KR0146494B1 - 세라치아 마르세센스 단백분해효소의 억제단백질 및 그의 제조방법 - Google Patents
세라치아 마르세센스 단백분해효소의 억제단백질 및 그의 제조방법Info
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Abstract
본 발명은 세라치아 마르세센스(Serratia marcescens)단백분해효소인 세라치오펩티다제(serratiopeptidase)의 억제단백질(SmaPI) 및 전기 억제단백질의 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 이용하여 억제단백질 SmaPI을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 재조합 세라치아 마르세센스를 온도 37℃의 조건에서 배양하여 그 상등액을 수득하고, 암모늄설페이트 및 100℃에서의 열처리한 다음, 세파덱스 G-100 크로마토그래피, Mono Q HR5/5 크로마토그래피 및 슈퍼로스 6HR 크로마토그래피를 일련의 과정으로 수행하여 SmaPI를 순수분리하였다. 본 발명에서 제조된 고역가의 억제단백질 SmaPI는 세라치오펩티다제 활성의 억제를 필요로 하는 여러 산업적 분야에 이용될 수 있을 것이다.
Description
제1도는 재조합 플라스미드 pSP2의 유전자 지도를 나타낸다.
제2도는 억제단백질 SmaPI 유전자의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명은 세라치아 마르세센스(Serratia marcescens) 단백분해효소의 억제단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 세라치아 마르세센스 단백분해효소인 세라치오펩티다제(serratio-peptidase)의 신규한 억제단백질(SmaPI) 및 전기 억제단백질의 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 이용하여 억제단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
세라치아 마르세센스가 생산하는 단백분해효소인 세라치오펩티다제는 소염제로 널리 사용되고 있으며, SmaPI는 세라치오펩티다제를 특이적으로 억제하는 단백질이다.
야생주의 세라치아 마르세센스에서는 SmaPI의 활성이 매우 낮기 때문에 지금까지 알려지지 않았는데, 세라치아 마르세센스에서 클로닝된 세라치오펩티다제 유전자 하부에 또 다른 하나의 유전자가 발견되어 이것이 SmaPI 억제단백질일 것이라는 가능성이 제시되었다(참조: J. Bacteriol.,173:2160-2166(1991); j. Bacteriol., 174:2361-2366(1992)). 그러나, 이 유전자를 대장균이나 세라치아 마르세센스 등에서 발현시켜 고역가로 SmaPI을 생산하거나 순수분리하여 세라치오펩티다제의 억제단백질이라는 것을 밝힌 바가 없었으며, 또한 이 단백질의 물리, 화학, 생물학적 특성을 밝힌 바도 없었다.
이에, 본 발명의 발명자들은 SmaPI 유전자를 대장균이나 세라치아 마르세센스에서 발현시킨 결과, 고역가로 SmaPI 활성이 검출됨을 발견하였다. 본 발명에서는 세라치아 마르세센스(ATCC 21074)로 부터 세라치오펩티다제 유전자를 포함하는 DNA 단편을 클로닝하여, 이 DNA 단편을 포함하는 여러 가지 재조합 플라스미드로 대장균 및 세라치아 마르세센스를 형질전환시켜 단백질을 발현시키는 경우, 고역가의 SmaPI를 세포내 페리플라즘(periplasm)이나 세포밖 배지중에서 수득할 수 있었다. 또한, SmaPI를 함유한 페리플라즘이나 세포밖 배지로 부터 세라치오펩티다제 억제 특이성을 갖는 SmaPI를 고순도로 분리 정제하여, 그의 생화학적 특성을 규명할 수 있었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 세라치아 마르세센스 단백분해효소인 세라치오펩티다제의 신규한 억제단백질 SmaPI를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 억제단백질의 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 이요하여 SmaPI를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
우선, 본 발명자들은 세레치아 마르세센스(ATCC 21-74) 균주로 부터 분리한 세라치오펩티다제 활성을 억제하는 단백질(SmaPI)의 유전자가 포함된 4.0kb DNA 단편을 pUC19의 HindIII 부위로 도입하여 재조합 플라스미드 pSP2를 제조하였다. 그런 다음, 재조합 플라스미드 pSP2로 미생물을 형질 전환시키고, LB액체배지에서 20 내지 37℃의 온도에서 진탕배양하여, 억제단백질 SmaPI의 발현을 유도하였다. 재조합 미생물이 대장균인 경우 SmaPI는 세포내에 다량 축적되었고, 재조합 미생물이 세라치아 마르세센스인 경우, 아생종의 세라치아 마르세센스가 생산하는 SmaPI 양의 100배 이상을 생산였으며, 특히, 배양온도 37℃에서는 세포외 배지중으로 SmaPI를 전부 분비하였다.
한편, 재조합 세라치아 마르세센스로 부터 SmaPI를 순수분리하기 위하여, 재조합 세라치아 마르세센스를 온도 37℃의 조건에서 배양하여 그 상등액을 수득하였다. 그런 다음, 배양상등액에 암모늄 설페이트를 첨가하여 단백질을 침전시키고 용해시켜, 100℃에서 열처리한 다음, 세파덱스 G-100, Momo Q HR5/5 및 슈퍼로스 6HR 크로마토그래피 등을 일련의 과정으로 수행하여 SmaPI를 순수분리하였다.
전기에서 순수분리한 SmaPI는 분자량이 10,000달톤이며, 열 및 pH의 폭 넓은 범위에서 매우 안정하고, 1:1 비공유결합에 의한 기질과의 경쟁적 억제를 통하여 세라치오펩티다제만을 특이적으로 억제하며, N-말단 아미노산 서열로 Ala-Leu-Pro-Thr-Ala-Gln-Ser-Leu-Ala-Gly-Gln-Trp-Glu-Val-Ala을 가짐을 확인하였다. 본 발명에서는 제조된 고역가의 억제단백질의 SmaPI는 세라치오펩티다제 활성의 억제를 필요로 하는 여러 산업적 분야에 이용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예1:재조합 플라스미드 pSP2의 제조]
세라치아 마르세센스(ATCC 21074) 균주의 염색체 DNA에 제한효소 HindIII을 처리하여, 세라치오펩티다제 활성을 억제하는 단백질(SmaPI)의 유전자가 포함된 4.0kb DNA 단편을 얻었다. 한편, 플라스미드 pUC19을 HindIII로 절단하고, 송아지 소장의 인산가수분해효소(calf intestinalphosphatase)를 이용하여 탈인산화시킨 다음, 전기의 4.0kb DNA 단편과 연결시켜 재조합 플라스미드 pSP2를 제조하였다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드 pSP2의 제한효소 지도와 4.0kb DNA 단편 내에서의 SmaPI 유전자의 위치를 제1도에 나타내었다. 제1도에서, SMP는 세라치오펩티다제 유전자를 나타내며, 괄호 안의 숫자는 상대적 거리를 kb로 나타낸 것이다.
한편, SmaPI 유전자의 염기서열을 생거(Sanger) 의 방법(F. Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463-5467(1977))으로 결정하여, 제2도에 나타내었다. 제2도에서, SMP는 세라치오펩티다제의 단백질 합성 종결유전자 부위, Pre-SmaPI는 SmaPI의 전구체 단백질의 합성이 개시되는 부위 및 Mature SmaPI는 활성형 SmaPI 단백질의 합성이 개시되는 부위를 각각 나타낸다.
[실시예2:pSp2 형질전환체로 부터의 SmaPI 제조]
실시예1 에서 제조된 재조합 플라스미드 pSP2를 염화칼슘을 이용한 방법(Sambrock et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, pp.182-184(1989))으로 대장균 JM109 및 세라치아 마르세센스(ATCC 27117)를 형질 전환시키고, 형질전환된 미생물을 LB액체배지에서 200rpm으로 24시간 진탕배양하였다. 그런 다음, 세포 내외에 존재하는 SmaPI의 활성을 측정하여 하기 표1에 나타내었다.
SmaPI의 활성은 순수분리한 세라치오펩티다제(3.33U)에 SmaPI를 혼합하여 25℃에서 30분간 방치한 다음, 잔존하는 세라치오펩티다제 활성을 측정함으로써 결정되었는데, 이때. 1 효소단위(unit)는 세라치오펩티다제의 활성을 50% 감소시키는 SmaPI의 양으로 정의되었다. 한편, 세라치오펩티다제의 활성은 희석한 세라치오펩티다제 함유용액 0.1㎖와 50mM 인산칼륨 완충용액(pH 7.5)에 2.4%(w/v) 아조카제인(azocasein)을 녹인 기질용액 0.6㎖를 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)을 첨가하여 효소반응을 정지시키고, 7,000×g에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액 0.6㎖에 10N 수산화나트륨 0.3㎖을 혼합한 후, 420㎚에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다. 이때, 세라치오펩티다제 1 효소단위는 1분당 흡광도를 0.01 증가시키는 효소의 양으로 정의되었다.
상기 표1에서 보듯이, 재조합 대장균의 경우 SmaPI는 세포내에 다량 축적되었으며, 재조합 세라치아 마르세센스의 경우 배양온도 20 내지 30℃ 범위에서는 세포내에서 SmaPI가 다량 축적되었으나, 배양온도 37℃에서는 세포외 배지중으로 전부 분비되었음을 알 수 있고, 또한 재조합 대장균에서보다 재조합 세라치아 마르세센스에서의 SmaPI 발현율이 높음을 알 수 있었다. 아울러, pSP2로 형질전환된 세라치아 마르세센스의 경우, 야생종의 SmaPI 생산(0.8U/㎖)의 100배에 해당하는 80U/㎖의 SmaPI를 생산함을 확인하였다.
[실시예3:SmaPI의 분리 및 생화학적 특성 확인]
실시예 2에서와 마찬가지로 재조합 세라치아 마르세센스를 매분당 200 내지 300회의 교반속도로 배양온도 37℃ㅇ의 조건에서 24시간 배양한 다음, 10,000×g에서 10분간 원심분리하여 세포 침전물을 제거하고 배양상등액을 수득하였다. 배양상등액에 80% 암모늄 설페이트를 첨가하여 단백질을 침전시키고 용해시켜, 100℃에서 20분간 열처리한 다음, 세파덱스 G-100 크로마토그래피, Mono Q HR5/5 크로마토그래피 및 슈퍼로스 6HR 크로마토그래피를 수행하여 SmaPI를 순수분리하였다.
전기에서 순수분리한 SmaPI의 생화학적 특성을 하기 표2에 나타내었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본발명은 세라치아 마르세센스 단백분해효소인 세라치오펩티다제의 억제단백질 SmaPI 및 전기 억제 단백질의 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 이용하여 억제단백질 SmaPI을 제조하는 방법을 제공한다. 아울러, 본 발명의 재조합 세라치아 마르세센스로부터 분리한 SmaPI는 분자량이 10,000달톤이며, 열 및 pH의 폭 넓은 범위에서 매우 안정하고, 1:1 비공유결합에 의한 기질과의 경쟁적 억제를 통하여 세라치오펩티다제만을 특이적으로 억제하며, N-말단아미노산서열로Ala-Leu-Pro-Thr-Gln-Ser-Leu-Ala-Gly-Gln-Trp-Glu-Val-Ala을 가짐을 확인하였다. 본 발명에서 제조된 고역가의 억제단백질 SmaPI는 세라치오펩티다제 활성의 억제를 필요로 하는 여러 산업적 분야에 이용될 수 있을 것이다.
Claims (3)
- 세라치아 마르세센스(serratia marcescens)의 세라치오펩티다제(serratiopeptidase) 활성을 억제하는 단백질(SmaPI)의 유전자가 포함된 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물을 배양하여 고역가의 SmaPI를 제조하는 방법.
- 제2항에 있어서, 미생물은 대장균 또는 세라치아 마르세센스(Serratia marces cens)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 세라치아 마르세센스(Serratia marcescens)의 세라치오펩티다제(serratiopeptidase) 활성을 억제하는 단백질(SmaPI)의 유전자가 포함된 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물로 부터 제조된 다음과 같은 특성을 가지는 억제단백질 SmaPI:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019950003459A KR0146494B1 (ko) | 1995-02-22 | 1995-02-22 | 세라치아 마르세센스 단백분해효소의 억제단백질 및 그의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019950003459A KR0146494B1 (ko) | 1995-02-22 | 1995-02-22 | 세라치아 마르세센스 단백분해효소의 억제단백질 및 그의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR960031597A KR960031597A (ko) | 1996-09-17 |
| KR0146494B1 true KR0146494B1 (ko) | 1998-08-01 |
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ID=19408605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1019950003459A KR0146494B1 (ko) | 1995-02-22 | 1995-02-22 | 세라치아 마르세센스 단백분해효소의 억제단백질 및 그의 제조방법 |
Country Status (1)
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|---|---|
| KR (1) | KR0146494B1 (ko) |
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1995
- 1995-02-22 KR KR1019950003459A patent/KR0146494B1/ko not_active IP Right Cessation
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|---|---|
| KR960031597A (ko) | 1996-09-17 |
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