KR0179338B1

KR0179338B1 - 가축질병의 치료 및 예방을 위한 면역증강제

Info

Publication number: KR0179338B1
Application number: KR1019950048433A
Authority: KR
Inventors: 김종만; 우승룡; 조윤상
Original assignee: 이관용; 농림부 국립수의 과학검역원
Priority date: 1995-12-11
Filing date: 1995-12-11
Publication date: 1999-03-20
Also published as: KR970032884A

Abstract

본 발명은 포도상 구균(Staphylococcus aureus cowan I주)의 사(死)균체 또는 정제 단백질; 그리고 보데텔라균(Bordetella pertussis ATCC 9797)의 정제 단백질을 유효성분으로 그리고 보호제를 함유함을 특징으로 하는 동물용 면역증강제를 제공한다. 이 면역증강제는 각종의 세균성 질병에 대해 면역증강효과를 나타낼 뿐만아니라 바이러스 질병에 대해서도 우수한 면역효과를 나타낸다.

Description

가축질병의 치료 및 예방을 위한 면역증강제

제1도는 본 발명에 따른 면역증강제의 생산공정도이다.

본 발명은 가축에 사용하기 위한 면역증강제에 관한 것이고, 보다 상세하게는 많은 종류의 가축 전염병을 효율적으로 방제 할 수 있으며, 치료제가 없는 바이러스성 질병의 치료에도 효과를 나타내는 면역증강제에 관한 것이다.

지금까지 가축질병에 대한 대책은 백신을 이용한 전염병 예방과 항생제 등에 의한 세균성 질병을 치료하는 것에 중점을 두고 행하여져 왔다.그러나 백신은 원인체별로 백신을 접종하여야하고 부작용 및 변이 균독주 발생 등에 의한 예방효과 감소 등의 문제점이 밝혀지고 있으며, 항생제에 의한 질병치료는 내성균 출현과 축산물 안정성 관계로 문제가 되어왔다.

이에 선진제국에서는 생체내 질병 방어의 중추 역할을 하는 면역세포들의 기능을 증강시켜 광범위한 질병을 효율적으로 방제할 수 있게 하는 면역증강제를 개발하여 활용하고 있다. 예를 들면, 미코박테리움 클레오네이(Mycobacterium chelonei)균체 또는 사카로미세스 세레비시아에(saccharomyces cerevisiad)균의 세포벽에서 추출한 다당류 성분이 국내에도 수입되어 면역증강제로 사용되고 있다.

그러나 이들 면역증강제들은 그의 예방효과가 만족스럽지 못하고 또한 가격이 비싸서 축산농가에서 활용하기에는 무리가 있다고 하는 문제점이 있어왔다.

따라서 본 발명의 목적은 보다 면역증강효과가 뛰어나고 또한 그동안 특별한 체료제가 없었던 바이러스성 질병에도 효과를 나타내는 면역증강제를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 포도상 구균의 균체 세포벽 또는 분비단백질과 보데텔라균의 분비 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역증강제를 제공한다.

본 발명의 상기한 목적, 기타 목적, 특징 및 적용은 발명의 상세한 설명에 의해 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 면역증강제는 포도상 구균의 균체 세포벽 또는 분비 단백질과 함께 보데텔라균의 분비 단백질을 유효성분으로 함유한다. 이들 두 균체 성분 간의 비율은 특별히 한정되지 않으며 중량비로 1:1-10의 범위내에 있을 수 있다.

종래 여러 종류의 균종이 면역증강효과를 나타낸다고 하는 것이 보고되어 왔으며, 포도상구균과 보데텔라 균 각각의 면역증강 작용도 이미 보고된 바 있다. 그러나 본 발명의 완성일 이전까지는 이들의 구체적인 면역증강 기작은 규명되어 있지 않았고, 이들을 면역증강제로서 실용화하고자 하는 시도도 없었다.

이에 본 발명자들은 보다 효과적이고 상승작용을 나타내는 면역증강제를 찾아내고자 하는 연구의 일환으로 여러균종에 대한 면역세포별 면역증강효과를 조사하였고, 그 결과로서 포도상 구균과 보데텔라균의 혼합사용에 의해 최적의 면역증강제를 발명하기에 이르렀다.

포도상 구균에 있어서는 균체의 세포벽과 분비 단백질이 면역증강 성분으로 사용되고, 보데텔라균에 있어서는 균 발육 중에 분비되는 단백질인 퍼튜톡신(pertutoxin)이 면역증강효과를 나타낸다.

이들 포도상 구균의 세포벽과 분비 단백질은 각각 단독으로 사용하거나 또는 함께 사용할 수 있다. 본 발명자들의 연구에 따르면, 포도상 구균의 세포벽 및/또는 단백질을 동물체에 투여하면 면역세포중에서 항체를 생성하는 체액면역(B-림프구)에 주로 작용하고, 보데텔라균의 단백질은 세포면역능(T-림프구)에 관여하는 림프구에 주로 작용하는 것으로 밝혀졌다.(표 1 및 표 2) 따라서, 이들 두 균주를 혼합하여 사용하면, 생체 내의 전반적인 면역능을 효과적으로 증강시킬 수 있으며, 실제 현재 사용되고 있는 면역증강제와 비교하여 우수한 면역증강효과를 나타낸다.

본 발명에 따른 면역증강제는 면역화하고자 하는 질병의 백신에 혼합하여 사용하거나 또는 증강제 단독으로 사용될 수 있으며, 그양은 1mg/ml농도의 증강제 2ml를 통상의 백신 1바이알과 혼합하여 투여하거나 단독으로 투여할 수 있다.

본 발명의 면역증강제는 백신과 혼합하여 투여하기 좋은 주사제의 제형, 또는 그외 정제와 같은 제형을 가질 수 있으며, 이를 경구 또는 주사투여 같은 비경구 경로를 통하여 투여할 수 있다. 또한 본 발명의 면역증강제는 제형의 종류에 적합한 당업자에게 주지된 각종의 부형제를 적의 함유할 수 있으며, 그 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로 보호제(10%탈지분유)와 혼합한 후 동결건조하는 것에 의해 제형화할 수 있으며, 사용시에 증류수에 레바미졸(Levamisole, sigma, 500μg/ml)이 들어있는 희석액으로 ml당 1mg의 증강제가 함유하도록 녹여서 사용한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 실시예에만 국한 되는 것은 아니다.

[실시예 1]

면역증강효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있는 표 1에 나타낸 10종의 균주에 대하여 이들을 각 균에 적합한 공지의 방법으로 배양한 후, 균 배양액, 배양 상충액, 균체, 세포벽 또는 분비 단백질에 대하여 호중구의 살균성 물질 생성능을 비교하였다.

호중구는 미생물 탐식 및 살균작용을 하는 면역세포로서 호중구는 살균성 물질인 과산화수소(H₂0₂) 및 수퍼옥사이드(O₂)의 생성능을 비교함으로써 각종 균주의 면역증강효과를 평가할 수 있다.

과산화수소 생성능의 증가는 표 1에, 그리고 수퍼옥사이드 생성능 증가는 표 2에 나타내었다.

*증가율은 무처리 호중구의 과산화수소 생산량과 비교한 백분율이다. 흡광도는 560nm에서 측정

*증가율은 무처리 호중구의 수퍼옥사이드 생산량과 비교한 백분율이다.

상기 표 1과 2의 결과로부터, 포도상 구균(S. aureus(Cowan))이 가장 우수한 면역증강효과를 나타냄을 알 수 있다.

[실시예 2]

상기결과를 바탕으로하여, S.serevisiae(S라 한다)의 균체 및 정제 분비 단백질 혼합물, 포도상 구균(Staphyloccus aureus Cowan 1주; A라 한다.), 보데텔라(Bordetella pertussis, ATCC 9797; B한다) 균, P.acnes(P라 한다) 의 균체 및 정제 분비단백질, 그리고 C. gulliemondii(C라 한다)을 이용하여 면역증강제 시제품을 제조하였다.

균을 10% 소혈액 한천배지에서 37℃에서 18시간 배양하여 순수 집락을 선발하고 트립틱 소이 브로스(Tryptic soy broth,BBL)에 각기 접종하여 37℃에서 48시간 교반(shaking)배양하였다.

배양한 포도상구균은 80℃, 10분간 열처리하여 0.3% 포르마린으로 실온에서 4시간볼활화하고 8,000×g, 20분간 원심분리하였다.

균체는 무게를 측정하여 냉장보관하고 상층액은 과포화 암모니움 설페이트(Smmonium sulfate, Sigma)를 서서히 가하면서 5℃에서 포도상 구균 분비단백질을 용출시켜 냉장실에서 하루밤 정치하고 형성된 단백물질을 10000rpm,1시간 원심분리하여 수집하고 투석막을 이용하여 0.01M PBS에서 투석하면서 불순물을 제거, 포도상 구균이 분비한 세포벽의 용성특수단백질(solubilized cell wall protein) 인 단백질 A를 정제하였다.

보데텔라균 배양물은 0.2% 포르마린으로 냉장실(5℃)에서 1-2일간 불활화하고 8,000xG, 20분 원심분리하여 균체를 제거하고 상층액에 포도상구균 상층액의 암모니움 설페이트 처리법과 같이하여 보데텔라균이 분비한 독소단백(pertussis toxin = pertutoxin)을 정제 하였다. 이렇게 준비한 포도상구균 균체, 분비단백 그리고 보데델라균의 분비단배질을 각각 1:1:1 의 비율로 합하여 무게를 측정하고 0.01M PBS에 ml당 10mg이 함유하도록 부유시켜 0.2% 포르마린을 가하여 5℃에서 2-3일 처리한 후 10%탈지분유(Skim milk)를 증강제 6과 탈지분유 4의 중량비율로 혼합하여 분병하고 동결건조 하였다. 이상의 공정을 제1도에 도시하였다.

이들 증강제 시제품을 하기 표 3에 나타낸 바와 같은 보조제를 이용하여 제제화한 후, 산양(山羊) 호중구의 랜덤(random) 및 직접(direct) 유주능 증강효과, 과산화수소 및 수퍼 옥사이드 생산능, 그리고 T-림프구의 분아능(MTT법으로 측정)을 판정하고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

T-림프구의 분아능은 유약화 반응을 통하여 측정하며, 림프구의 유약화 반응은 Denizot와 Lang 의 방법(1986)에 따라 생세포에 있는 미토콘드리아 효소인 숙시네이트 데히드로게나제가 테트라 졸리움 색소, MTT [3(4,5-디메틸티아졸-2-일) 2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드(Sigma)와 반응하여 생성되는 포르마잔(formazan)의 양을 비색법으로 측정하였다. 즉, 림프구를 RPMI 1640배지로 세포수가 1×10/ml로 되도록 조절하여 100μml씩 마이크로 플레이트 웰에 분주하고 Con A(Sigma)는 10mg/ml, PHA(식물응집소;Phytohemaglutinin Sigma)는 1mg/ml, 그리고 PWM(포크위드 미토겐;Pokeweed mitoben, sigma)은 40μg/ml로 RPMI 1640배지에 녹여 여과(pore size 0.22㎛)멸균후 소량씩 분주하여 -20℃에서 보존한 것을 Con A는 640배, PHA 는 400배, PWM은 10배(4㎍)로 희석한 것을 미토겐 별로 100㎕씩 가하였다. 대조군으로는 미토겐 대신 RPMI 1640 배지 100㎕를 가하였다. 이와같이 처리한 마이크로 플레이트는 5% CO기상의 항온기에서 37℃, 48시간동안 배양하였다.

배양한 마이크로플레이트를 400rpm, 15분간 원심하여 (ICE, DPR-6000, Rotor No.227)상층액을 제거하고, MTT액(2㎎/㎖) 50㎕씩을 각 웰에 가한 다음 5% CO기상의 항온기에서 37℃, 3시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 마이크로 플레이트를 다시 400rpm, 15분간 원심하여 상층액을 제거하고, 생성된 포르마잔을 ELISA판독기(reader)로 발색 정도를 판독하였다. 림프구의 유약화 상태는 호중구의 S.aureus탐식 상태를 전자현미경으로 관찰하였다.

상기 결과로부터, 무처리 대조군에 비하여 포도상구균은 호중구의 유주능과 살균성산화물질 생성능을 가장 현저하게 증가시키며, 보데텔라균은 면역기능의 중추세포인 림프구의 증식자극능(분아능)과 세포성 면역 증강물질 생산능을 가장 높게 증가시키는 것을 알 수 있다.

상기 표의 결과로부터, 본 발명에서 특징적으로 배합하여 사용하는 포도상 구균은 면역세포중에서 항체를 생성하는 체액면역(B-림프구)에 주로 작용하고, 보데텔라균의 단백질은 세포면역능(T-림프구)에 관여하는 림프구에 주로 작용하는 것을 알 수 있다. 따라서, 이들 두 균주를 혼합하여 사용하면, 생체내의 전반적인 면역능을 효과적으로 증강시킬 수 있으며, 하기 실시에 4에서 확인되는 것처럼, 현재 외국으로부터 수입되어 사용되고 있는 면역증강제 P 및 G와 비교하여 우수한 면역증강 효과를 나타낸다.

[실시예 4]

[공격균, 바이러스에 대한 면역증강제 접종마우스의 예방효과]

포도상구균 균체 세포벽과 분비 단백질의 1:1 혼합물, 또는 보데텔라균으로 만든 면역증강제를 마우스의 복강내로 0.1㎖(1.0㎎/㎖)주사하고 1-3일후 대장균 등 6종의 병원균(10-1000MLD/0.1㎖)과 오제스키 바이러스(10TCID)를 각기 마우스에 공격접종하고 5일간 관찰하면서 생존율을 조사하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

[실시예 5]

[면역증강제의 돼재 위축성비염 백신 방어능에 미치는 효과]

면역증강제를 백신과 혼합 접종시 백신의 방어능에 미치는 효과를 조사하기 위하여 돼지 위축성 비염 사균(AR) 백신 1바이알 단독, AR백신과 상기 실시예 1에서 제조한 면역증가제 2㎖의 혼합물, 또는 면역증강제 2㎖ 단독을 마우스에 접종하고 병원성 AR균으로 공격접종한 후 10일간의 생존율에 의한 백신 방어능 증강효과를 시험한 바 백신 단독으로 접종한 마우스 보다는 백신과 면역증강제를 혼합하여 접종한 마우스의 방어능이 현저히 높았다.

결과를 표 6에 나타내었다.

[실시예 6]

[면역증강제의 개에 대한 야외질병 치료, 예방효과]

면역증강제의 개 질병에 대한 치료, 예방효과를 조사하기 위하여 가축병원에 의뢰하여 실시예 1의 면역증강제의 효과를 조사한 결과 표 7에서와 같이 비접종견에 비하여 질병 발생율 감소와 치료효과 향상등의 임상효과를 얻었다.

[실시예 7]

한우에서 면역증강제의 질병예방 효과를 조사하기 위하여, 분만 직후 송아지에 실시예 1의 면역증강제를 접종하고 설사와 호흡기 발생 상황을 종래의 바이러스 제제와 비교한 결과 표 5에서와 같이 질병 지속일에서는 종래의 바이러스 제제가 약간 우수하였으나 60일간의 주기별 질병 발생은 본 발명의 면역증강제가 좀더 우수한 결과를 나타내었다.

결과를 표 8에 나타냈다.

Claims

포도상 구균(Staphylococcus aureus cowan I주)의 사(死)균체 또는 포도상 구균을 배양한 배양상층액에서 분리, 정제한 세포벽의 용성특수단백성분(solubilized cell wall protein)인 단백질 A; 그리고 보데텔라균(Bordetella pertussis ATCC 9797) 이 분비한 독소단백 (pertussis toxin)을 유효성분으로, 그리고 보호제를 함유함을 특징으로 하는 동물용 면역증강제.
제1항에 있어서, 보호제는 약 10% 탈지분유(skim milk)임을 특징으로 하는 면역증강제.
제1항에 있어서, 증류수에 레바미졸(Levamisole, sigma, 500㎍/㎖)이 들어있는 희석액을 이용하여 ㎖당 1㎎의 증강제가 함유되도록 녹여서 사용하는 것을 특징으로 하는 면역증강제.