KR100188459B1 - 신규 세포외 매트릭스 수용체-리간드 상호작용을 이용한 혈관 내피에의 임파구 접착의 억제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포외 매트릭스 수용체와 그 리간드 사이의 상호작용을 방해함으로써 이루어지는, 세포간의 유착을 억제시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 α 4 β 1 세포외 매트릭스 수용체가 한정된 펩티드 서열에의 부착을 통하여 내피세포에의 임파구 유착을 촉진한다는 발견사실에 근거한다.

본 발명의 이전에, α 4 β 1 수용체의 리간드는 동정되지 않았으며 임파구 부착에 있어 α 4 β 1 수용체의 기능은 밝혀지지 않았다.

항체 또는 한정된 펩티드 서열을 이용한 α 4 β 1과 그 리간드 사이의 상호작용을 지지함으로써 본 발명은 먼저 혈관내피를 통한 임파구의 조직으로의 이동을 특이적으로 방해할 수 있다.

그러므로 본 발명은 면역 반응의 억제에 특정 임상적 이용성을 가진다.

본 발명의 다양한 특정 구체예에서, 내피에의 임파구의 유착은 전신적으로 억제될 수 있거나 또는 특정 조직 또는 주위영역에 국소화될 수 있다. 따라서 본 발명은 알레르기, 천식 및 만성적 피부염 병상 등의 면역시스템의 만성적 또는 퇴행적 활성뿐만 아니라 자가면역반응에 관계되는 질환의 치료를 제공한다.

Description

[발명의 명칭]

신규 세포외 매트릭스 수용체-리간드 상호작용을 이용한 혈관 내피에의 임파구 접착의 억제

[도입]

본 발명은 세포간의 접착(adhesion)을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 α 4 β 1 세포외 매트릭스 수용체가 한정된 펩티드 서열에의 부착을 통하여 내피세포에 임파구의 접착을 촉진한다는 발견에 기초한다. 본 발명의 특정 구체예에서 모노클로날 항체 또는 펩티드는 임파구가 내피세포에 결합하는 것을 억제함으로써 조직으로의 임파구의 유입을 방지하고 면역방응을 억제하는데 이용된다.

[본 발명의 배경]

[세포외 매트릭스 수용체]

콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌 등과 같은 세포외 매트릭스(ECM) 성분에 대한 특정 세포표면 수용체(R)가 제시되어 있다(Hynes, 1987, Cell, 48:549-554; Hemler, 1988, Immunol, Today, 9:109). 세포외 매트릭스 수용체들(ECMR Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅵ)의 기능은 친화력 크로마토그래피(Wayner 및 Carter, 1987, J. Cell Biol., 105; 1873-1884; Staatz et al., 1989. J. Cell Biol., 198:1971-1924)에 의하여 그리고 정제된 리간드(Wayner 및 Carter, 1987, J. Cell Biol. 105:1873-1884) 또는 ECM(Wayner et al., 1988, J. Cell Biol. 107:1881-1891)과 세포의 상호작용을 특이적으로 억제하는 모노클로날 항체를 제조함으로써 밝혀져 왔다.

이들 기술을 이용하여 다양한 ECMR 들이 확인되었다. 모노클로날 항체를 이용하여, 웨인너 및 카터(Wayner 및 Carter 1987, J. Cell Biol. 105:1873-1884)는 사람의 섬유육종 세포에서 원콜라겐(native collagen)에 대한 두 종류의 세포 표면 수용체를 특성확인하였다; 제Ⅰ유형은 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌에의 세포접착에 관련하는 한편 제Ⅱ유형은 원콜라겐에만 세포가 접착하는 것이 관련한다. 웨인너등(1988, J. cell Biol. 107:1881-1891)은 콜라겐(P1H5), 피브로넥틴(P1F8 또는 P1D6) 및 콜라겐과 피브로넥틴(P1B5) 모두에 사람 세포의 접착을 억제하는 모노클로날 항체를 확인하였다; P1F8 및 P1D6은 ECMR Ⅵ으로 알려진 140kD 표면 수용체와 반응하는 것으로 밝혀졌다. 쿠니키등(Kunicki et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:4516-4519)은 P1H5(상기)도 피브로넥틴을 제와한 콜라겐 제Ⅰ 및 제Ⅲ 유형에의 사람 비활성 혈소판으 접착을 특이적으로 억제한다는 사실을 제시하였다. 피브로넥틴으로의 세포접착을 차단하는 모노클로날 항체를 이용하여 닭 배(embryo) 섬유아세포로부터 최소한 3개의 당단백질로 이루어진 복합체를 단리하는 한편(Knudsen et al., 1985, Exp. Cell Res. 157:218-226; Chen et al., 1985, J. Cell Biol. 100:1103-1114) 비트로넥틴 친화력 크로마토그래피를 이용하여 포유동물 세포로부터 두 당단백질 복합체를 단리하였다(Pytela et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:5766-5770; Pytela et al., 1986, Science 231:1559-1562). 주요 혈소판 표면 당단백질 Ⅱb 및 Ⅲa는 혈소판 막에 비공유결합 1:1 복합체로서 존재하며(Jennings 및 Phillips, 1982, J. Biol. Chem. 257:10458-10463), 피브리노겐(Bennett et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2417-2421; Marguerie et al., 1984, Eur. J. Biochem. 139:5-11), 피브로넥틴(Gardner 및 Hynes, 1985, Cell 42:439-448; Plow et al., 1985, Bolld 66:724-727), 폰빌레브란트인자(Ruggeri et al, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:6038-6041) 및 비트로넥틴(Pytela et al., 1986, Science 231:1559-1562)에 대한 ECMR로 작용한다. 많은 세포의 매트릭스 수용체 간에는 구조적 상동성을 공유하고 있다. ECMR은 세포접착 분자의 인테그린 패밀리의 원소이며, 인테그린 β1 서브유니트에 복합된 유일한 α서브유니트를 가진다(Hynes, 1987, Cell 48:549-554; Wayner 및 Carter, 1987, J. Cell Biol. 105:1873-1884; Wyner et al., 1988, J. Cell Biol., 107:1881-1891). 인테그린 수용체 패밀리의 부가적 원소는 백혈구 접착 단백질 및 VLA 항원 등이다. 백혈구 접착 단백질은 LFA-1, Mac-1 및 P150/95 등이며 이들은 공통의 95kDa β사슬 및 상이한 α사슬로 이루어진 이합체 당단백질이다(Kishiomoto et al., 1987, Cell 48:681-690). VLA 항원은 배양된 T 임파구에서 매우 늦게 나타나기(very late appearance) 때문에 이름붙여졌다(Hemler et al., 1983, J. Immunol. 131:334-340; Hemler et al., 1984, J. Immunol. 132:3011-3018; Hemler et al., 1985, Eur. J. Immunol. 15:502-508). VLA-β서브 유니트에 대한 항혈청은 피브로넥틴 또는 라미닌에의 세포접착을 차단하는 것으로 밝혀졌다(Takada et al., 1987, Nature 326:607-610).

이들 ECMR 사이의 상관관계도 밝혀졌다. ECMR VI은 원형 피브로넥틴 수용체(Pytela et al., 1985, Cell, 40:191-198), α 5 β 1, 혈소판 당단백질(gp) Ⅰc/Ⅱa 및 VLA5와 동일하며 ECMR Ⅱ는 α 2 β 1, 혈소판 당단백질 Ⅰa/Ⅱa 및 VLA2와 동일하며(Hemler et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:11478-11485), ECMR Ⅰ은 α 3 β 1 및 VLA3와 동일하다(Kunicki et al., 1988, J. Biol. Chem., 263:4516-4519; Takada et al., 1988, J. Cellular Biochem., 37:385-393; Wayner et al., 1988, J. Cell Biol. 107:1881-1891). α 2 β 1, α 3 β 1 alc α 5 β 1(P1H5, P1D6 및 P1B5)에 대한 모노클로날 항체는 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌-코팅 표면에의 섬유아세포 또는 혈소판 접착을 억제한다(Kunicki et al., 1988, J. Cell Biol. 107.:1881-1891; Wayner et al., 1988, supra). 상기 인테그린 패밀리의 일부 원소는 표 1에 나타나 있으며 다양한 ECMR들을 인식하는 많은 모노클로날 항체는 표 2에 나타나 있다.

β 인테그린은 배야세포 및 조직에서 차별적으로 발현되어 활성 의존 발현에서 분명한 차이를 나타낸다. 예컨대 조혈세포에서 α 5 β 1의 발현은 흉선세포와 말초 혈액 임파구의 아개체화(subpopulations), 단구성, 급성 임파성 또는 골수성 백혈병세포, 활성 T세포, 이동 조혈성 전구세포 및 일부 배양된 T, B 또는0 적밸혈병 세포계에 한정된다(Bernardi et al., 1987, J. Cell Biol., 105:489-498; Cardarelli et al., 1988, J. Cell Biol., 106:2183-2190; Garcia-Pardo et al., 1989 Garcia-Pardo et al., 1989, Exp. Cell Res., 181:420-431; Giancotti et al, 1986, J. Cell Biol., 103:429-437; Lial et al., 1987, Exp. Cell Res., 171:306-320; Wayner et al., 1988, J. Cell Biol. 107:1881-1891).

[피브로넥틴]

피브로넥틴은 특정 유형의 세포표면 및 혈장뿐만 아니라 세포외 매트릭스에 발견되는 단백질이다(Akiyama 및 Yamada, 1987, Adv. Enzymol. 59:1-57). 혈장에서, 대략 220kDa의 분자량을 가지는 두개의 유사한 서브유니트(A 및 B사슬로 호칭)로 구성되는 당단백질 이형이합체로서 존재한다(Akiyama 및 Yamada, 1987, Adv. Enzymol. 59:1-57; Erickson et al., 1981, J. Cell Biol. 91:673-678). 피브로넥틴 분자의 복수의 특정 분자내 도메인(Ruoslahti et al., 1981, J. Cell Biol. 256:7277-7281)은 단편으로 나누어질 수 있으며 각 단편은 다시 완전한 분자와 유사한 방식으로 콜라겐, 피브린, 헤파린 및 세포 표면과 상호 작용이 가능하다(Hynes 및 Yamada, 1982, J. Cell Biol. 95:369-377).

세포 및 혈장 피브로넥틴 이형이합체는 유사하나 동일한 폴리팹티드로 구성된다. 피브로넥틴 서브유니트 구조에 있어 다양성은 프레(pre)피브로넥틴 mRNA의 최소한 2영역(ED 및 ⅢCS 영역)에서의 교대 스플라이싱에 기인한 피브로넥틴 mRNA 1차 서열의 변화에서 유래한다.

피브로넥틴은 섬유아세포(Grinell et al., 1977, Exp. Cell. Res. 110:175-210). 마크포파아지(Bevilacgue et al., 1981, J. Exp. Med. 153:42-60), 다형핵 백혈구(Marino et al., 1985, J. Lab. Clin. Med. 105:725-730), 혈소판(Koteliansky et al., 1981, Fed. Euro. Biochem. Soc. 123:59-62) 및 각소세포(Clark et al., 1985, J. Invest. Dermatol. 84:378-383) 등의 다양한 유형의 세포의 이들에의 접착(소수)을 촉진할 수 있다(Liao et al., 1989, Exp. Cell Res. 181:348-361). 약 140kDa 분자량의 세포 표면 단백질과 피브로넥틴 간의 상호 작용은 섬유아세포(Brown 및 Juliano, 1985, Science 228:1448-1451; Akiyama et al., 1986, J. Cell Biol. 102:442-448; Brown 및 Juliano, 1985, J. Cell Biol. 103:1595-1603; Wylie et al., 1979, J. Cell Biol. 80:385-402), 내피세포(Plow et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:6002-6006), 임파양세포(Brown 및 Juliano 1986, J. Cell Biol. 103:1595-1603), 혈소판(Pytela et al., 1986, Science 228:1559-1562; Gardner 및 Hynes, 1985, Cell 42:439-448), 근세포(Horowitz et al., 1985, J. Cell Biol. 101:2134-2144; Dambsky et al., 1985, J. Cell Biol. 100:1528-1539; Chapman, 1984, J. Cell Biochem. 259:109-121) 및 골육종 세포(Pytela et al., 1985, Cell. 40:191-198)에서 관찰되었다.

피브로넥틴의 세포 표면에의 결합은 피브로넥틴 단편에 의하여 경쟁적으로 억제된다(Akiyama et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:13256-13260). 합성 펩티드를 사용하여, 유일한 최소 세포 인식부위로 생각되는 것의 서열을 Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS) 테트라펩티드로서 동정하였다(Pierschbacher 및 Ruoslahti, 1984, Nature 309:30-33; Pierschbacher et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1224-1227; Pierschbacher et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:5985-5988; Akiyama et al., 1985, J. Cell Biol. 102:442-448). 피브로넥틴의 세포결합 도메인에 존재하는 RGDS 서열은 Pytela et al(1985, Cell 40:191-198)에 의해 기술된 피브로넥틴 수용체의 원형에 대한 리간드이다.

여러 관찰 사실로부터 RGDS가 아닌 다른 영역이 피브로넥틴 결합기능을 하는 것으로 제시되었다(Humphries et al., 1986, J. Cell Biol. 103:2637-2647). 예컨대 합성 펩티드의 결합 친화력은 완전한 피브로넥틴 또는 더 큰 단편과 연관된 결합 친화력 보다 실질적으로 더 낮은 것으로 밝혀졌다(Akiyama et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10402-10405; Akiyamaet al., 1985, J. Biol. Chem. 260:13256-13260). 맥카티등(McCarthy et al., 1986, J. Cell Biol. 102:179-188)은 B16-F10 색소세포 종양 세포와 혈장 피브로넥틴의 33kDa 단편 사이의 결합 친화력을 밝힌 바 있다. 베르나디 등(Bernardi et al. 1987, J. Cell Biol. 105:489-498)은 피브로넥틴상의 두개의 다른 부위에 접착된 임파양 전구체 세포를 밝힌 바 있다; BaF3 세포계는 RGD 결합 도메인과 상호 결합하는 한편 PD31 세포계는 카르복시 말단 단편에 위치하고 헤파린의 높은 친화력 결합 부위와 관련되는 다른 도메인과 상호작용하는 것으로 보인다.

험프리등(Humphries et al., 1986, J. Cell Biol. 103:2637-2647)은 색소세포종과 접착 상호작용을 형성하는 피브로넥틴 단편의 능력을 섬유아세포와 비교하였다. 섬유아세포 BHK 세포는 RGDS 함유 세포-결합 도메인을 나타내는 75kDa 단편에 급속히 퍼지는 것으로 관찰된 반면 B16-F10 색소세포종 세포는 75kDa 단편에서는 퍼지지 않았으나 타잎 Ⅲ결합 단편(CS) 차등 영역 또는 V-영역(mRNA의 교대 스플라이싱이 일어나지 않는)을 포함하는 피브로넥틴의 부분으로부터 유래된 113kDa 단편에서 퍼지는 것으로 관찰되었다. 피브로넥틴 카르복실 말단 가까이에 위치하는 이 ⅢCS 영역에서 서열 Arg-Glu-Asp-Val(REDV)는 기능적 중요성을 가지는 것으로 보인다. 험프리 등(1987, J. Biol. Chem. 262:6886-6892)은 ⅢCS 영역에 걸쳐있는 일련의 중복상 펩티드를 연구하였다. 두 비인접 펩티드 CS1 및 CS5는 CS5보다 더 높은 억제 활성을 보이는 CS1과 섬유아세포가 아닌 색소세포종 세포의의 피브로넥틴의 접착에 경쟁적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다. 리아노 등(Liao et al., 1989, Exp. Cell Res. 181:348-361)은 MOPC 315, IgA-분비 임파양 세포가 RGD 상호 작용을 통하여 세포 결합 도메인에 결합하는 외에 RGD-독립 대사작용에 의하여 카르복시-말단 헤파린 결합 도메인에 우선적으로 결합한다. 그러나 피브로넥틴의 카르복시 말단 영역에 존재하는 접착 서열 및 이들 접착 서열에의 세포의 접착에 관계하는 세포 표면 수용체들은 밝혀지지 않았다.

[세포접착 분자의 생물학적 기능]

세포 간의 접착 상호 작용은 조직분화, 성장 및 형성 등의 많은 주요한 생물학적 작 동안에 발생하는 것으로 밝혀졌으며 또한 다양한 질병의 병원성에 결정적인 역할을 하는 것으로 보인다(Humphries et al., 1986, J. Cell Biol. 103:2637-2637; Grinnelll, 1984, J. Cell Biochem. 26:107-116; Hynes, 1986, Sci. Am. 254:42-51).

예컨대 접착 상호 작용은 면역 시스템에서 극히 중요한 것으로 알려져 있다. 면역 매개 세포의 국소화는 최소한 부분적으로 세포간의 접착 상호작용에 기인한다. 임파양 세포의 재순환은 비-임의적이다(Male et al., Advanced Immunology, J. B. Lippincatt Co., Philadelphia, p. 14.4-14.5); 임파구는 이들이 들어갈 제2임파양 기관 유형에 우선성을 나타낸다. 제2임파양 기관을 통한 왕래에서 임파구는 먼저 후-모세 정맥의 혈관내피에 결합한 후 그다음 내피 간의 단단한 연결부를 개방한 다음 끝으로 기본적으로 조직으로 이동하여야 한다. 호밍(homing)이라 불리는, 혈액으로부터 특정 임파양 조직으로의 재순환 임파구의 이동은 임이파구 표면 및 고내피 세정맥의 내피세포상에서의 상보적 접착 분자와 관련된다.

한편, 혈관 내피에의 다형핵 백혈구의 접착은 급성 염증성 반응의 형성에 중요한 현상으로 여겨지며 호중구 매개성 혈관 손상의 특정 유형 뿐만 아니라 효과적인 화학주성 반응에 요구되는 것으로 여겨진다(Zimmerman 및 McIntyre, 1998, J. Clin. Invest. 81:51-537; Harlan et al., 1987, Leukocyte Emigration 및 its Sequelae, Movat, ed. S. Karger AG. Basel, pp. 94-104; Zimmerman et al., ibid., pp. 105-118). 특정 작용제 물질로 자극될 때 다형핵 밸혈구(Tonnensen et al., 1984, J. Clin. Invest. 74:1581-1592), 내피세포(Zimmerman et al., 1985, J. Clin. Inv~est. 76:2235-2246; Bevilacque et al., J. Clin. Inverst. 76:2003-2011) 또는 둘다(Gamble et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:8667-8671) 접착된다: 그 결과, 다형핵 백혈구는 내피세포 표면에 축적된다.

또한, 면역결핍 환자에게 특정 항-당단백질 항체로 연구 결과 CD18 복합체의 하나 또는 그 이상의 구성체는 유효한 호중구 화학주성 및 기타 접착 관련 기능에 요구된다는 사실이 제시되었다(Zimmerman and MacIntyre, 1988, J. Clin. Invest. 81:531-537). CD18 복합체는 β2 인테그린 서브패밀리와 동일하다(supra).

성숙 및 분화과정 동안, 임파구-서브군은 다른 해부 부위에 국소화한다. 예컨대 비성숙 T세포는 흉선에 존재하게 된다. 유사하게 IgA-생산 B 세포는 장점막에 위치하게 되는 것으로 생각된다(Parrott, 1976, Clin. Gastroenterol. 5:211-228). 이와는 달리, IgG-생산 B세포는 1차적으로 임파절에 위치하며 여기서부터 IgG는 전신순환으로 분비된다(Parrott 및 deSousa, 1966, Nature 212:1316-1317). T세포는 점막 내면 보다는 피부 상피에 더 많이 존재하는 것으로 보인다(Cahill et al., 1977, J. Exp. Med. 145:420-428).

백혈구 접착 단백질의 생리학적 중요성(상기)은 사람의 유전병인 백혈구 접착 결핍(LAD; Anderson et al., 1985, J. Infect. Dis. 152:668; Arnaout et al., 1985, Fed. Proc. 44:2664)의 존재에 의하여 부각된다. 다양한 연구 결과 LAD와 연관된 분자 손상은 공통 β사슬의 합성 결여 또는 정상 합성 후 급속한 분해를 초래한다(Liowska-Grospierre et al., 1986, Eur. J. Immunol. 16:205; Diamanche et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17:147). 심각한 형태의 LAD에서 LFA-1, Mac-1 또는 p150/95 어느 것도 백혈구 막에서 발현되지 않는다: 낮은 수준의 백혈구 막발현은 심하지 않은 질환자에게 관찰된다. 이것은 염증반응 동안에 혈관계에서 조직으로의 다형핵 백혈구 및 단구의 이동에 손상을 초래하며 결과적인 박테리아 감염의 재발을 유도한다(Anderson et al., J. Infect. Dis. 152:668; Arnaout et al., 1985, Fed. Proc. 44:2664).

또한 ECMR은 면역 시스템 이외의 기능과 관련되는 것으로 관찰되었다. Ⅱb/Ⅲa 혈소판 표면 당단백질 복합체의 결실은 Glanzmann의 혈소판 무력증으로 알려진 유전병에서의 혈소판 기능의 손상을 초래하는 것으로 보인다(Hy-nes, 1987, Cell 48:549-554). 험프리 등(Humphries et al. 1988, J. Cell Biol. 106:1289-1297)은 말초신경계 뉴우런이 피브로넥틴의 ⅢCS 영역 및 중앙세포- 결합 도메인 모두를 품는 기질에 축색(신경세포돌기)을 신장시킬 수 있음을 관찰하였다. 더욱이 최근에 본 발명자들은 라미닌 또는 피브로넥틴의 축색돌기 형성이 ECMR에 대한 항체에 의해 억제될 수 있음을 밝혔다.

[본 발명의 요약]

본 발명은 세포외 매트릭스 수용체와 리간드 사이의 상호 작용을 방해함으로써 이루어지는 세포와 세포 사이의 접착을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 α 4 β 1 세포외 매트릭스 수용체가 한정된 펩티드 서열에의 결합을 통하여 임파구의 내부세포에의 접착을 촉진한다는 발견에 기초한다.

본 발명 이전에는 α 4 β 1 수용체의 리간드는 밝혀지지 않았을 뿐아니라 임파구 부착에 있어 α 4 β 1 수용체의 기능도 밝혀지지 않았다. 항체 또는 한정된 펩티드 서열을 이용한 α 4 β 1 수용체와 그 리간드의 상호 작용을 억제함으로써 본 발명은 처음으로 임파구의 혈관 내피를 통한 조직으로의 이동을 특이적으로 방해할 수 있게 한다. 그러므로 본 발명은 면역 반응의 억제에서 특별한 임상 이용성을 가진다; 본 발명의 다양한 특정 구체예에서, 임파구의 내부로의 접착은 체계적으로 억제되거나 또는 아니면 특정 조직 또는 주변 영역에 국소화한다. 따라서 본 발명은 알레르기, 천식 및 만성 피부염 병상 등의 면역체계의 기타 만성 또는 재발성 활성화 뿐만 아니라 자가면역 반응에 관련되는 질병의 치료를 제공한다.

[약어]

본 명세서에서 정의된 펩티드 서열은 다음과 같이 아미노산 잔기에 대한 일문자 심벌로 표시한다:

A(알라닌), R(아르기닌), N(아스파라긴), D(아스파르트산), C(시스테인), Q(글루타민), E(글루탐산), G(글리신), H(히스티딘), I(이소류신), L(로이신), K(리신), M(메티오닌), F(페닐알라닌), P(프롤린), S(세린), T(트레오닌), W(트립토판), Y(티로신), V(발린).

[도면의 간단한 설명]

제1도는 T 임파구(Molt 4), K562-1, RD 또는 HT1080 세포의 혈장 피브로넥틴에이 접착, P1D6 모노클로날 항체로의 억제 및 α 5 β 1의 세포 표면 발현.

Cr- 표식 세포(10 세포/㎖)을 4℃에서 60분간 P1D6 모노클로날 항체(50㎍/㎖)로 배양하고 37℃에서 30분(HT108 또는 RD) 또는 4시간(Molt 4 또는 K562)동안 P1D6(막힌 막대) 또는 마우스 IgG(개방막대)의 존재하에 피브로넥틴-코팅(20㎍/㎖) 플라스틱 표면에 부착되게 하였다. 혈장 피브로넥틴(pV\FN)에의 접착은 플라스틱 표면에 결합된 Cr cpm으로서 발현된다. α 5 β 1의 세포 표면 발현은 P1D6 모노클로날 항체로 현탁액의 세포를 염색함으로써 유동 혈구계산에 의해 측정하였다. 로그 P1D6(사선막대)은 기준위의 평균 채널수(0-255)로서 나타냈다.

제2도는 HT10890, Molt4 또는 임상적으로 활성된 CD8+T(LAK) 세포 세정 추출물로부터 임파구 피브로넥틴 수용체의 면역 침전.

I-표식 Molt4, LAK 또는 HT1080 세포를 프로테아제 억제자로서 페닐메틸 술포닐 플루오라이드(1mM), N-에틸말레이미드(1mM), 루펩틴(1㎍/㎖) 및 디이소프로필 플루오로포스페이트(1mM)의 존재하에 1%트리톤 X-100으로 추출하였다. 이들 추출물의 분취량을 α 3 β 1(P1B5), α 2 β 1(P1H5) 및 α 4 β 1(P3E3)에 대한 모노클로날 항체로 면역침전시켰다. 면역 침전된 항원을 2-Me이 부재하에서 7.5% SDS-PAGE 겔에 장착하고 방사선 사진으로 가시화하였다. T 임파구로부터의 P3E3으로 면역 침전된 3개의 띠가 나타났다(화살표).

제3도는 인테그린 α 4 β 1으로서 임파구 특정 피브로넥틴 수용체의 동정.

I-표면 표식 Jurkat 세포를 1mM CaCl, 1mM 디이소프로필-플루오로포스페이트, 1mM 페닐메틸 술포닐 플루오라이드, 1mM N-에틸말레이미드, 1㎍/㎖ 루페틴 및 2㎍/㎖ 콩 트립신 억제자의 존재하에 0.3% CHAPS로 추출하였다. 그다음 추출물 분취량을 골수종(SP2) 배양 상등액 또는 모노클로날 항체 P3E3, P4C2, P4G9 또는 P1D6(항-α 5 β 1)으로 면역 침전시켰다. 면역 침전물을 환원제의 부재하에 8% SDS-PAGE 겔에 장착하고 방사선 사진으로 가시화하였다. 분자량 표시는 좌측에 나타나 있다. α 5 및 β 1 서브유니트는 P3E3, P4C2 및 P4G9로 제조된 면역 침전물에 존재하는 띠가 나타낸 것과 마찬가지로 표시되었다(화살표).

제4도는, 피브로넥틴-코팅 표면상의 중심 접착에 α 4 β 1 및 α 5 β 1의 국소화.

RD세포를 트립신 처리하고 37℃에서 1시간 동안 혈청의 부재하에 실란화 및 피브로넥틴-코팅된(20㎍/㎖) 유리커버 슬립에 접착되게 하였다. 이 시간의 말엽에 세포를 기술하는 바와같이(실험공정) 중심접착에 수용체의 국소화를 위하여 제조하였다. 패널 A 및 C는 RD세포가 피브로넥틴에 접착될 때 간섭 굴절 현미경으로 가시화된 중심접착(화살표)을 나타낸다. 패널 B는 항체 AB33으로 염색된 RGD 원형 피브로넥틴 수용체 α 5 β 1의 중심접착에의 재조직을 나타낸다(화살표). 패널 D는 RD세포가 피브로넥틴에 접착될 때 P4G9(FITC)로 염색된 α 4 β 1의 중심접착에의 재조직을 나타낸다(화살표). 패널 A 및 B는 동일한 필드이고 패널 C 및 D는 동일한 필드이다.

제5a도, 본 연구에 사용된 단편의 개시점을 보여주는 사람 혈장 피브로넥틴(pFN)의 도메인 구조, B. 단편의 순도를 나타내는 SDS-PAGE겔 분석(10% 아크릴아미드).

80kDA 단편은 N-말단 아미노산 서열 SD()VPSPR()LQF을 가지며 따라서 피브로넥틴 분자의 위치 874에서 시작한다(Kornblihtt et al., 1985, EMBO J. 4:1755-1759). 이 단편은 피브로넥틴의 세포결합 도메인(세포) 및 RGDS 서열을 포함한다. 58 kDA 및 38 kDA 다편은 N-말단 아미노산 서열 TAGPDQTEMTIEGLQ을 가진다. 두 단편은 C- 말단 헤파린 결ㅎ바 도메인(HepⅡ)을 포함하며 트립신에 의한 두 피브로넥틴 사슬의 상이한 절단에 기인한다. 38kDa 단편은 피브로넥틴(ⅢCS)의 교대 스플라이싱 연결 단편의 처음 67아미노산 잔기로 구성된다(Garcia-Pardo, 1987, Biochem. J., 241:923-928). 따라서 이것은 A사슬로부터 유래한다. 38kDa 단편은 B16-F10 골수종 세포에 의하여 인식되는 REDV 접착 부위를 함유하지 않는다(Humphries et al., 1986, supra; Humphries et al,, 1987, supra). 58kDa 단편은 피브로넥틴의 B사슬에서 유래하고 ⅢCS영역이 결핍되어 있다(Garcia-Pardo, et al., 1989, EMBO J., Submitted). 또한 58kDa 단편은 피브로넥틴(Fib Ⅱ)의 C-말단 피브린 결합 도메인을 함유하며 혈장 피브로넥틴의 이 영역에서 이미 제시된 단편과 유사하다(Cl-ick, E. M., 및 Balian, G. 1985, Biochem., 24:6685-6696). 은 염색에 의하여 띠를 가시화하였다.

제6도는 혈장 피브로넥틴의 정제된 38kDa 및 80kDa 트립신 단편 및 혈장 피브로넥틴의 조혈세포의 접착.

Cr-표식 K562(적혈구 백혈병), Jurkat(CD3+T 임파구) 및 YT(CD3+T 임파구) 세포(10 /웰)을 37℃에서 2시간 동안 지시된 농도로 완전한 혈장 피브로넥틴(pFN) 도는 정제된 80kDa 및 38kDa 트립신 단편으로 코팅된 플라스틱 표면에 접착되게 하였다. 이 시간의 끝 무렵에 비-접착 세포를 세척 제거하고 결합세포를 SDS/NaOH에 용해하고 정량하였다. 그 결과는 결합된 Cr cpm으로 나타냈다.

제7도는 완전한 혈장 피브로넥틴(pFN) 또는 정제된 80kDa 및 38 kDa 트립신 단편에의 T 임파구의 접착에 미치는 인테그린 수용체 α 5 β 1 및 α 4 β 1(각각)에 대한 모노클로날 항체 P1D6 및 P4C2의 효과.

Cr-표식 Molt 4 페소를 4℃에서 1시간 동안 정제 P1D6 또는 P4C2 모노클로날 항체(50㎍/㎖) 또는 정제 마우스 IgG(50㎍/㎖)로배양하였다. 이들을 그다음 1시간 동안 표시된 농도로 완전한 혈장 피브로넥틴 또는 80kDa 및 38 kDa 트립신 단편으로 코팅된 플라스틱 표면에 접착되게 하였다. 이 시간의 끝무렵에 비-접착 세포를 세척제거하고 접착세포를 용해하고 결합된 Cr cpm을 감마 카운터에서 정량하였다. 그 결과는 결합 cpm으로 표시하였다.

제8도는, IL-1β활성 HUVE 세포에의 T 임파구의 접착에 미치는 CS-1 B12 펩티드의 효과.

제9도는, a) ⅢCS 및 CS-1 영역의 다이아그램.

b) CS-1, A13 및 B12의 아미노산 서열.

[발명의 상세한 설명]

임파구에서 α 5 β 1의 기능을 조사하기 위한 실험에서 및 휴지 말초혈액 및 배양된 T 임파구(Molt 4 또는 Jurkat)가 원형 피브로넥틴 수용체 α 5 β 1에 독립적인 피브로넥틴에 대한 친화력을 나타낸다는 사실을 관찰하였다. 이들 세포들이 피브로넥틴-코팅 표면에 부착되더라도 이들은 기능적으로 정의된 모노클로날 항체 P1D6에 의해 인식되는 α 5 β 1의 낮은 수준 또는 검출되지 않을 수준으로 나타난다(Wayner et al., 1988, J. Cell Biol. 107:1881-1891). 더욱이 T 임파구의 피브로넥틴에의 접착은 접착 과정에서 피브로넥틴에 대한 다른 수용체와의 관련을 제시하는 펩티드를 함유하는 P1D6 또는 RGD에 의하여 부분적으로만 억제될 수 있다. 한편 악성 또는 형질전환 섬유아세포 및 활성 T 임파구(LAK 세포) 등의 다른 세포의 피브로넥틴에의 접착은 P1D6에 의해 완전히 억제될 수 있다.

이 사실은 휴지 말초 혈액 T 임파구 및 배양된 T 세포 백혈병이 다중 독립적 및 기능적 피브로넥틴 수용체를 발현한다는 것을 제시한다.

본 발명에 따라서, 다른 피브로넥틴 수용체는 다른 세포는 제외한 T 임파구의 피브로넥틴에의 접착을 특이적으로 억제하는 모노클로날 항체를 제조하는 것으로 밝혀졌다. 이 수용체는 인테그린 수용체 α 4 β 1과 동일하며 말초 혈액 임파구, 배양된 T 세포계 및 RD세포의 혈장 피브로넥틴으로의 접착을 매개한다. 더욱이, T 임파구는 험프리 등(Humphries et al., 1986, J. Cell Biol., 103:2673-2647; Humphries et al., 1987, J. Cell Biol., 262:6886-6892)이 정의한 CS-1, CS-2 및 CS-3 영역에 걸쳐있는 타입 Ⅲ 결합 단편(ⅢCS)의 67아미노산 잔기 및 헤파린 Ⅱ 도메인을 포함하는 혈장 피브로넥틴(Garcia-Pardo et al., 1987, Biochem. J., 241:923-928)의 38 kDa 트립신 단편(tryptic fragment)에 분명한 선호도를 나타낸다. 본 발명에 따라서, T 임파구는 CS-1에만 부착되며 α 4 β 1(P3E3, P4C2, P4G9)에 대한 모노클로날 항체는 38 kDa 단편 및 CS-1에의 T 임파구 접착을 완전히 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한 T 임파구는 헤파린 Ⅱ 도메인에 존재하는 부위에 부착(매우 낮은 치화력으로)되며 α 4 β 1에 대한 모노클로날 항체도 이 상호작용을 억제하는 것으로 밝혀졌다. α 4 β 1에 대한 기능적으로 한정된 모노클로날 항체는 서열을 함유하는 혈장 피브로넥틴의 80kDa 트립신 단편에의 T 임파구 접착을 억제하지 않는 한편 α 5 β 1(원형 피브로넥틴 수용체)에 대한 항체는 이 상호작용을 완전히 억제한다.

또한 본 발명은 α 4 β 1 수용체가 임파구와 내피세포 사이의 상호작용을 매개한다는 발견에 관한 것이다. 본 발명에 따라 항체 또는 펩티드는 임파구의 내피세포에의 접착을 차단하는데 이용될 수 있다. 한정적인 의미가 아닌 분명한 개시를 위하여 다음 서브절에 따라 본 발명을 기술하고자 한다.

ⅰ) 세포외 매트릭스 수용체(ECMR)에 대한 항체의 제조

ⅱ) ECMR-리간드 상호 작용의 특성 확인

ⅲ) 세포접착의 방해 방법

ⅳ) 본 발명의 이용 및

ⅴ) 발명의 펩티드 및 항체

[세포외 매트릭스 수용체에 대한 항체의 제조]

세포외 매트릭스 수용체에 대한 항체의 제조는 공지의 항체 생산방법에 따라 실시할 수 있다. 완전한 세포 또는 정제된 세포외 매트릭스 수용체(ECMR)을 면역원으로 사용한다. 숙주의 면역은 다른 종에서 얻은 면역원을 사용하여 실시하는 것이 바람직하다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날이다.

공지의 다양한 방법이 주어진 ECMR의 에피토프에 대한 폴리클로날 항체의 생산에 이용될 수 있다. 항체의 생성을 위하여 다양한 숙주 동물은 ECMR 단백질 또는 합성단백질 또는 그 단편을 주입하여 아니면 완전한 세포를 사용하여 면역시킨다. Freund's 보조제(완전 또는 불완전)에 한정되지 않으나 수산화알루미늄 등의 미네랄 겔, 리소레시틴, 플루론 폴리올, 폴리아니온, 펩티드, 오일에멀션, 케이홀 림페트 헤모시아닌, 디니트로페놀 등의 표면 활성물질 및 BCG(바실레 Calmette-Guerin)과 Corynebacterium parvum 등의 강력하게 유용한 사람의 보조제 등과 같이 숙주에 따라 면역학적 반응을 증가시키기 위하여 다양함 보조제를 이용할 수 있다.

ECMR의 에피토프에 대한 모노클로날 항체는 연속적인 세포계의 배양에 의하여 항체분자의 생성을 제공하는 기술에 의하여 제조된다. 하이브리도마 기술에 한정되지 않지만 Kohler 및 Milstein(1975, Nature 256:495-497) 및 Taggart 및 Samloff(1983, Science 219:1228-1230) 및 최근의 사람 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbr et al., 1983, Immunology Today 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies 및 Cane\cer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 등이 있다. 치료를 위한 모노클로날 항체는 사람의 모노클로날 항체 또는 키메라 사람-마우스(또는 다른종) 모노클로날 항체이다. 사람 모노클로날 항체는 공지의 많은 기술에 따라 제조될 수 있다(예컨대 Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). 키메라 항체 분자는 사람의 불변 영역을 가지는 마우스 항원-결합 도메인을 함유하도록 제조된다(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, Takeda et al., 1985, Nature 314:452).

ECMR 에피토프에 대한 항체의 분자 클론은 공지기술에 따라 제조될 수 있다. 재조합 DNA 방법(예컨대 Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)은 모노클로날 항체 분자 또는 그것의 항체 결합 영역을 코드하는 핵산 서열을 구성하는데 사용된다.

항체 분자는 공지기술 예컨대 면역흡착법 또는 면역 친화력 크로마토그래피, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 등의 크로마토그래피법 또는 이들의 조합에 의하여 정제될 수 있다.

분자의 인자형을 포함하는 항체 단편은 공지기술에 의해 생성될 수 있다. 예컨대 이들에 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 것들이 있다. 항체분자의 펩신 절단에 의하여 생산될 수 있는 F(ab')단편;F(ab')단편의 이황화 브리지를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab' 단편 및 항체 분자를 파파인과 환원제로 처리함으로써 생산될 수 있는 2Fab 또는 Fab 단편. 한편 상기 방법에 의하여 생산된 ECMR과 반응하는 항체가 공지 기술에 따라 동정 및 선별될 수 있다. 예컨대 항체는 폴리아미드 겔에서 다른 단백질로부터 분리되거나 또는 정제되어진 밝혀진 ECMR에 결합 및/또는 면역 침전되는 것으로 밝혀졌다. 한편, ECMR에 대한 항체는 ECMR에 결합하는 이미 밝혀진 ECMR 항체와 경쟁하는 능력에 의해 동정될 수 있다. ECMR에 결합하는 항체는 또한 ECMR/리간드 상호 작용을 차단하는 이들의 능력에 의하여 동정될 수 있다. 예컨대 이들에 한정되지는 않지만 피브로넥틴(그 자체는 동정 또는 특성 확인될 필요는 없으나 단지 기능적으로 한정됨)에 결합하는 ECMR 수용체를 가지는 세포는 피브로넥틴으로 코팅된 기질에 접착되는 것으로 밝혀졌다.

항혈청 또는 하이브리도마 상등액이 기질에의 세포접착을 억제하는 것으로 나타난다면 항혈청 또는 상등액에 포함된 항체는 ECMR 수용체를 인식한다.

본 발명에 따라서, α 4 β 1 수용체를 인식하는 항체는 상기 제시된 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 α 4 β 1에 대한 모노클로날 항체는 다음과 같이 생산될 수 있다: RBF/DN 생쥐로부터 얻은 생쥐를 팩된 T 임파구 약 1000μℓ로 면역시킨다. 이들의 비장을 오이 및 헤르젠버그(0i 및 Herzenberg 1980, :Selected Methods In Cellular Immunology, Mishell 및 Shiigi, eds, Freeman 및 Co., San Francisco, pp. 351-373) 및 타가트와 삼로프(Taggart 및 Samloff 1983, Science 219:1228-1230)에 의해 기술된 예컨대 NS-1/FOX-NY 골수종세포와 융합시킨다. 그 다음 아데닌/아미노프테린/티미딘으로 보충된 RPM1 1640 배지에서 생존 이형다핵세포를 선별한다.

임파구 ECMR에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마는 피브로넥틴-코팅표면에의 접착에 의하여 스크린하고 희석을 한정하여 클로닝한다. 특별히, α 4 β 1에 대한 항체는 예컨대 CS-1 펩티드 또는 그 유도체로 코팅된 기질 또는 내피세포에의 임파구의 접착을 차단하는 능력에 의하여 동정한다. 그러나 α 4 β 1를 인식하지 않는 항체는 RGD-펩티드 코팅 기질에의 α 5 β 1 수용체를 가지는 세포의 결합을 억제하지 않을 것이다. 한편 α 4 β 1에 대한 항체는 다음과 같은 이들의 능력에 의해 동정된다;

ⅰ) 공지 항-α 4 β 1 항체(예컨대 P4C2 또는 P4C10)의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력 또는 ⅱ) 공지 항-α 4 β 1 항체(예컨대 겔, 웨스턴 블로트에서 또는 일련의 면역 침전 실험에서)와 동일한 단백질에 결합하는 능력.

[ECMR/리간드 상호작용의 특성확인]

세포외 막 수용체간의 상호 작용은 예컨대 이들에 한정되지 않지만 다음의 방법에 의하여 특성 확인된다.

ⅰ) 수용체 분포 및 기능의 확인

ⅱ) 수용체/리간드 결합의 방해

ⅲ) 수용체 및/또는 리간드의 화학적 특성 확인 및 단리

이들 방법은 다음의 세서브절에서 더욱 상세히 기술되어 있다.

[수용체 분포 및 기능의 결정]

본 발명의 방법에 따라 수용체 분포는 공지의 방법을 이용하여 결정한다. 예컨대 이것에 한정되지 않지만, ECMR을 가지는 세포군은 해당 ECMR에 대한 모노클로날 항체를 이용하여 동정한다. ECMR에의 항체의 결합은 면역형광법 및 면역 퍼옥시다아제 염색법 등의 면역조직 화학적 기술에 의하여 결정된다. 아니면, 해당 ECMR을 가지는 세포의 군은 형광-활성세포 선별기법에 따라 모은다. 세포가 적당한 리간드상에 성장될 때 중심 접착에의 세포 표면 접착 수용체의 특이적 재조직이 나타나는 것같기 때문에(Burridge et al., 1988, Ann. Rev. Cell Biol. 4:487-525) 유력한 리간드와 주어진 수용체 사이의 기능적 상호작용을 특성확인하는 한 방법은 해당 ECMR이 세포와 리간드 기질간에 형성된 중심 접착으로 분포하는지의 여부를 결정하는 것과 관련된다. 예컨대 이것에 한정되지는 않지만 α 4 β 1은 다음 방법에 의하여 수용체/리간드 상관 관계에서 피브로넥틴과 상호작용하는 것으로보인다(하기 참조). 임파구는 피브로넥틴 기절에 접착하도록 되고 세포와 기질 사이의 중심 접착은 간섭 굴절 현미경에 의하여 가시화한다(Izzard et al., 1976, J. Cell Sci. 21:129-159). P4G9 또는 P3C10 등의 α 4 β 1을 인식하는 항체를 사용하여 예컨대 플루오로-이소티오세아네이트 등의 표준 면역조직 화학적 기법에 따라 혈청이 존재하지 않은 상태에서 α 4 β 1이 중심접착으로 재분포 된다는 사실을 밝혔다.

또한 ECMR 및 리간드 사이의 상호작용은 다양한 다른 기질에 접착하는 ECMR의 능력을 테스트 함으로써 확인된다. 예컨대 해당 ECMR 또는 해당 세포 타입은 예컨대 피브로넥틴, 콜라겐, 비트로넥틴 또는 라미닌 등의 세포외 매트릭스의 정제 성분으로 구성되는 기질에 결합하는 능력을 테스트한다. 본 발명의 특정 구체예에서 α 4 β 1를 가지는 세포는 α 4 β 1/피브로넥틴 상호 작용의 결과로서 콜라겐 또는 라미닌 기질에는 접착하지 않고 피브로넥틴에 접착하는 것으로 밝혀졌다.

해당 ECMR이 특정 단백질 리간드에 결합하는 것으로 나타나는 본 발명의 다른 구체예에서 단백질 리간드의 서브단편을 가지는 기질은 세포 표면상의 ECMR에 결합하여 ECMR과 리간드간의 결합 부위를 국소화하는 능력을 테스트한다. 수용체가 피브로넥틴(상기)에 결합하는 것으로 밝혀진 α 4 β 1인 본 발명의 특정 구체예에서 피브로넥틴의 서브 단편을 가지는 기질은 하기의 6절에서 예시된 바와같이 α 4 β 1-소유세포에 결합하는 이들의 능력에 대하여 테스트한다. T 임파구가 α 4 β 1 수용체를 가지는 피브로넥틴의 80kDa 세포 결합 도메인에 접착하더라도(제5a도) 이들은 혈장 피브로넥틴의 A(또는 H) 사슬에서 유래하는 38 kDa 트립신 단편상에 위치하는 비-RGD함유 영역에 대해 분명한 선호도를 나타내었다. 또한 T 임파구는 5 단편을 함유하는 다른 Hep Ⅱ에 인식되어 결합하였다. 그러나 높은 친화력의 임파구 결합 부위는 38 kDa 단편에 위치한다.

본 기준에서, 38 kDa 단편은 T 임파구 접착을 매개하는데 5 단편보다 3배 이상 효율적이었다. 제5a도에 도시된 바와같이 38 kDa 및 58 kDa 단편은 각각 혈장 피브로넥틴의 A 및 B 사슬로부터 유래하였다. 그러므로 이들은 ⅢCS의 존재 또는 부존재하에서 상이하다(Kornblihtt et al., 1985, supra; Garcia-Pardo, 1987, supra). 따라서, 여기서 사용된 38 kDa 및 58 kDa 단편은 Hep Ⅱ 도메인에 위치하는 공통적인 낮은 친화력 T 임파구 결합부위를 가지며 부가적인 높은 친화력 T 임파구 접착 부위는 38 kDa 단편에 유일한 ⅢCS 영역에 존재한다는 사실이 가능하다. 사실, T 임파구는 B16 세포색소중 세포 및 조류신경관 세포에 대한 높은 친화력 접착 부위로 정의되어진, CS-1에 결합하고 특이적으로 인식되는 것으로 보인다(Humphries et al., 1987, supra; Humphries et al., 1988, J. Cell Biol., 106:1289-1297; Dufour et al., 1988, EMBO J., 7:2661-2671). CS-1은 혈장 피브로넥틴의 A 사슬상의 타입 ⅢCS 도메인에 존재하는 분자이질성(교대 스플라이싱에 의한 생성) 영역이다.

[수용체/리간드 결합에서 간섭]

ECMR/리간드 상관 관계는 수용체/리간드 결합을 방해하는 제제를 확인하고 평가함으로써 더욱 특성 확인할 수 있다.

예컨대 해당 ECMR에 대한 항체는 리간드/수용체 결합을 억제하는데 사용된다. 특정 세포유형이 세포기질 또는 주어진 리간드에 접착한다는 관찰 사실을 고려하면 상호 작용에 관련하는 ECMR을 동정하는 것이 매우 흥미있다.

각각이 다른 ECMR에 대한 모노클로날 항체 패널을 기질에의 세포 접착을 차단하는 능력에 대해 테스트하였다. 특정 항체에 의한 결합 억제는 이 항체에 의하여 인식된 ECMR이 접착 상호 작용에 관련한다는 것을 제시한다. 본 발명의 특정 구체예에서 배앙물에서 내피세포에의 임파구 접착은 다양한 다른 ECMR에 대한 항체에 의해서는 아니지만, α 4 β 1에 대한 항체에 의하여 억제되며(하기 7절 참조), 이 사실은 α 4 β 1은 내피세포에의 임파구 접착에 필요하다는 것을 나타낸다. 또한 모노클로날 항체는 ECMR 및 리간드 기질간의 상호작용을 결정하는데 사용된다.

6절에서 예시된 바와같이, 38 및 58 kDa 단편에의 T 임파구 접착은 α 4 β 1에 대한 기능적으로 한정된 모노클로날 항체에 의하여 완전하게 억제될 수 있다. 더욱이, CS-1(IgG 접합자) 코팅 표면에의 T 임파구 접착은 P4C2, P3E3 또는 P4G9에 의해 완전하게 억제될 수 있다. 이들 데이타들은 α 4 β 1이 CS-1에 대한 T 임파구 수용체임을 분명히 보여준다. 대조적으로, 이들 항체는 원형 접착서열 arg-gly-asp(RGD)을 함유하는 80kDa 단편에의 T세포 접착을 억제할 수 없다. 80kDa 단편에의 T 세포 접착은 RGDS 또는 α 5 β 1(P1D6)에 대한 모노클로날 항체에 의하여 완전하게 억제될 수 있다. P1D6 및 RGDS는 38 및 58 kDa 단편 또는 CS-1에의 T 임파구 접착을 억제하지 못한다. 이와함께 이들 데이타들은 α 4 β 1가 Ⅲ) 및 가능한 Hep Ⅱ에서 다른 접착서열에 대한 혈장 피브로넥틴 수용체의 카르복시 말단 접착 도메인에 대한 수용체로서 작용한다는 것을 보여준다.

본 발명의 다른 구체예에서, ECMR/리간드 상관 관계는 리간드의 구조를 측정함으로써 특성 확인된다. 특히, ECMR/리간드 상호작용에서 리간드와 경쟁하는 제제의 능력을 평가한다. 예컨대 리간드가 단백질인 경우 단백질의 다양한 단편이 수용체/리간드 결합을 경쟁적으로 억제하는 이들의 능력에 대하여 테스트한다. 임파구가 피브로넥틴 뿐만 아니라 내피세포에 결합하는 것으로 관찰되는 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서 피브로넥틴의 펩티드 단편은 내피세포 기질에이 임파구의 결합을 경쟁적으로 억제하는 능력에 대하여 테스트하였다. 7절에서 예시된 바와같이, CS-1 펩티드 및 특히 펩티드 EILDVPST는 피브로넥틴 및 내피세포에의 임파구 결합을 경쟁적으로 억제함으로써 EILDVPST에 상동적인 또는 동일한 영역에 리간드상의 결합부위를 국소화할 수 있다.

[세포 접착의 방해법]

본 발명에 따라 세포간의 접착은 ECMR/리간드 상호작용을 방해함으로써 억제된다. 본 발명의 특정 구체예에서 내피세포에의 임파구의 결합은 그 리간드에의 α 4 β 1의 결합으로 방해됨으로써 억제된다. 이것은 ECMR에 대한 항체 아니면 그 리간드에 대한 항체를 사용함으로써 이루어진다(항체는 위에서 기술된 바와 유사한 방식으로 리간드에 대해 생성된다). 본 발명의 다른 구체예에서, 그 리간드에의 α 4 β 1의 결합을 억제하는 펩티드는 한편 내피세포에의 임파구의 접착을 억제하는데 이용된다.

본 발명의 특정 구체예에서, 항-α 4 β 1 항체 또는 그 단편 또는 유도체는 혈관 내피세포에의 α 4 β 1 수용체를 가지는 임파구의 결합을 억제하는데 이용된다. 바람직한 구체예에서, 항체는 동일한 결합 특이성을 가지는 키메라 항체를 포함하여 모노클로날 항체 특히 항체 P4C2(α 4 β 1) 또는 P4C10(β1) 또는 이들의 단편 또는 유도체이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 펩티드는 혈관 내피세포에의 α 4 β 1 수용체를 가지는 임파구의 결합을 억제하는데 사용된다. 바람직한 구체예에서 펩티드는 최소한 피브로넥틴의 ⅢCS 가변영역의 서열부를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서 펩티드는 최소한 험프리 등(Humphries et al., 1987, J. Bill. Chem. 262:6886-6892 본 명세서에 참고문헌으로 통합됨)에 의해 정의된 CS-1 펩티드부 또는 그것에 실질적으로 유사한 펩티드를 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 펩티드는 최소한 서열 EILDVPST부 또는 실질적으로 이것에 상용적인 서열을 포함한다.

[본 발명의 이용]

본 발명에 따라 세포간의 접착은 ECMR 및 그 리간드 사이의 결합을 방해함으로써 억제된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 내피세포에의 임파구의 접착은 내피세포 표면상의 리간드에 임파구상의 α 4 β 1의 결합을 방해함으로써 억제된다. 본 발명에 따라서 ECMR/내피세포 상호작용을 방해함으로써 내피에의 이들 세포의 접착의 억제 및 내피세포 리간드와 다른 ECMR의 상호작용이 예견된다. 예컨대 내피에의 마크로파아지의 접착도 마크로파아지 ECMR/내피세포 상호작용의 방해에 의하여 억제된다. 한편, CS-1 펩티드도 인식하는 색소세포증 세포는 본 발명의 펩티드 또는 항체를 이용하여 조직에 들어가고 전이되는 것을 억제한다.

그러므로 본 발명의 방법은 임파구가 혈관 내피를 통하여 조직으로 전이되는 것을 방지하는데 유용하다. 따라서 본 발명은 이와같은 치료가 요구되는 환자에서 면역반응을 억제하는 방법을 제공한다. 특정구체예에서 본 발명은 몇몇 예를들어 콜라겐 혈관질환 및 기타 자동면역질환(예컨대 전신홍반성낭창 및 류마티스 관절염), 다발성 경화증, 천식 및 알레르기 등을 포함하는 면역체계의 만성 도는 재발성 활성화와 관련된 질환의 치료방법을 제공하다. 또한 본 발명은 예컨대 이들에 한정되지 않으나 이식숙주질환, 이인자형이식거부 또는 이합반응을 포함하는 이와같은 치료를 요하는 완자에서 면역체계의 비교적 급활성의 치료방법을 제공한다.

질병의 상태에 따라서 전신 또는 국소적으로 임파구의 조직으로의 이동을 억제하는 것이 바람직하다. 예컨대 전신홍반성낭창 등과 같은 다중 기관계와 관련되는 질환에서 임상적 격화중에 전신적으로 임파구 접착을 억제하는 것이 바람직하다. 그러나 국소적 접촉피부염에 대해서는 감염된 조직 세포로만 임파구의 이동을 한정시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법의 국소적 이용 및 전신적 이용의 조절은 투여될 항체 또는 펩티드의 조성을 변형시킴으로써 또는 이들 제제의 구조 또는 이들의 약리학적 조성을 변화시킴으로써 달성된다. 예컨대 본 발명의 항체 또는 펩티드는 피하, 근육내, 혈관내, 정맥내, 동맥내, 비막내, 경구, 복강내; 직장, 기관지내 또는 포막내등의 다양한 투여경로를 통하여 투여된다. 그러나 임파구의 내피에의 접착을 국소 억제하기 위해서는 본 발명의 항체 또는 펩티드 치료량을 적당한 약리학적 담체로 피하 또는 근육내 투여하는 것이 바람직하다. 아니면, 임파구 접착의 전신적 억제를 달성하기 위해서는 항체 또는 펩티드를 정맥내 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 본 발명의 항체 또는 펩티드등의 이송을 용이하게 하는 약리학적 담체를 사용하는 것이 바람직하다. 예컨대 항체, 펩티드등이 피부로 이송될 경우(예컨대 만성적 피부염 상태의 치료를 위하여), 외피, 표피 및 전피의 투과를 보조하는 약리학적 담체가 바람직하다.

또한 본 발명의 항체 또는 펩티드의 파종(dissemination)은 펩티드 또는 항체의 반감기 또는 그 유효 반감기를 변화시킴으로써 조절할 수 있다. 예컨대 본 발명의 펩티드는 비교적 짧은 반감기를 가진다. 이들 펩티드가 지속적인 유리 이식편에 투여된다면 이식주위의 조직부는 펩티드에 노출되는(에컨대 류마티스 관절염 환자의 관절) 한편 펩티드는 더 먼 조직에 이르기전에 분해된다. 아니면, 펩티드가 이들에 한정되지는 않지만 아미노산 치환, 글리코실화, 부분입체이성질체 치환(즉 구성 아미노산의 D- 부분 이성질체), 첨가등의 유도체를 생성하는 화학적 변성에 의하여 더 긴 반감기를 달성하게 된다면 펩티드는 지속적인 수준에서 더 폭넓게 분산되어진다. 다른예로서 펩티드의 N-말단 또는 C-말단이 변성되어 더 높은 안정성을 초래하다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 펩티드는 특정조직으로 항체 또는 펩티드를 향하게 하는 다른 리간드 또는 항체와 접합될 수 있다. 예컨대 이들에 한정되지는 않지만 본 발명의 펩티드는 내피세포로 표적된 항체와 접합될 수 있다. 더욱이 항체는 ECMR을 모방하도록 생성되어 내피세포 리간드에 부착되고 임파구 접착을 차단할 수 있다.

[본 발명의 펩티드 및 항체]

본 발명의 펩티드는 해당 ECMR과 상호작용할 수 있는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서 α 4 β 1 수용체와 상호작용할 수 있는 펩티드는 내피에의 임파구 결합을 억제하는데 이용된다. 바람직하게는 이들 펩티드는 생체내 이전에 실험실내 이용에서 내피에 임파구의 접착을 억제하는 것으로 보인다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 펩티드는 최소한 피브로넥틴 ⅢCS 영역의 일부를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서 펩티드는 최소한 제9(a) 및 (b)도에 제시된 CS-1 서열에 실질적으로 상동적인 서열 또는 CS-1 펩티드 서열의 일부를 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서 본 발명의 펩티드는 서열 EILDVPST 또는 실질적으로 이것에 상동적인 펩티드서열의 최소한 일부를 포함한다. 실질적으로 상동적인이란 본 발명의 펩티드가 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산에 대해 기능적으로 동등한 아미노산으로 치환되어 잠재성(silent) 변화를 초래하도록 특정 서열이 변화된 것을 의미한다. 예컨대 서열내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 기능적으로 동등하게 작용하는 유사극성의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 서열내의 아미노산의 치환은 아미노산이 속하는 부류의 다른 원소로 선택된다. 예컨대 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 로이신, 이소로이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌 등이다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오니, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민 등이다. 양전하를 띤(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘 등이다. 음전하를 띤(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산 등이다. 또한 위에서 논의된 바와같이 본 발명은 상기 펩티드의 유도체에 관한 것이다.

상기한 바와같이 정의되고 생성된 본 발명의 항체는 F(ab'), Fab' 및 Fab 단편등을 포함하여 모노클로날 및 폴리클로날 항체 뿐만 아니라 이들의 단편 및 유도체도 포함한다.

[실시예:혈장 피브로넥틴에서 대체 세포부착 도메인에 대한 임파구 접착수용체의 동정 및 특성확인]

핵 조혈세포에 의해 우선적으로 발현되는 인테그린 수용체 α 4 β 1(Hemler et al., 1987. supra)와 동일한 것으로 보이는 신규 피브로넥틴 수용체에 대해 다음 실험에서 기술하고자 한다. 특정 피브로넥틴 수용체로서 α 4 β 1의 동정은 ⅰ) 모노클로날 항체(P4C2, P3E3 및 P4G9)에 의한 피브로넥틴에의 세포접착의 억제 및 ⅱ) 피브로넥틴-의존성 중심 접착으로 α 4 β 1의 결집 및 특이적 재조직에 근거한다.

이러한 발견들은 α 4 β 1 및 α 5 β 1 원형 피브로넥틴 수용체가 피브로넥틴에의 세포 접착의 1차 매개체로서 함께 작용한다는 사실을 제시한다.

[재료 및 방법]

[시약]

페닐메틸 술포닐 플루오라이드, n-에틸말레이미드, 루펩틴, 디이소프로필 플루오로포스페이트, 2-메르캅토에탄올, 소혈청알부민(BSA), 트리톤 X-100, 단백질 A-아가로오스, 콩 트립신 억제제 및 V8 프로테아제(Staphylococcus aureus, V8, 균주로부터 얻음, 타입 ⅩⅦ 프로테아제)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 락토페록시다아제 및 글루코오스 옥시다아제는 Calbiochem(San Diego, CA)로부터 구입하였다. TPCK-트립신은 Cooper Biomedical (Malvern, PA)로부터 입수하고 형광-접합된(염소) 항-마우스 IgG 및 IgM(H 및 L사슬) 또는 로다민-접합된(염소) 항-토끼 IgG 및 IgM(H 및 L사슬)은 Tago, Inc,(Burlingame, CA)로부터 입수하였다. R-피코에리트린-접합된 스트레파비딘은 Biomeda(Foster City, CA)로부터 입수하고 토끼-항 마우스 IgG(H+L) 항혈청은 Cappel(Cooper Biomedical, Malvern, PA)로부터 입수하였다. Cr-크로메이트나트륨은 New England Nuclear로부터 입수하였다. I는 Amersham(Arlington Hts., IL)로부터 입수하였다. 인간 재조합 인터류킨-2(IL-2)는 우르달박사(Dr. D. Urdal, Immunex Corp., Seattel, WA)로부터 얻었다. 라미닌은 Collaborative Research, Inc. Bedford, MA로부터 구입하였으며 정제된 혈장 피브로넥틴 및 콜라겐 타입Ⅰ 및 Ⅲ는 상기한 바와같이 제조하였다(Wayner, E.A. 및 Carter, W.G., 1987, supra 및 Wayner et al., 1988. supra).

[세포 및 세포배양]

RD(사람 횡문근육종) 및 HT1080(사람섬유육종) 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD)로부터 입수하였다. 말초 혈액단핵세포(PBMC), 혈소판 및 정상사람 기증자로부터의 과립구군은 기술한 바와같이 조제하였다(Kunicki et al, 1988, supra; Wayner et al., 1988, supra). 급성임파성, 과대과립임파구(LGL) 또는 골수성 백혈병 환자의 말초혈액 세포는 I. Bernstein 박사 및 T. Loughran 박사(Fred Hutchinson Cancer Research Center)로부터 입수하였다. 사람 림포킨(500U/㎖ IL-2) 활성킬러(LAK) 세포 및 모노클로날 HLA B7 특이사람 세포독성 T 임파구(CTL) 세포계 C1C4는 표준공정에 따라 제조하였다(Grimm et al., 1982, J. Exp. Med., 155:1923-1941; Glasebrook, A. L. and Fitch, F. W., 1980, J. Exp. Med., 151:876-895; Brooks, 1983, Nature, 305:155-158; Wayner, E. A. and Brooks, C. G., 1984, J. Immunol., 132:2135-2142; Wayner, E. A. and Carter, W. G., 1987, J. Cell Biol., 105:1873-18840).

EBV 형질전환 B 임파구 세포계(BLCL) ST-1은 C1C4 CTL계의 생산에 사용된 기증자 췌장으로부터 유도하였다. 다른 모든 세포계 및 세포배양 조건은 이미 기술한 바와같다(Wayner, E.A. 및 Carter, W.G., 1987, supra; Wayner et al., 1988, supra).

[항체]

피브로넥틴 수용체 α 5 β 1의 세포질 도메인에 대하여 제조된 토끼 폴리클로날 항체 AB33을 사용하여 중심 접착에서의 α 5 β 1을 검출하였다. 수용체의 VLA 패밀리의 공통 인테그린 β1 서브유니트(Hemler M.e. et al., 1988, supra)에 대한 모노클로날 항체 AlA5(Hynes, R.O. 1987. supra) 및 VLA 4α 서브유니트에 대한 B5-G10(Hemler et al, 1987, supra)는 Dana-Farber Cancer Inst., Boston, MA의 Martin Hemler 박사로부터 입수하였다. 인테그린 수용체 α 3 β 1(P1B5), α 2 β 1(P1H5) 및 α 5 β 1(P1D5)에 대한 모노클로날 항체가 기술되어 있으며 이 실험실에서 개발되어 있다. P1H5 및 P1D6은 각각 섬유 아세포 및 혈소판의 콜라겐 및 피브로넥틴-코팅 기질에의 접착을 억제한다(Wayner E.A. 및 Carter, W.G., 1987, supra; Kunicki et al., 1988, supra; Wayner et al., 1988, supra). 임파구 접착 수용체에 대한 모노클로날 항체는 오이 및 헤르젠베르그의 방법(0i, V.T. and Herzenberg, L.A. 1980, Immunoglobulin producing hybrid cell lines. In:Selected Methods in Cellular Immunology. Ed. by B.B. Misshell and S.M. Shiigi, W.H. Freeman and Co., San Francisco, pp. 351-373) 타가르트 및 삼로프(Taggart, R.T. and Samloff, I.M., 1983, Science, 219, 1228-1230) as described(Wayner and Carter, 1987; Wayner, et al., 1988).에 기술)에 의하여 생산되었다.

100㎕ f 팩 T 임파구로 면역된 RBF/DN 마이스의 췌장을 제거하고 NS-1/FOX-NY 골수종 세포롤 융합하였다. 활성 이형다핵세포는 아데닌/아미노프테린/티미딘으로 보충된 RPMI1640에서 선별하였다(Taggart 및 Samloff, 1983). 임파구 접착 수용체에 대한 항체를 생성하는 하이브리도마는 피브로넥틴-코팅 표면에의 임파구 접착의 특이적 억제에 의해 스크린하고 한정희석에 의하여 클로닝하였다.

AlA5(Hemler et al., 1987, J. Biol Chem. 262;3300-3309)은 인테그린 수용체의 β1 서브유니트와 특이적으로 반응하고 세포접착을 억제한다고 보도된 바 있지만(Takeda et al., 1988, J. Cell. Biochem. 37:385-393)이 시약은 표면에의 임파구 접착을 억제하는 것으로는 관찰되지 않았다. 그러므로 기능적으로 한정된 항-β1 모노클로날 항체 P4C10은 이미 기술한 방법에 의하여 생산하고 다중 리간드에의 세포접착의 억제를 스크린한다. P4C10은 피브로넥틴, CS-1, 콜라겐 및 라미닌에의 세포 접착을 억제하고 표준 생화학기준에 따라 β1과 반응하는 것으로 밝혀졌다.

[완전한 피브로넥틴 및 피브로넥틴 단편에의 세포접착의 억제]

정제된 혈장 피브로넥틴 트립신 단편 및 CS 펩티드에 세포접착을 변화시키는 항체를 이미 기술한 방법에 따라 동정하였다(Wayner 및 Carter 1987). 간략히 새로운 48 웰 스티렌플레이트를 사람 혈장 피브로넥틴(5㎕/㎖)으로 코팅하였다. 플레이트를 10mg/㎖ 가열 변성된 BSA(HBSA)로 보충된 PBS로 차폐하였다. T 임파구 또는 HT1080 세포를 Na Cr O(50㎕ Ci/㎖,2!4시간)으로 표식하고 세척하고 5×10 HT1080 또는 배양된 T세포 또는 5×10 PBL/웰을 상온에서 15분간 하이브리도마 배양 상등액(1mg/㎖가열 변성된 BSA로 보강된 PBS로 1:2 희석) 또는 대조 골수종 세포 배양 상등액에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 15 내지 30분(HT1080) 또는 2 내지 4시간(임파구) 동안 하이브리도마 상등액의 존재하에서 단백질-코팅 표면에 접착되게 하였다. 비-접착 세포를 PBS로 세척하여 제거하고 접착세포는 SDS/NaOH에서 용해하고 결합 Cr-cpm은 감마 카운터에서 정량하였다.

[면역침전 및 연속적인 면역침전, V8 프로테아제 펩티드 지도 및 폴리아크릴아미드겔 전기영동]

활성세포를 기술한 바와같이(Wayner 및 Carter, 1987) 125-요오드로 표면 표식하고 50mM 인산염 환충식염수 pH 7.2의 0.3% CHAPS 세척제 또는 1% v/v 트리톤 X-100세정제로 추출하였다. 일부 경우에 1mM CaCl을 용해 완충액에 첨가하였다. 1mM 페닐메틸 술포날 플루오라이드, 1mM N-에틸말레이미드, 1㎕/㎖ 루펩틴 및 1㎕/㎖ 트립신 콩 억제제를 프로테아제 억제제로 사용하였다. 면역 침전 및 연속적인 면역 침전을 기술한바(Wayner 및 Carter, 1987 supra) 대로 정확히 실시하였다. 펩티드 분석은 클레벨랜드 등(Cleveland et al., 1977, J. Biol. Chem. 252:1102-1106)의 기본 공정에 약간의 수정을 가하여 실시하였다(Wayner 및 Carter, 1987). 황산 도데실 나트륨을 함유하는 폴리아크릴 아미드 슬랩겔(SDS-PAGE 겔)은 라엠리(Laemmli, 1970, Nature 227:680-685)의 기본 스택킹겔 시스템에 따랐다.

[사람 혈장 피브로넥틴으로부터 트립신 단편의 제조 및 CS 펩티드의 합성]

사람 혈장 피브로넥틴으 호르위쯔 및 쉴만(Horowitz 및 R. Schulman, New York Blood center, NY)으로부터 기능받았다. 피브로넥틴을 37℃에서 90분간 TPCK-트립신으로 분해하고 분해물을 기술한 친화력 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분획하였다(Carcia-Pardo et al., 1987, Biochem. J. 241:923-928; Garcia-Pardo et al., 1989, Exp. Cell Res. 181:426-431). 사람 피브로넥틴의 ⅢCS영역(CS-1 및 CS-2)의 초기 48 잔기에 걸쳐있는 두 중첩 펩티드를 합성하고 기술한 토끼 IgG에 결합시켰다(Humphries et al., 1986 및 Humphries et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:6886-6892).

[수용체 발현의 형광분석]

현탁액에서 세포상의 ECMR 발현은 EPICS 750 이중 레이저 세포분류기(Coulter, Hialeah; FL)에서 하나 또는 두가지 색깔의 유동혈구계산기로 분석하였다. 양성 형광을 10 log자로 측정하였으며 형광 세기(log FI)는 평균 채널수(0-255)로 표시하였다. 비-면역 마우스 IgG 네가티브 대조에 대한 기준 형광은 각 세포군에 대해 측정하고 감하였다. 접착 세포를 트립신 처리하고 유동 혈구계산에 이용하기 전에 혈처의 존재하에서 37℃ 15분간 회복시켰다. 하나 또는 두가지 색깔의 형광측정을 위하여 현탁액에 10 세포를 단백질 G-세파로스 정제 염소 IgG(20㎍/㎖)로 30분간 배양한 후 4℃에서 60분간 1단계 항체로 배양하고 10mg/㎖ HBSA 및 0.02% 아자이드 나트륨(Hanks/BSA/SA)을 함유하는 Hanks Balanced Salt 용액에서 세척하고 Hanks/BSA/SA에서 4℃, 60분간 FITC-접합 토끼 항-마우스 IgG로 배양하였다. 이들을 세척하고 PBS 상의 냉각 2% 파라포름알데히드(새로 제조)에 고정시켰다. 두가지 색깔 형광분석을 위하여, 정제 및 비오티닐화된 모노클로날 항체를 그다음 Hanks/BSA/SA의 1㎍/㎖ 최종농도로 FITC-염색 및 고정된 세포에 첨가하고, 4℃, 60분간 배양하였다. 2% 파라포름알데히드로 사전 고정화는 임파구 인테그린 수용체의 발현에 별다른 영향을 주지 않았다. 고정 세포를 세척하고 4℃, 30분간 1/50 희석액에서 피코에리트린-접합 스트레파비딘(Bionetics)을 함유하는 0.5㎖ Hanks/BSA/SA에서 배양하였다. 최종적으로 염색세포를 세척하고 PBS상의 2% 파라포름 알데히드에서 다시 고정하고 EPICS 유동 혈구계산기에서 분석을 위하여 4℃ 암실에 방치하였다.

[중심접착에서 수용체의 국소화]

접착세포를 트립신 처리하고 1㎍/㎖ BSA+100㎍/㎖ 콩 트립신 억제제가 보강된 RPMI에서 세척하고 산에 접착되게 하고 기술한(Carter 및 Wayner, 제조편) 바와같이 1 내지 4시간동안 혈청이 없는 가운데 피브로넥틴, 라미닌 또는 콜라겐(20㎍/㎖)로 코팅된 유리커버 슬립을 세척하는 실란처리하였다. 배양말기에 비-접착세포를 제거하고 접착세포를 100mM 카코딜레이트나트륨, 100mM 수크로오스, 4.5mM CaCl, 2% 포름알데히드에서 20분간 고정하였다. 이들을 0.5% 트리톤 X-100으로 5분간 침투화시킨 다음 세척하고 PBS 상의 25% 염소 혈청을 차단하였다. 침투된 세포를 특정 수용체에 대한 항체로 염색하고(상온에서 60분), 세척하고 FITC-접합 염소 항-마우스 또는 로다민-접합 염소 항-토끼 IgG로 배양하고(상온에서 45분) 다시 세척하였다. 커버슬립을 기술한 바대로 형광 및 간섭 굴절 현미경(IRM) 관찰을 위하여 유리 슬라이드상에 역위(invert) 시켰다(Izzard, S.C. 및 Lochner, L.R., 1976, J. Cell. Sci., 21, 129-159).

[조직염색]

조직에서 인테그린 수용체의 분산은 저온조 섹션의 형광현미경으로 측정하였다. 저온조섹션(6㎛)은 이소펜탄/액체질소에서 스냅동결후 0CT 배지에 넣은 사람 피부, 편도 또는 종양 샘플로부터 제조하였다. 모든 섹션은 상기한 바와같이 1차 항체 및 2차 형광 항체로 배양하기전에 PBS의 4% 파라포름 알데히드에 고정하였다(Carter 및 Wayner, 1988, J. Biol. Chem. 263:4193-4201). 대조실험에서 로다민의 형광성은 형광필터를 사용하거나 또는 그 반대로 측정하였다.

[결과]

[대체 피브로넥틴 수용체의 동정]

배양 T 임파구(Molt 4), K562, RD(횡문근육종) 및 HT1080(섬유육종) 세포 및 새로이 얻어진 PBL(도시되지 않음)은 피브로넥틴-코팅 표면에 접착하였다(제1도; 개방 막대). 그러나 Molt 4 및 RD 세포는 모노클로날 항체 P1D6에 의하여 인식되는 원형 피브로넥틴 수용체(인테그린 α 5β 1)의 낮은 수준 또는 검출되지 않은 정도의 수준으로 발현되었다(제1도: 사선막대). 이와 일치하게 피브로넥틴에의 Molt 4 및 RD 세포의 접착은 P1D6에 의하여 완전히 억제될 수 없었다(제1도: 밀폐 막대). 한편, 다량의 α 5 β 1(HT1080 및 K562)을 발현하는 피브로넥틴에의 세포의 접착은 P1D6에 의하여 효과적으로 억제될 수 있다. 더욱이 합성 펩티드 RGDS는 혈장 피브로넥틴에의 T 임파구 접착을 완전하게 억제하지 않았다(Molt 4 또는 Jurkat 세포에 대해 50~70%, 이에 반해 섬유 세포에 대해서는 80~90%, K562-1 세포에 대해서는 100%). 이와같이 이들 데이타들은 T 임파구 등의 일부 세포가 α 5 β 1이 아닌 다른 피브로넥틴 접착 수용체를 발현한다는 사실을 제시하였다.

본 발명자들은 배양 T 임파구에 대한 모노클로날 항체를 제조하고 이들에 대해 피브로넥틴-코팅 표면에의 섬유아세포 접착이 아닌 임파구의 접착을 특이적으로 억제시키는 능력을 스크린함으로써 다른 예상 피브로넥틴 수용체를 동정하려고 시도하였다. 이 공정에 의해 피브로넥틴에의 HT1080 세포 접착이 아닌 배양 T 임파구의 접착을 억제하는 몇몇 모노클로날 항체(P4C2, P3E3, P4G9)을 동정하였다(표 3).

I-표면표식 PBL(도시되지 않음), Molt 4 또는 HT1080(제2도) 세포로 제조된 트리톤 X-100 세제 융해물로부터의 면역 침전결과 억제적인 모노클로날 항체(P3E3에 대한 데이타)는 환원제의 존재하(도시하지 않음) 도는 부재하(제2도)에서 M 150,000(p150)에 이동하는 임파구 추출물에 존재하는 단일 단백질과 반응한다. 이들 면역 침전 조건하에서 p150은 분명한 α-β 서브유니트 구조를 결여하고 있으며 인테그린 수용체 α 2 β 1 또는 α 3 β 1의 α 또는 β 서브유니트와 이동하지 않았다(제2도). 만성적으로 활성된 CD8+ 킬러 T 임파구(LAK) 또는 CTL(도시되지 않음)로 제조된 트리톤 X-100세제 추출물로부터 면역침전된 항원은 p150 이외에도, 환원제의 존재하(도시되지 않음) 또는 부재하에서 M 80,000 및 70,000에 이동하는 비교적 많은 양의 두 작은 단백질을 함유하고 있다. V8 프로테아제 펩티드 지도화 결과 p80 및 p70은 p150(도시되지 않음)의 단백질 분해 단편이었다. 이들 작은 분자량 형태는 세제 추출물이 다중 프로테아제 억제제의 존재하에 제조될때라도 만성적 활성 T세포로부터 면역 침전될 수 있다(제2도 리간드). p80 및 p70은 휴지 PBL, 배양된 T(Molt 4, Jurkat) 또는 B세포 백혈병 및 RD 세포로 제조된 추출물이 실제적으로 존재하지 않았다.

p150의 생화학적 특성은 이것이 햄러(Hemler et al., 1987)가 기술한 VLA 4 항원과 관련이 있다는 것으로 제시하고 있다. 이 사실은 VLA 4 특이적 모노클로날 항체 B5-G10으로 연속적으로 면역침전결과 확인되었다(도시하지 않음). p150은 1mM Ca 의 존재하에 I 표면 표식된 T 임파구의 CHAPS 세제(0.3%)용해후 면역 침전을 실시할 경우 β1과의 연관에 의하여 인테그린 슈퍼 패밀리의 α서브유니트로서 형성되었다. 이들 조건하에서 α4는 β1과 이형이합체로서 침전되었다. β1의 실체는 V8 프로테아제 펩티드 지도화(도시되지 않음)에 의해 확인되었다. 억제적인 모노클로날 항체(P3E3, P4C2 및 P4G9)로 T 임파구로부터 면역침전된 α 4 β 1 이형이합체는 다음 3기준에 의하여 P1D6으로 면역 침전된 원형 피브로넥틴 수용체 α 5 β 1과는 별개의 것으로 보인다.

1) T 임파구의 세제 추출물에 존재하는 α 4 β 1 및 α 5 β 1의 상대적인 양은 존재하는 α 4 β 1의 더 높은 수준과 구변된다(제3도).

이것은 유동 혈구계산기를 이용하여 얻어진 테이타와 일치한다(제1도).

2) 일련의 면역 침전 실험에서 α 4 β 1에 대한 모노클로날 항체는 α 5 β 1의 안정성을 사전에 보장하지 않았다(도시되지 않음).

3) 모노클로날 항체 P3E3 및 P1D6으로 침전된 α 4 및 β 5 서브유니트로부터 얻어진 V8 프로테아제 펩티드 지도는 분명히 구분가능하였다. 더욱이 Jurkat 세포(제3도)에서 고분자량의 다른 단백질(p180)까지의 α 4 β 1의 접합자를 용해시키는데 이용된 조건(0.3% CHAPS 및 1mM CaCl) 하에서도 모노클로날 항체와 반응하거나 또는 α 4 β 1과 공침전되었다. p180은 Ca 의 부재하에서 제조된 트리톤 X-100 세제 추출물 또는 비-임파양 세포, P1D6모노클로날 항체(제3도)로부터 제조된 추출물에는 존재하지 않았다. p180과 다른 인테그린과의 상관관계는 밝혀지지 않았다. α4는 Ca 의 부재하에서 트리톤 X-100으로 T세포 용해후 β1없이 면역 침전될 수 있기 때문에 억제적인 모노클로날 항체는 α4 서브유니트에 존재하는 에피토프이라는 사실이 이것에 의해 밝혀졌다(제2도).

[배양세포 및 조직에서 α 4 β 1 및 α 5 β 1의 분포]

이미 밝혀진 바와같이(Hemler, supra), α 4 β 1은 유핵 조혈세포에 광범위하게 분포한다(표 4).

2색 유동 혈구계산결과 비장, 편도 및 말초혈에서 유래된 모든 임파구 서브군은 다량의 α 4 β 1를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한 본 발명자들이 조사한 급성 임파성(T 또는 B) 백혈병에서 바로 유래된 말초혈 단구세포, 모든 과대과립 임파성(LGL) 및 골수성 백혈병 및 배양된 T 및 B 임파구 세포계는 다양의 α 4 β 1를 나타냈다(표Ⅳ). 정상 사람의 혈소판 및 과립세포는 α 4 β 1에 대해 네가티브로 나타났다. 이와는 대조적으로 α 5 β 1를 나타내는 유일한 세포군은 활성 T세포, 혈소판, 단구세포 및 과립세포, 급성 임파성(T 또는 B) 또 골수성 백혈병 및 배양된 K562; HL-60 및 U937 세포이다. 일부 배봉된 T(Molt 4 또는 Jurkat) 및 B(st-1) 세포계는 P1D6 모노클로날 항체에 의해 검출되는 바와같은 낮은 수준의 α 5 β 1를 나타냈다. 일부 정상 개체에서 PBL 서브군은 유동 혈구계산으로 검출된 P1D6 형광성에 대해 양성이었다. 본 발명자들은 α 5 β 1를 발현하는 이 PBL 서브군의 성질을 조사하였다. TY, CD3 T 세포 임파조은 유동혈구계산에서 P1D6에 대하여 완전하게 네가티브이었다. 이들 결과로부터 휴지 T 임파구에 의해 구조적으로 나타나는 주로 피브로넥틴 수용체는 α 4 β 1이며 이미 제시한 바와같이(Wayner et al., 1988) T 임파구의 f α 5 β 1) 발현은 임파 또는 활성 배양세포에 한정된다는 사실을 알 수 있었다. 놀랍게도 대부분의 섬유아세포계는 낮은 수준의 α 4 β 1를 나타내는 반면 과대 혈관 내피세포(HUVE) 및 배양 내피세포는 유동 혈구계산에 의해 α 4 β 1에 대해 네가티브로 나타났다.

조직에서 α 4 β 1은 성인비장, 림프절 및 편도선에 존재하였으며 조사된 다른 모든 조직에서는 근본적으로 검출되지 않았다. 또한 특정 조직 도메인의 세포에 의해 발현된 피브로넥틴 접착 수용체의 상대적 양은 현저하게 상이하였다. 예컨대 편도선 및 배중추 영역 및 피질의 PBL과 임파구는 많은 양의 α 4 β 1을 발형하였으나 실질적으로 α 5 β 1은 발현하지 않았다. 또한 α 4 β 1은 성인 임파조직의 내피 영역에서는 발견되었으나 이들이 이 영역의 임파구 침윤 또는 임파 내피세포에 의한 α 4 β 1의 발현 결과인지는 분명하지 않다.

[피브로넥틴-의존 중심접착에의 α 4 β 1의 국소화]

세포들이 혈청의 부재하에 적당한 리간드상에서 성장될 때 중심 접착에의 세포 표면 접착 수용체의 특이적 제조직이 존재한다(Burridge et al., 1988, Ann. Rev Cell, Biol.,4, 487-525 참조). 일부 섬유아세포는 α 4 β 1를 발현하기 때문에 본 발명자들은 이 수용체가 피브로넥틴이 접착기질로서 사용될 때 중심접착으로 분포되는지의 여부를 조사하였다. 제4도(a 및 c)에서 볼 수 있는 바와 같이, RD세포가 피브로넥틴에서 성장될 때 1차 중심 접촉 부위 또는 중심 접착은 간섭 굴절현미경에 의하여 가시화된다(Izzard, S.C. 및 Lochner, L.R., 1976, J. Cell. Sci., 21, 129-159).

본 발명자 및 기타 연구자들이 밝힌 바와같이(Roman, J., LaChance, R., Broekelmann, T.J., Roberts, C.J., Wayner, E.A., Carter, W.G., 및 Macdonald, J., 1988, J. Cell Biol. 108:2529-2543). 혈청이 존재하지 않은 상태에서 α 5 β 1은 RD 세포가 라미닌-코팅 표면이 아닌 피브로넥틴상에서 성장될 때(제4b도, 화살표) 중심 접착에 집중되었다. 유사하게 모노클로날 항체 P4G9(제4d도, 화살표)로 염색한 결과 α 4 β 1도 세포가 라미닌-코팅 표면(도시되지 않음)이 아닌 피브로넥틴상에서 성장될 때 중심 접착에 집중되었다는 것을 알 수 있다. 이들 결과로부터 피브로넥틴과 α 4 β 1의 특이적 상호작용이 중심접착, 배양 세포의 1차 접착 구조에 존재한다는 사실이 밝혀졌다. 중심접촉에 두 수용체의 존재는 α 4 β 1 및 α 5 β 1이 피브로넥틴의 분명한 접착서열에 결합한다는 가능성을 제시하였다. 실제적으로 P4C2 및 P1D6이 완전한 혈장 피브로넥틴에의 세포접착을 동시에 억제하는데 사용될 때 이 사실에 대한 증거가 얻어졌다. P1D6 및 P4C2가 함께 사용될 때 T 임파구의 접착을 완전하게 억제하였으며, 완전한 혈장 피브로넥틴에의 RD 세포의 접착을 부분적으로 억제하였다(표 5).

흥미롭게도, T 임파구와는 달리, P1D6 또는 P4C2 어느 하나만은 완전한 혈장 피브로넥틴의 RD 세포 접착의 좋은 억제자가 아니었다. 피브로넥틴에의 RD 세포 접착은 함께 사용될 때만 P1D6 및 P4C2에 의하여 효과적으로 억제될 수 있다.

[피브로넥틴의 RGD 독립 교대 접착부위의 수용체로서의 α 4 β 1의 작용]

앞의 결과(표 3, 표 5, 제1도, 제4도)들은 혈장 피브로넥틴에의 일부 세포의 접착이 두 독립적인 세포 표면 수용체 α 4 β 1 및 α 5 β 1에 의하여 매개된다는 사실을 분명히 제시하였다. 피브로넥틴에서 α 5 β 1에 대한 리간드는 RGD서열을 함유하는 8 kDa 세포-결합 도메인이라는 사실이 밝혀져 있다(Pytela, R., Pierschbacher, m,d., 및 Ruoslahti, E., 1985, Cell, 40:191-198).

α 4 β 1과 상호 작용하는 피브로넥틴의 영역을 결정하기 위하여 본 발명자들은 혈장 피브로넥틴의 다양한 단백질 분해 단편에의 배양 T 임파구의 접착(제5a 및 b도 참조) 뿐만 아니라 이들 단편에의 임파구 접착에 미치는 모노클로날 항체 P1D6 및 P4C2의 효과에 대하여 조사하였다.

제6도에서 도시된 바와같이 Jurkat, YT 및 Molt 4 세포는 RGD- 함유 단편(80kDa) 보다 헤파린(Hep) Ⅱ 도메인을 함유하는 38 kDa 단편에 훨씬 효과적으로 접착한다. Jurkat 및 Molt 4 세포는 또한 58kDa 단편을 함유하는 다른 HepⅡ 도메인에 투여량 의존 양상으로 부착한다. 그러나 58 kDa 단편에의 최대 세포 접착은 38 kDa 피브로넥틴 단편에 의하여 달성되는 것의 30%만이 이루어진다.

이 사실은 38 kDa 단편이 T 임파구에 대한 높은 친화력 접착부위를 함유한다는 것을 제시한다. T 임파구는 혈장 피브로넥틴 HepⅠ도메인을 함유하는 N-밀딘 29kDa 단편에 접착하지 않았다.

일반적으로, 새로이 얻은 PBL은 Jurkat 또는 Molt 4 세포와 유사한 접착 패턴을 나타냈으며 80kDa 단편에 결합하는 새로이 얻어진 PBL의 능력은 α 5 β 1의 발현과 상관성이 있다.

K562 세포(제6도)와 같은 다른 조혈세포계는 혈장 피브로넥틴의 80kDa 단편에 대해 분명한 선호도를 나타내는 한편 RD 세포는 N-말단 29kDa 단편을 제외하고 테스트된 혈장 피브로넥틴의 모든 단편에 뒤범벅한 접착을 나타냈다. RDGS(1mg/㎖)은 안전한 피브로넥틴에의 Jurkat 세포접착을 부분적으로(50%) 억제하며 80kDa 단편에의 접착을 완전하게(100%) 억제하였다. 38 kDa 단편에의 Jurkat 세포접착은 RGDS에 의하여 영향을 받지 않았다(1mg/㎖까지).

본 발명자들이 이미 밝힌 바와같이(표 3 및 제1도), α 4 β 1 및 α 5 β 1에 대한 모노클로날 항체는 완전한 혈장 피브로넥틴에의 T 임파구 접착을 부분적으로 억제하였다(제7도, 상부). 기재한 바와같이, P1D6은 RGD 접착 서열을 함유하는 80kDa 단편에의 T 세포접착을 완전하게 억제하였다(제7도, 중앙). P1D6은 38 kDa(제7도, 아래), 또는 58kDa 단편에의 T 임파구 접착을 억제하지 않았다.

이와는 반대로 P4C2는 38 kDa 단편에의 T 임파구 접착을 완전하게 억제하였으며 80kDa 단편에의 접착에는 영향을 미치지 않았다(제7도). 더욱이 HepⅡ도 함유하는 58 kDa 단편에의 T 임파구의 접착은 P4C2에 의하여 억제될 수 있다.

모든 경우에서 α 4 β 1 및 α 5 β 1 모두를 발현하는 다른 T 임파구 세포계(예컨대 Jurkat 세포)는 Molt 4 세포와 마찬가지로 행동한다(제7도).

표 4에서 보는 바와 같이 K562 세포는 α 5 β 1만을 발현한다. 38(제6도) 및 58 kDa 단편에의 K562 세포의 접착은 80kDa 단편에의 접착과 비교할 때 상당히 감소되었다(제6도). 완전한 혈장 피브로넥틴(제1도) 또는 80kDa 단편에의 이들 세포의 접착은 P1D6에 의하여 완전히 억제될 수 있다. 한편, α 5 β 1를 발현하지 않은 YT 세포(표 4)는 완전한 혈장 피브로넥틴 및 80kDa 단편에 거의 접착하지 않는다(제6도). 이들 세포는 Jurkat 또는 Molt 4 세포보다 혈장 피브로넥틴- 코팅 표면에 접착하는데 2 내지 3배 더 오래 걸린다. 그러나 YT 세포는 38 kDa 단편에 투여량 의존 형식으로 효과적으로 접착하며(제6도) 38 kDa 단편에의 이들 세포의 접착은 P4C2에 의하여 완전하게 억제될 수 있다. 이들 데이타는 Hep Ⅱ 및 ⅢCS 여역을 함유하는 혈장 피브로넥틴의 단편에 접착하는 능력과 α 4 β 1 발현사이의 직접적인 상관관계를 나타낸다. 더욱이 이들 데이타는 α 4 β 1이 교대 세포접착 도메인에 대한 수용체로서 작용한다는 사실을 분명히 나타내고 있다.

[α 4 β 1은 CS-1에 대한 임파구 수용체이다]

혈장 피브로넥틴 A 사슬에 존재하는 ⅢCS 영역(제5도)은 피브로넥틴에의 세포적착의 이동에 관여하는 적어도 두 부위를 포함한다(Humphries et al., 1986, J. Cell Biol. 103:2637-2647; Humphries et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:6886-6892; Humphries etal.; 1988, J. Cell Biol. 106:1289-1297). 전체 ⅢCS 영역(CS 펩티드)에 걸쳐있는 일련의 중복합성펩티드를 이용하여 험프리 및 공동연구자들은 CS-1(N-말단) 펩티드가 마우스 골수종세포에 의하여 인식되는 접착서열을 함유하고 있음을 밝혔다(Humphries et al., 1986, 1987). 본 발명자들은 여기에 38 kDa 단편이 사람의 T 임파구에 의하여 인식되는 고친화력 접착부위를 함유하며, α 4 β 1은 38 kDa에의 T 임파구 접착을 매개하는 수용체임을 밝혔다. 이 단편은 CS-5 부위를 포함하지 않으나 골수종세포에 대한 고친화력 접착 부위로서 한정되는(Humphries et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:6886-6892) 전체 CS-1 영역을 포함한다(Carcia-Pardo et al., 1987, Biochem. J., 241:923-928). 그러므로 T 임파구는 CS-1을 인식하여 결합하는지의 여부 및 α 4 β 1이 이 상호작용에 관련되는 수용체인지의 여부를 결정하는데 흥미가 있다.

T 임파구(Jurkat 또는 Molt 4 세포)는 CS-1(토끼 IgG 접합자)-코팅 플라스틱 표면을 인식하여 접착한다(표 6). T 임파구(Jurkat)는 CS-2(토끼 IgG 접합자) 코팅 표면 또는 토끼 IgG 만으로 코팅된 플라스틱 표면에 부착하지 않는다. 더욱이 α 4 β 1(P4C2)에 대한 모노클로날 항체는 CS-1에의 T 임파구 접착을 완전하게 억제하는 한편 α 5 β 1(P1D6)에의 항체는 전혀 효과가 없었다(표 Ⅵ). 이미 본 바와 같이, α 4 β 1에 대한 항체는 38 kDa 단편에의 T 임파구 접착을 완전하고 특이적으로 억제하며(표 6) α 5 β 1에의 항체는 80kDa 단편을 함유하는 RGD에의 접착을 특이적으로 억제하였다.

[토론]

모노클로날 항체 기술(Wayner, E.A., Carter, W.G., Piotrowicz, R. 및 T.J. Kunicki, 1988, J. Cell Biol., 10:1881-1891)을 이용하여 본 발명자들은 새로운 피브로넥틴 수용체 α4β1을 동정하였다. 모노클로날 항체 P3E3, P4C2 및 P4G9는 α4서브유니트상의 에피도프를 인식하여 카르복시 말단 헤파린 Ⅱ도메인 및 타입 Ⅱ연결 단편부(ⅡCS)를 함유하는 혈장 피브로넥틴의 38kDa 트립신 단편에의 말초혈 및 배양 T 임파구의 접착을 완전하게 억제하였다. α4β1에 대한 ⅢCS의 리간드는 골수종 세포에 대한 접착부위로서 이미 한정된 CS-1 영역이었다. α4에 대한 기능적으로 한정된 모노클로날 항체는 완전한 혈장 피브로넥틴의 T임파구 접착을 부분적으로 억제하며 RGD 접착서열을 함유하는 80kDa 트립신 단편에의 접착에는 영향을 미치지 않았다. 이미 기술된 피브로넥틴 수용체 α5β1에 대한 모노클로날 항체는 80kDa 단편에의 T임파구 접착을 완전하게 억제하며 38kDa 단편 또는 CS-1에의 접착에는 영향을 미치지 않았다. α1β1 및 α5β1 모두는 이들 수용체를 발현하는 섬유아세포가 피브로넥틴-코팅 표면상에서 자랄 때 중심 접착에 국소화하였다. 이러한 관찰 사실은 중심 접착에서 두 수용체와 피브로넥틴과의 특이적 상호작용을 나타내고 있다.

최근, 베르나르디 등(Bernardi et al., 1987, supra; Liao et al., 1987, Exp. Cell, Res., 171:306-320; Liao et al., 1989, Exp. Cell Res., 181;348-361)은 일부 B임파구 세포계가 카르복시 말단 Hep Ⅱ 도메인내에 위치하는 혈장 피브로넥틴 영역에 결합한다는 사실을 제시하였다. 리아오 등(Liao et al., 1987, supra)은 B세포에서 인테그린-형 수용체를 동정하였다. 그러나 이들이 제시한 단백질들이 α2β1, α2β1 또는 α5β1인지는 분명하지 않다. 베르나르디 등(Bernarde et al., 1987, supra)은 또한 B임파구에 의하여 발현되는 피브로넥틴 수용체를 동정하였다. 놀랍게도 이 연구에서, HepⅡ를 함유하는 단편에 부착된 B세포는 α4β1에 유사한 수용체를 발현하는 한편 세포 접착 도메인을 함유하는 RGD에 부착된 세포는 α5β1에 유사한 수용체를 발현하였다. 그러나 이들 데이터로부터 또한 결합에 관련된 수용체를 동정한 것인지는 분명하지 않았다. 결국, 이전의 이들 발견과 본 관찰의 결과는 ⅰ)혈장 피브로넥틴에 존재하는 카르복시 말단 영역에 존재하는 교대 접착 도메인의 존재 및 ⅱ)이 교대 접착 부위에 대한 수용체로서 α4β1의 역할을 뒷받침하는 분명한 증거를 제공하고 있다. 피브로넥틴과의 α4β1 상호작용에 관여하는 상세한 아미노산 서열을 밝히는 것은 매우 흥미있는 일이다. 38kDa 또는 58kDa 단편 또는 CS-1 어느 것도 RGD 서열을 함유하고 있지 않기 때문에(Kornblihtt et al., 1985, supra; Garcia-Pardo, 1987, supra; Humphries et al., 1986, supra; 및 Humphries et al., 1987, supra) α4β1에 대한 리간드의 특성확인은 피브로넥틴에의 세포 접착에 중요한 새로운 아미노산 서열을 동정하는 것이 명확하다. 38kDa 단편은 CS-5을 함유하지 않기 때문에(Garcia-Pardo, 1987, supra), 38kDa 즉 이들 세포의 α4β1에 대한 리간드에의 T임파구 접착을 책임지는 최소 아미노산 서열은 arg-glu-asp-val 또는 REDV 가 아니다(Humphries et al., 1986, supra).

α2β1과 같이, α4 서브유니트는 β1서브유니트와 약하게 연관되어 있다. 데이터는 주어져 있으며(제2도) 본 발명자의 이전의 발견사실(Wayner, E.A. 및 Carter, W.G., 1987, supra 및 Wayner et al., 1988, supra)은 α2β1 및 α4β1에 대한 기능적으로 정의된 모노클로날 항체는 서브유니트 분리후 β1없이 α2 또는 α4의 면역 침전에 근거하여, α서브유니트에 존재하는 에피도프와 선택적으로 상호작용한다는 것을 보여주고 있다. 이들 결과들은 유일한 α서브유니트가 각 α-β 복합체의 리간드- 결합 특이성을 결정하는데 관여한다는 것을 제시한다. 이러한 개념은 β1과 모두 결합하는 α5 및 α4는 피브로넥틴의 분명한 부위에의 접착을 매개한다는 다음 관찰 사실에 의하여 더욱 뒷받침 된다. 이것은 β서브유니트가 결합에는 중요하지 않으며 수용체-리간드 상호작용의 특이성은 유일한 α-β복합체 또는 α에 의하여 결정된다는 것을 제시하지는 않는다.

LAK 세포가 많은 세포 표면 α4β1를 발현하지만 이것은 피브로넥틴에의 LAK 세포 접착을 완전히 억제하는 기능적 수용체 1 P1D6으로 여겨지는 않는다는 것은 흥미있는 사실이다. 이것에 대한 이유는 LAK 세포가 α4의 분해형태를 발현한다는 사실일 수 있다(제2도 참조). 또한 이들은 활성화되기 때문에 LAK 세포는 휴지 말초혈 또는 백혈병 T세포와 비교할 경우 α5β1을 과발현한다(표 Ⅷ). α4β1에 비하여 α5β1의 많은 양을 발현하는 다른 세포(K562-1 및 HT1080)에서 α5β1을 통한 80kDa RGD 함유 도메인에의 접착은 현저하다(제6도, K562-1 세포 참조). 이것은 수용체 발현의 조절이 피브로넥틴상의 다른 부위를 인식하고 결합하는 세포의 능력을 결정한다는 것을 의미한다. 더욱이, 또한 피브로넥틴에 대한 두 수용체의 공발현은 세포 결합성을 증가시킬 수 있다. 예컨대 Jurkat 및 RD 세포는 α4β1만을 발현시키는 YT 세포에 비하여 피브로넥틴에의 비교적 번잡한 접착을 나타낸다.

피브로넥틴의 세포 접착의 조절은 가능한한 가장 간단한 조건하에서도 실제적으로 복잡하며 이것은 α5β1 및 α4β1이 상호 독립적으로 기능하며 피브로넥틴의 두 결합부위와의 상호작용 동안에 중복되지 않기 때문에 그런 것 같다. 이 간단한 상태에서의 이탈은 세포 접착의 매우 민감한 조절의 가능성을 제공한다. 적어도 복잡한 수준에서는 이 조절은ⅰ)리간드의 결합부위의 노출 및/또는 합성을 조절하는 과정 및 ⅱ)수용체의 기능적 발현의 조절로서 대강 구획될 수 있다. 두 수준에서의 조절의 예는 최근에 이용가능하며 림포킨 및 특이항원이 T임파구의 α5β1발현을 유도한 후 피브로넥틴에의 세포 접착을 증가시킨다는(Wayner et al., 1988, supra)관찰 사실을 포함한다. 또한 상처의 회복 또는 염증동안에 피브로넥틴의 ⅢCS 영역에서 mRNA 스플라이싱의 통제(Kornblihtt et al., 1985, supra)는 휴지 또는 활성 T세포에서 수용체-리간드 결합의 특이성을 지휘한다. 단순한 상태에서의 변형을 다수의 실제적인 메카니즘을 동정하기 시작하는 부가적인 실험을 요하나 흥미로운 일이다.

결론적으로, 이러한 발견사실들은 배양 T 임파구가 피브로넥틴에의 결합동안에 두 독립적인 수용체를 이용하며 ⅰ)α5β1은 세포접착도메인을 포함하는 RGD에 대한 수용체이고 ⅱ) α4β1은 헤파린 Ⅱ 및 ⅢCS 도메인을 함유하는 카르복시말단 세포 접착 영역에 대한 수용체이다는 사실을 분명히 보여주고 있다. 더욱이, 이들 데이터들은 T 임파구가 피브로넥틴 프레-mRNA의 교대 스플라이싱에 의하여 생성되는 ⅢCS(CS-1)의 분자 이종 영역에 대하여 분명한 선호도를 나타나며 α4β1은 이 접착 부위에 대한 수용체라는 사실을 보여주고 있다.

[실시예]

활성 내피에의 임파구 접착은 피브로넥틴의 대체 스플라이싱 ⅢCS 영역의 CS-1에의 인테그린 수용체 α4β1의 결합에 의하여 매개된다.

다음 실시예를 통하여, 종양 괴사인자 알파(TNFα) IL-1 및 종양 괴사인자 베타(TMFβ)를 포함하여, 염증 반응과 관련된 다양한 사이토킨으로 활성화되는 배양 거대혈관 내피세포 및 내피세포에의 T 세포 접착을 매개하는데 있어 α4β1 수용체 및 그 리간드 CS-1의 역할을 밝히고자 한다. 또한 α4β1 수용체를 통한 내피세포에의 임파구의 접착을 차단하는 모노클로날 항체 및 펩티드 단편의 능력도 밝힌다.

[재료 및 방법]

[시약]

사용된 시약은 상기 6.1.1절에 기술한 바와 같다.

[세포 및 세포배양]

Jurkat (인간 T 세포 백혈병)은 파울 콘론 박사(Dr. Paul Conlon, Immunex. Corp., Seattle, WA)로부터 입수하였으며 Ramos(인간 B 세포 백형병)은 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD)로부터 입수하였다. LAD(백혈구 접착 결핍) 및 ST-1 B 세포계는 인간 B임파구의 엡스테인-바르바이러스 형질전환에 의하여 제조하였다. LAD 세포계는 접착 수용체의 β2인테그린 패밀리의 결핍이 있는 환자의 B 세포로부터 형성하였으며 존 하란박사(Dr. John Harlan, Harborview Medical Center, Seattle, WA)로부터 구입하였다. HUVEs는 역시 셀 시스템으로부터 구입한 한정(혈청무)배지에 유지하였다.

[염증성 사이토킨으로 HUVEs의 활성화]

HUVEs를 6내지 24시간동안 TNFα(10ng/ml)로 실험 또는 IL-1β(1ng/ml)로 배양하였다. 배양 깔기에 HUVE 단일층을 세정하고 접착분석에 사용하였다.

[CS 펩티드의 합성]

혈장 피브로넥틴의 CS-1 영역에서 유래된 펩티드를 합성하고 온코진 회사(Oncogen Corp Seattle WA) 제임스 블레크 박사의 표준공정에 따라 HPLC 정제하였다. CS-1펩티드를 제임스 블레크 박사의 표준공정에 따라 토끼 혈청알부민 또는 KLH와 접합시켰다. RGD 대조 펩티드는 Peninsula Laboratories(Belmont, CA)로부터 얻었다.

[모노클로날 항체]

하기 항체는 다음 실험실에서 개발하였다: α2β1 수용체를 인식하는 P1H5(Wayner et al., 1987, J. Cell Biol. 105: 1873-11884; Wayner et al., 1988, J, Cell Biol. 107: 1881-1891); α3β1 수용체(상기)를 인식하는 P1B5; Pytela et al (Cell 40:191-198)에 의해 기술된 α5β1원형 피브로넥틴 수용체를 인식하는 P1D6; β1서브유니트를 인식하는 P4C10; 및 β2(CD18)를 인식하는 P4H9, 웨인너 등 (Wayner et al(1987, J.Cell Biol. 105:1873-1884) 및 Wayner et al. 1988, J. Cell, Biol 107: 1881-1891)에 전체적으로 기술된 방법에 따르며 전체 내용은 본 명세서에 통합되어 있으며 표 2에 기술되어 있다.

[내피세포 접착 분석]

사람 태반혈관 내피세포(HUVEs)를 상기한 바와 같이 48웰 플레이트에서 배양하였다. HUVE 단일층 배양에의 임파구의 접착을 측정하기 위하여 임파구를 Na CrO(50μCi/ml, 2-4시간)로 표식하고 세척한 다음 10 임파구를 억제적 항체 또는 CS-1 유래 펩티드의 존재 또는 부재하에서 HUVE 단일층으로 배양하였다. 임파구를 37℃에서 30분간 접착하게 하였다. 비-접착세포를 PBS로 세척하여 계속 제거하고 접착세포를 SDS/NaOH에 용해하였다. 결합 Cr-cpm를 감마 카운터로 정량하였다. 일부 실험에서 내피세포는 한정된 CS-100 배지(Cell Systems, Seattle, WA)에서 6내지 24시간 TNF-β(10ng/ml) 또는 IL-1β(1ng/ml)로 배양함으로써 접착분석하기 전에 활성화시켰다.

[결과]

[정상인 및 LAD 환자의 임파구의 표면 표현형]

임파구가 유출동안에 어떠한 메카니즘을 이용하는가에 대하여 고찰하기 위하여, 본 발명자들은 인테그린 수용체에 대하여 정상인 및 LAD 임파구의 표면 표현형을 먼저 결정하였다. 이들 데이터는 표 7에 제시되어 있으며 LAD 세포가 β1인테그린을 함유하는 β1에 대하여 정상세포 표면 표현형을 가진다는 사실을 분명히 보여주고 있다. 예상한 바와 같이 LAD 환자의 B 세포는 β2에 대해 네가티브를 나타내기 때문에 이 사실은 LAD 임파구가 내피를 통과하여 접착하는 동안에 인테그린을 함유하는 β1을 이용한다는 것을 강력하게 제시하고 있다.

형광세기는 10 ℓog자로 측정하였으며 각각의 +는 0 내지 255(채널수)까지 50단위를 나타내는 임의 단위로 표시하였다.

+/-는 기준에 대하여 한정적이고 반복적인 이동을 표시한다(＜50 유니트).

cpm=분당 횟수.

데이터는 단일 대표 실험으로부터 얻은 것이다.

[휴지 및 활성 내피세포에의 임파구의 접착 능력]

다양한 세포계로부터의 크롬-표식 임파구에 대하여 휴지 또는 활성 내피 세포에의 접착 능력을 테스트하였다(표 8). 테스트한 모든 세포계가 휴지 내피세포에 어느 정도는 접착하는 것으로 나타났으나 IL-1 또는 TNF에 의해 활성화된 내피세포에의 T 및 B 임파구의 접착은 10배 정도 훨씬 더 높게 관찰되었다. 내피세포에의 LAD 환자 임파구의 접착은 정상 B 세포(ST-1)의 ST-1 세포계에 대해 관찰된 것과는 상당히 다르게는 관찰되지 않았다. IL-1와 TNF 활성 내피에의 접착간에는 세포계 사이에서 별차이 없는 것으로 관찰되었다.

[내피세포에의 임파구 접착에 미치는 항-수용체 항체의 효과]

내피에 접착하는 크롬-표식 임파구의 능력이 하이브리도마 상등액의 존재 하에서 테스트 될 경우 α4β1 또는 β1에 대한 모노클로날 항체만이 접착을 억제하는 것으로 밝혀졌다; 원형 피브로넥틴 수용체 및 α3β1수용체 등의 다른 수용체에 대한 모노클로날 항체는 실제적으로 억제효과를 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다(표 8). 모노클로날 항체P4C2(α4β1에 대한) 및 P4C10(β1에 대한)의 존재하에서, 내피에의 표식 임파구의 접착은 완전하게 폐지되었다. 놀랍게도, LAD세포 접착도 항-α4β1항체(P4C2)에 의해 억제되었으며 이것은 CD18 수용체가 관찰된 접착 성질에 관계되지 않는다는 것을 나타낸다. 또한 α2β1, α5β1(표 8) 및 β2(도시되지 않음)는 임파구에 의하여 발현되지 않을지라도 이들 수용체에 대한 항체는 기초 또는 활성 HUVEs에의 임파구 접착을 억제하지 않았다(표 9 참조). 이들 데이터는 인테그린 수용체의 표면 발현 및 수용체에 대한 억제 항체의 결합은 반드시 내피에의 임파구 결합의 억제를 유발하지 않는다는 것을 보여 주고 있다. 이것은 유출에서의 제1단계로서 내피에의 임파구 접착을 매개하는 α4β1의 특이역할을 의미한다. 더욱이, α4β1에 대한 항체는 내피세포에의 임파구 접착을 억제하기 때문에 이 사실은 α4β1에 대한 리간드 아미노산 서열 EILDVPST(표 12참조)도 내피의 표면에서 발현된 리간드에 존재하는 이 서열에 α4β1의 결합을 통하여 임파구 누출에 관련될 수도 있음을 제시하고 있다.

[내피에의 임파구 접착에 있어서 α4β1에 대한 리간드로서 CS-1의 역할]

활성 내피세포에의 크롬-표식 임파구의 접착을 억제하는 합성 CS-1 및 유도체 펩티드의 능력을 다양한 펩티드를 이용하여 평가하였다. 합성 CS-1 펩티드는 기준 또는 활성 내피세포 단일층에의 T 또는 B 임파구 접착의 강력한 억제제였다(표 10 및 11). 놀랍게도, EILDVPST 서열은 휴지 또는 활성 HUVEs에의 임파구 접착을 억제하는데 요구되는 최소 펩티드이었다. Ramos B 세포계 등의 일부 경우에 HUVE 에의 이들 세포에의 접착은 EILDVPST 펩티드로 완전히 폐기될 수 있다(표 10 및 11). 대조실험에서 원형 피브로넥틴 수용체α5β1에 대한 리간드인 RGD서열은 휴지 또는 활성 HUVE에의 임파구 접착을 억제하지 않았다.

ND=결정되지 않음

[토론]

실험 관찰(상기 6절 참조)결과는 혈장 피브로넥틴의 T 임파구에 대한 고친화력 결합부위가 ⅢCS 도메인의 CS-1 영역에 위치한다는 사실을 강력하게 제시하였다. CS-1 영역은 25아미노산으로 구성되어 있다(제9도). 그러므로 피브로넥틴에의 임파구 α4β1 수용체의 결합에 관여하는 최소 펩티드 서열을 결정하는 것이 중요하다. 본 발명자들이 취한 최초 단계는 CS-1 펩티드를 두 개의 작은 펩티드 A13 또는 B12로 나누고 (제9도)이들 펩티드의 어느 것이 α4β1 수용체의 결합에 대하여 피브로넥틴과 경쟁함으로써 피브로넥틴에의 임파구 접착을 억제할 수 있는지의 여부를 검사하는 것이다. 데이터는 억제 활성이 CS-1의 카르복시 말단부로부터 유래한 B12 펩티드에 존재한다는 것을 분명히 나타내고 있다. 다음 단계는 피브로넥틴 및 CS-1(RSA 접합자) 코팅-표면에의 임파구의 접착을 억제하는 B12의 카르복시 말단부로부터 유래된 상당히 긴 펩티드의 능력을 조사하는 것이다. 이들 데이터는 혈장 피브로넥틴 및 CS-1에의 임파구 접착에 관하여 α4β1의 결합에 요구되는 최소 아미노산 서열은 EILDVPST 이라는 것을 보여준다.

백혈구 접착 결핍(LAD)환자의 다형핵 백혈구 (호중구)는 β2인테그린 서브유니트의 발현에 결손이 있으며 따라서 혈관 내피에의 접착에 수용체(LFA-1,Mac-1 또는 p150/95)를 함유하는 β2를 이용하지 않는다. 그러므로 이들 환자의 호중구는 말초 조직으로 혈류가 통과하게 하지 않는다. 그러나 LAD 임파구는 내피를 통과하는 누출을 실시하며 이 질환자의 조직에서 발견될 수 있다. 그러므로 이것은 말초 조직으로의 혈류의 통과중에 β2함유 인테그린과는 다른 메카니즘을 이용한다는 것을 의미한다. 다음 일련의 실험은 누출동안에 말초형 임파구에 의해 이용되는 메카니즘을 전체적으로 이해하는 본 발명자의 시도로 구성된다.

상기 실험은 혈관 내피세포에의 임파구의 접착에서 α4β1수용체에 의한 중요한 역할을 분명히 보여주고 있다.

테스트된 모든 임파구 세포계들은 형광분석결과에 의해 α4β1 및/또는 α5β1을 발현하는 것으로 밝혀졌으며 배양된 사람 태반 혈관 내피세포에 접착하는 것으로 관찰되었다. 이 접착은 α4β1에 대한 모노클로날 항체에 의해서만 차단되는 것으로 밝혀졌다; 다른 수용체에 대한 항체는 억제효과를 근본적으로 가지지 않는 것으로 밝혀졌으며 임파구 및 내피세포 사이의 접착 상호작용에서 α4β1수용체의 중요성을 제시하고 있다.

또한 합성 CS-1 및 유도 펩티드(표 9,10 및 11)도 내피에의 임파구 접착을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 아미노산 서열 EILDVPST는 상호작용에서 특히 중요한 것으로 밝혀졌다. 임파구 α4β1수용체가 실제로 내피세포 표면의 피브로넥틴과 상호작용하는지의 여부가 결정되지 않은 사실이 강조되어야 한다. 또는 α4β1은 다른 비-피브로넥틴 단백질의 상황에서 펩티드 EILDVPST 또는 유사서열을 인식하는 것이 가능하다.

[세포계의 기탁]

다음 세포계는 ATCC(Rockville,MD)에 기탁되었으며 다음의 수탁번호를 부여 받았다.

세포계 수탁번호

P4C2 HB-10215

P4G9 HB-10213

P3E3 HB-10212

P4C10 HB-10214

본 발명은 예시된 유전자 및 단백질 또는 기탁된 미생물에 의해 그 범위가 한정되지 않으며 본 발명의 한 단면의 단일 예시에만 의도하는 것이 아니다. 본 명세서에 기술되고 나타나 있는 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형이 이전의 기술 및 첨부 도면으로부터 본 분야에 통상의 지식을 가진자에게 자명하다. 이와 같은 변형은 첨부된 청구범위내에 포함된다.

Claims (19)

1. 면역체계 질환을 치료하기 위한 조성물로서, ATCC에 기탁되고 수탁번호 HB-10215를 갖는 하이브리도마에 의해 생성되는 모노클로날 항체 P4C2 또는 ATCC에 기탁되고 수탁번호 HB-10214를 갖는 하이브리도마에 의해 생성되는 모노클로날 항체 P4C10과 동등한 면역학적 기능을 갖고, 임파구상의 세포외 매트릭스 수용체 α 4 β 1에 결합하고 내피세포에 상기 임파구의 결합을 방해하는 모노클로날 항체, 그것의 항원 결합 단편 또는 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
2. 임파구상의 세포외 매트릭스 수용체 α 4 β 1에 결합하는 펩티드를 포함하는 면역체계 질환을 치료하기 위한 조성물로서, 상기 펩티드는 피브로넥틴의 ⅢCS 영역을 포함하는 하기의 아미노산 서열 또는 적어도 아미노산 서열 Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr을 함유하는 그것의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:

   Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn

   Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr Val

   Gln Lys Thr Pro Phe Val Thr His Pro Gly Tyr Asp Thr

   Gly Asn Gly Ile Gln Leu Pro.
3. 제2항에 있어서, 상기 펩티드는 피브로넥틴의 CS1 영역을 포함하는 하기의 아미노산 서열 또는 적어도 아미노산 서열 Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr을 함유하는 그것의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물: Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr.
4. 제3항에 있어서, 상기 펩티드는 아미노산 서열 Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 명역체계 질환은 자기면역 질환 또는 면역체계의 만성 또는 재발성 활성화인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 면역체계의 만성 또는 재발성 활성화는 콜라겐 혈관 질환, 다발성 경화증, 알레르기, 천식 또는 만성 염증 피부 상태인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제6항에 있어서, 싱기 콜라겐 혈관 질환 또는 다른 자기면역 질환이 전신 홍반성 낭창 또는 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 면역체계 질환이 급성 활성화인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 면역체계의 급성 활성화가 이식에 대한 숙주 질환, 동종 이식 거부, 또는 수혈 반응인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제1항 및 제5항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 ATCC에 기탁되고 수탁번호 HB-10215를 갖는 하이브리도마에 의해 생산되는 P4C2인 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제1항 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 세포외 매트릭스 수용체 α 4 β 1의 β1 서브유니트에 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 ATCC에 기탁되고 수탁번호 HB-10214를 갖는 하이브리도마에 의해 생산되는 P4C10인 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제2항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 상피세포의 표면상의 리간드에 표적화된 항체에 컨쥬게이트되는 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제2항에 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역체계 질환은 자기면역 질환 또는 면역체계의 만성 또는 재발성 활성화인 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제14항에 있어서, 상기 면역체계의 만성 또는 재발성 활성화는 콜라겐 혈관 질환, 다발성 경화증, 알레르기, 천식 또는 만성 염증 피부 상태인 것을 특징으로 하는 조성물.
16. 제15항에 있어서, 상기 콜라겐 혈관 질환 또는 다른 자기면역 질환이 전신 홍반성 낭창 또는 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제14항에 있어서, 상기 면역체계의 질환은 급성 활성화인 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 제17항에 있어서, 상기 면역체계의 급성 활성화가 이식에 대한 숙주 질환, 동종 이식 거부, 또는 수혈 반응인 것을 특징으로 하는 조성물.
19. 약제학적으로 수용가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항, 제2항 내지 제4항 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물.