 1 parts by weight . 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 이용될 수 있다. However, for health and hygiene long term administration of the, or for health control purposes there can be less than the amount of the above-mentioned range, the active ingredient since there is no problem in terms of safety may also be used with more than the above range amounts .

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. The type of food is not limited. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. Examples of foods that can be added to the material meats, sausages, breads, chocolates, candies, seunekryu, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, and alcoholic drinks and vitamin complex, etc, and includes all kinds of health food in general meaning.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. The composition for health beverages of the present invention may contain as an additional component such as various flavors or natural carbohydrates, as conventional beverages. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. The above-described natural carbohydrate is a sugar alcohol of the polysaccharide, xylitol, sorbitol, and pentaerythritol, such as disaccharides, and dextrin, cyclodextrin, such as monosaccharides, maltose, sucrose, such as glucose and fructose. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 이용할 수 있다. Natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract as a sweetener, may be used such as synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 음료 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다. The content of the natural carbohydrate is approximately 0.01 ~ 0.04 g, preferably about 0.02 ~ 0.03 g per 100 generally ㎖ beverage compositions of the present invention.

상기 외에 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 이용되는 탄산화제 등에 첨가할 수 있다. The addition to ARA Nicolas proteosome culture or the Arazyme separation therefrom of utility kusu are various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acid, protective colloidal thickeners, pH can be added for adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonated agents used in carbonated beverages or the like. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육에도 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 첨가할 수 있다. In addition, there may be added a natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage in the pulp for the production of ARA Nicolas proteosome culture of utility kusu or separated therefrom Arazyme. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 이용할 수 있다. These ingredients can be used alone or in combination. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. It is generally such that the ratio of the additive does not significantly important in the selection Ara Nicolas proteosome utility kusu range from which the liquid culture or the separated Arazyme per 100 parts by weight of 0.01 to 0.1 parts by weight of the present invention.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물을 제공한다. It also provides a cancer metastasis prevention and suppression pharmaceutical composition containing as an active ingredient Arazyme.

또한, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 유효성분으로 함유하는 암전이 예방용 건강식품을 제공한다. In addition, Ara Nicolas proteosome cancer metastasis containing the liquid culture or the separated Arazyme therefrom as an active ingredient of the utility kusu provides health food for prevention.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 MMP-9 발현 억제제를 제공한다. It also provides the expression of MMP-9 inhibitor comprising, as an active ingredient Arazyme.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 발현억제제를 제공한다. Also provides NF-κB expression inhibitors containing Arazyme as an active ingredient.

아울러, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 PCNA 발현억제제를 제공한다. In addition, ARA provides PCNA expression inhibitors containing an atom as an active ingredient.

이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다. Performing more than the present invention, experimental examples and will be explained in detail by formulation examples.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제제예에 한정되는 것은 아니다. The following Examples, Experimental Examples and Formulation Examples are not limited to the examples, experimental examples and formulation examples of this disclosure, it may make the present invention to illustrate the invention.

< 실시예 1> 아라자임 ( arazyme )의 제조 <Example 1> Preparation of Arazyme (arazyme)

본 발명의 유효성분인 아라자임(arazyme)을 제조하기 위하여, 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주(KCTC 0268BP)를 배양배지(박토 트립톤 0.5 %, 효모 추출물 0.5 %, 염화 나트륨 0.1 %, 염화 칼륨 0.05 %, 염화 칼슘 0.02 %, 황산 마그네슘 0.02 %)에서 22℃로 18 시간 동안 배양하였다. In order to prepare a Arazyme (arazyme) an active ingredient of the present invention, Ara Nicolas proteosome utility kusu HY-3 strain (KCTC 0268BP) in the culture medium (Bacto tryptone 0.5%, 0.5% yeast extract, 0.1% sodium chloride, from 0.05% potassium chloride, 0.02% calcium chloride, magnesium sulfate 0.02%) to 22 ℃ and incubated for 18 hours. 배양액을 2 ㎛ 막여과를 이용해서 균체와 상등액을 분리한 다음 분리된 상등액을 10 kDa의 막 여과를 이용하여 농축하였다. One using the culture solution 2 ㎛ membrane filtration separating the microbial cells and the supernatant, and then the separated supernatant was concentrated using a filtration membrane of 10 kDa. 본 발명의 아라자임은 기본적으로 음이온의 특성을 가지므로 농축액을 50 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 DEAE-셀룰로오즈(DEAE-cellulose)를 이용한 이온 교환 수지(ion exchange resin)와 20 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 세파덱스 G-75(Sephadex G-75)를 이용한 젤 여과 교환수지(gel filtration exchange resin)를 이용해 정제를 했다. Arazyme of the present invention is basic, so as to have the characteristics of the anion concentrate 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) using an ion exchange resin to a pre-treatment by DEAE- cellulose (DEAE-cellulose) to (ion exchange resin) and 20 mM tris-HCl buffer with a (pH 7.6) a Sephadex G-75 (Sephadex G-75) gel filtration exchange resin (gel filtration exchange resin) using a pre-treatment to said tablets. 정제된 효소액은 10% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 전기영동(electrophoresis)을 하여 밴드 경향을 확인하였는데 그 결과 본 발명의 아라자임은 소단위를 갖지 않는 단일체(monomer)로서 약 51.5 kDa의 분자량을 갖는 밴드를 나타냄을 확인하였다. It was purified enzyme liquid is a 10% SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel) by electrophoresis (electrophoresis) confirmed the band tends to result Arazyme of the present invention is a monolith (monomer) having no subunits of about 51.5 kDa was confirmed in the band indicates a molecular weight. 단, 아라자임 생산을 위한 아라니콜라 프로테오리티쿠수 HY-3 균주(KCTC 0268BP)는 다양한 산업용 배지에서 생산을 할 수 있으며 생산된 배양액 또한 다양한 방법으로 분리 및 정제하여 이용할 수 있다. However, it is possible to produce in a variety of industrial media Ara Nicolas proteosome utility Kusu HY-3 strain for production Arazyme (KCTC 0268BP) and the production culture medium also can be used to separate and purify a variety of ways. 본 발명의 아라자임은 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드 서열을 가지며, 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다. Arazyme of the present invention has the polypeptide sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.

< 실험예 1> 시험군의 구성 및 투여 <Experimental Example 1> The configuration and administration of the test group

본 발명에서는 CAnN.Cg-Foxn1nu/CrljBgi 계통의 5주령 특정병원체부재(SPF) 누드(Nude) 마우스(오리엔트, 한국) 평균체중 15 g인 것을 이용하였다. In the present invention, it was used in CAnN.Cg-Foxn1nu / CrljBgi 5-week-old specific pathogen members (SPF) nude (Nude) mouse strain (Orient, Korea), average weight 15 g.

마우스는 입수 후 동물실에서 약 7일간 검역 및 순화시켰으며, 순화기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 선발하여 시험에 이용하였다. Mice were brought about seven days quarantine and acclimatization in the animal room after the acquisition, by observing the general symptoms of acclimatization period selected only healthy animals were used for testing.

본 발명에서 이용된 마우스의 경우, 온도 22± 3℃, 상대습도 50± 10%, 조명시간 12 시간(08:00 점등 ~ 20:00 소등)으로 설정된 자동 온습도 조절 장치가 설치된 동물실에서 순화 및 사육되었다. For the mice used in the present invention, the purification at a temperature 22 ± 3 ℃, animal room with a relative humidity of 50 ± 10%, temperature and humidity controlled automatically set the lighting time of 12 hours (8:00 to 20:00 light dark) apparatus is installed, and It was bred. 환경조건은 정기적(3개월 1회)으로 측정되었다. Environmental conditions were measured on a regular basis (three months once). 환경 측정의 결과, 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 인정되지 않았다. Changes are considered to affect the results of environmental tests measure was not recognized. 전 시험기간 동안 폴리카보네이트제 사육상자[240 W × 390 L × 175 H (mm)]에 5마리 이하씩 수용하였다. During the entire test period polycarbonate breeding box it was acceptable by five or less in the [240 W × 390 L × 175 H (mm)]. 개별 식별은 유성 매직펜을 이용한 피부표식법과 사육상자별 개체식별 카드표시법을 이용하였다. Individual identification was performed using a skin marker Law breeding boxes per object identification cards notation using oil-based markers. 사료는 실험동물용 고형사료(PMI Nutrition International, 505 North 4th Street Richmond, in 47374, USA)를 방사선 조사(13.2 kGy) 멸균하여 자유 섭취시켰다. Experimental diet of solid food for animals (PMI Nutrition International, 505 North 4th Street Richmond, in 47374, USA) was a free intake by irradiation (13.2 kGy) sterilization. 물은 카본 필터를 통해 정화된 상수도수를 물병을 이용하여 자유 섭취 시켰다. The water intake was free to use a water bottle of the number of water purification through the carbon filter.

일주일의 순화 기간이 경과한 뒤, 인간 페암 세포(Human Lung Adenocarcinoma cell)인 A549 세포주를 1ⅹ10 7 세포(Cell)로 마우스의 왼쪽 겨드랑이 피하에 이식시켜 암을 유발시킨 동시에 4개의 그룹(대조군, T1, T2, T3 및 표 1)으로 분리한 후, 12주간 아라자임(arazyme)을 0 ㎎/㎏(대조군), 150 ㎎/㎏(T1), 300 ㎎/㎏(T2) 및 600 ㎎/㎏(T3)의 농도로 주 6회 존대(zonde)를 이용하여 경구 투여하였다. After this acclimatization period of one week passed, the human peam cells (Human Lung Adenocarcinoma cell) in the A549 cell line with 1ⅹ10 7 cells (Cell) was implanted into the left side skin of the mouse at the same time that cause cancer four groups (control, T1, after separation by T2, T3 and Table 1), 12 weeks Arazyme (arazyme) to 0 ㎎ / ㎏ (control group), 150 ㎎ / ㎏ (T1), 300 ㎎ / ㎏ (T2) and 600 ㎎ / ㎏ (T3 ) concentration was orally administered six times per week using the jondae (zonde) in the. 전 실험기간 중 체중측정 및 일반 증상 관찰을 실시하고 12주 후 부검을 실시하였다. Conduct observed weight measurement and general symptoms during the test period and before an autopsy was carried out after 12 weeks.

실험군의 구성은 아래의 표 1과 같다. Configuration of the experimental groups are shown in Table 1 below.

실험군의 구성 Configuration of group 그룹 group 동물표지 Animals cover 이종이식 (SC) Xenograft (SC) 아라자임 경구투여 Arazyme oral administration 대조군 Controls 1-10 1-10 마우스당 A549 1×10 7 세포 A549 1 × 10 7 cells per mouse 0 ㎎/㎏ 0 ㎎ / ㎏ T1 T1 11-20 11-20 마우스당 A549 1×10 7 세포 A549 1 × 10 7 cells per mouse 150 ㎎/㎏ 150 ㎎ / ㎏ T2 T2 21-30 21-30 마우스당 A549 1×10 7 세포 A549 1 × 10 7 cells per mouse 300 ㎎/㎏ 300 ㎎ / ㎏ T3 T3 31-40 31-40 마우스당 A549 1×10 7 세포 A549 1 × 10 7 cells per mouse 600 ㎎/㎏ 600 ㎎ / ㎏

< 실험예 2> 아라자임 투여가 체중변화에 미치는 영향 조사 <Experimental Example 2> Effect of Arazyme administration on body weight change research

실험예 1에서와 같이 인간 폐암 세포주(A549)를 누드 마우스에 이식한 후, 1주일에 한 번씩 체중을 측정함으로써 체중변화를 관찰하고 동물의 일반 증상을 관찰하였다. After transplantation of human lung cancer cell line (A549) on nude mice as shown in Experimental Example 1, by measuring the body weight once a week observed weight changes were observed and the general symptom of animals.

전 실험기간(12주)을 거쳐 아라자임 투여군은 체중이 증가되는 양상을 보였는데 이중 특히 300 ㎎/㎏ 투여군(T2) 및 600 ㎎/㎏ 투여군(T3)에서 체중의 증가가 두드러졌다(표 2 및 도 1). Through the entire experimental period (12 weeks) Arazyme treated groups was the increase in body weight significantly in the dual especially 300 ㎎ / ㎏ treated groups (T2) and 600 ㎎ / ㎏ group (T3) was a beam of aspects gained weight (Table 2 and Fig. 1).

마우스의 체중 Body weight of a mouse 마우스의 체중 변화 (g) Weight change of mice (g) 주(week) Week (week) 대조군 10마리 10 control T1 10마리 T1 10 Marie T2 10마리 T2 10 Marie T3 10마리 T3 10 Marie 체중 weight 체중 weight 체중 weight 체중 weight 1 One 18.05 ± 0.95 18.05 ± 0.95 18.15 ± 0.93 18.15 ± 0.93 18.26 ± 1.08 18.26 ± 1.08 18.96 ± 0.57 18.96 ± 0.57 2 2 17.52 ± 1.63 17.52 ± 1.63 18.62 ± 0.93 18.62 ± 0.93 19.14 ± 1.07 19.14 ± 1.07 19.03 ± 0.96 19.03 ± 0.96 3 3 18.57 ± 1.02 18.57 ± 1.02 18.63 ± 1.06 18.63 ± 1.06 19.30 ± 1.24 19.30 ± 1.24 19.11 ± 0.78 19.11 ± 0.78 4 4 19.04 ± 1.29 19.04 ± 1.29 19.03 ± 0.88 19.03 ± 0.88 19.92 ± 1.15 19.92 ± 1.15 19.54 ± 0.93 19.54 ± 0.93 5 5 19.30 ± 1.17 19.30 ± 1.17 19.78 ± 0.98 19.78 ± 0.98 20.34 ± 1.23 20.34 ± 1.23 20.33 ± 1.22 20.33 ± 1.22 6 6 19.75 ± 1.27 19.75 ± 1.27 20.08 ± 1.00 20.08 ± 1.00 20.33 ± 1.21 20.33 ± 1.21 20.25 ± 1.24 20.25 ± 1.24 7 7 19.97 ± 1.58 19.97 ± 1.58 19.72 ± 0.94 19.72 ± 0.94 20.74 ± 1.15 20.74 ± 1.15 20.67 ± 1.20 20.67 ± 1.20 8 8 20.05 ± 1.49 20.05 ± 1.49 20.42 ± 0.79 20.42 ± 0.79 21.33 ± 1.18 21.33 ± 1.18 21.00 ± 1.32 21.00 ± 1.32 9 9 20.16 ± 1.53 20.16 ± 1.53 21.00 ± 1.10 21.00 ± 1.10 21.17 ± 2.17 21.17 ± 2.17 21.27 ± 1.64 21.27 ± 1.64 10 10 20.16 ± 1.50 20.16 ± 1.50 20.92 ± 1.75 20.92 ± 1.75 21.01 ± 2.65 21.01 ± 2.65 21.66 ± 1.75 21.66 ± 1.75 11 11 19.78 ± 1.56 19.78 ± 1.56 19.91 ± 1.56 19.91 ± 1.56 19.77 ± 2.42 19.77 ± 2.42 20.58 ± 2.19 20.58 ± 2.19 12 12 19.67 ± 1.58 19.67 ± 1.58 19.74 ± 1.77 19.74 ± 1.77 19.41 ± 2.42 19.41 ± 2.42 20.27 ± 2.26 20.27 ± 2.26

대조군: 아라자임 0 ㎎/㎏ 경구투여, Control group: Arazyme 0 ㎎ / ㎏ oral administration,

T1: 아라자임 150 ㎎/㎏ 경구투여, T1: Arazyme 150 ㎎ / ㎏ oral administration,

T2: 아라자임 300 ㎎/㎏ 경구투여, T2: Arazyme 300 ㎎ / ㎏ oral administration,

T3: 아라자임 600 ㎎/㎏ 경구투여. T3: Arazyme 600 ㎎ / ㎏ oral administration.

< 실험예 3> 아라자임 투여가 종양 성장에 미치는 영향 <Experimental Example 3> Effect of Arazyme administration on tumor growth

실험예 1에서와 같이 인간 폐암 세포주(A549)를 누드 마우스에 이식한 후, 5주째부터 육안적으로 종양크기를 확인할 수 있었으며 이후부터 8주 동안 일주일에 한번씩 캘리퍼(caliper)를 이용하여 각각의 마우스에서의 종양의 크기를 측정하였다. Experimental Example After the transplantation of human lung cancer cell line (A549) in nude mice as in the first, from the 5th week gross to each mouse using a caliper (caliper) once a week for after eight weeks was to determine tumor size the tumor size was measured in the. 종양의 부피는 종양의 장경과 단경을 측정하여 다음 식 1과 같이 계산하였다. The volume of the tumor is to measure the long diameter and short diameter of the tumor was calculated as: (1).

<식 1> <Equation 1>

종양의 부피(㎣) = (장경 × 단경 2 )/2 The volume of tumor (㎣) = (longer diameter × shorter diameter 2) / 2

측정한 결과 전 실험기간동안 아라자임을 300 ㎎/㎏(T2) 및 600 ㎎/㎏(T3) 투여한 군에서 대조군에 비해 종양크기가 감소하였으며 통계학적 유의성이 관찰되었다(도 2). As a result of measuring the duration of the experiment before the Arazyme 300 ㎎ / ㎏ (T2) and 600 ㎎ / ㎏ (T3) in tumor size was reduced compared to control in the treated group during the statistical significance was observed (Fig. 2).

<실험예 4> 폐암조직의 조직병리학적 관찰 <Experiment 4> of lung tissue pathology observed

누드 마우스에 인간 폐암 세포주를 이식한 12주 후에 에틸에테르에 마취시켜 희생시키고 종양 및 실질장기를 채취하였다. After 12 weeks of transplantation of human lung cancer cell line in nude mice was anesthetized with ethyl ether were sacrificed and the tumors collected and substantial long term. 채취한 종양조직의 무게를 측정하였으며 심장, 간장, 폐장, 췌장, 신장, 비장 등 장기를 채취하였다. We measured the weight of the collected tumor tissues were collected for heart, liver, lung, pancreas, kidney, spleen, etc. organs. 채취한 종양과 장기는 10% 중성 포르말린에 24 시간 고정시킨 후 자동 조직 처리기구(automatic tissue processor)로 조직 처리를 수행하였다. Harvested tumor and organs was carried out by automated tissue processing the tissue processing apparatus (automatic tissue processor) were fixed 24 hours in 10% neutral formalin. 조직 처리과정을 거친 종양과 장기는 파라핀 포매 후 4 ㎛의 두께로 박절하여 헤마톡살린-에오신 염색(Hematoxylin-eosin staining, H&E 염색)을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다. The tissue processing rough tumor and organs are by bakjeol to a thickness of 4 ㎛ After paraffin-embedded utilizing hematoxylin-eosin and subjected to dyeing (Hematoxylin-eosin staining, H & E staining) were observed with an optical microscope.

그 결과, 아라자임 투여군은 대조군에 비해 종양세포침윤이 약하게 진행되고 있었다(도 3). As a result, Arazyme treated is a tumor cell infiltration was in progress weaker than the control group (Fig. 3).

<실험예 5> MMP-9의 면역 조직화학적 관찰 Immunohistochemical of <Experiment Example 5> MMP-9 observed

MMP-9의 면역 조직화학적 관찰을 위하여, 포르말린에 고정한 후 제작된 파라핀 포매조직을 4 ㎛의 두께로 박절하여 탈파라핀시킨 후 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위해 3% H 2 O 2 에 30분간 처리하고 0.01 M 인산완충식염수(phosphate-buffer saline, PBS)로 세척한 다음, 조직의 항원 발현을 증가시키기 위하여 0.01 M 구연산염(citrate) 완충액으로 처리하고, 마이크로파(microwave)로 고열처리 하였다. For the immunohistochemical staining observed in MMP-9, were fixed in formalin produced a paraffin-embedded tissue for 30 minutes in 3% H 2 O 2 was paraffin to bakjeol in the 4 ㎛ thickness to inhibit the activity of endogenous peroxidase treatment and treated with high heat 0.01 M phosphate buffered saline (phosphate-buffer saline, PBS), and then, 0.01 M citrate (citrate) treatment with a buffer solution, and the microwave (microwave) to increase expression of the antigen in tissue washed. 비특이적 반응을 억제하기 위하여 20 g/㎖ 프로테이나제(proteinase) K로 37℃에서 10분간 처리한 후 인산완충식염수로 세척 후 1 시간 동안 차단(blocking)시켰다. It was blocked (blocking) for an hour after the treatment 20 g / ㎖ proteinase (proteinase) 10 minutes at 37 ℃ to K and then washed with phosphate buffered saline to inhibit non-specific reaction. 그 후, 항-래빗(rabbit) 1차 항체인 MMP-9(1:100, Santa Cruz Bio, USA)을 4℃에서 하룻밤 동안 처리한 다음 PBS 완충액으로 5분간 3회 세척하고 비오틴(biotin)과 결합시켰다. Then, anti-rabbit (rabbit) 1 primary antibody of MMP-9 (1: 100, Santa Cruz Bio, USA) the treated overnight at 4 ℃ then washed three times for 5 minutes with PBS buffer and biotin (biotin) and It was combined. 비오틴과 결합된 1차 항체를 완충액으로 세척한 후 스트렙트아비딘(Streptavidin)으로 접합된 HRP(Horse-Rradish Peroxidase)를 부착 시키고, Histostantin-plus bulk kit(Zymed Laboratories Inc, USA)로 37℃에서 30분간 반응시켜 충분히 세척한 후 3,3-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloried; DAB, Zymed Laboratories Inc, USA) 용액으로 발색시키고 증류수로 세척한 다음 Meyer's hematoxylin(Research genetics, USA)으로 대조 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다. Biotin and coupling the primary and then the antibody was washed with the buffer and attached to a streptavidin with HRP (Horse-Rradish Peroxidase) conjugated to avidin (Streptavidin), Histostantin-plus bulk kit (Zymed Laboratories Inc, USA) with from 37 ℃ 30 minutes and then sufficiently washed by reacting 3,3-diaminobenzidine tetrahydro- chloride; a (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloried DAB, Zymed Laboratories Inc, USA) and color development in solution, washed with distilled water and then Meyer's hematoxylin (Research genetics, USA) subjected to contrast staining was observed with an optical microscope.

그 결과, 아라자임 투여군은 대조군에 비해 MMP-9의 발현양상이 감소하였다(도 4 및 도 5). As a result, Arazyme treated group decreased the expression of MMP-9 relative to the control group (Figs. 4 and 5).

MMPs(matrix metalloproteases)의 생성의 증가시 염증과 더불어 여러 종류의 암에서 침윤도와 전이가 증가하는 것으로 알려져 있다. It is known that the transition chimyundo and increases in several types of cancer as well as inflammatory by increasing the production of MMPs (matrix metalloproteases). 또한 MMPs는 주로 MMP-9 및 MMP-2에 의해서 이루어진다. In addition, MMPs are made primarily by MMP-9 and MMP-2. 특히 MMP-9의 발현을 조절하는 상위 신호전달 기전에는 MAPKs를 포함하는 성장인자, 사이토카인, 종양촉진인자 등이 관여한다. In particular, this involved such as higher signaling mechanism to regulate the expression of MMP-9 include growth factors, cytokines, tumor promoting factor comprising the MAPKs. MMP-9의 발현양상의 감소는 암의 침윤과 전이가 억제되고 있는 것을 의미한다. Decrease in expression of MMP-9 means that the invasion and metastasis of cancer can be suppressed.

< 실험예 6> NF -κB의 면역 조직화학적 관찰 <Experiment 6> immunohistochemistry of NF -κB chemical observed

NF-κB의 면역 조직화학적 관찰을 위하여, For the immunohistochemical observation of NF-κB, 상기 실험예 5와 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체는 MMP-9 대신에 항-래빗(rabbit) 1차 항체인 NF-κB(1:200, Cell Signaling Technology Inc, USA)를 이용하였다. The experiment was performed in the same process as in Example 5 instead of the primary antibody anti-MMP-9 in-rabbit (rabbit) Primary antibody, NF-κB: was used as the (1 200, Cell Signaling Technology Inc, USA).

그 결과, 아라자임 투여군은 대조군에 비해 NF-κB의 발현양상이 감소하였다(도 6 및 도 7). As a result, Arazyme treated group was reduced compared to control the expression of NF-κB (Fig. 6 and 7).

NF-κB는 다양한 환경적 인자에 대한 반응으로 활성화되는 유도전사 인자이다. NF-κB is induced transcription factors that are activated in response to various environmental factors. 또한 약물 불응성의 또 다른 영향인자이기도 하다. In addition, drug refractory sex is also other influencing factors. 이는 사이토카인 합성의 중요한 인자이며, 면역반응이나 염증반응에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 증가시키는 전사인자로 활성화되면 핵 내로 이동하여 염증 유전자의 발현을 증가시킨다. This is an important factor of cytokine synthesis, when activated by transcription factors that increase the expression of various genes involved in the immune response or inflammatory reaction to move into the nucleus and increases the expression of inflammatory genes. NF-κB의 발현 감소는 암이 억제되고 있는 것을 의미한다. Decreased expression of NF-κB, which means that the cancer is inhibited.

<실험예 7> PCNA의 면역 조직화학적 관찰 <Experiment 7> immunohistochemical observation of PCNA chemical

PCNA의 면역 조직화학적 관찰을 위하여, For the immunohistochemical observation of PCNA, 상기 실험예 5와 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체는 MMP-9 대신에 항-마우스 1차 항체인 PCNA(1:800, Santa Cruz Bio, USA)를 이용하였다. The experiment was performed in the same process as in Example 5 in place of the primary antibody is anti-MMP-9 - mouse primary antibody, PCNA: it was used as the (1 800, Santa Cruz Bio, USA).

그 결과, 아라자임 투여군은 대조군에 비해 PCNA의 발현양상이 감소하였다(도 8 및 도 9). As a result, Arazyme treated group decreased the expression of PCNA, compared to the control group (Figs. 8 and 9).

PCNA는 DNA 폴리머라제 델타(polymerase delta)의 보조적인 단백질로, PCNA의 발현은 각질세포의 증식상태, 신경교증, 착색된 피부병변, 폐의 비소세포성암의 조직 병리학적 등급과 관련이 있다고 알려져 왔기에, PCNA의 조직면역형광법은 종양조직에서의 성장에 관여하는 부분이 얼마 만큼인지 알려주는 척도로 작용한다. PCNA has came known to be associated with DNA polymerase delta (polymerase delta) expressed proliferative state, glial syndrome, pigmented skin lesions, histopathological grade of lung non-small cell carcinoma of the keratinocytes of the auxiliary protein, PCNA , the organization of PCNA immunofluorescence serves to tell whether the measure as part of an organization involved in the growth of some tumors. PCNA의 발현의 감소는 종양조직의 성장이 억제되고 있음을 의미한다. Decrease in expression of PCNA is meant that the growth of the tumor tissue is inhibited.

<실험예 8> 아라자임의 급성 독성실험 <Experiment 8> Experiment for acute toxicity Arazyme

본 발명의 아라자임에 대한 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. In order to examine the acute toxicity of the Arazyme of the present invention, experiments were performed as described below.

위스터(Wistar) 계통의 9주령 특정병원체부재(SPF) 암컷 랫트((주)오리엔트, 대한민국, 서울)에 대해 각각 4마리씩 4개군으로 나누어, 온도 22± 3℃, 습도 55± 10%, 조명 12L/12D 조건의 동물실 내에서 사육하였다. Above requester (Wistar), each divided into 4 rats Four groups were about 9-week-old specific pathogen of the grid member (SPF) female rats (Co., Orient, Republic of Korea, Seoul, Korea), temperature 22 ± 3 ℃, humidity 55 ± 10%, one trillion people of 12L / 12D conditions were housed in an animal room. 랫트 입수 후 동물실에서 1 주일간 검역 및 순화과정을 거쳤다. After the rats obtained underwent a week-long quarantine and acclimatization process in the animal room. 전 시험기간 동안 폴리카보네이트제 사육상자[240 WX 390 LX 175 H (mm)]에서 5마리 이하씩 수용하였다. During the entire test period polycarbonate breeding box was received in [240 WX 390 LX 175 H (mm)] by less than 5. 개체식별은 유성 매직펜을 이용한 피부표식법과 사육상자별 개체식별 카드표시법을 이용하였다. Identification was performed using a skin marker Law breeding boxes per object identification cards notation using oil-based markers. 실험 동물용 고형사료(PMI Nutrition International, 미국)는 멸균하였으며, 물은 상수도수를 물병을 이용하여 자유 섭취 시켰다. Solid feed for experimental animals (PMI Nutrition International, USA) were sterile, the water was consumed by the free bottle of water can be.

상기 실시예의 아라자임을 0, 1250, 2500 및 5000 ㎎/㎏ 농도로 주사용 멸균주사용수에 용해하여 10 ㎖/㎏의 용량으로 조재하여 랫트에 경구투여용 존대(zonde)를 이용하여 단회 경구 투여하였다. The embodiment Arazyme 0, 1250, 2500 and to and dissolved in 5000 ㎎ / ㎏ concentration injectable sterile water for injection into the jojae at a dose of 10 ㎖ / ㎏ using jondae (zonde) for oral administration to rats a single oral administration It was. 일주일간의 순화 기간을 거쳐서 4개의 그룹으로 분리 한 후 10 주령의 랫트에 아라자임 농도별로 투여한 후 일반 증상 관찰을 실시한 후 아라자임의 실질 장기에 대한 독성을 평가하기 위해서 24 시간 후 부검을 실시하였다. An autopsy was carried out after 24 hours in order through the purifying mode for a week to evaluate the toxicity on the atom after administration by each atom concentration of ARA in the 10-week-old rats were then separated into four groups and then subjected to observed general symptoms Ara real long-term .

암컷 랫트에 아라자임을 경구 투여한 후 시험물질 투여에 따른 일반증상을 정확하게 관찰하고 독성을 평가하기 위해서 동물의 행동, 외관, 기능에 대한 관찰을 실시하였다. The observation of the animal behavior, appearance, function was performed in order to assess the exact observe general symptoms and toxicity according to the dose after oral administration of the test substance Arazyme in female rats.

실험결과, 아라자임 투여 후 동물의 활동성, 보행, 기질, 경련 등에 있어서는 아무런 이상 증상이 관찰되지 않았으며, 피모 상태, 안구주변, 귀, 생식기, 사지 상태, 꼬리 상태 등의 동물의 외관 관찰 및 호흡 상태, 타액분비, 분변, 구토 등의 기능 관찰에서도 아무런 이상 증상이 관찰되지 않았다. Experimental results Arazyme was a no symptoms In like activity of animals, walking, a substrate, convulsions was not observed after administration, coat condition, eye around the ear, the genital limb conditions, appearance observation and breathing of the animals, such as tail state the state did salivation, feces, no functional abnormalities observed in the vomiting was observed. 아라자임 투여 24 시간 후에 부검을 실시하였다. Arazyme administration autopsy was carried out after 24 hours. 육안부검 소견에서도 전장기에서 아라자임 투여에 의한 아무런 이상도 관찰되지 않았다. No longer administered by the Arazyme around the organs in the gross autopsy findings were not observed. 아라자임 치사랑(LD 50 )은 5000 ㎎/㎏이상의 고농도인 것으로 판단된다. Arazyme chisarang (LD 50) is determined to be more than 5000 ㎎ / ㎏ high concentration. 현미경학적 관찰에 있어서 간, 심장, 폐 및 췌장 등의 실질 장기에서는 아무런 병리학적 이상 소견이 관찰되지 않았다. In the microscope Observations liver, but it is no pathological findings in the real organs such as the heart, lungs and pancreas observed.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다. The Manufacturing Examples for the composition of the present invention.

< 제제예 1> 약학적 제제의 제조 <Formulation Example 1> Preparation of pharmaceutical formulations

<1-1> 산제의 제조 <1-1> Preparation of powders

아라자임 2 g Arazyme 2 g

유당 1 g Lactose 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다. After mixing the above components, to thereby prepare a powder and filled in airtight packs.

<1-2> 정제의 제조 <1-2> Preparation of tablets

아라자임 100 ㎎ Arazyme 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎ Corn starch 100 ㎎

유 당 100 ㎎ Oil per 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎ Magnesium stearate 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다. After mixing the above components, other appointed in accordance with the manufacturing method of the conventional purification to prepare a tablet.

<1-3> 캡슐제의 제조 <1-3> Preparation of capsules

아라자임 100 ㎎ Arazyme 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎ Corn starch 100 ㎎

유 당 100 ㎎ Oil per 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎ Magnesium stearate 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다. After mixing the above components, which were filled in gelatin capsules to prepare a capsule according to the conventional method for preparing capsules.

<1-4> 환의 제조 <1-4> Preparation ring

아라자임 1 g Arazyme 1 g

유당 1.5 g Lactose 1.5 g

글리세린 1 g Glycerin 1 g

자일리톨 0.5 g Xylitol 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다. After mixing the above components was prepared such that the 1 g per ring 4 in a usual manner.

<1-5> 과립의 제조 <1-5> Preparation of granules

아라자임 150 ㎎ Arazyme 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎ Soybean extract 50 ㎎

포도당 200 ㎎ Glucose 200 ㎎

전분 600 ㎎ Starch 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다. After mixing the above components by the addition of 30% ethanol were charged into a 100 ㎎ included after formation of the granules was dried at 60 ° C ℃.

<1-6> 주사액제의 제조 <1-6> Preparation of an injection solution the

아라자임 10 ㎍/㎖ Arazyme 10 ㎍ / ㎖

묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지 Dilute hydrochloric acid until the pH BP 7.6

주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖ Weeks using sodium chloride BP maximum 1 ㎖

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 아라자임을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. Dissolved Arazyme the BP state using an appropriate volume of sodium chloride and, to adjust the pH of the resulting solution to pH 7.6 using dilute hydrochloric acid BP, and adjusting the volume by using a primary sodium chloride using BP and mixed sufficiently. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다. The solution was filled in a transparent glass to 5 ㎖ type I ampoule, by dissolving the glass and sealed under the upper lattice of air, the injection solution was prepared in the 120 ℃ 15 minutes sterilized by autoclave.

< 제제예 2> 식품의 제조 <Preparation Example 2> Preparation of Food

상기 제제예 1의 산제, 정제, 캡슐제, 환 및 과립을 식품에 응용하여도 무방하며, 상기의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다. And FIG mubang by applying the powders, tablets, capsules, pills and granules of the formulation example 1 on food, prepared as a food comprising the Arazyme separated from the culture medium or which of the Ara Nicolas proteosome utility kusu follows: It was.

<2-1> 밀가루 식품의 제조 <2-1> Preparation of flour food

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 10.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 통상의 방법으로 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다. Ara Nicolas proteosome the from the culture medium or which of the utility kusu separation Arazyme added to the flour 0.1 to 10.0 parts by weight of the mixture to prepare a bread, cake, cookies, crackers and noodles by a usual method using the Health enhancing foods It was prepared.

<2-2> 스프 및 육즙( gravies )의 제조 <2-2> Preparation of soup and gravy (gravies)

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다. The ARA Nicolas proteosome from the liquid culture or the utility of this separation kusu Arazyme 0.1 to 1.0 parts by weight of Sprague and meat products for promoting health in the usual manner was added to the gravy, soup and gravy of cotton was prepared.

<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조 <2-3> Preparation of ground beef (ground beef)

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다. Ara Nicolas proteosome to 10 parts by weight of a liquid culture or the separated therefrom Ara of utility kusu atom is added to the ground beef Health enhancing ground beef was prepared for in the usual manner.

<2-4> 유제품( dairy <2-4> dairy products (dairy products )의 제조 manufacture of products)

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 통상의 방법으로 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다. Ara Nicolas proteosome culture or the separated therefrom Ara of utility kusu added to the atom of 0.1 to 1.0 parts by weight of milk, and various dairy products such as butter and ice cream in a conventional method by using the milk was produced.

<2-5> 선식의 제조 <2-5> Preparation of wire

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. A power distribution in which the brown rice, barley, rice, followed by the alpha screen Coix by a known method and then dried to prepare a powder of 60 mesh particle size by using a crusher.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. Black soybean, black sesame and wild sesame were prepared as powder and then roasted according steamed and dried according to a known method of 60 mesh particle size by using a crusher.

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 진공 농축기에서 감압, 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. Ara Nicolas proteosome utility reduced pressure to remove therefrom the liquid culture or the Arazyme kusu in a vacuum concentrator, concentrated and spray-dried with a hot-air drier to give the dry powder was pulverized to 60 mesh particle size of the dry product obtained by the mill.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 통상의 방법으로 제조하였다. By mixing the grains, seeds and the dry powder of Ara Nicolas proteosome utility kusu culture or the separated therefrom Arazyme of prepared in the following ratio were prepared in the usual manner.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부), Grains (brown rice: 30 weight part, Coix 15 parts by weight of barley, 20 parts by weight),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부), Seeds (wild sesame: 7 weight part, black soybean: 8 weight part, black sesame: 7 weight part),

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말(1 중량부), Ara Nicolas proteosome utility kusu dry powder of discrete Arazyme culture or from which the (1 part by weight),

영지(0.5 중량부), Ganoderma (0.5 parts by weight),

지황(0.5 중량부) Rehmannia glutinosa (0.5 weight part)

< 제제예 3> 음료의 제조 <Formulation Example 3> Preparation of the beverage

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 음료를 다음과 같이 제조하였다. A drink containing the atom Ara Nicolas proteosome utility kusu the liquid culture or the separation therefrom of ARA was prepared as follows.

<3-1> 건강음료의 제조 <3-1> Preparation of health drink

액상과당(0.5 중량부), 올리고당(2 중량부), 설탕(2 중량부), 식염(0.5 중량부), 물(75 중량부)과 같은 부재료와 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임(0.5 중량부)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후, 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다. Liquid fructose (0.5 parts by weight), oligosaccharide (2 parts by weight), sugar (2 parts by weight), table salt (0.5 parts), water (75 parts by weight) and from the culture medium or which of Syracuse same sub material and Ara Nicolas proteosome utility the instantaneous sterilization by homogeneously blending the separated Arazyme (0.5 part by weight) and then, by packing it in small packaging container such as a glass bottle, PET bottle was prepared in the health drink.

<3-2> 야채쥬스의 제조 <3-2> Preparation of vegetable juice

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.5 g을 토마토 또는 당근 등의 야채의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다. Ara Nicolas proteosome the culture medium or a separation therefrom Arazyme 0.5 g of utility kusu was prepared in a conventional manner as health promoting for vegetable juice is added to the juice 1,000 ㎖ of vegetables, such as tomato or carrot.

<3-3> 과일쥬스의 제조 <3-3> Preparation of fruit juice

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 g을 사과 또는 포도 등의 과일의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다. Ara Nicolas proteosome the culture medium or a separation therefrom Arazyme 0.1 g of utility kusu was prepared Health enhancing fruit juice was added to a conventional method in 1,000 ㎖ juices of fruits such as apples or grapes.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 ( Aranicola proteolyticus )가 생산하는 아라자임(arazyme)은 인간 폐암 세포주가 이식된 누드 마우스의 체중을 증가시키고 종양의 크기 및 침윤현상은 감소시키며, MMP-9, NF-κB 및 PCNA의 발현양상도 감소시키므로 폐암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다. As described above, Ara to produce ARA Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus) of the present invention atom (arazyme) increases the weight of the human lung cancer cell line is transplanted nude mice, and the size and infiltration phenomenon of the tumor is reduced , expression of MMP-9, NF-κB and PCNA reduced because may be useful as a pharmaceutical composition for lung cancer treatment and prevention.

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Claims (13)

  1. 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물. Arazyme (arazyme) cancer prevention and treatment of pharmaceutical composition containing as an active ingredient.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 아라자임은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물. The method of claim 1, wherein the Arazyme is pharmaceutical composition for prevention and treatment of cancer, characterized in that the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 아라자임은 아라니콜라 프로테오리티쿠스( Aranicola The method of claim 1 wherein the ARA is Arazyme Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus ) 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물. proteolyticus) cancer prevention and treatment of pharmaceutical composition, characterized in that the separation from the culture broth.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스( Aranicola proteolyticus )는 아라니콜라 프로테오리티쿠스( Aranicola The method of claim 3, wherein the ARA Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus) is Ara Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus ) HY-3(수탁번호 : KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물. proteolyticus) HY-3 (accession number: KCTC 0268BP) cancer prevention and treatment of pharmaceutical composition, characterized in that.
  5. 제 1항에 있어서, 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물. The method of claim 1 wherein the cancer is a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of cancer, characterized in that lung.
  6. 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 유효성분으로 함유하는 암 예방용 건강식품. Ara Nicolas proteosome utility kusu the liquid culture or the separated therefrom Ara atom of a health food for preventing cancer containing as an active ingredient.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스( Aranicola The method of claim 6, wherein the ARA Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus )는 아라니콜라 프로테오리티쿠스( Aranicola proteolyticus) is Ara Nicolas proteosome utility kusu (Aranicola proteolyticus ) HY-3(수탁번호 : KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 암 예방용 건강식품. proteolyticus) HY-3 (accession number: cancer health food for the prevention, characterized in that KCTC 0268BP).
  8. 제 6항에 있어서, 상기 아라자임은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암 예방용 건강식품. 7. The method of claim 6 wherein the Arazyme is health food for preventing cancer, wherein the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  9. 아라자임을 유효성분으로 함유하는 암전이 예방 및 억제용 약학적 조성물. The Arazyme cancer metastasis preventing and inhibiting pharmaceutical composition comprising as an active ingredient.
  10. 아라자임을 유효성분으로 함유하는 암전이 예방용 건강식품. Health food for preventing cancer metastasis comprising Arazyme as an active ingredient.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 MMP-9 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물. The method of claim 1, wherein the composition is a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer characterized by inhibition of MMP-9 expression.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 NF-κB 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물. The method of claim 1, wherein the composition is a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer characterized by inhibition of NF-κB expression.
  13. 제 1항에 있어서, PCNA 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물. The method of claim 1 wherein the cancer preventive and therapeutic pharmaceutical composition, characterized in that for suppressing the expression of PCNA.
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