KR0165692B1 - 사료의 조성을 변경 및 최적화시키는 방법 - Google Patents

사료의 조성을 변경 및 최적화시키는 방법 Download PDF

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해칸 알쿠비스트, 마가레타 린더
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Abstract

본 발명은 혈액 중에서 소위 FIL-렉틴의 농도를 시험하는 것을 기초로 하여 사료 조성물을 변경시키고, 최적화시키는 방법에 관한 것이다. 이 변경은 사료에 특정 당 및 아미노산을 첨가함으로써 발생된다. 따라서, FIL 농도를 조절하여 성장을 최적화시킨다.

Description

사료의 조성을 변경 및 최적화시키는 방법
동물의 일일 성장은 영양분이 장 내로 흡수되는 방법에 크게 좌우된다. 단당류 및 아미노산 등의 다수 영양분의 흡수는 소장 벽을 통과하는 유체 및 전해물의 운반/유동과 관련되어 있다. 그러므로, 소장 점막을 통과하는 유체 및 전해물등의 유동을 조절하는 신체의 능력은 일일 성장에 있어 필수적이다.
최근 몇 년 동안 장 내의 유체 및 전해물의 교환을 조절하는 신체의 능력에 관한 중요한 발견이 이루어졌다. 장벽을 통과하여 유체 및 전해물의 재흡수를 증진시키는 능력을 갖는 다양한 펩타이드가 동정되었다. 이러한 호르몬 유사 펩타이드 중 가장 중요한 것으로는 소마토스타틴, 뉴로펩타이트 Y(인용 문헌 1,2) 및 소위 항분비 단백질, ASP(3,4)가 있다. ASP는 분비를 방지하고, 장 내에서 유체 및 전해물의 재흡수를 증가시키며, 이러한 측면에서 보아 쥐 및 돼지에게는 현재까지 가장 효력있는 물질(4,5)이며, 분자량은 약 60,000달톤이고, 단백질 사슬을 고유한 항원 결정기를 함유한다(4). ASP의 효과는 쥐에서 소위 소장 루프(loop) 시험으로 결정한다. 소장의 절편(루프)을 봉합에 의하여 결찰시키고, 루프 중에 시험 물질(항분비 물질) 또는 완충액(위약)이 첨가된 특정량의 콜레라 독소(통상 3x10-6g)를 정맥내 주사한다. 독성 작용의 결과로서, 유체는 수시간 후에 소장 루프 내에 분비된다. 단위로 표시되는 물질의 항분비 효과는 대조용 동물 및 시험 동물 중의 영향을 받은 루프의 중량의 길이의 비율(㎎/㎝)로부터 계산된다. (1단위=소장 루프 중에서 유체 분비를 50% 억제하는 항분비 물질의 양; 인용 문헌 3 및 4 참조).
돼지에 관한 연구에서 ASP는 자발적으로 형성되고, 초유 및 모유 내로 분비되고, 젖먹이는 동안에 ASP는 신생 새끼 돼지에게 전달되고(6), 모유 중의 고농도의 ASP는 자손을 신생아 설사에 대하여 보호한다.
놀랍게도, 최근에는 특정 당 및 아미노산을 사료에 첨가하는 것이 ASP 유사 렉틴의 형성 뿐만 아니라 동물의 일일 성장의 증가를 유도한다는 것이 발견되었다. 유도된 단백질 및 천연 ASP-단백질은 동일한 분자량을 갖고, 유사한 소장 효과를 나타내나, 그들은 그들의 항원(-항체 결합) 특성 및 등전점에서 차이가 있으며, 또한 아가로스 등의 특정 다당류에 결합되는 그들의 능력에 있어서 차이가난다. 다른 종류의 렉틴과 유사하게, 그들은 α-메틸-D-글루코시드 또는 갈락토오스 등의 단당류를 사용함으로써 다당류로부터 용출될 수 있다. 그러므로, 본 발명자들은 이후 당 또는 아미노산에 의하여 유도되는 이러한 신규 단백질을 사료 유도된 렉틴(FIL)이라 명명 할 것이다. 사용된 당은 단당류, 이당류 또는 당 알코올이다. 사용된 아미노산은 알파-아미노산이다. 특정한 경우에 있어서, 아미노산은 아미드에 의하여 치환 또는 보충될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라서, 사용된 당은 단당류, 이당류 또는 당 알코올이다. 바람직한 당에는 글루코오스, 사카로오스 및 소르비톨이 있다. 사용될 수 있는 다른 당에는 프룩토오스, 갈락토오스, 만노오스, 락토오스, 만니톨 및 크실리톨이 있다.
상기한 바와 같이, 사용된 아미노산에는 알파-아미노산이 있다. 바람직한 아미노산에는 트립토판, 아스파르트산, 라이신, 트레오닌 및 메티오닌이 있다. 사용될 수 있는 다른 아미노산에는 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 페닐 알라닌, 타이로신, 아르기닌, 히스티딘 및 글루탐산이 포함된다. 상기한 바와 같이, 특정한 경우에 있어서의 아미노산은 아미드에 의하여 치환될 수 있거나 보충될 수 있다. 바람직한 아미드는 우레아이다.
따라서, 본 발명은 사료의 조성을 변경시켜 FIL의 형성을 유도하는 방법에 관한 것이다. 백신접종과 유사하게, 이 방법은 특정 척추 동물 단백질의 합성 유도시에 발견된다. 그러나, 고분자량의 항원으로 이루어진 백신과 대조적으로, 아미노산 및 당은 저분자량이다. 나아가서, 유도된 렉틴은 백신에 의하여 유도되는 항체 및 림포킨과는 아주 다른 특성을 갖는다. 신규 호르모 유사 물질의 생성이 유도되는 유사기작은 알려지지 않았다.
따라서, 사료 유도된 렉틴은 외부 자극에 의하여 유도되는 그들의 능력에 있어서, 독특한 것으로 나타난다. 더욱이, 놀랍게도 신규 렉틴의 생성은 투여량에 좌우되는, 즉 그 생성량은 사료 중의 유리 당 및 아미노산의 농도 증가에 비례하여 증가한다는 것이 발견되었다.
특정 항혈청을 사용함으로써, 천연 ASP 및 사료 유도된 렉틴을 구분할 수 있다. 실시예 1,4 및 9에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, FIL을 특정 사료를 급식한 돼지 및 닭의 혈액으로부터 각각 정제하고, 이 후 정제된 렉틴을 토끼에 주입하여 항혈청(각각 토끼-항-돼지-FIL 및 토끼-항-닭-FIL)을 얻는다. 또한, 돼지 및 닭으로부터 ASP에 대한 항혈청(ASP에 대한 항혈청은 ASP를 중화시키나 FIL은 중화시키지 않은)을 제조한다. 이러한 상이한 항체를 사용하여, 상기한 소장 루프 시험에 의하여 FIL의 활성으로부터 ASP의 활성을 중화 및 분화시킬 수 있다. 쥐에 이러한 생물학적 분석법을 사용함으로써, 혈액 또는 모유 중의 ASP 및 FIL 단위 수를 결정한다.
상기한 놀랄만한 발견 때문에, FIL의 최대 유도를 위한 사료 중의 유리 당 및 아미노산의 함량을 최적화시키는 것이 최근에 동물의 혈액 또는 모유 중에서 렉틴을 분석함으로써 진행되고 있다. 본 명세서 중의 사료란 동물용 사료, 사료 첨가물 및 음료를 의미한다.
FIL의 생물학적 효과는 천연 ASP의 생물학적 효과와 상당한 정도로 동일하다. ASP와 유사하게, FIL은 엔테로톡신에 의하여 유발되는 유체 분비를 방지한다. 나아가서, 놀랍게도 혈액 중의 최적 FIL 농도는 성장의 증가를 가져온다는 것이 발견되었다. FIL 농도의 최적화는 비육 동물의 사료에 첨가함으로써 직접 이루어지거나 또는 그의 성장하는 자손에게 모유를 먹이는 어미 동물의 사료에 첨가함으로써 간접적으로 이루어질 수 있다. 후자의 방법의 성장-촉진 효과는 ASP 유사 FIL이 모유를 경유하여 전달될 수 있어서, 자손에 대하여 효과를 나타낼 수 있다는 발견에 따른다(실시예 6).
가장 현저한 효과는 돼지를 이유시킨 후에 이루어진다. 이유 기간은 돼지의 성장에 있어 중요하고, 그 다음 기간 동안 동물은 그 성장이 지연되게 되는데, 이러한 기간 동안의 민감성의 증가는 스트레스의 증가가 ASP의 형성을 중단시켜 ASP의 혈액 농도가 현저하게 감소한다는 사실에 의하여 유발될 수 있다(7). 사료 유도된 레시틴의 형성은 ASP의 천연적인 형성보다 스트레스에 덜 민감한 것으로 보인다. FIL 형성을 위해 사료를 최적화함으로써, 이유 후 1주일 동안과 같은, 스트레스의 기간 동안에도 유체 분비를 방지할 수 있다. 그러므로, 가축을 사육하는 농부를 위한 실제적인 중요성은 상당하다.
나아가서, 본 발명은 다음의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명된다.
렉틴의 아가로스 겔에 대한 친화도를 사용함으로써 FIL을 혈액으로부터 추출하였다. 항응고 물질을 함유하는 FIL-함유 전혈액 1리터에 티오황산나트륨 1g 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 1㎎을 첨가시켰다. 혈액 세포를 원심 분리로 분리시키고, 투명한 혈장을 용액의 약 10% 부피에 대응하는 겔 부피를 갖는 세파로스 6B 칼럼[파르마시아 LKB 바이오테크놀로지(Pharmacia LKB Biotechnology), 스톡홀름 소재]을 통하여 용출시켰다. 인산염 완충 생리 식염수(PBS=0.15M NaCl, 0.05M인산나트륨, pH7.2)의 3베드 부피(bed volume)로 세척시킨 후에, 칼럼을 PBS 중에 용해된 1M α-메틸-D-글루코시드 2베드 부피로 용출시켰다. 용출물 Amicon PM10 한외 여과막 상에서 농축시키고, 이어서 상기한 기술(4)에 따라서 등전성 포커싱(isoelectric focusing)에 의하여 분획화시켰다. 쥐에서의 소장 루프 시험에 의하여, 각종 분획의 활성 및 pH를 결정하였다. 이러한 방법으로, 활성 물질(FIL)의 등전점을 얻었다. 높은 항분비 활성을 갖는 분획을 모으고, Amicon PM10상에서 5-8ml로 농축시키고, 1ml씩 나누고, -20℃에서 동결시켰다. 이러한 분획을 소듐 도데실설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 전기 영동(4)를 사용하는 분자량 결정, 및 항체를 생성하기 위한 토끼의 면역화를 위하여 사용하였다. 돼지로부터의 FIL에 대한 항혈청을 돼지로부터의 ASP를 사용하여 흡수시키고, 항체를 돼지로부터의 ASP로 포화된 아가로스 칼럼을 통하여 용출시켰다.
표1은 다른 종류의 FIL 및 ASP를 이러한 항원(각각 ASP 및 FIL)에 대한 항혈청(항원/항혈정 비 = 1/100)과 혼합시킨 후에 어떻게 중화시켰는지를 나타낸다(pFIL=돼지로부터의 FIL, cASP=닭으로부터의 ASP, bASP=소로부터의 ASP 등). FIL 유도 사료 조성물을 실시예 4,8 및 11에 나타내었다. 각각의 동물 종으로부터의 ASP를 상기 설명한 바와 같이 생성시켰다(4). 표 2는 다른 종류의 동물로 부터의 FIL의 등전점(pI) 및 킬로달톤(KDa)으로 표시된 분자량(M.W.)을 나타내었다. 돼지, 닭 및 소로부터의 ASP의 등전점은 각각 4.7, 4.8 및 4.8이었다.
[실시예 2]
이 실시예는 스웨덴식 표준 사료를 공급한 돼지에서의 ASP의 농도를 나타낸다.
혈액 시료를 이유 7일 후에 채취하고, 대략 1,400마리의 암퇘지가 있는 무리 중에서 연구를 수행하였는데, 여기에서 500마리의 돼지를 매주 이유시켰다. 이러한 돼지를 연구가 수행된 이유 유니트로 이유 시기에 이동시켰다. 7일 후, 새끼 돼지는 그들 자신의 사료를 자유로이 섭취하였다. 새끼 돼지를 위한 소위 표준 사료는 다음의 조성을 갖는다.
곡물 88%
미량 원소, 비타민, 미네랄 6.1%
단백질 식품 5.8%
(유리 아미노산의 첨가:
라이신 0.39%, 메티오닌 0.03% 및
트레오닌 0.1%)
표 4는 이유 후 여러 시간에 있어서 한배에서 태어난 10마리 돼지의 혈장 중의 ASP의 함량을 나타낸다. 돼지를 이유와 관련하여 이유 유니트로 이동시켰다. 이러한 연구를 표 3에서와 동일한 사료를 이용하여 동일한 무리 중에서 수행하였다.
[실시예 3]
글루코오스, 각종 아미노산 또는 우레아를 함유하는 용액에 의하여 돼지 중에서 FIL을 유도시켰다. 실시예 1의 결과는 FIL이 그의 생화학적 및 면역학적 특성에 있어서 ASP와 상이하나, 둘다 쥐 소장 루프 시험에서 소장 분비에 대한 유사한 억제 효과를 나타낸다는 것을 증명한다.
이 실시예에서, FIL 유도 물질을 4-5주령(약 이유 4일전) 새끼 돼지에게 용액으로 공급하였다. 1군당 4마리의 새끼 돼지에게 25ml 용액을 2회 16시간 간격으로 경구적으로 공급하였다. 추가로 5시간 후에, FIL 분석용 혈액 시료를 채취하였다. 돼지에게 또한 표준 사료로부터의 유리 아미노산을 공급하였다(실시예 2참조).
[실시예 4]
3주령부터 통상적인 표준 사료 또는 FIL-자극 사료를 공급한 새끼 돼지에 대한 스프티트-리터(split-litter) 실험의 결과를 얻었다. ASP 뿐만 아니라 FIL의 혈장 농도를 이유 바로 직전 또는 4일 후에 분석하였다. 새끼 돼지의 체중 및 사료 소비량을 기록하였다. 5주령에서 이유시켰다.
성장을 이유 전의 일과 이유후 28일 사이의 체중 차이로부터 계산하였다. 대조군에게 표준 사료(실시예 2참조)를 공급하고, 시험군에게 FIL의 형성을 자극하기 위해 표준 사료에 추가하여 또한 3% 글루코오스 및 0.1% 트립토판을 공급하였다.
본 발명은 또한 실시예 5 및 6에서도 뚜렷한 바와 같이 더 나이가 든 돼지에게도 적용된다.
[실시예 5]
돼지를 비육 유니트로 이동시킨지 2-3주 후에, 시험을 수행하였다. 이때, 동물은 14-15 주령이었다. FIL유도 사료의 제공 바로 직전 및 7일 후에, 혈액 시료를 얻었다. 이 사료는 다음으로 구성되었다.
곡물 85%
글루코오스 4.0%
단백질 식품 6.2%
(아미노산의 첨가 :
라이신 0.34%, 트레오닌 0.11%
아스파르트산 0.10%, 트립토판 0.05% 및
메티오닌 0.03%)
미네랄, 비타민, 미량원소 3.3%
지방 1.5%
[실시예 6]
FIL 유도된 사료를 공급한 암퇘지의 FIL 형성 자극 후, 신생 새끼 돼지에게 FIL을 전달하였다. 초유 및 새끼 돼지의 혈액 중의 FIL의 농도를 분석하였다. 표준 사료는 아미노산인 라이신 0.09% 및 메티오닌 0.02%를 함유하였다.
표 8 및 9는 분만한지 2일 후 초유 중의 FIL의 함량(평균)을 나타낸다. 표 8은 또한 2일령 새끼 돼지의 혈장 중의 FIL 농도를 나타낸다. 시험 군 중의 암퇘지에게 분만전 7일로부터 분만 후 6일까지 3% 소르비톨(표 8) 또는 3% 수크로오스 및 0.7% 라이신(표 9)이 첨가물을 공급하였다. 새끼 돼지에게는 단지 초유만을 공급하였다. 대조군 중의 암퇘지에게는 다음의 조성으로 이루어진 표준 사료를 공급하였다.
곡물 83.6%
미네랄, 미량 원소, 비타민 3.1%
단백질 식품 13.3%
(첨가 : 라이신 0.09%, 메티오닌 0.02%)
또한, 새에 있어서도 장 내의 유체 분비는 실시예 7-9에 증명된 바와 같이 ASP 및 FIL에 의하여 조절된다.
[실시예 7]
표에서는 닭의 혈액 중의 ASP의 함량은 동물이 세균성 질환에 걸려서 가장 민감한 상태로 있는 경우에 약 3주까지 연속하여 감소하고 있다는 것을 나타낸다. 이러한 무리 중에서, 혈장 중의 ASP의 농도는 출생시의 농도 부근으로 다시 상승되었다.
표준 사료는 다음의 조성으로 이루어졌다.
곡물 76.3%
미량 원소, 비타민, 미네랄 2.7%
단백질 식품 21.0%
(첨가 : 라이신 0.25%, 메티오닌 0.17%)
표 11에서는 도살시예 35일령의 설사중에 걸린 닭 및 걸지지 않은 닭으로부터 형장 중의 ASP 농도를 나타낸다. 닭에게 표준 사료를 공급하였다. 10마리 닭으로부터 혈액 시료를 각각의 군 내에 모으고, 전체 30마리의 닭을 사용하여 2종의 실험을 수행하였다.
[실시예 8]
시험군 중의 닭에게 3% 글루코오스 및 0.1% 트립토판이 첨가된 표준 사료를 공급하였다.
[실시예 9]
모든 군에게 0일째에서 제36일까지 곡물 76%, 미량 원소, 비타민, 미네랄 1.7% 및 단백질 사료 식품 22%(라이신 0.05%, 메티오닌 0.11%가 첨가됨)로 이루어진 동일한 기본 사료를 공급하였다. 제1군에게는 도살시까지(제36일) 첨가물이 없는 기본 사료를 공급하였다. 제2군에게는 제0-32일 동안 0.07% 모넨신(포자충증 억제제)이 첨가된 기본 사료를 공급하였다. 제3군에게는 제0-32일 동안에 1% 글루코오스 및 0.02% 트립토판(모넨신 미함유)이 첨가된 기본 사료를 공급하였다. 제4군에게는 제0-32일 동안 0.07% 모넨신 및 1% 글로코오스가 첨가된 기본 사료를 공급하였다. 제33일로부터 도살시(제36일)까지, 모든 군에게 첨가물이 없는 기본 사료를 공급하였다. 살아있는 동물의 중량 및 사료 증가량(㎏ 사료/㎏ 체중)을 제36일에 평가하였다. FIL값(단위/ml 혈액)을 제35일에 평가하였다.
천연 ASP 및 사료 유도된 FIL의 농도를 또한 소에서 평가하였으며, 이 평가 결과를 다음의 실시예에서 예시하였다.
[실시예 10]
송아지의 나이는 5-7 주령이었다. 우유를 일일 4L, 사료를 일일 0.5㎏ 공급하였다. 사료는 옥수수 83내지 89%, 단백질 식품 10내지 15%, 및 미네랄, 비타민 및 미량 원소 1내지 2%로 이루어졌다.
[실시예 11]
송아지 연령 및 사료 섭취는 상기 실시예에서와 동일하였다. 우유 대체물의 매일 섭취량은 200g이었다. 이 양에 유장 분말(1군) 또는 글루코오스 35g, 트립토판 0.62g, 아스파트산 0.62g(2군)의 FIL-형성 자극제 36g을 첨가하였다. 그 이후에, 혼합물을 물 2L중에 용해시켰다. 일일 체중 증가를 제0일 및 18일 사이에 기록하고, FIL 값을 제18일째에 기록하였다.
상기 실시예로부터, FIL의 형성을 유도하고, 동물의 건강 및 성장 증가를 현저하게 향상시키는 것이 가능하다는 것은 명백하다. 이 실시예의 목적은 효과가 다양한 수단에 의하여 수행될 수 있다는 것을 나타내며, 본 발명은 제한하는 것은 아니나, 최대 효과에 있어서 약간의 차이가 존재한다는 것을 나타낸다. 사료 소비량 뿐만 아니라 FIL유도에 대한 민감성에 있어서의 차이 때문에, 첨가물의 종류 및 양은 다른 연령 및 다른 동물 종 사이에서 다르다. 효과적인 물질은 전체 할당량/사료의 프리믹스(Premix)로서, 전체 할당량/사료의 일부로서, 또는 분말 또는 용액 상태의 할당량/사료에 대한 별도의 부가물로서 첨가될 수 있다는 것은 명백하다.
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Claims (7)

  1. 0.15 M NaCl-0.05 M 인산나트륨 완충액(pH7)중에서 아가로스에 고친화성으로 결합하고 1Mα-메틸-D-글루코시드의 첨가 후에 아가로스로부터 다시 해리되는 혈액 렉틴(FIL로 명령)의 함량을 동물중에서 측정하고, 얻어진 정보로부터 1ml혈액이 상기 렉틴 0.5단위 이상을 함유하게 되도록 하는 양으로 당 및(또는) 당 알코올 및(또는) 아미노산 및(또는) 아미드를 함유하는 사료를 제조하는 것을 특징으로 하는, 동물의 일일 성장을 증가시키기 위하여 사료의 조성을 변경 및 최적화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 사료 중에 일일 체중 1㎏당 0내지 6g의 단당류 및(또는) 이당류 및(또는) 당 알코올, 및 0내지 5g의 아미노산(또는) 아미드를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 돼지, 닭 또는 송아지에게 공급하기 위한 사료 중에 일일 체중 1㎏당 0.3내지 4.0g의 단당류(또는) 이당류 및(또는) 당 알코올, 및 전체량 0.01내지 1g의 유리 아미노산 및(또는) 아미드를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 비육 돼지에게 공급하기 위한 사료 중에 일일 체중 1㎏당 0.8내지 2.0g의 단당류(또는) 이당류 및(또는) 당 알코올, 바람직하게는 1.4내지 1.8g의 글루코오스, 및 전체량 0.02내지 4.0g의 유리 아미노산 및(또는) 우레아, 바람직하게는 아스파트산, 라이신, 메티오닌 또는 트립토판을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 암퇘지에게 공급하기 위한 사료 중에 일일 체중 1㎏당 0.5내지 2.0g의 단당류(또는) 이당류 및(또는) 당 알코올, 바람직하게는 0.7내지 1.2g의 소르비톨 및(또는) 사카로오스, 및 전체량 0.01내지 0.2g의 유리 아미노산 및(또는) 우레아, 바람직하게는 0.01내지 0.06g의 라이신 및(또는) 0.002내지 0.02g의 메티오닌을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 닭에게 공급하기 위한 사료 중에 일일 체중 1㎏당 0.3내지 4.0g의 단당류(또는) 이당류 및(또는) 당 알코올, 바람직하게는 0.5내지 3g의 글루코오스, 및 전체량 0.1내지 1g의 유리 아미노산 및(또는) 우레아, 특히 0.01내지 0.05g의 트립토판을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제3항에 있어서, 송아지에게 공급하기 위한 사료중에 일일 체중 1㎏당 0.1내지2.0g의 단당류 및(또는) 이당류 및(또는) 당 알코올, 바람직하게는 0.3내지 0.8g의 글루코오스, 및 전체량 0.01내지 0.2g의 유리 아미노산을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
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