KR100209097B1

KR100209097B1 - 퍼옥시다아제의 기질인 티엠비의 안정화된 조성물

Info

Publication number: KR100209097B1
Application number: KR1019960049196A
Authority: KR
Inventors: 길정수; 임종순
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1996-10-28
Filing date: 1996-10-28
Publication date: 1999-07-15
Also published as: KR19980029865A

Abstract

티엠비, 타우로콜릭산 나트륨 및/또는 콜릭산 나트륨, 및 완충액을 포함하는 퍼옥시다아제의 기질액 조성물은 티엠비를 포함한 완충액을 장시간 보관할 경우 용기 바닥에 결정이 생기고 결과적으로 최종 흡광도 값이 떨어지는 현상을 방지하는 효과가 있음을 확인하였다.

Description

퍼옥시다아제의 기질인 티엠비의 안정화된 조성물

[산업상 이용 분야]

본 발명은 진단 키트에서 통상 사용되는 퍼옥시다아제(peroxidase)의 여러 기질 가운데 하나로 사용되는 3,3'5,5'- 테트라메틸 벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(TMB), 이후 티엠비로 약칭한다) 기질의 안정화된 조성물에 관한 것이다.

[종래 기술]

티엠비는 퍼옥시다아제의 통상적 기질로 널리 사용되고 있는 OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride)나 ABTS(2',2'-azino-di-3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid)보다 다음과 같은 점에서 우수한 성질을 가지고 있다. 즉, OPD나 ABTS가 에임스 시험(Ames test)에서 돌연변이 물질로 판명된 반면 티엠비는 돌연변이 유도 물질이 아니며 색 변환 속도가 매우 높기 때문에 발색 시약으로서 우수한 특성을 지니고 있다(Holland, V.R., Tetrahedron 30, 3299, 1974; Garner, R.C., Cancer Lett. 1, 39, 1975; Garner, D.D.J.Forensic, Sci., 21, 816, 1976).

그러나 티엠비는 이러한 우수한 특성을 가지고 있지만, 수용액에 잘 녹지않고 또한 여러 완충액에서 불안정하다는 문제점을 가지고 있다. 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위하여 수용액에서 티엠비의 용해도를 증가시키기 위해서는 수용액에서 티엠비의 농도를 줄이거나, 또는 티엠비를 변형시킨 용해성 형태의 티엠비 디하이드로클로라이드를 사용하는 방법도 있으나, 티엠비 디하이드로클로라이드는 공기와 접촉시 산화 반응이 쉽게 일어나 변색되기 쉽고 또한 티엠비와 티엠비 디하이드로클로라이드 두 물질 모두 장기간 보관할 때 결정화가 일어나 침전이 생긴다는 단점이 있다(Liem, H.H., Anal. Biochem.,98, 388, 1979).

한편, 티엠비 수용액의 안정도를 증가시키기 위해 완충액에 바시트라신(bacitracin)을 첨가하는 방법(USP 5206150)과 2-하이드록시프로필-β-사이클로 덱스트린( 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin)을 첨가하는 방법(Cattaneo, M.V., Anal. Biochem., 223, 313, 1994)들이 고안되었으나 이것은 자연 산화를 완전히 억제하지 못하는 단점을 가지고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 진단 키트에서 통상 사용되는 퍼옥시다아제의 기질인 티엠비(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(TMB))기질액의 안정화된 조성물을 제공하는 것이다. 이에 따라, 본 발명은 먼저 완충액에서 티엠비의 용해도를 증가시키는 방법을 제공하며, 이 상태에서 안정된 용해 상태를 유지시키는 방법을 제공한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 티엠비,타우로콜릭산 나트륨 및/또는 콜릭산 나트륨, 및 완충액을 포함하는 퍼옥시다아제의 기질액 조성물을 제공한다.

상기 타우로콜릭산 나트륨의 농도는 0.25mM∼ 0.5mM인 범위가 바람직하다.

상기 콜릭산 나트륨의 농도는 0.1%(w/v)인 범위가 바람직하다.

상기 완충액은 아세테이트 완충액 또는 시트레이트-인산 완충액이 바람직하다.

상기 완충액의 pH는 3.7 내지 4.8이다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예에 있어서, 티엠비의 고농도 저장 용액은 8mg 티엠비(Fluka사제)를 1㎖의 75% DMSO(Sigma사제)에 녹여 이를 0.1M 아세테이트 완충액에 100배 희석하여 사용하였다.

[실시예]

[실시예 1]

[티엠비 기질 완충액의 최적 pH 조건 결정]

pH 값이 각각 6, 5, 4.5, 3.5인 0.1M 아세테이트 완충액을 제조하여 0.01%의 하이드로젠 퍼옥사이드(H₂O₂)를 가한 다음 이 용액에 8㎎/㎖ 농도의 티엠비 기질 농축액을 100 :1로 희석하여 퍼옥시다아제의 기질로 사용하였다. 염소 항 이뮤노글로블린 G 항체-퍼옥시다아제 콘쥬게이트(goat anti-human IgG- HRP conjugate(Bio-Rad사제))를 콘쥬게이트 희석액(30% FBS, 10mM sodium phosphate, 0.15M NaCl, 0.02% Thimerosal, 0.01% CaCl₂)에 20,000 : 1 희석한 용액을 96웰 플레이트(well plate)에 10㎕를 가한 다음 티엠비 완충액 100㎕를 첨가하여 상온에서 30분간 배양하고, 1N 황산 100㎕를 가하여 반응을 정지시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 실험을 티엠비 완충액을 제조한 다음 0시간, 4시간 후에 동일 조건에서 4회 반복 실험을 하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 4시간 후에 자연 산화에 의한 흡광도 값이 높게 나타나지 않는 pH 조건과, 퍼옥시다아제를 처리한 웰에서 흡광도 값의 차이가 최소이면서 활성도가 최대인 pH 조건을 조사한 결과 pH 4.5가 최적임을 확인할 수 있었다.

[실시예 2]

[0.1M 아세테이트(pH 4.5)완충액에서 장시간 티엠비의 용해 상태를 유지시키는 방법]

실시예 1과 동일한 조건의 티엠비 기질액을 동일한 플라스틱 튜브에 여러번 사용할 경우 용기 바닥에 티엠비의 결정이 생기게 되고, 이 튜브를 재사용할 경우 결정화가 반복되어 퍼옥시다아제에 제공되는 티엠비의 양이 떨어져 제조 후 시간이 경과하면 할수록 흡광도가 떨어지는 현상이 발견되었다. 결국 완충액 내에서 티엠비의 용해도가 떨어져서 나타나는 현상으로 판단되어 이를 개선하는 방법을 고안하였다. 0.1M 아세테이트(pH 4.5), 0.01% H₂O₂완충액에 20종류의 계면 활성제를 여러 농도로 처리하여 용기 바닥에 티엠비의 결정화가 진행된 용기에 각 조건의 기질 용액을 만들어 실시예 1과 동일한 실험을 실시하였다. 표 2의 결과와 같이 타우로콜릭산 나트륨(Sigma사제)과 콜릭산 나트륨(Sigma사제)이, 첨가되지 않은 대조군의 흡광도 값과 비교시 유용한 것으로 확인되었으며 유용한 농도는 각각 0.25mM-0.5mM과 0.1%이었다. 이 결과는 표 2에 나타내었다.

[실시예 3]

[실시예 2의 기질 완충액의 무작위 추출 혈장 표본에 대한 필드 테스트(Field test)]

실시예 2의 조건의 기질 완충액에 티엠비를 첨가한 다음 시판 준비 중인 LG HBD 항원 진단 시약 키트(기준 및 시험 방법, 보사부 허가 번호 2049)를 이용하여 무작위로 추출한 혈장 표본에 대한 필드 테스트를 실시하였다.

HBD 항원 진단 키트로 시료의 분석 방법은 다음과 같다. B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 항체가 부동화(coated)된 96 웰 플레이트에 혈장 표본 100㎕를 가한 다음 다시 콘쥬게이트 25㎕를 가하여 37℃에서 1시간 30분 반응시킨 후 세척한 뒤, 티엠비 기질액을 100㎕ 가하고 상온에서 30분간 반응시킨 후 1N 황산 100㎕를 가하여 반응을 중지시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 티엠비 기질액을 실시예 2와 동일한 조건으로 타우로콜릭산 나트륨과 콜릭산 나트륨을 포함하는 티엠비 기질액을 사용하여 0 시간, 그리고 4 시간 후에 동일한 혈장 표본으로 실험을 실시하여 그 결과를 표 3(타우로콜릭산 나트륨)과 표 4(콜릭산 나트륨)에 각각 나타내었다. 티엠비 기질 제조 후 0 시간과 4 시간 후의 흡광도 값을 비교해 보았을 때 흡광도 값이 큰 차이가 나지 않음을 알 수 있었다.

상기한 바와 같이 0.1M 아세테이트 완충액에서 티엠비의 용해도를 증가시키기 위해 이 완충액의 pH를 6에서 3.5까지 변화시켜 pH 4.5에서 최적 조건을 찾을 수 있었다. pH가 낮을수록 티엠비의 용해도는 증가하지만 자연 산화도 증가함을 알 수 있었고 퍼옥시다아제의 활성에도 좋지 않았다. 이 조건에서 제조 후 바로 사용하면 아무런 문제가 없었지만 티엠비를 포함한 완충액을 장시간 보관할 경우 용기 바닥에 결정이 생기고 결과적으로 최종 흡광도 값이 떨어지는 현상이 발생하여, 이를 보완하고자 20종의 계면 활성제를 여러 농도로 첨가하여 조사한 결과 타우로콜릭산 나트륨(sodium taurocholic acid)과 콜릭산 나트륨(sodium cholate) 이, 티엠비를 포함한 완충액을 장시간 보관할 경우 용기 바닥에 결정이 생기고 결과적으로 최종 흡광도 값이 떨어지는 현상을 방지하는 효과가 있음을 확인하였다.

Claims

타우로콜릭산 나트륨 및/또는 콜릭산 나트륨; 및 아세테이트 완충액 또는 시트레이트-인산 완충액을 포함하는 퍼옥시다아제의 기질액 조성물.
제1항에 있어서, 상기 타우로콜릭산 나트륨의 농도는 0.25mM∼ 0.5mM인 기질액 조성물.
제1항에 있어서, 상기 콜릭산 나트륨의 농도는 0.1%(w/v)임을 특징으로 하는 기질액 조성물.
제1항에 있어서, 상기 완충액의 pH가 3.7 내지 4.8인 기질액 조성물.