KR0156226B1

KR0156226B1 - 캐노데옥시콜린산의 유도체를 함유하는 혈관형성 억제제

Info

Publication number: KR0156226B1
Application number: KR1019950009439A
Authority: KR
Inventors: 김규원; 서홍석; 이호영; 김태형; 허회경
Original assignee: 서홍석; 김규원; 서치영; 주식회사대웅제약
Priority date: 1995-04-21
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 1998-11-16
Also published as: KR960037049A

Abstract

본 발명의 하기 일반식들로 표시되는 케노데옥시콜린산 유도체의 1종을 유효성분으로서, 혈관 형성 억제에 유효한 양으로 함유하는 혈관 형성 억제제를 제공한다.

(상기 식중에서,

Me는 메틸기, Et는 에틸기, Bn는 벤질기, OBz는 벤조일기, TBSO는 t-부틸디메틸실릴릭옥사이드이며 iPr은 이소프로필기이다)

Description

케노데옥시콜린산의 유도체를 함유하는 혈관형성 억제제

본 발명은 케노데옥시콜린산(chenodeoxycholic acid : 이하 CDCA로 약함)의 유도체를 함유하는 혈관형성 억제제에 관한 것이다.

정상적인 조직에 있어서는, 세포성장과 DNA 합성은 양성적인(positive) 그리고 또한 음성적인(negative) 차원으로 작용하는 각종의 조절인자(regulatory factors)에 의해 면밀하게 조절된다. 정상세포가 충실성 종양(solid tumor)으로 발전함에 따라 이 세포는 여러 변화를 겪는다. 생리적인 차원에서는 성장이 자극되고, 면역성이 감소되며, 새로운 혈관형성이 유도된다. 새로운 혈관을 유도하는 이러한 능력, 즉 맥관형성(angiogenesis) 및 신혈관생성작용(neovascularization)은 대부분의 악성세포의 특징이며 충실성 종양이 성장을 위해 필수적인 요구사항이다. 더욱이, 종양에 침투하는 새로운 혈관은 대부분 조양세포가 순환계로 들어가는 부위를 형성한다. 맥관형성은 또한 전이성 콜로니의 확장을 위해서도 필요하다. 악성세포의 성장이외에도 다른 질병들도 신혈관성 녹내장, 당뇨병성 망막증 및 류마티스 관절염을 비롯한 비정상적인 혈관신생작용의 특징을 갖는다.

따라서, 혈관형성을 억제하는 물질은 상기한 혈관형성과 관련된 각종 질병의 효과적인 예방 및/또는 치료를 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

콜린산 및 CDCA의 여러 생리활성을 연구하여 그들의 효과적인 암세포분화 유도능을 확인한 바 이는 본 발명자들은 계속된 연구에서 CDCA의 여러 가지 유도체를 합성하고, 이들중 혈관형성 억제능을 갖는 후술하는 화합물들(각각 TK-042, TK-046, TK-082, TK-104, TK-105, TK-114, TK-097, TK-074로 명명)을 스크리닝하여 본 발명을 완성하게 되었다.

CDCA는 콜레스테롤의 분해산물로서 24개의 탄소원자로 구성되며, A, B고리는 시스 형태로 결합된다. 18, 19위치에 베타형 메틸기를, 그리고 3, 7번 위치에 알파형 알코올기를 갖고 있다.

본 발명의 목적은 적어도 1종의 하기의 케노데옥시콜린산 유도체를 혈관형성을 억제하기에 유효한 양으로 함유하는 혈관형성 억제제를 제공하는 것이다.

(상기 식중에서,

Me는 메틸기, Et는 에틸기, Bn은 벤질기, OBz는 벤조일기, TBSO는 t-부틸디메틸실릴릭옥사이드이며 iPr은 이소프로필기이다)

본 발명의 다른 목적 및 적용은 하기 발명의 상세한 설명란으로부터 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 화합물을 제조하는 것은 하기의 케노데옥시콜린산(1)으로부터 출발하여 다음에 나타내는 반응경로에 따라 수행할 수 있으며, 구체적인 반응조건은 각 실시예에 나타내었다.

본 발명에 따른 화합물들은 효과적인 혈관 형성 억제 작용을 나타내기 때문에, 혈관형성과 관련되 제 질병의 예방 및/또는 치료의 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 혈관형성 억제제는 각종의 투여 경로를 통하여 혈관형성을 억제하기 위하여 혈관형성을 억제하는데 유효한 양으로 투여될 수 있으며, 그의 제형, 투여량 등은 투여목적, 투여경로 및 투여대상의 상태 및 체중 등을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.

바람직하게는, 혈관형성 억제제 조성물은 상기한 각종 케노데옥시콜린산 유도체 중 1종과 제약학적으로 허용되는 담체를 함께 함유한다. 제약학적으로 허용되는 담체에는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 표준의 제약학적 담체를 어느 것이든 포함된다. 전형적으로 이러한 담체는 전분, 밀크, 당, 특정종류의 클레이, 젤라틴, 스텐신산, 탈크, 식물성 기름 또는 오일, 검, 글리콜류 등의 부형제, 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함한다. 이러한 담체에는 또한 풍미제 및 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다.

이러한 담체를 함유하는 조성물은 주지된 방법에 의해 제형화할 수 있다. 그러나, 혈관의 형성을 억제하기에 유효한 양의 우르소데옥시콜린산 유도체를 함유하는 조성물은 이전에는 알려진 적이 없다.

본 발명의 방법에 있어서, 우르소데옥시콜린산 유도체-함유 조성물은 주지된 방법, 예을 들면 경구, 정맥내, 근육내, 경피 투여 등의 방법에 의해 투여할 수 있지만, 이들 방법에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명을 실시함에 있어서, 조성물에 함유되는 케노데옥시콜린산 유도체의 양은 매우 광범위하다. 혈관 형성을 억제하는데 유효한 양은 0.01㎎-1g 우르소데옥시콜린산 유도체이다. 제제의 정확한 양 및 투여횟수는 제제의 특성, 투여 대상의 체중 및 상태, 종양의 크기, 투여경로 및 횟수, 그리고 사용하고자 하는 특정 유도체의 특성에 따라 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 영문약자는 다음과 같은 의미를 갖는다.

본 발명에 따른 물질의 동정은 람버트 등의 방법(Lambert et al., Organic Structural Analysis, MacMillan Publ. Co., NY 1993)에 따라 NMR(베리언사 제품, 200MHz)를 사용하여 행하였다.

[실시예 1]

본 발명에 있어서 케노데옥시콜린산 유도체의 혈관형성 억제능은 CAM분석법(Crum et al., Science, 230, 1375, 1985)을 이용하여 측정하였다. 아베에이카계 옥용계의 수정난을 구입하여 45시간동안 18℃로 유지하고, 습도 60%로 유지되는 37℃ 배양기에 옮겼다. 이를 0일배로 기준삼았다. 2일배가 되면 계란의 끝부분에 구멍을 내어 주사기로 알부민을 2㎖ 뽑아냈다. 3일배에 계란의 공기주머니쪽을 요오드팅크(Iodine Tincture)로 소독하고, 메스로 지름 3㎝ 크기의 원형 창문을 만들고, 일반 접착테이프(스카치사 제룸)로 봉하였다. Termanox 13㎜ 디스크에 화합물을 각각 1㎎씩 도포하고, 40분간 방치하여 건조시켰다. 4,5일배 계란의 유리테이프를 떼어내고, 건조시킨 thermanox disk를 얹어놓은 후 다시 유리테이프로 창문을 봉하였다.

배양기에서 2일 더 배양한 후, 10% 유화물(녹십자사 제품, 상품명 Intralipid)을 CAM 막 안쪽에 주입하여 유화물로 채워진 CAM을 사진촬영하고, 혈관형성 억제양을 관찰하였다.

혈관형성 억제 여부는 혈관 형성이 안된 부분이 직경 3㎜ 이상이면 혈관형성 억제능을 갖는 것으로 간주하였으며, 아무런 처리를 행하지 않은 경우에 형성된 혈관의 크기를 기준으로 하여 상대적으로 혈관 형성이 안된 비율을 측정하여 혈관형성 억제량으로 평가하였다.

혈관형성 억제활성이 75%인 CDCA(1)를 Mel과 DBU로 처리하여 얻은 메틸에스테르(TK-046)의 활성은 80%이었다.

TK-046를 TBSCI과 이미다졸을 처리하여 얻은 3번 위치에 TBS화된 에테르(TK-103)의 활성은 17%이었다.

TK-103를 Mel와 NaH로 처리하여 메틸 에테르(TK-104)로 전환하고, TBAF로 처리하여 알코올(TK-105)로 전환시키고, NaOH로 처리하여 카르복실산(TK-114)를 얻었다. TK-104, TK-105, TK-114의 활성은 각각 0%, 80%, 60%이었다.

CDCA(1)을 EtBr과 DBU로 처리하여 얻은 에틸 에스테르(TK-042)의 활성은 68%이었다.

CDCA(1)을 EtBr과 DBU로 처리하여 얻은 프로필 에스테르(TK-097)의 활성은 50%이었다. CDCA(1)을 염화벤질과 DBU로 처리하여 얻은 벤질 에스테르(TK-074)의 활성은 0%이었다. TK-074를 벤조일화(TK-082)하였을 때, 활성은 57%이었다.

[실시예 2]

(상기 식중에서, Et는 에틸기이다)

CDCA 2.00g(0.0051M)과 DBU 1.4㎖(0.01M)를 DMF 10㎖에 용해시키고, 브로모에틸 1.5㎖(0.02M)을 가한 후 상온에서 1.5시간동안 교반하였다. 물로 세척하고 초산에틸 100㎖로 3번 추출하여 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 감압농축하였다.

용리제로 초산에틸 : n-헥산 : 디클로로메탈(7 : 4 : 1)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피하여 목적물질 1.9g을 얻었다. 이때 Rf는 0.33이며, 최종수율은 92%이었다. CDC¹³와 TMS에 녹여 C¹³NMR로 측정한 결과는 다음과 같다.

CAM 분석법에 의한 혈관형성억제능은 68%이었다.

[실시예 3]

(상기 식중에서, Me는 메틸기이다)

CDCA 1.00g(0.0025M)과 DBU 0.7㎖(0.005M)를 DMF 7㎖에 용해시키고, 요오드메틸 1.4g(0.01M)을 가한 후 상온에서 3시간동안 교반하였다. 물로 세척하고, 초산에틸 50㎖로 3번 추출하여 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 감압농축하였다.

용리제로 초산에틸 : n-헥산(4.5 : 2.5)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피하여 목적물질 0.97g을 얻었다. 이때 Rf는 0.25이며, 최종수율은 96%이었다.

CAM 분석법에 의한 혈관형성억제능은 80%이었다.

[실시예 4]

(상기 식중에서, Me는 메틸기이며 TBSO는 t-부틸디메틸실릴릭옥사이드이다)

TK-046 2.5g(0.006M)과 이미자졸 1.05g(0.15M)를 DMF 15㎖에 용해시키고, TBSCl 1.0g(0.0067M)을 가하고 상온에서 2시간 교반하였다. 물로 세척하고, 초산에틸 30㎖로 5번 추출하여 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 감압농축하였다.

용리제로 초산에틸 : n-헥산(5 : 2)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피하여 목적물질 2.8g을 얻었다. 이때 Rf는 0.7이며, 최종수율은 88%이었다.

CAM 분석법에 의한 혈관형성억제능은 17%이었다.

[실시예 5]

TK-103 2.6g(0.0051M)을 DMF에 녹이고 0℃로 유지하면서 NaH 0.92g(0.01M)을 가하여 40분간 교반하였다. 다시 요오드메탄 1.2㎖(0.02M)을 가하고 상온에서 4시간 교반하였다.

lN 염산수용액과 물 100㎖로 세척하고, 초산에틸 30㎖로 3번 추출하여 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 감압농축하였다.

용리제로 초산에틸 : n-헥산(1 : 10)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피하여 목적물질 2.5g을 얻었다. 이때 Rf는 0.37이며, 최종수율은 93%이었다. CAM분석법에 의한 혈관억제능은 0%이었다.

[실시예 6]

(상기 식중에서, Me는 메틸기이다)

TK-104 2.3g(0.0043M)을 TBAF 1.68g(0.0064M)을 THF 10㎖에 용해시키고 16시간 교반하였다. 물로 세척하고, 초산에틸 30㎖로 3번 추출하여 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 감압농축하였다. 용리제로 초산에틸 : n-헥산(1 : 5)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피하여 목적물질 1.7g을 얻었다. 이때 Rf는 0.32이며, 최종수율은 94%이었다. CAM 분석법에 의한 혈관형성 억제능은 80%이었다.

[실시예 7]

(상기 식중에서, Me는 메틸기이다)

TK-105 1g(0.0023M)을 5N NaOH 10㎖과 혼합하여 48시간 교반하였다. 5N 염산수용액으로 중성화하고, 물로 세척한 후 초산에틸 70㎖로 추출하여 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 감압농축하였다. 용리제로 초산에틸 : n-헥산(4 : 3)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피하여 목적물질 0.84g을 얻었다. 이때 Rf는 0.6이며, 최종수율은 90%이었다.

이 물질의 실험식은 C₂₅H₄₂로써, 7-히드록시-3-메틸옥시 콜란-24-온산(3α, 5β, 7α)로 명명하였다. CAM 분석법에 의한 혈관형성억제능은 60%이었다.

[실시예 8]

(상기 식중에서, iPr은 이소프로필기이다)

CDCA 0.5g(0.0013M)과 DBU 0.39㎖(0.0026M)를 DMF 5㎖에 용해시키고, 2-브로모프로판 0.43㎖(0.005M)을 가한 후 상온에서 3시간 교반하였다. 물로 세척하고, 초산에틸 30㎖로 3번 추출하여 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 감압농축하였다. 용리제로 초산에틸 : n-헥산(3 : 4)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피하여 목적물질 0.552g을 얻었다. 이때 Rf는 0.25이며, 최종수율은 98%이었다.

이 물질의 구성은 C₂₇H₄₆O₄로써, 콜란-24-온산 3,7-디히드록시-(3α, 5β, 7α), 프로필 에스테르로 명명하였다. CAM 분석법에 의한 혈관형성억제능은 50%이었다.

[실시예 9]

(상기 식중에서, Bn는 벤질기이다)

CDCA 2.00g(0.0051M)과 DBU 1.4㎖(0.001M)를 DMF 15㎖에 용해시키고, 브로모벤질 3.0㎖(0.02M)을 가한 후 상온에서 3시간 교반하였다. 물로 세척하고, 초산에틸 50㎖로 2번 추출하여 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 감압농축하였다. 용리제로 초산에틸 : n-헥산(3.5 : 2.5)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피하여 목적물질 2.01g을 얻었다. 이때 Rf는 0.35이며, 최종수율은 88%이었다.

TMS에 녹여 H¹과 NMR과 C¹³NMR로 측정한 결과에 따르면, 이 물질은 3,7-디히드록시-콜란-24-온산(3α, 5β, 7α)벤질 에스테르이다. CAM 분석법에 의한 혈관형성억제능은 0%이었다.

[실시예 10]

(상기 식중에서, Bn는 벤질기이며 OBz는 벤조일기이다)

TK-074 1g(0.0022M)과 트리플루오로리에틸아민 0.63α(0.0044M)을 DMF 10㎖에 용해시키고, 염화벤조일 1.27㎖(0.011M)을 6시간 가한 후 0℃이하에서 30분간 교반하고, 상온에서 1시간 교반하였다. 물로 세척하고, 0.1N 염산수용액으로 중성화하고, 초산에틸 50㎖로 3번 추출하여 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 감압농축하였다. 용리제로 초산에틸 : n-헥산(2 : 5)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피하여 목적물질 0.40g을 얻었다. 이때 Rf는 0.33이며, 최종수율은 28%이었다.

이물질의 실험식은 C₄₅H₅₄O₆로써, 3,7-비스-벤조일옥시-콜란-24-온산-3α, 5β, 7α)벤질에스테르로 명명하였다. CAM 분석법에 의한 혈관형성억제능은 57%이었다.

[실시예 11]

급성독성시험

상기 실시예 2 내지 실시예 10에서 수득한 케노데옥시콜린산의 유도체 및 케노데옥시콜린산의 급성독성시험을 실시하고, 그 결과를 표1에 나타내었다. 시험은 20~23g 무게의 ICR계 숫쥐 100마리를 대상으로 10마리를 1군으로 하여 1~10군으로 분류한 후, 0.5% 카르복실메틸셀룰로오즈 용액내에 현탁시킨 시험물질 500㎎/㎏으로 투여한 후, 사망동물수 및 반수치사율을 측정하였다.

상기 표1로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 케노데옥시콜린산의 유도체 투여시 사망동물은 관찰되지 않았고 반수치사율(LD50: Lethal Dose)은 5000㎎/㎏이상이므로, 안전성이 매우 높은 물질임을 알 수 있다.

Claims

유효성분으로서 하기 일반식들로 표시되는 케노데옥시콜린산 유도체의 1종을 0.01㎎~1g의 양으로 함유하는 혈관 형성 억제제.

(상기 식중에서, Me는 메틸기, Et는 에틸기, Bn는 벤질기, OBz는 벤조일기, TBSO는 t-부틸디메틸실릴릭옥사이드이며 iPr은 이소프로필기이다)