KR0158495B1

KR0158495B1 - 안트라퀴논을 사용한 메타노젠 박테리아의 메탄 생성 억제방법

Info

Publication number: KR0158495B1
Application number: KR1019950701534A
Authority: KR
Inventors: 제임스 마틴 오돔
Original assignee: 도날드 씨.폴; 바이오-테크니칼 리소시즈 엘피
Priority date: 1992-10-22
Filing date: 1993-10-20
Publication date: 1998-11-16
Also published as: EP0665775B1; JPH10229889A; US5648258A; CA2147647C; DE69313655D1; AU5404494A; MY115294A; EP0665775A1; NZ257443A; PL308485A1; ES2107056T3; CA2147647A1; JPH07509124A; DE69313655T2; CN1090707A; WO1994008738A1; AU669591B2; JP3126147B2; JP2912598B2

Abstract

본 발명은 안트라퀴논 화합물을 첨가하므로써 특히 매립식 쓰레기처리장(landfills) 및 반추동물의 전위(rumen) 내에서 메타노젠 박테리아의 메탄 생성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

안트라퀴논을 사용한 메타노젠 박테리의 메탄 생성 억제 방법

[발명의 분야]

본 발명은 메타노젠 박테리아(methanogenic bacteria)의 메탄 발생 억제제로서 안트라퀴논의 용도에 관한 것이다.

[발명의 배경]

메타노젠 박테리아의 메탄 생성의 조절은 몇가지 중요한 농경적 및 환경적 유용성을 갖는다. 오래전부터 소의 전위(rumen)에서의 메탄 생성의 조절은 소의 사료(feelstock)로부터 우유 생산 및 식용육 생산의 효율에 영향을 미치는 것으로 인식되어 있다. 또한, 주된 온실 효과 기체로서의 메탄의 조절에 대한 환경학적 관심이 재개되었다.

미생물에 의한 메탄 형성은 엄밀히 메타노젠 박테리아로 일반적으로 공지된 대사적으로 독특한 유기체 그룹에 의해 수행되는 혐기성 과정이다. 상기 유기체 그룹은 메타노코쿠스(Methanococcus) 속, 메타노박테리움(Methanobacterium) 속, 메타노사르시나(Methanosarcina) 속, 메타노브레비박터(Methanobrevibacter) 속, 메타노테르무스(Methanothermus) 속, 메타노트릭스(Methanothrix) 속, 메타노스피릴룸(Methanospirillum) 속, 메타노미크로비움(Methanomicrobium) 속, 메타노코코이데스(Methanococcoides) 속, 메타노제니움(Methanogenium) 속, 및 메타노플라누스(Methanoplanus) 속을 포함한다. 이들 박테리아는 반추동물의 전위, 흰개미의 장(gut), 매립식 쓰레기처리장(landfills), 고여 있는 연못, 혐기성 소화조(digestor) 및 논을 포함하는 엄밀한 혐기성 서식지에 널리 분포한다. 이들의 성장 온도 범위는 중온균 온도 내지 극도의 고온균 온도일 수 있다.

메타노젠은 생태학적으로 고도의 상호작용을 갖고, 이들의 생존에 필요한 기질을 생산하는 다른 박테리아의 대사활동에 크게 의존한다. 발효 박테리아는 셀룰로즈 또는 단백질과 같은 복합 거대분자를 수소, 이산화탄소, 아세트산 및 포름산의 4가지 주요 메탄노젠성 기질로 전환시키므로써 이들 기질을 제공한다. 이어서 메타노젠은 이들 발효 최종-생성물을 제거하고 이들을 메탄 가스 및 이산화탄소로 전환시킨다.

이러한 유형의 연관성의 통상적인 실례는 종간 수소 이동이라고 칭하는데, 여기서 수소-생성 유기체는 메타노젠을 위한 수소를 발생시키고, 이어서 메타노젠은 수소를 제거하여 실질적으로 수소 생산자에 대한 억제 효과를 갖는다. 이것은 자연의 먹이 연쇄에서 볼 수 있는데, 여기서 일차 박테리아는 셀룰로즈를 락테이트, 아세테이트, 지방산, 이산화탄소 및 수소를 포함하는 다양한 생성물로 전환시키고, 이어서 메타노젠은 수소 및 이산화탄소를 이용하여 메탄 및 물을 생성시킨다.

해수 또는 염수와 같이 셀페이트가 풍부한 물에서, 셀룰로즈는 설페이트 환원 박테리아(SRB)에 의해 이산화탄소 및 황화수소로 전환된다. 이들 박테리아는 메타노젠과 유사한 대사작용을 하며, 수소 및 셀페이트를 사용하여 황화수소를 생성할 수 있다. 설페이트 농도가 낮은 하수처리 설비 및 담수 늪에서는, SRB가 메타노젠과 공생관계로 들어가 유기산 및 알콜로부터 수소를 생성시킨다. 이어서 메타노젠은 수소를 메탄 및 이산화탄소로 전환시킨다.

메타노젠은 전형적으로 80%/20%(부피/부피)의 수소/이산화탄소하의 실험실내에서 성장하지만, 자연환경에서는 메타노젠 및 SRB는 단지 미량의 수소 및 이산화탄소에 노출되어 성장한다. 수소, 이산화탄소 및 아세테이트의 중간단계 수준은 매우 낮으나, 메타노젠 및 설페이트-환원군은 당, 유기산(즉, 락테이트, 지방산) 및 알콜의 발효로 방출되는 이들 기질상에서 성장할 수 있다.

메탄생성의 억제는 두가지 이상의 중요한 유용성을 가진다. 첫번째는 소 및 양과같은 반추동물에서 일어나는 전위 발효의 화학적 조작으로, 미생물의 전위 대사작용을 메탄 형성에서 휘발성 지방산 형성으로 전환시키는 것이다. 메탄은 반추동물의 전체 칼로리 섭취량의 5내지 10%의 칼로리 손실을 나타내므로, 반추동물이 그의 영양분으로서 사용하는 상기 에너지의 휘발성 지방산으로의 전환은 사료의 식용육으로의 전환 효율을 증가시킬 것이다. 메탄 형성과 휘발성 지방산인 프로피오네이트의 생성사이의 역관계는 많은 연구자들에 의해 밝혀졌으므로, 전위 영양물에 미치는 메탄 억제제의 긍정적인 효과가 기대된다(C. J. Van Nevel, D. I. Demeyer, Manipulation of rumen fermentation: The Rumen Microbial Ecosystem, P. N. Hobson, (ed) Elsevier Publishing Co.(1988)).

메탄 형성의 억제의 다른 중요한 적용은 주요 온실효화 기체 및 대기 오염물 생성의 감소일 것이다. 비록 메탄의 모든 온실 효과 오염물의 단지 0.4%를 차지할 뿐이지만, 지구 대기의 전체 온실 상승효과의 18%를 차지하며, 메탄의 연 증가율은 1%에 달한다. 환경내 메탄의 일차 공급원의 일부는 가축, 매립식 쓰레기처리장 및 벼농작지로부터 발생하며, 이들은 함께 전체 메탄 발생량의 40% 이상 및 인위적 메탄 발생량의 60% 이상을 차지한다. 벼농작지로부터 발생하는 메탄 발생량은 대기중에 생성된 전체 메탄의 약 20%를 차지하고, 매립식 쓰레기처리장에서 발생하는 메탄 발생량은 전체 발생량의 약 7%를 차지한다. 동물의 메탄 생성에 있어서는, 반추동물인 소가 가장 많은 메탄을 발생한다. 평균 젖소는 하루에 200ℓ의 메탄을 생성할 수 있다. 미합중국의 가축만도 일년에 5백만 톤이상의 메탄을 생성한다. 그러므로, 인간의 농업 및 산업적 활동은 지구 대기로 방출되는 전체 메탄에 크게 기여한다.

이전에는 주로 반추동물의 효율을 증가시키기 위해 사료의 첨가물로서 사용하기 위한 메타노젠 억제제를 개발하였다. 이러한 첨가제는 주로 두가지 부류로 구분된다. 제1그룹은 미생물 먹이연쇄내의 메타노젠 상부스트림 지점에서 탄소 또는 전자의 흐름을 방해하므로써 메탄 형성에 간접적으로 영향을 미치는 화합물이다. 제2그룹은 직접적으로 메타노젠에 영향을 미친다. 메탄생성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 것으로 공지된 화합물의 실례는 니트레이트와 같은 통상의 음이온에서 이온운반체 항생제(ionophore antibiotics)까지 다양하다. 특정 실례에는 모넨신(monensin), 라살로시드(lasalocid), 살리노마이신(salinomycin), 아보파르신(avoparcin), 아리드신(aridcin), 악타플라닌(actaplanin), 페니실린(penicillin), 염소 및 브롬 메탄 유사체, 장쇄 지방산, 설페이트 및 니트레이트가 있다. 보다 충분한 실례가 본 원에서 참고로 인용한 문헌[C. J. Van Nevel, D. I. Demeyer, Manipulation of rumen fermentation: The Rumen Microbial Ecosystem, P. N. Hobson, (ed) Elsevier Publishing Co. (1988)]에 수록되어 있다. 이들 화합물의 전부는 아니나 일부는 메탄 형성에 대한 특이성이 결여되어 있고, 일부는 동물의 전위에서 여러가지 부작용을 나타낸다.

반추동물의 메탄 형성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 것으로 특허청구된 다양한 화합물에 많은 특허권이 부여되었다. 그러나, 메탄 생성의 억제제로서 나트라퀴논을 사용하는 것을 개시하는 문헌은 없다고 생각된다.

안트라퀴논의 생물학적 활성은 다양하며, 이들 화합물의 유용성은 항균제, 단백질분해 효소 억제제 및 완하제와 같은 용도를 포함한다. 카시아 종(Cassia sp.)과 같은 식물 추룰 안트라퀴논의 항균 활성은 오래전에 밝혀졌다. 카시아의 활성 성분은 4,5-디하이드록시안트라퀴논-2-카복실산(안첼(Anchel), J. Biol. Chem., 177:169-177(1949))으로 규명되었다. 그러나, 기존의 문헌에서는 안트라퀴논의 일반적인 항균효과는 박테리아 종 및 수행되는 공정에 따라 산발적이며 예측불가능하게 나타난다고 기술하고 있다. 예를 들어, 바실루스(Bacillus) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 그램 양성 박테리아는 안트라퀴논에 민감하나, 에쉐리히아 종(Escherichia sp.) 또는 슈도모나스 종(Pseudo -monas sp.)과 같은 그램 음성 박테리아는 민감하지 않다는 연구 결과가 있다(카바나우(Kavanaugh), J. Bacteriol., 54: 761-767(1947)). 그러나, 다른 연구결과, 1,4,6,8-테트라하이드록시안트라퀴논은 바실루스의 모든 균주를 억제하지는 않으며, 노카르디아(Nocardia)(그램 양성)의 4가지 균주중에서 단지 한가지만에 대해서만 효과적임이 밝혀졌다. 상기 화합물은 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 종, 살모넬라 종(Salmonella sp.) 또는 사르시나 종(Sarcina sp.)에 상기 예시한 효과를 나타내지 않는다(Anke et al., Arch. Microbiol., 126:223-230(1980); Anke et al., Arch. Microbiol., 126:231-236(1980)). 1,8-디하이드록시안트라퀴논의 금속 킬레이트물은 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 활성을 나타내는 반면, 1,2-디하이드록시안트라퀴논 및 1-아미노-4-하디록시안트라퀴논은 일반적으로 이들 균주에 대해 비활성이다. 안트라퀴논 알로에-에모딘(aloe-emodin) 및 레인(Rhein)은 바실루스 섭틸리스 및 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 억제력이 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이와 관련된 안트라퀴논인 크리소파놀(Chrysophanol)은 이들 균주에 대한 억제력이 없다. 시험한 안트라퀴논중 어느 것도 이스트 칸디다(yeast Candida)를 억제하지 않았다(Fuzellier et al., Ann Pharm. Fr., 39(4)313-318(1981)). 디아미노안트라퀴논은 그램 양성 코쿠스에 대한 독성을 나타내지만 그램 음성 박테리아에 대해서는 나타내지 않음이 밝혀졌다(Haran et al., Isr. J. Med. Sci., 17(6):485-496(1981)). 이러한 결과는 안트라퀴논의 산발적이고 예측불가능한 항균 효과를 대표한다.

스위스연방 특허 제 614,466 호는 치환제 메틸, 하이드록시메틸, 카복실, 알데히드 또는 카복시에틸 그룹을 갖는 안트라퀴논이 조직 배양물중의 박테리아 성장을 억제하고, 진핵생물의 성장은 바람직하나 박테리아 성장은 바람직하지 않은 기타의 경우에서도 억제하는 것으로 공지되어 있음을 개시한다.

1,3,6,8-테트라하이드록시안트라퀴논은 장 벽의 신경근접합부를 자극함으로써 완하게 효과를 나타내는 것으로서 특허청구되었다(미합중국 특허 제5,039,707 호).

또한 안트라퀴논은 박테리아의 DNA 대사작용을 방해하고(안케 등, Arch, Microbiol., 126:231-236(1980)), ADP의 미토콘드리아로의 이동을 억제하는 것으로 밝혀졌다(부스(Boos) 등, FEBS Lett., 127:40-44(1981)). 독성 과산화물 라디칼을 생성하는 환원된 안트라퀴논과 산소의 화학반응은 또한 중요한 독성 메카니즘일 수 있다(쉐르바노비스키(Shcherbanoviskii) 등, Rastit. Resur., 11(3):445-454(1975)).

안트라퀴논의 특정 효소계에 대한 다방면의 억제효과가 보고 되었으나, 안트라퀴논의 전반적인 독성 결핍은 이들이 식물중에서 천연으로 생성되고, 의복용 건염 염료로서 널리 이용되고, 현재까지 완하제로서 이용되므로써 의해 지지된다. 안트라퀴논, 특히 하이드록실화된 안트라퀴논의 약학적 유용성은 이들의 약한 변이유발원임을 발견되므로써 감소되었다. 그러나 할로겐화된 안트라퀴논은 변이유발원이 아니다(브라운(Brown) 등, Mutation Research, 40:203-224(1976)).

미합중국 특허원 제 07/510,763 호는 다수의 안트라퀴논 유도체가 혐기성 설페이트-환원 박테리아의 호흡성 설페이트-환원을 억제한다고 개시한다. 또한, 이들 박테리아내의 다른 성장 모드는 영항을 받지 않으며, 에쉐리히아 콜라이 및 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.)과 같은 기타 박테리아 유형은 상기 바람직한 화합물에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 바람직한 나트라퀴논은 할로겐화된 유도체 뿐만아니라 하이드록실화된 유도체를 포함한다. 이들 화합물은 모든 실험실용 설페이트-환원 박테리아 균주에서의 설파이드 생성을 억제 할뿐만 아니라 다양한 자연 환경물로부터 불순한 설페이트-환원성 증균에서의 설파이드 생성을 억제한다.

요약하면, 안트라퀴논은 다양한 특정 생물학적 성질을 가지지만, 이들 화합물은 이전에 메탄생성 과정의 억제제로서 제시된 바가 없었다. 그러므로, 이들 화합물의 사용은 메타노젠 박테리아로부터 메탄 생성의 억제제로서의 요구를 충족시킨다. 상기 억제 효과는 일반적으로 비-독성이어야 하고, 존재하는 미생물 개체군의 자연 평형을 크게 혼란시킴이 없이 메탄 생성을 억제하는 능력을 가지는 것이 바람직히다.

[발명의 개요]

본 발명은 메타노젠 박테리아를 함유하는 배지를 안트라퀴논 화합물과 접촉시킴을 포함하는, 메타노젠 박테리아의 메탄 생성을 억제하는 방법을 제공한다. 메타노젠 박테리아 배지는 예컨대 다른 수소-생성 또는 아세테이트-생성 박테리아 균주를 포함하는 혼합된 박테리아 배양물일 수 있다. 박테리아 배지에 존재하는 수소의 수준은 바람직하게는 약 5 부피% 미만이고, 안트라퀴논 화합물은 배지중에 약 1㎎/1 이하의 농도로 존재한다.

안트라퀴논을 첨가함으로써 메타노젠 박테리아의 메탄 생성을 억제하는 방법은, 예를 들어 매립식 쓰레기처리장과 같은 지하 환경, 벼논 및 반추동물의 전위에서의 메탄 생성을 감소시키는 데 유용하다. 상기 억제 방법은 주요 온실효과 기체의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 반추동물에게 안트라퀴논 화합물을 공급함을 포함하는, 반추동믈의 휘발성 지방산의 생성을 증가시키는 방법을 제공한다.

[발명의 상세한 설명]

하기의 용어는 본 원에서 사용되며, 특허청구범위를 이해하는데 사용하기 위해 제공된다.

용어 안트라퀴논 화합물은 하기 구조식의 염기성 트리사이클 구조를 함유하는 나트라퀴논 화합물을 포함하고, 4개의 간단한 할로겐, 카복실, 하이드록실, 또는 아미노 치환체로 치환된 아트라퀴논 화합물을 포함하는 것으로 정의된다:

반응성 염료의 실례인 테트라사이클린 또는 설폰화된 안트라퀴논은 포함하지 않는다.

본 발명의 범주내에 포함되는 전형적인 화합물은 1,8-디하이드록시 안트라퀴논; 1-아미노안트라퀴논; 1-클로로안트라퀴논; 2-클로로안트라퀴논; 2-클로로-3-카복시안트라퀴논; 1-하이드록시안트라퀴논; 및 안트라퀴논을 포함한다.

용어 메타노젠 박테리아는 메탄을 생성할 수 있는 능력을 가진 박테리아를 의미하고; 메타토코쿠스, 메타노박테리움, 메타노사르시나, 메타노브레비박터, 메타노테르무스, 메타노트릭스, 메타노스피릴룸, 메타노미크로비움, 메타노코코이데스, 메타노제니움을 포함하나 이에 국한되지는 않는다.

용어 혐기성 소화조는 예를 들어 생활 폐기물을 메탄 및 이산화탄소로 혐기성 전환시키기 위한 장치를 의미한다. 본 원에서 참고로 인용한 레난드(Renand, P), 도체인(Dochain, D), 보스틴(Bostin, G), 나비유(Naveau, H), 나인스(Nyns, B-J)의 문헌 [Adaptive Control of Anaerobic Digestion Processes: A Pilot Scale Application, Biotechnol. Bioeng., 31:287: 294 (1988)]을 참조하라.

용어 혐기성 소화조 물질은 예컨대 본 원에서 사용한 미합중국 델라웨어 월밍톤 소재의 생활 폐기물 처리설비로부터 얻은 물질을 의미하고, 발효 클로스트리디움(clostridium), 메타노젠 박테리아 및 설페이트-환원 박테리아와 같은 미생물뿐만 아니라 대사가능한 유기물로 구성된다. 스위짼바움(M. S. Switzenbaum(Ed))의 문헌 [생활 및 공업 폐수의 혐기성 처리 기술(Anaerobic Treatment Technology for Municipal and Industrial Wastewater), Water Science and Technology, 제 24권, 8호, 1991]을 참조하라.

본 원에 사용된 용어 메타노젠 박테리아 배지는 메타노젠 박테리아의 성장을 가능하게 하는 임의의 배지를 의미한다. 구체적으로, 한정된 실험실용 배양물, 및 생활 폐기물 처리 소화조; 매립식 쓰레기처리장; 논; 반추동물의 전위; 정체된 담수 및 해수 연못; 또는 기타 천연 또는 인조의 혐기성 서식지에서 발견되는 혐기성 소화조 물질과 같은 메타노젠 박테리아의 성장을 허용하는 임의의 기타 인조 또는 천연 배지를 포함한다.

반추동물은 셀룰로즈를 휘발성 지방산으로 전화시키므로써 이것을 그의 영양분으로 유도하는 동물을 의미한다. 이와같은 전환은 전위(rumen)라고 칭하는 소화계의 특정 부위에서 일어난다. 문헌 [C. J. Van Nevel, D. I. Demeyer, Manipulation of rumen fermentation: The Rumen Microbial Ecosystem, P. N. Hobson, (ed) Elsevier Publishing Co. (1988)]을 참조하라.

본 발명의 한가지 실시태양은 5 부피% 미만의 일정한 양의 수소가 존재하는 조건하에서, 단일 배양물 또는 혼합된 배양물중에서 메타노젠 박테리아 배지를 안트라퀴논과 접촉시킴과 관련된다. 상기 조건하에서의 메탄 생성 수준은 안트라퀴논을 사용하지 않는 배양물과 비교하여 크게 감소되는 것으로 나타났다. 메타노젠 및 수소-생성 유기체의 실험실 균주를 포함하는 한정된 두가지 구성원의 박테리아 개체군의 구성은 또한 원하는 조건을 형성할 것이다. 혐기성 소화조와 같은 천연 공급원으로부터 얻은 메타노젠의 혼합된 증균 배양물은 또한 원하는 조건을 형성할 것이다. 혐기성 소화조 또는 전위 공급원으로부터의 혼합된 메타노젠 증균물은 미생물로 구성되는 이들 생태계와 가장 근접하게 유사하다.

메타노젠의 순수한 배양물은 미합중국 메리랜드 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)과 같은 임의의 국제적으로 공인된 미생물 기탁기관으로부터 쉽게 구입할 수 있다. 메타노젠의 순수한 균주의 실례는 ATCC 제 33274 호 해당하는 엠. 포르미시움(M.formicium)이다.

혐기성 소화조 물질의 전형적인 샘플은 혐기성 소화조를 이용하는 폐기물 처리공장으로부터 구입할 수 있다. 메타노젠은 통상적으로 나트륨 아세테이트와 함께 아르곤 또는 질소하의 80%/20% 부피비의 수소/이산화탄소를 포함하는 기상하에서 보조 배지중에 성장시키므로써 실험실에서 순수한 배양물로서 배양한다. 상기 성장 조건이 천연의 조건에 가장 근접한 것은 아니나, 최대 성장 속도 및 최대 세포 밀도를 생성시킨다. 이어서 상기의 높은 수소 수준이 유지되는 신속하게 성장하는 배양물 샘플을 신선한 배지로 이동시키고, 다양한 수소 농도에서 성장 시험을 수행할 수 있다. 배양물은 안트라퀴논이 효과적인 메탄 억제제로서 작용하기 위한 천연의 수소 농도만큼 낮은 수소 농도(5% 미만)에서 성장해야 한다고 밝혀졌다.

단일 또는 혼합된 배양물에서 생성되는 수소 및 메타의 농도는 당해분야에 공지된 표준 방법으로 측정되며, 포라팩 큐(Porapak Q) 컬럼 및 아르곤 이동 기체와 함께 열전도도 검출기를 사용하는 기체 크로마토그래피가 바람직하다. 수소 및 메탄 측정을 위한 다른 적합한 방법은 문헌 [타데세(Tadesse) 등의 J. Chromatogr., 171, 416, (1979) 및 헤이트(Heidt) 등의 J. Chromatogr., 69(1), 103, (1972)]에 기술되어 있다.

본 발명의 안트라퀴논 화합물은 예컨대 안트라퀴논을 보다 큰 전체 구조물중의 일부로서 함유하는 아드리아마이신으로 대표되는 안트라퀴논-유도된 항생체의 광범위한 그룹과는 구별된다. 본 발명의 안트라퀴논은 하기의 염기성 트리사이클 구조물을 포함하며, 이 구조물은 약 4개 이하의 간단한 할로겐, 카복실, 하이드록실, 또는 아미노 유도체로 추가로 치환될 수 있다;

효과적인 화합물의 전형적인 실례를 표 12에 수록하였다. 일반적으로, 안트라퀴논은 크게 반응성이지는 않으나, 가역적 산화-환원 반응을 수행한다.

본 원에서 바람직한 안트라퀴논은 9,10-디하이드로안트라퀴논, 1-아미노안트라퀴논, 1-클로로안트라퀴논, 2-클로로안트라퀴논, 2-클로로-3-카복시안트라퀴논, 1-하이드록시안트라퀴논 및 치환되지 않은 안트라퀴논을 포함하며; 여기서 치환되지 않은 안트라퀴논이 가장 바람직하다. 효과적인 억제제로서 밝혀진 안트라퀴논은 모두 쉽게 구입할 수 있는 시판 화학물질이고, 적합한 매질중에 용해시키는 것 이외의 다른 특별한 준비과정이 필요하지 않다.

안트라퀴논을 배양물에 공급하기 위한 몇가지 허용된 방법이 있다. 메탄생성을 억제하기 위해 박테리아 성장 배지에 아트라퀴논을 전달하기 위하여 미세하게 미분된 입자를 사용할 수 있다. 또한, 일부의 안트라퀴논은 용해시킬 수 있고 액체 형태로 첨가될 수 있다. 수성 현탁액 또는 수용액을 제조하기 위하여 물을 사용할 수 있고, 이들 현탁액 또는 용액은 본 발명의 생체내 적용을 위해 가장 바람직하다. 그러나, 에탄올, 메탄올, 디메틸 설폭사이드 및 아세톤과 같은 유기 용매를 또한 사용할 수 있다. 이들 용매는 실험적으로 편리하므로 시험관내 및 실험실 적용에 있어서 가장 바람직하다. 상기 유기 용매중에서 아세톤이 가장 바람직하다. 일단 적절한 용매중에 용해된 안트라키논은 메탄노젠 박테리아 배지에 직접 첨가될 수 있다.

안트라퀴논의 효과적인 최종 농도는 1 내지 5 ppm(중량/부피=㎎/1)의 범위이다. 일부의 안트라퀴논은 혐기성 소화조내에 존재하는 박테리아에 의해 분해되므로, 1 내지 5 ppm 범위의 안트라퀴논 농도를 유지하기 위해서는 상기 화합물(들)을 반복적으로 적용하는 것이 필요하다고 밝혀졌다.

가축, 특히 소 및 양과 같은 반추동물의 사료 이용 효율은 농업 분야에서 경제적으로 중요하다. 일찌기 반추동물의 메탄생성을 억제하는 화합물이 또한 사료 이용률에도 기여하는 것으로 알려져 있다.

반추동물의 사료 이용률을 증가시키는 방법의 개발을 촉진시키기 위해, 반추동물이 음식물, 특히 탄수화물을 소화시키고 분해시키는 생화학적 메카니즘이 널리 연구되었다. 탄수화물은 전위내에서 단당류로 분해되고, 이것은 피루베이트로 전환되고, 이어서 아세테이트 및 프로피오네이트로 전환되는 것으로 밝혀졌다. 연구결과, 특정 전위 미생물은 복합 탄수화물의 단당류를 포름산, 아세트산, 부티르산 및 석신산과 함께 이산화탄소 및 수소로 발효시킨다. 발효과정동안 생성된 이산화탄소 및 수소는 메타노젠 박테리아의 활동을 통해 메탄 형성에 사용된다. 총체적으로 휘발성 지방산(또는 VTFA)으로 공지된 이들 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트는 모두 반추동물의 에너지원으로 사용된다. 그러나, 피루베이트로부터 아세테이트로의 전환은 탄소원자 한개의 쇄-감소를 유발시키고, 이 하나의 탄소원자는 이산화탄소의 형태로 손실되며, 이어서 이것은 메탄 가스로 비가역적으로 전환된다. 프로피온산의 생성은 탄소원자의 손실보다는 이산화탄소의 도입을 유발하므로, 반추동물의 전위에서 탄수화물로부터 프로피오네이트를 생성하는 것은 아세테이트 및 부티레이트의 생성보다 에너지면에서 더욱 효율적인 분해 경로를 제공한다.

그 결과, 반추동물의 전위에서 VTFA 비율이 프로피온산이 증가된 비율로 이동하도록 처리하면 일정량의 음식물 소모에 대한 반추동물의 성장에 유리한 효과를 일으킨다. 따라서, 전위 발효의 효율을 증가시키므로써 이에 상응하는 성장 속도 및/또는 동물에 의한 사료 이용률의 증가가 일어난다(미합중국 특허 제 4,876,367 호 참조).

예를 들어, 사료 이용율 및/또는 성장속도는 바람직하게 프로피온산 대 아세트산의 몰비율을 증가시키거나, 또는 전위내의 전체 휘발성 지방산의 농도(즉, 아세트산, 프로피온산 및 부트르산의 합)를 증가시키므로써 개선될 수 있다. 이와 유사하게, 전위에서 메탄생성을 억제하면 트림을 통한 메탄 가스의 손실을 명백히 감소시키고, 성장에 보다 바람직한 지방산, 특히 프로피온산 및 부티르산을 생성하도록 한다는 것이 또한 공지되었다. 미합중국 특허 제 3,745,221 호; 제 3,615,649 호; 및 제 3,862,333 호를 참조하라.

그러므로, 본 발명의 다른 목적은 휘발성 지방산의 생성을 증가시키고 사료 이용률을 증가시키는 유리한 효과를 일으키는, 반추동물의 메탄생성을 억제하기 위한 화합물 및 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 안트라퀴논이 불순한 전위 박테리아 배양물과 접촉하였을때, 상기 안트라퀴논은 메탄 생성량을 감소시키고 휘발성 지방산 생성을 프로피오네이트가 많은 비율로 이동시킨다.

바람직한 실시태양에서, 누공형성된 거세된 숫소(fistulated steer)로부터 전위액을 추출하고 미생물의 대표적 개체군을 수득한다. 전형적으로, 전위액의 샘플을 치즈클로쓰(cheesecloth)를 통해 여과하고, 용출액을 수집한다. 치즈클로쓰에 남아있는 입상 물질을 생리 완충액에 재현탁시키고 용출액을 다시 여과시킨다. 세포 분리에 적합한 완충액은 쳉(Cheng)등의 문헌 [J. Dairy Sci. 38, 1225(1955)]에 기술되어 있다. 용출액을 저조시키고(pool) 입상 물질이 상부로 분리될때까지 방치한다. 이어서 등명한 층을 동일한 완충액으로 희석시키고, 배양하기 위해 pH 7.0으로 조절한다.

휘발성 지방산의 측량 방법은 당해분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 불꽃 이온화 검출기를 갖춘 HPLC 또는 기체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법이 바람직하다. 본 발명에 사용하기 적합한 방법은 문헌 [Jen et al., J. Chromatogr., 629(2), 394(1993) and Nakamachi et al. Kogyo Yosui, (394), 36, (1991)]에 기술되어 있다.

상기 언급한 바와 같이, 반추동물에서 바람직한 휘발성 지방산의 생성을 증가시키는 것으로 공지된 시판중인 화합물이 몇가지 있는데, 이중 가장 잘 알려진 것은 모넨신 및 2.2-디클로로아세트아미드이다(미합중국 특허 제 3,839,557 호 참조). 바람직한 휘발성 지방산의 생성에 미치는 안트라퀴논의 효과를 시험하기 위하여, 이들 화합물을 지방산 생성을 분석하는 시험에서 양성의 대조물로서 사용하였다.

전위의 화학 및 미생물학은 복잡하며, 많은 요소에 영향을 받고, 특히 섬유의 식이 섭취에 적잖이 영향을 받는다. 바람직한 휘발성 지방산의 생성은 섭취되는 음식물 성분에 영향을 받는 적당한 전위 미생물의 존재에 크게 의존한다. 예를 들어, 옥수수 및 당밀을 함유하고-섬유질 사료를 먹인 양은 자주개자리(alfalfa) 건초를 먹인 양에 비해 반추동물성 미생물 개체군이 크게 변동한다[매키(Mackie), J. Agric. Sci., 103(1), 37 (1984)]. 개질된 음식물이 메탄형성 및 VTFA 생성에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 평가하기 위하여, 누공형성된 거세된 숫소에게 자주개자리 건조, 또는 50% 자주개자리 및 50% 분쇄된 옥수수를 함유하는 50:50 사료 농축 음식물을 먹였다. 메탄 생성은 상기 두가지 음식물 조건하에서 모두 동등하게 잘 억제되었으나, 바람직한 VTFA 생성은 단지 50:50 사료 농축 음식물을 먹인 숫소에서만 상당히 증가하였다.

당해분야에 공지된 바와 같이, 암모니아 질소의 유리는 전위의 성분에 적용하는 경우 단백질 분해의 측정방법이며, 소화독소의 간접적인 측정방법이다. VTFA 생성을 분석하는 동안, 암모니아 질소의 유리는 페놀하이포클로라이트가 사용되는 개선된 열량측정 분석법을 이용하여 추적하며 630 nm의 파장에서 측정한다[시어시(Searcy) 등의 Clinica Chem. Acta., 12, 170 (1965)].

당해분야에서 효과적인 사료 첨가제이기 위해서는, 활성 화합물은 바람직한 휘발성 지방산 생성을 증가시키고 메탄생성을 억제할 수 있는 것뿐만 아니라 섬유질 소화 속도상에 억제 효과가 없어야 한다. 본 발명의 안트라퀴논이 소화 과정을 방해하는 효과가 있는지 여부를 평가하기 위하여, 누공형성된 동물의 소화속도를 내산성 섬유(ADF)의 소화속도를 측정하므로써 결정하였다.

ADF 분석의 통상적인 방법은 일반적으로 화학적 분해(불순한 섬유, AOAC의 공식 방법, 1975, 136), 또는 습윤제 처리(내중성 섬유/내산성 섬유, 반 소에스트(van Soest)와 와인(Wine, J.), AOAC, 1967, 50, 50), 또는 효소 분해(웨인스톡(Weinstock)과 벤함(Benham), J. Cereal Chem., 1951, 28, 490; 헬렌두른(Hellendoorn) 등, J. Sci, Food Agric., 1975, 26, 1461)에 의해 다른 성분들을 용해시키므로써 미리 처리된 ADF 샘플을 기본으로한다. 이어서 샘플을 유리 필터를 통해 여과시켜 식이성 섬유를 분리한다. 내산성 섬유를 사용한 소화 속도의 측정 방법은 당해분야에 공지되어 있다(예를 들어, 고에링(Goering) 등의 Forage Fiber Analysis. Agriculture Handbook #3, (1970), Agriculture Research Service, USDA, Washington, DC.)

본 발명의 중요한 몇가지 측면을 예시하고자 하기의 비제한적인 실시예를 제공한다. 혐기성 소화조를 갖는 슬러지(sludge) 및 소의 전위에는 통상적으로 높은 수준의 메타노젠이 존재하기 때문에, 이들 별개의 두 생태계를 선택하여 이들 시스템의 메탄 생성에 미치는 안트라퀴논의 영향을 설명하였다. 또한, 특성이 밝혀진 메타노젠 균주를 포함하는 박테리아의 한정된 혼합 배양물을 연구하였다. 기타 비메타노젠성 반응에 미치는 안트라퀴논의 영향 및 글루코즈의 수소로의 발효 및 젖산의 수소로의 발효의 특성을 밝혔으며, 글루코즈 또는 락테이트로부터 메탄으로의 메타노젠성 전환 및 수소와 함께 이산화탄소 또는 아세테이트로부터 메탄으로의 전환의 특성도 또한 밝혔다.

[실시예]

[실시예 1]

(방법론 및 성장 조건)

하기 조성의 한정된 무기질 배지를 기본 배지로 사용하고, 이 배지에 원하는 성장 조건에 따라 탄소 및 전자 공여체 및 전자 수용체를 첨가하였다. 이 기본 배지를 배지 BTZ-3으로 표시하고, 표 1에 정의하였다.

용액 1의 화학적 성분을 표 3에 수록하였다(HEPES는 N-[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산]이다. 레사주린(Resazurin)은 산화환원 지시약으로서 사용하나 배지의 필수 성분은 아니다).

BTZ-3 배지를 제조하기 위하여, 표 2의 성분들을 환저 플라스크에서 혼합하고, 아르곤 하에서 끓였다. 이어서 아르곤하에서 상기 고온의 배지에 40 ml의 환원제를 첨가하여 상기 배지를 환원시켰다. 상기 환원제는 나트륨 설파이드 무수물(2.5 g/200 ml) 및 시스테인 하이드로클로라이드(2.5 b/200 ml)와 함께 혼합된 0.2 N NaOH(200 ml 물중의 1.6 g)로 구성된다. 20 방울의 1M HCI을 첨가하고, pH를 6.8 내지 7.0으로 조절하였다. 이어서 상기 배지를 성장 튜브 또는 병에 분배하고 상기 성장 용기 및 배지 모두에 아르곤 기체를 계속 가하였다. 이어서 상기 배지를 115℃에서 20분동안 가압멸균시켰다.

아르곤 하에서 NaOH(0.2 N)를 끓이고, 냉각시키고 나트륨 설파이드를 첨가하여 상기 환원제를 제조하였다. 나트륨 설파이드가 용해된 후, 시스테인 하이드로클로라이드를 첨가하고 용해되도록 하였다. 이어서 환원제를 아르곤하에서 튜브당 10 ml씩 분배하고 115℃에서 20분동안 가압멸균시켰다.

명시한 경우에 BTZ-3의 개질물을 사용하였고, 이들은 통상적으로 하나 이상의 하기 성분들로 구성된다: 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 이스트 추출물(Difco Laboratories), 기상 수소/이산화탄소. 2-클로로-3-클로로안트라퀴논을 20 mM의 수용액으로서 첨가하는 것을 제외하고는 모든 안트라퀴논을 아세톤중의 1000 ppm 용액으로서 첨가하였다.

[실시예 2]

(혐기성 소화조 증균물 연구)

본 실시예는 혐기성 소화조 슬러지에서 발효, 및 락테이트(컬럼 A) 또는 글루코즈(컬럼 B)로부터 메탄으로의 혐기성 분해의 메타노젠성 단계에 미치는 안트라퀴논(AQ), 1,8-디하이드로안트라퀴논, 9,10-디하이드로안트라퀴논, 및 2-클로로안트라퀴논의 영향을 예시한다. 본 실시예는 하기 단계의 소화과정을 연구하였다;

(1) 글루코즈로부터 수소, 아세테이트 및 이산화탄소로의 발효.

(2) 락테이트로부터 수소, 아세테이트 및 이산화탄소로의 발효.

(3) 글루코즈로부터 수소, 아세테이트, 이산화탄소 및 메탄으로의 발효.

(4) 락테이트로부터 수소, 아세테이트, 이산화탄소 및 메탄으로의 발효.

혐기성 소화조 슬러지는 미합중국 델라웨어 윌밍튼 소재의 폐기물 처리설비로부터 구입하고, 이후의 실험을 위해 글루코즈 또는 락테이트 개질된 배지상에서 증균시켰다. 모든 배지를 0.05% 이스트 추출물로 개질시켰다. 24시간의 예비배양 기간 후, 예비배양물의 10% 접종물을 상기 개질된 배지로 이동시켜 실험을 개시하였다. 본 실시예에서 락테이트, 컬럼 A는 BTZ-3 성장 배지중의 30 mM 나트륨락테이트를 나타낸다. 글루코즈, 컬럼 B는 BTZ-3 성장 배지중의 10 mM 글루코즈를 나타낸다.

이어서 상기 배양물에 표 4에 수록한 4가지 상이한 농도의 1,8-디하이드록시안트라퀴논, 9,10-디하이드로안트라퀴논, 또는 2-클로로안트라퀴논을 첨가하고, 4시간동안 배양하였다. 배양물중에 시간당 생성된 수소 및 메탄은 포라팩 큐 컬럼 및 아르곤 이동기체를 사용하는 기체 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 열 전도도 검출기를 사용하였다. 결과를 표 3 내지 표5에 수록하였다.

상기 데이타는 2-클로로안트라퀴논, 1,8-디하이드록시안트라퀴논 또는 치환되지 않은 9,10-디하이드로안트라퀴논이 락테이트 또는 글루코즈로부터 수소로의 발효에 미치는 효과의 일반적인 결핍을 설명한다. 그러나, 락테이트 또는 글루코즈로부터의 메탄 발효는 상기 3가지 모든 안트라퀴논 17.5μM에 의해 거의 완전히 억제된다. 이것은 수소 또는 아세테이트가 (발효성 유기체에 의해) 형성되는 지점에서가 아닌, 수소 및 이산화탄소 또는 아세테이트로부터 (메타노젠 박테리아에 의해) 메탄이 형성되는 지점에서 억제가 일어남을 제시한다.

[실시예 3]

(메탄 억제 조건)

실시예 3의 목적은 배양물의 수소 농도를 변화시키면서 수소 및 이산화탄소 또는 아세테이트로부터 메탄의 형성에 미치는 2-클로로안트라퀴논의 효과를 시험하는 것이다.

H/CO(80/20 부피/부피) 하에서, 10 mM 나트륨 아세테이트가 공급되는 BTZ-3 배지내에서 혐기성 소화조 슬러지를 미리 배양시키므로써 혐기성 소화조 증균물내의 메탄 형성을 조사하였다. 이어서 상기 예비배양물의 일부를 신선한 배지(이것은 아세테이트 H/CO가 공급되지 않는다)로 옮겨 10% 부피/부피의 접종을 수행한다. 2-클로로안트라퀴논(AQ)을 표 6에 수록한 농도로 상기 시험 배양물에 가하고, 이 배양물을 0.5% 내지 80%의 수소농도에 접하도록 하였다. 배양물로부터의 메탄 형성의 초기 속도를 측정하였다가(기체 크로마토그래피, 포라팩 큐 컬럼, 아르곤 운반기체, 열전도도 검출). 결과를 하기 표 6에 수록하였다.

혐기성 소화조 증균물에서 아세테이트로부터의 메탄생성에 미치는 2-클로로안트라퀴논의 영향을 또한 조사하였다. 시험 배양물이 모두 30 mM의 나트륨 아세테이트를 함유하는 것을 제외하고는 상기 기술된 방법대로 수행하였다. 상기 배양물에 2-클로로안트라퀴논을 표 7에 수록한 다른 농도로 첨가하고, 메탄의 생성량을 상기 기술한 바대로 측정하였다. 결과를 하기 표 7에 수록하였다.

상기 데이타는 2-클로로안트라퀴논이 수소(표 6) 또는 아세테이트(표 7) 기질로부터의 메탄생성을 억제함을 나타낸다. 그러나, 메타노젠성 기질로서의 수소로는, 메탄 형성이 낮은 수소 농도(즉, 0.5%, 2%, 5%)에서만 억제되고, 40% 또는 80%의 수소농도에서는 억제되지 않았다. 이러한 억제는 낮은 농도의 AQ(3.5 μM 2-클로로안트라퀴논)에서도 명백하게 일어났다. 낮은 주변 수소농도는 혐기성 소화조 또는 소의 전위에서 전형적으로 발견된다(C. J. Van Nevel, D. I. Demeyer의 문헌 [Manipulation of rumen fermentation: The Rumen Microbial Ecosystem, P. N. Hobson, (ed) Elsevier Publishing Co. (1988)] 및 레난드, 도체인, 보스틴, 나비유, 나인스, B-J의 문헌 [Adaptive Control of Anaerobic Digestion Processes: A Pilot Scale Application, Biotechnol. Bioeng., 31:287: 294 (1988)].

자연에서 다른 중용한 메타노젠성 기질은 아세테이트이다. 아세테이트를 기질로서 사용하는 경우, 2-클로로안트라퀴논은 상기 표 7에 기술한 바와 같이 메탄 형성을 또한 억제하는 것으로 밝혀졌다.

[실시예 4]

(전위 메탄생성 연구)

실시예 4는 탄소 공급원으로서 자주개자리를 이용하는 메타노젠 박테리아에 의한 메탄형성에 미치는 2-클로로안트라퀴논의 영향을 전위 증균물로 수행하여 시험하였다.

신선한 전위액을 누공형성된 소(미합중국의 델라웨어 대학교의 동물학과 및 농생화학과에서 구입한, 전위 부분으로 외과적으로 이식된 시료 지점을 갖는 소)로부터 얻고, 2:3의 배지:전위액(부피비) 비율이 되도록 신선한 배지로 접종할때까지 약 40。C에서 유지시켰다. 상기 배지는 기본 무기질 배지 BTZ-3(실시예 1의 배지)에 더하여 0.38 g/1의 염화나트륨 및 2.63 g/1의 중탄산나트륨으로 구성된다. 메타노젠성 기질로서 미세하게 분쇄된 자주개자리 200 mg을 함유하는 130 ml 용량의 휘튼병(Wheaton bottle)에 상기 혼합물 20 ml를 분배하였다. 공급되는 기상은 질소/이산화탄소 80/20(부피비)이었다. 상기 배양물을 흔들면서 40。C에서 배양시켰다. 2-클로로안트라퀴논(AQ)을 표 8에 수록한 4가지 다른 농도로 첨가하고, 메탄, 수소, 아세테이트 및 프로피오네이트의 농도를 시간에 따라 측정하였다. 수소 및 메탄 농도는 기상의 간헐적인 샘플링으로 얻은 샘플의 기체 크로마토그래피(포라팩 큐 컬럼, 아르곤 운반기체, 열전도도 검출)에 의해 검출하였다. 아세테이트 및 프로피오네이트 농도는 액체 샘플링으로 얻은 샘플의 고압 액체 크로마토그래피(해밀톤 폴리포어 H 컬럼(Hamilton Polypore H coulmn), 이동상으로서 0.013 M 황산 사용)에 의해 검출하였다. 21 시간 지점에 대한 결과를 하기 표 8에 수록하였다.

상기 데이타는 2-클로로앝트라퀴논의 0 내지 20μM의 범위에 대한 한계 효과만을 설명하였다. 수소 수준의 약 8배 증가 및 아세테이트 및 프로피오네이트 수준의 약간의 감소가 나타났다. H의 증가는 메탄 생성이 개시된 것을 매우 민감하게 나타내는 것이다. 전자는 CO가 메탄으로 환원되는데 사용되기 보다는 H생성으로 전환된다. 상기 기술된 성장 조건하에서 대조물을 부차배양시키므로써 2-클로로안트라퀴논 40 μM에서 상기 실험을 반복하였다. 배양물당 200 mg의 자주개자리를 다시 첨가하고, 이 배양물을 40℃에서 24시간동안 배양하였다. 이 실험에 대한 데이타를 표 9에 수록하였다.

40μM(10 ppm)의 2-클로로안트라퀴논에서의 데이타는 이용된 수소가 누적되는 동안 메탄 형성이 기대한 바와 같이 억제되었음을 명확히 설명한다. 약간의 아세테이트 형성의 증가 및 약간의 프로피오네이트 형성의 감소가 있었다.

[실시예 5]

(한정된 혼합 배양물 연구)

실시예 5는 설페이트-환원 박테리아인 데설포비브리오 데설푸리칸스(Desulfovibrio desulfuricans) WADS (WADS는 공급원으로서, 델라웨어 윌밍톤 소재의 혐기성 소화조를 의미한다) 및 메타노젠인 메타노박테리움 포르미시움(Methanobacterium formicium)으로 구성되는 한정된 혼합 배양물에 의한 메탄 생성에 미치는 동량의 1- 및 2-클로로안트로퀴논의 효과를 시험하였다. 본 실시예에서, 두 박테리아는 락테이트가 탄소 공급원으로서 작용하는 배양물중에 존재한다. 안트라퀴논이 설페이트 환원의 결과로 성장하는 설페이트 환원 박테리아를 억제하는 것으로 공지되어 있으나, 설페이트 환원에 의해서가 아닌 락테이트의 수소로서의 발효에 의해서 성장하는 데설포비브리오 데설푸리칸 WADS에 대해서는 클로로안트라퀴논이 효과가 있다. 이 배양물에서, 메타노박테리움 포르미시움은 디. 데설푸리카에 의해 생성된 수소 및 이산화탄소상에서 성장하여 메탄을 생성한다.

락테이트는 데설포비브리오 데설푸리칸에 의한 대사작용의 결과로 하기의 전환을 수행하고:

2 락테이트- 2 아세테이트 + 4 수소 + 1 이산화탄소

생성된 수소는 하기 도식에 따라 메타노박테리움 포르미시움에 의해 메탄 및 물로 전환된다:

4 수소 + 1 이산화탄소 - 1 메탄 + 2 물

상기 배양물에 표 10에 나타낸 아세톤중의 3가지 다른 농도의 안트라퀴논 혼합물 용액을 가하고, 배양물에 의해 생성된 수소 및 메탄의 수준을 일 간격으로 측정하였다. 결과를 표 10에 나타냈다.

대조 배양물(안트라퀴논 없음)에서, 설페이트-환원균에 의해 생성된 수소는 0 시간에서 매우 신속하게 나타나며, 메타노젠의 의해 메탄으로 전환될때 사라졌다. 이러한 신속한 수소 생성은 안트라퀴논으로 처리된 배양물을 함유하는 모든 배양물에서 일어난다. 0.05 ppm AQ에서 메타노젠에 의한 수소의 메탄으로의 전환은 약간 지연되고, 수소 수준은 모든 배양물내에서 높게 유지되며 0.2 ppm을 포함한다. 또한 메탄 생성이 안트라퀴논의 증가와 함께 증진적으로 억제되는 것으로 나타나고; 0.2 ppm AQ 수준에서 메탄의 생성은 거의 완전히 감소된다.

[실시예 6]

(상이한 안트라퀴논의 효과)

실시예 6은 전자 및 탄소 공급원으로서 락테이트가 제공된 혐기성 소화조 슬러지의 메탄생성에 미치는 상이한 안트라퀴논의 효과를 연구하였다.

혐기성 소화조 증균물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 30 mM의 나트륨 락테이트를 함유하는 BTZ-3 배지로 제조하였다. 약 20 mM의 농도로 아세톤중의 안트라퀴논 용액을 첨가하고, 메탄 수준을 이전에 기술한 바와 같이 표시된 시간에 따라 측정하였다. 결과를 표 11에 나타냈다.

상기 데이타로부터, 치환되지 않은 안트라퀴논을 포함하는 임의의 안트라퀴논 유도체의 첨가는 메탄 형성을 억제하는 것을 알 수 있다. 2-클로로-3-카복시 안트라퀴논은 가장 약한 억제제이다. 상기 데이타는 염기성 트리사이클 환 구조물이 억제에 필수적인 성분임을 제시하고, 이와 함께 예컨대 클로로-, 하이드록시-, 또는 아미노치환제들은 이러한 활성을 증가시키거나 파괴하진 않는다고 제시한다.

[실시예 7]

(100% 자주개자리 건초 사료를 먹인 거세된 숫소로부터 분리한 전위 미생물로부터의 메탄 생성 및 휘발성 지방산 수준에 미치는 안트라퀴논 화합물의 영향)

미생물의 분리:

실질적으로 실시예 4에 기술된 바와 같이 전위 미생물을 분리하였다. 간단히, 100% 자주개자리 건초(100% 사료)로 구성되는 음식물을 먹인 누공형성된 거세된 숫소로부터 혼합 전위 미생물의 배치(batch) 배양물을 형성하였다. 시험관내 음식물을 1 mm 메쉬 스크린을 통해 분쇄하고, 30 ml 배양액(15 ml의 전위액 및 15 ml의 표준 전위 완충액)중의 0.375 g의 속도로 사용하였다. 표준 전위완충액은 당해분야에 공지되어 있으며, 적합한 실례는 고에링(Goering) 등의 문헌 [Forage Fiber Analysis. Agriculture Handbook #3, (1970), Agriculture Research Service, USDA, Washington, DC.]에 기술되어 있다. 먹인지 3시간후에 전위액을 수집하고, 치즈클로쓰 4 개층을 통해 여과하고, 혐기성 조건하에서 입자-결합된 미생물을 회수하기 위해 처리하였다.

(안트라퀴논의 제조 및 대조 화합물:)

시험 화합물은 9,10-안트라퀴논, 2-클로로안트라퀴논 및 2-클로로-3-카복시안트라퀴논을 포함한다. 모넨신(미합중구 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니) 및 2,2-디클로로아세트아미드(미합중국 위스콘신 밀워키 소재의 알드리치 케미칼 캄파니)는 메탄 억제를 위한 사료첨가제 및 양성 대조물로서 사용하기 위해 시판되는 2가지 화합물이다. 모든 화합물은 에탄올에 용해하였으며, 0.25 ml의 용액이 원하는 농도가 되도록 적절히 희석하였다(배양액내의 ppm 단위). 대조 배양물은 0.25 ml의 에탄올만을 갖는다. 이전 연구로부터의 데이타(나타내지 않음)는 이러한 수준의 에탄올이 전위 발효에 최소한의 영향을 미치는 것으로 나타냈다.

배양조건:

40℃로 유지되는 50 ml 용량의 혈청 병내에서 혐기성 조건하에서 배양하였다. 각 화합물의 각 투여량에 대해서 3가지 배양 복제물을 제조하고, 전형적으로는 24 시간동안 배양하였다.

기상 및 휘발성 지방산 수준의 측정:

24시간 배양 후, 전체 기체 생성량을 전위(displacement)에 의해 측정하고, 이후의 분석을 위한 기체 샘플을 취하였다. pH를 즉시 측정하고, 5 ml의 발효액에 1 ml의 25% m-인산을 첨가하였다. 산성화시킨 유체를 시어시(Searcy) 등의 문헌 [Clinica Chem. Acta., 12, 170, (1965)]에 기술된 바와 같은 개선된 페놀하이포클로라이트 방법을 사용하여 암모니아 질소에 대해 분석하고, 630 nm에서 측정하였다.

휘발성 지방산을 10 m, 530 ㎛ 마크로보어 카보왁스 M 컬럼(macrobore Carbowas M column)(미합중국 펜실바니아 벨레폰트 소재의 수펠코 인코포레이티드(Supelco Inc.))을 사용하는 기체 크로마토그래피(미합중국 펜실바니아 애본데일의 휴렛-팩커드 모델 589)에 의해 측정하였다. 이동 기체로서 10 ml/분의 유속의 헬륨을 사용하였다. 샘플 1㎕를 8:1 분할비로 주입하였다. 주입 포트의 온도는 200℃이고, 검출기 온도는 250℃이었다. 오븐 온도는 1분동안 0℃, 1 분당 5℃씩 증가시켜 100℃로, 1 분당 45℃로 증가시켜 170℃가 되도록 프로그램한 후 이 온도를 5분동안 유지시켰다. 측정된 휘발성 지방산(VTFA)은 아세트산(C2), 프로피온산(C3), 이소부티르산(Ci), 이소발레르산(Ci), 및 발레르산(C5)을 포함한다.

기상을 간헐적으로 샘플링하여 메탄 및 수소를 기체 크로마토그래피(포라캑 큐 컬럼, 아르곤 이동기체, 열전도도 검출)에 의해 분석하였다. 초기 오븐 온도는 1 분동안 90℃이고 이어서 190℃가 될때까지 1 분당 30℃로 증가시킨 후, 이 온도를 6분동안 유지시켰다. 이동기체로서 11 mV/분의 유속을 갖는 아르곤을 사용하였다.

기체 및 VTFA 생성에 미치는 안트라퀴논의 효과:

표 12는 사료를 먹이고, 다양한 안트라퀴논 화합물, 모넨신 및 2,2-디클로로아세트아미드로 처리한 누공형성된 거세된 숫소로부터 분리한 전위 미생물로부터 수집한 데이타를 나타낸다.

표 12는 9,10-안트라퀴논, 2-클로로안트라퀴논 및 2-클로로-3-카복시안트라퀴논 모두가 메탄 형성을 억제하며, 카복실화된 유도체가 최소한의 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 5 ppm 수준의 9,10-안트라퀴논을 제외하고는, 수소 형성에 미치는 효과가 거의 없다. 아세테이트 형성은 9,10-안트라퀴논 및 2-클로로안트라퀴논에 의해 억제된다. 프로피오네이트 및 부틸레이트 수준에 있어서 단지 약간의 상승만이 관찰되었다. 시판되는 메탄 억제제(및 프로피오네이트-증가제)인 모넨신은 0.5 ppm에서 메탄 형성을 억제하지만, 지방산에 대해서는 이 농도에서 한계 효과만을 가졌다. 전위 첨가제인 2,2-디클로로아세트아미드에 대해서도 동일한 결과가 관찰되었다. 처리되지 않은 대조물에 비해 대부분의 처리된 배양물에서 전체 휘발성 지방산 생성량이 매우 약간 억제되는 거승로 나타났다.

본 실시예에 나타낸 데이타는, 사료(자주개자리 건초)를 먹인 경우 0.5 내지 5 ppm 수준의 3가지 안트라퀴논에 있어서 메탄 형성을 제한적으로 억제하고, 치환되지 않은 안트라퀴논 및 2-클로로안트라퀴논의 경우는 최대한으로 억제한다고 설명한다. 안트라퀴논에 의한 메탄 억제는 모넨신 또는 2,2-디클로로아세트아미드보다 우수한 것으로 나타났다. 상기 시험 화합물은 모두 휘발성 지방산에 크게 영향을 미치지 않았다. 배양물중의 유리 암모니아 질소의 측정 수준에서 알수 있는 바와 같이, 안트라퀴논 또는 기타 시험 화합물이 단백질분해에 미치는 어떠한 역효과도 나타나지 않았다.

[실시예 8]

(50:50 농축 사료를 먹인 거세된 숫소로부터 분리한 전위 미생물의 메탄 생성 및 휘발성 지방산 수준에 미치는 안트라퀴논 화합물의 영향)

실시예 7에 기술된 바와 같이 미생물을 분리하였으나, 본 실시예에서는 전위 미생물을 50%의 자주개자리 및 50%의 분쇄된 옥수수로 구성된 50:50 농축 사료를 포함하는 음식물을 먹인 누공형성된 거세된 숫소로부터 분리하였다. 화합물의 제조, 배양, 및 기체 및 VTFA 측정은 실시예 7에 기술한 바대로 수행하였다. 기체 및 VTFA 생성에 미치는 안트라퀴논의 효과를 설명하는 데이타를 표 13에 나타냈다.

표 13은 건초:배합사료(feedlot) 농축 사료의 50:50 혼합물의 발효에 미치는 안트라퀴논, 모넨신 및 2,2-디클로로아세트아미드의 효과를 나타낸다. 이러한 음식물은 전위 첨가제의 실제 적용에서 사용되는 것과 보다 더욱 유사하다. 시험 화합물 0.5 ppm 수준에서도 메탄은 분명히 억제되지만, 카복실화된 안트라퀴논은 메탄 형성에 단지 최소한의 효과만을 나타낼 뿐이다. 실시예 7에 나타낸 100% 자주개자리 배양물과는 대조적으로, 9,10-안트라퀴논 또는 2-클로로안트라퀴논으로 처리된 배양물에서는 다량의 수소 축적이 관찰되었다. 휘발성 지방산, 특히 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트는 분명히 영향을 받았다. 아세테이트 형성은 억제된 반면, 프로피오네이트 및 부티레이트 형성은 증가되었다. 이러한 증가는 반추동물의 대사작용에 유리하고 성장 효율을 증가시킬 수 있다. 본 실시예에서는 암모니아 질소를 측정하지 않았다. 배양물이 과량의 수소 생성에 오랜기간동안 적응하는 경우, 이론적으로는 프로피오네이트 및 부티레이트 형성이 증가해야 하는데, 이것은 이들 화합물의 형성은 종종 수소 기체 형태의 환원제를 필요로 하기 때문이다.

[실시예 9]

(섬유질 소화에 미치는 안트라퀴논의 영향)

실험 화합물이 섬유질 소화를 방해하지 않는다는 것은 중요하다. 따라서, 9,10-안트라퀴논, 2-클로로안트라퀴논, 2-클로로-3-카복시안트라퀴논, 모넨신 및 2,2-디클로로아세트아미드가 100% 자주개자리로 구성되는 사료의 섬유질 소화에 미치는 효과를 시험하였다.

배양 후 24 시간후에, 사료 잔류물의 내산성 섬유(ADF) 함량을 분석하여 섬유질 소화 정도를 측정하였다. ADF의 소화 정도는 음식물중의 ADF의 초기양에서 ADF의 잔류량을 빼므로서 계산하였다. ADF 소화정도의 계산방법은 당해분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 고에링 등의 문헌 [Forage Fiber Analysis. Agriculture Handbook #3, (1970), Agriculture Research Service, USDA, Washington, DC.)]에 기술되어 있다.

표 14에 나타낸 바와 같이, 소화%는 처리된 배양물 대부분에서 약간 낮아졌다. 그러나, 임의의 안트라퀴논과 복용량-반응성 사이의 분명한 관계성은 없다. 그러므로, 안트라퀴논은 섬유질 소화에 중요한 영향을 나타내지 않는 것으로 결론지을 수 있다. 대조 화합물은 관심 화합물을 용해시키는데 사용하는 용매 자체였다.

Claims

반추동물의 전위(rumen)내의 배지를 아트라퀴논 화합물과 접촉시킴을 포함하는, 반추동물의 전위내의 메타노젠 박테리아(methanogenic bacteria)에 의한 메탄 생성을 억제하는 방법.
제1항에 있어서, 안트라퀴논 화합물이 배지중에 약 1 mg/L 이하의 농도로 존재하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 안트라퀴논 화합물이 치환되지 않은 안트라퀴논, 1-아미노안트라퀴논, 1-클로로안트라퀴논, 2-클로로-3-카복시안트라퀴논, 1-하이드록시안트라퀴논, 9,10-디하이드로안트라퀴논으로 구성되는 그룹으로서 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 반추동물이 소인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 메타노젠 박테리아가 메타노코쿠스(Methanococcus), 메타노박테리움(Methanobacterium), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노브레비막터(Methanobrevibacter), 메타노테르부스(Methanothermus), 메타노트릭스(Methanothrix), 메타노스피릴룸(Methanospirillum), 메타노미크로비움(Methanomicrobium), 메타노코코이데스(Methanococcoides), 메타노제니움(Methanogenium), 및 메타노플라누스(Methanoplanus)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
제5항에 있어서, 안트라퀴논 화합물이 치환되지 않은 안트라퀴논, 1-아미노안트라퀴논, 1-클로로안트라퀴논, 2-클로로-3-카복시안트라퀴논, 1-하이드록시안트라퀴논, 9,10-디하이드로안트라퀴논으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
반추동물의 전위에 안트라퀴논 화합물을 도입하므로써 반추동물의 메탄생성을 억제하는 방법.
제7항에 있어서, 도입되는 안트라퀴논 화합물의 양이 전위내에 1 mg/L 이하의 농도를 생성하기에 충분한 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 안트라퀴논 화합무링 치환되지 않은 안트라퀴논, 1-아미노안트라퀴논, 1-클로로안트라퀴논, 2-클로로-3-카복시안트라퀴논, 1-하이드록시안트라퀴논, 9,10-디하이드로안트라퀴논으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
제9항에 있어서, 메타노젠 박테리아가 메타노코쿠스, 메타노박테리움, 메타노사르시나, 메타노브레비박터, 메타노테르무스, 메타노트릭스, 메타노스피릴룸, 메타노미크로비움, 메타노코코이데스, 메타노제니움, 및 메타노플라누스로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
제10항에 있어서, 반추동물이 소인 방법.