KR0149278B1 - 한국산 두꺼비로부터 분리한 항균 펩타이드 - Google Patents
한국산 두꺼비로부터 분리한 항균 펩타이드Info
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Abstract
본 발명은 한국산 두꺼비(Bufo bufo gargarizans)로부터 분리한 항균 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 항균 펩타이드는 분자량이 약 433Da인 39개의 아미노산 잔기로 구성되었으며, 그램 양성균, 그램 금성균 및 효모 등에 대하여 강력한 항균활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 항균 펩타이드는 항균제로 이용되어 상처치료 촉진제, 외상 치료제, 구강청정제 및 안약 등으로 개발될 수 있을 것이다.
Description
제1도는 한국산 두꺼비로부터 분리한 항균 펩타이드의 분자량 측정을 나타내는 질량분석 스펙트럼이다.
제2도는 본 발명의 항균 펩타이드를 리신 카르복실 말단 절단효소(endoproteinase Lys-C)로 절단하여 얻은 펩타이드 단편의 항균력을 측정한 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 한국산 두꺼비(Bufo bufo gargarizans)로부터 분리한 항균 펩타이드에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 두꺼비로부터 여러 박테리아 뿐만 아니라, 원핵생물 및 곰팡이 등에 대하여 강한 항균활성을 나타내는 항균 펩타이드에 관한 것이다.
지구상에 있는 모든 동물들은 자신을 바이러스나 세균과 같은 미생물의 감염으로부터 방어 또는 보호할 수 있는 생체방어기구를 가지고 있다. 이러한 현상은 곤충을 포함한 무척추동물에게도 적용되므로, 곤충이 미생물의 침입으로부터 자신을 보호하는 방어기구에 대한 연구결과, 누에 애벌레의 세크로핀(Cecropin)이 항균 펩타이드로 발견된 이후, 생리활성 물질로서 항균 펩타이드의 중요성이 크게 인식되었다.
현재까지 약 2,000여종 이상의 항균 펩타이드가 발견되었으며, 이들 펩타이드는 발견된 종에 따라 그 아미노산 조성이 상이하나, 항균활성을 나타내는 작용기작은 유사한 것으로 알려져 있다. 이러한 항균 펩타이드들은 새로운 의약품으로서 각광받을 수 있는 다음과 같은 몇가지 우수한 점을 가지고 있다: 첫째, 항균 펩타이드는 기존의 항생제보다 폭넓은 범위의 미생물에 대하여 강한 항균력을 가진다; 둘째, 항균 펩타이드는 숙주세포는 파괴하지 않고 외부에서 침입한 병원균에 대해서만 항균활성을 나타내므로, 인체에 유효한 항생물질로서의 개발 가능성이 높다; 셋째, 모든 항균 펩타이드는 글리코실화(glycosylation)등의 2차 변형이 없기 때문에, 유전자 조작을 통하여 기존의 원핵 미생물에 의한 대량생산이 가능하다.
최근 수년간의 연구에 의하면, 거의 모든 고등생물이 병원성 미생물에 대한 방어 수단으로 면역체계와는 별도로 항균 펩타이드를 체내에 축척하거나 분비하는 것으로 보고되었으며, 특히, 양서류의 피부와 위에는 여러 종류의 항균 펩타이드가 존재하는 것으로 알려지고 있다. 이들 중 대표적인 항균 펩타이드로는 세크로핀, 디펜신(Defensin), 머게이닌(Magainin) 및 타키플레신(Tachyplesin)등이 알려져 있으며, 이들은 17 내지 24개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로서 그램 음성균과 그램 양성균 뿐만 아니라 원핵생물, 곰팡이 등에 대하여도 항균력을 가지며, 그중 일부의 펩타이드는 암세포와 바이러스의 처치에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
특히, 전기 항균 펩타이드 중 머게이닌은 양서류의 표피에서 분리된 23개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로서, 병원성 미생물 뿐만 아니라 인체 폐암세포에도 작용하는 것으로 보고되고 있는데(참조: Michael A., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:5449-5453(1987)). 이의 항균능력, 작용기작 및 구조 등에 대한 연구 결과로부터 현재 실용화에 가장 근접한 항균 펩타이드로 알려지고 있다.
이에, 본 발명의 발명자들은 항균 펩타이드를 다량 함유하고 있는 것으로 알려진 양서류로부터 새로운 항생물질을 탐색하고자 예의 연구를 거듭한 결과, 민간요법에서 외상치료제로 이용되어 온 한국산 두꺼비로부터 분리한 항균 펩타이드가 기존의 강력한 항균 펩타이드보다 항균력이 매우 우수한 신규물질임을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 한국산 두꺼비(Bufo bofo gargarizans)로부터 분리한 항균 펩타이드를 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
한국산 두꺼비로부터 항균 펩타이드를 분리하기 위하여, 우선 한국산 두꺼비의 위를 마쇄하여 펩타이드만을 추출 농축한 다음, 헤파린-세파로스(heparin-Separose) 크로마토그래피 및 C18역상 고속액체 크로마토그래피(C18reversed-phase HPLC)를 수행하여 항균 펩타이드를 순수 분리하였다.
전기에서 분리한 항균 펩타이드의 분자량을 측정한 결과, 전기 펩타이드는 아미노산 잔기 39개로 구성된 약 4,330Da의 펩타이드임을 확인하였다. 또한, 본 발명 항균 펩타이드의 항균력을 측정한 결과, 그램 음성균과 그램 향성균 뿐만 아니라 곰팡이 등에 대하여도 강력한 항균력을 나타내며, 기존의 강력한 항균 펩타이드인 머게이닌보다 더욱 항균활성이 우수함을 확인하였다. 아울러, 항균 펩타이드를 리신 카르복실 말단 절단효소(Endoproteinase Lys-C)로 절단하여 얻은 21개 아미노산으로 구성된 항균 펩타이드 단편 또한 강력한 항균력을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 항균 펩타이드는 폭넓은 범위의 미생물에 대하여 강력한 항균활성을 나타내므로, 항균제로 이용되어 상처치료 촉진제, 외상치료제, 구강청정제 및 안약 등으로 개발될 수 있을 것이다.
본 발명에서 아용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 다라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 본 발명의 항균 펩타이드는 한국산 두꺼비로부터 유래한 천연의 펩타이드 뿐만 아니라, 개시된 아미노산 서열에 의해 당업계의 통상적인 방법에 따라 화학적으로 합성된 펩타이드를 포함한다고 보아야 할 것이다.
[실시예 1]
한국산 두꺼비로 부터의 항균 펩타이드 분리
한국산 두꺼비(Bufo bufo gargarizans)를 이산화탄소로 질식시킨 다음, 위를 절개하고 펩타이드 추출용액(1M HCI, 1% NaCl, 1%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 5%(v/v)포름산으로 구성된 용액)을 첨가하여 절개한 위를 마쇄하여 펩타이드만을 추출하였다. 그런 다음, 추출한 펩타이드를 Sep-Pak C카트리지(Waters Associates, USA)를 이용하여 농축시키고, 헤파린-세파로스(Pharmacia, Sweden) 크로마토그래피하여 항균력이 있는 활성분획을 수득한 후, 이 분획을 C역상 고속액체 크로마토그래피(Waters Associates, USA)하여 항균 펩타이드를 순수 분리하였다.
전기에서 한국산 두꺼비로 부터의 항균 펩타이드 분리시, 항균활성은 최서저해농도 측정법(minimal inhibitory concentration test)으로 측정되었다.
[실시예 2]
항균 펩타이드의 특성 확인
[실시예 2-1]
항균 펩타이드의 분자량 및 아미노산 서열 결정
실시예1에서 순수 분리한 항균 펩타이드의 분자량을 질량분석기(mass spectroscopy, Kartos Kompact MALDI, UK)를 이용하여 측정한 결과, 4330Da으로 확인되었다(참조: 제1도), 아울러, 순수 분리한 항균 펩타이드의 아미노산 서열은 자동 아미노산 서열 분석기(automatic amino acid sequencer, Fullerton, USA)로 결정되었는데, 전기 펩타이드는 다음과 같은 39개의 아미노산으로 구성된 신규한 펩타이드임을 확인하였다:
[실시예 2-2]
항균 펩타이드의 항균력측정
본 발명 항균 펩타이드의 항균력을 여러 가지 미생물에 대한 항균 펩타이드의 최소저해농도를 측정함으로써 결정하였다.(참조: 표2).
상기 표2에서 보듯이, 본 발명의 항균 펩타이드는 그램음성균, 그램 양성균 및 효모 대하여 강력한 항균력을 가지고 있으며, 특히, 그램양성균인 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus) 및 그램음성균인 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)에 대한 항균력은 매우 우수함을 알 수 있다.
한편, 본 발명의 항균 펩타이드의 항균력을 기존의 강력한 항균 펩타이드인 머게이닌 2(Sigma, USA)의 항균력과 비교하여, 하기 표3에 나타내었다.
상기 표3에서 보듯이, 본 발명의 항균 펩타이드는 머게이닌 2보다2배 이상의 강한 항균력을 나타냄을 알 수 있다
한편, 전기 항균 펩타이드를 리신 카르복실 말단 절단효소(Endoproteinase Lys-C)로 절단하여 얻은 다음의 21개 아미노산으로 구성된 항균 펩타이드 단편의 항균력을 바실러스 서브틸리스에 대한 최소저해농도 측정법으로 결정한 결과, 강력한 항균활성을 나타냄을 확인하였다(참조:제2도):
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 한국산 두꺼비로부터 분리한 신규한 항균 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 항균 펩타이드는 분자량이 약 4330Da이며, 그램 양성균, 그램 음성균 및 곰팡이 등에 대하여 강력한 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 항균 펩타이드는 항균제로 이용되어 상서치료 촉진제, 외상 치료제, 구강청정제 및 안약 등으로 개발될 수 있을 것이다.
Claims (2)
- 다음과 같은 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드:
- 제1항의 항균 펩타이드로부터 유도된 다음과 같은 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드:
Priority Applications (1)
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| KR1019950002164A KR0149278B1 (ko) | 1995-02-07 | 1995-02-07 | 한국산 두꺼비로부터 분리한 항균 펩타이드 |
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| KR1019950002164A KR0149278B1 (ko) | 1995-02-07 | 1995-02-07 | 한국산 두꺼비로부터 분리한 항균 펩타이드 |
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