KR0144182B1 - 글루타메이트-파이루베이트 트랜스아미네이즈와 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미네이즈 효소활성 동시측정용 바이오센서 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 클루타이메이트탈수소효소 한 가지만의 효소를 사용하여 클루타이메이트-파이루베이트 트랜스아미네이즈와 클루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미네이즈를 동시에 측정할 수 있는 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명의 바이오센서는 절연성 기판상에 기준전극을 형성하는 단계, 상기 기준전극 일측기판상에 제1, 제2 지시전극을 형성하는 단계, 상기 기준전극 타측기판상에 상기 기준전극을 중심으로 각기 상기 제1, 제2 지시전극에 대항되도록 제3, 제4 지시전극을 형성하는 단계, 상기 제1, 제2, 제3, 제4 지시전극상에 카본페이스트층을 형성하는 단계, 상기 제1, 제2 지시전극상의 카본페이트상에 효소/고분자 카본페이스트층을 형성하는 단계, 상기 제1지시전극상에 형성된 효소/고분자 카본페이스트층과 제3지시전극상에 형성된 비효소/고분자 카본페이스트층에 걸쳐 GPT 효소반응용 아미노산/고분자 페이스트층을 형성하는 단계, 및 상기 제2지시전극상에 형성된 효소/고분자 카본페이스트층과 제4지시전극상에 형성된 비효소/고분자 카본페이스트층에 걸쳐 GOT 효소반응용 아미노산/고분자 페이스트층을 형성하여 단계로 이루어지는 방법으로 제조된다.

Description

글루타메이트-파이루베이트 트랜스아미네이즈와 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미네이즈 효소활성 동시측정용 바이오센서 및 그 제조방법

제1도는 글루타메이트-파이루베이트 트랜스아미네이즈와 글루타메이트 탈수소효소에 의한 효소반응을 연속적으로 나타낸 설명도

제2도는 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미네이즈와 글루타메이트 탈수소효소에 의한 효소반응을 연속적으로 나타낸 설명도

제3도는 본 발명의 바이오센서를 제작하는 과정을 나타내는 공정평면도

제4도는 본 발명의 바이오센서의 사시도

제5도는 GPT 및 GOT 효소활성 측정용시료가 본 발명의 바이오센서의 각 효소활성 측정부위로 분리되어 들어가도록 하는 보조장치의 사시도

본 발명은 글루타메이트-파이루베이트 트랜스아미네이즈(glutamate-pyruvate trans aminase, GPT)와 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미네이즈(glutamate-oxalo acetate transaminase, GOT) 활성을 정량적으로 측정할 수 있는 바이오센서에 관한 것으로, 특히 한가지 효소만을 사용하여 간편하게 GPT와 GOT의 양을 동시에 측정할 수 있는 다중 바이오센서(multi-biosensor)에 고나한 것이다.

일반적으로 임상에서 측정되는 검사항목중 글루타메이트-파이루베이트 트랜스아미네이즈와 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미네이즈는 간염진단뿐 아니라 간의 손상 또는 간기능 저하의 지표가 되는 중요한 효소이다.

또한, GPT와 GOT 이 두가지 트랜스아미네이즈(transaminase)는 간뿐만 아니라 심장 기능의 이상유무를 판단할 경우에도 그 측정이 중요한 효소로 알려져 있다(H. U. Bergmeyer(1974). Methoden der enzymatischen Analyse, 3rd edition, Verlag Chemie, Weinheim, Volume I, pp.6-74).

이러한 GPT와 GOT는 간이 손상을 입거나 비정상적인 상태일 경우에 혈액중으로 유출되기 때문에 혈중 이들 효소의 양을 정량함으로써 임상학적 진단정보를 얻을 수 있다.

GPT는 생체내에서 아미노산의 일종인 알라닌(L-alanine)의 아미노기를 옥소글루타레이트(2-oxoglutarate)에 전이하여 글루타메이트(L-glutamate)와 파이루베이트(pyruvate)를 생성하는 반응에 관여한다.

한편 역반응이 일어나는 경우는 알라닌이 생성된다.

반변, GOT의 경우는 아스파테이트(L-aspartate)의 아미노기를 옥소글루타레이트(2-oxoglutarate)에 전이하여 글루타메이트(L-glutamate)와 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 전환시킨다.

즉, 이들 효소반응을 요약하면 다음과 같다.

따라서 GPT는 알라닌 트랜스아미네이즈(alanine transaminase, ALT)라고 불리우기도 하며, GOT는 아스팔테이트 트랜스아미네이즈(aspartate transaminase, AST)라고 불리운다.

GPT와 GOT를 분석하는 기존의 측정방법은 세계특허 WO 91/13169 등에서 기술된 바와 같이 위의 반응 (1)과 (2)에서 각각 생성된 파이루베이트(pyruvate)와 옥살로아세테이트(oxaloacetate)를 기질로 하는 효소반응을 이용하여 개발되었다.

이와 같은 방법은 이미 진단킷트 형태로 상용화 되어 있다.

즉, GPT 측정의 경우 (1)의 반응에서 생성된 파이루베이트가 락테이트 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH)의 반응으로 락테이트(lactate)로 전환되는데 이때 조효소인 NADH(1, 4-dihydronicotinamide adenine dinucleotide)가 NAD⁺(β-nicotinamide-adenine dinucleotide)로 전환된다(반응식(3)).

따라서 GPT 효소활성은 1분당 생성되는 파이루베이트의 양에 비례하므로 LDH의 반응에 의해 소모되는 NADH의 양을 측정함으로써 GPT의 양을 알 수 있게 된다.

보통 이것은 기존의 분광학적 방법을 사용하여 365nm의 파장하에서 1분당 NADH의 흡광도 감소변화를 측정한다(J. Lab. Clin. Med., 46 ; 785-789, 1955).

한편, GOT의 측정은 (2)의 반응에서 생성된 옥살로아세테이트가 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH)의 반응으로 말레이트(malate)로 전환되는 것을 이용한다(반응식(4)).

이 반응에서도 역시 조효소인 NADH가 NAD+로 전환되기 대문에 NADH의 흡광도 변화를 측정하는 같은 원리로 이용하고 있다.

위와 같은 반응기작을 이용하여 GPT와 GOT를 측정하기 위한 바이오센서가 몇가지 보고된바 있다.

한가지 방법은 파이루베이트 산화효소(pyruvate oxidase)라는 효소의 반응을 이용한예인데 GPT를 측정할 때는 반응 (1)에서 생성된 파이루베이트를 다음과 같이 식(5)의 반응결과 생성되는 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂) 또는 소모되는 용존산소의 양을 측정함으로써 측정하였다(Anal. Chim, Acta., 159 : 81-86, 1984 ; Anal. Chim. Acta., 118 : 65-71, 1980).

한편 GOT는 옥살아세테이트 탈수소효소(oxalacetate decarboxylase) 반응결과 반응식 (6)과 같이 파이루베이트를 생성하므로, 역시 (5)의 반응과 결합하여 GPT와 GOT를 연속적으로 측정할 수 있는 분석시스템도 보고된 바 있다(Anal. Chem., 56 : 1876-1880, 1984).

다른 한 예는 파이루베이트 산화효소를 사용하지 않고 GPT나 GOT의 효소반응 (1)과 (2)에서 공통으로 생선되는 글루타메이트를 이용하는 측정시스템이다.

글루타메이트 산화효소(glutamate oxidase) 반응에 의해 생성되는 과산화수소(H₂O₂)의 양을 측정하므로써 GPT나 GOT를 정량할 수 있다고 보고한 바 있다(Anal. Chim. Acta. 245 : 57-62, 1991).

전혈(whole blood)이나 혈청(serum)중의 GPT 혹은 GOT를 측정하는 기존의 측정방법이나 장치는 대부분 분광학적인 방법을 이용한 분석법을 채택하고 있다.

이미 기술한 바와 같이 기존의 상용화된 진단킷트의 경우 대부분 락테이트 탈수소효소와 말레이트 탈수소 효소의 반응에 관여하는 조효소인 NADH의 흡광도를 측정하는 시스템이다.

따라서 이들 시스템은 분광광도계(spectrophotometer)가 반드시 필요하게 된다.

또한, 시료로서 전혈(whole blood)의 사용이 곤란하다는 점과 만일 사용할 경우에는 시료의 전처리단계(sample pretreatment)가 반드시 필요하다는 점이 단점이라 할 수 있다.

이미 보고된 바와 같은 GPT 또는 GOT 활성측정용 바이오센서 시스템 중에서 파이루베이트 산화효소의 반응을 이용하는 경우 식 (5)의 반응결과 생성되는 과산화수소(H₂O₂) 또는 소모되는 용존산소의 양을 측정하기 위해 프라티눔(platinum) 전극 또는 용존산소전극을 트랜스듀서로 활용하여 이들 트랜스듀서의 감응부위에 효소고정화막을 부착시킨 형태로 개발되었다.

이경우 센서의 소형화 및 대량생산에 어려움이 있고, 따라서, 막(membrane)형태로 고정화된 효소의 활성 뿐만아니라, 바탕전극은 트랜스듀서의 감도 및 성능에 의해 바이오센서의 특성이 좌우되었다.

또한 시료인 혈액중에 존재하는 다른 전극활성물질에 의한 간섭물질(interferences)에 의한 영향도 크기 때문에 정확한 정량이 어려웠다.

또한 옥살로아세테이트 탈수소효소 반응과 파이루베이트 산화효소의 연쇄반응을 이용하여 GOT를 측정하는 시스템은 두 가지 효소를 이용해야 하기 때문에 제작하기 어려울 뿐만아니라 전체적인 시스템이 복잡해지는 문제점이 있었다.

GPT나 GOT의 효소반응 (1)과 (2)에서 공통으로 생성되는 글루타메이트를 이용하는 측정시스템에서, 글루타메이트 산화효소 반응을 사용하는 경우 역시 전극상에 효소 고정화막을 형성시킨 형태이기 때문에 생체물질이 갖는 수명의 한계를 극복할 수 없고, 바이오센서의 연속사용에는 제한이 되기 때문에 실용화 하기 어려운 기술이라 할 수 있다.

한편, 최근의 연구개발 추세는 바이오센서를 일회용으로 활용하는데 역점을 두고 있는 실정이다.

바이오센서를 일회용으로 활용하기 위해서는, 바이오센서 제조시 바이오센서 각 단위소자의 특성이 일정하도록 해주는 것과 값싸게 소형화 시키는 것이 가장 중요한 문제라 할 수 있다.

이런 관점에서 최근 초기 장비투자가 저렴하고 쉽게 적용할 수 있는 후막형성기술이 바이오센서 상용화 기술로 각광을 받고 있다.

본 발명은 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출한 것으로, 한가지 효소만을 사용하여 간편하게 GPT 및 GOT 활성을 동시에 측정할 수 있는 바이오센서를 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 바이오센서는 하기의 절연성 기판상에 기준전극을 형성하는 단계, 상기 기준전극 일측기판상에 제1, 제2 지시전극을 형성하는 단계 ; 상기 기준전극 타측기판상에 상기 기준전극을 중심으로 각기 상기 제1, 제2 지시전극에 대향되도록 제3, 제4 지시전극을 형성하는 단계 ; 상기 제1, 제2, 제3, 제4 지시전극상에 각각 카본페이스트층을 형성하는 단계 ; 상기 제1, 제2 지시전극상의 카본페이스트상에 각각 효소/고분자 카본페이스트층을 형성하는 단계 ; 상기 제3, 제4 지시전극상의 카본페이스트층상에 각각 비효소/고분자 카본페이스트층을 형성하는 단계 ; 상기 제1 지시전극상에 형성된 효소/고분자 카본페이스트층과 제3 지시전극상에 형성된 비효소/고분자 카본페이스트층에 걸쳐 GPT 효소 반응용 아미노산/고분자 페이스트층을 형성하는 단계 ; 및 상기 제2 지시전극상에 형성된 효소/고분자 카본페이스트층과 제4 지시전극상에 형성된 비효소/고분자 카본페이스트층에 걸쳐 GOT 효소반응용 아미노산/고분자 페이스트층을 형성하는 단계로 이루어지는 방법에 의해 제조됨에 특징이 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

절연성 기판으로는 폴리에스테르, PVC, 폴리카보네이트 등의 고분자기판이 사용된다.

효소/고분자 카본페이스트상의 효소로는 글루타메이트 탈수소효소(glutamate dehyd rogenase)가 사용되며, 효소/고분자 카본페이스트는 글루타메이트 탈수소효소와 NAD+, 하이드록시에틸 셀룰로오즈, 및 탄소분말로 이루어진다.

비효소/고분자 카본페이스트는 소혈청 알부민과 NAD+, 하드록시에틸 셀루로오즈 및 탄소분말로 이루어진다.

GPT 효소반응용 아미노산/고분자 페이스트는 알라닌과 알파게토글루타레이트 및 하이드록시에틸 셀룰로오즈로 이루어진다.

GOT 효소반응용 아미노산/고분자 페이스트는 아스파테이트와 알파켕토글루타레이트 및 하이드록시에틸 셀룰로오즈로 이루어진다.

상기와 같이 구성되는 본 발명의 GPT, GOT 효소활성 동시측정용 바이오센서의 동작을 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 바이오센서는 GPT와 GOT 두개의 효소반응에 의해 글루타메이트가 공히 생성되며 이 글루타메이트는 글루타메이트 탈수소효소에 으해 제 1, 2도에 나타낸 바와 같이, 옥소글루타레이트(2-oxoglutarate)(또는 알파케토글루타레이트(α-ketoglutarate)라고 하기도 함)를 생성함과 동시에 조효소인 NAD(P)+가 NAD(P)H로 전환되는 반응이 일어나므로, 일정전압이 인가되어 있는 전극상에는 조효소인 NADH(H)가 NAD(P)+로 산화될때 변하는 전류를 측정하면 궁극적으로 GPT와 GOT의 정량이 가능하다는 사실에 입각한 것이다.

GPT와 GOT의 효소활성을 각각의 상응하는 전극상에서 단위시간당 생성되는 NAD(P)H의 양에 비례한다는 것을 이용한 것이다.

단, 본 발명에서는 상기와 같은 원리에 의해 GPT 및 GOT의 동시측정이 가능하도록 GPT 및 GOT 측정용전극은 동일기판상에 서로 분리된 형태로 구성된다.

본 발명에서 전극은 기존의 전기화학적 원리를 이용한 센서와 같이 기준전극(reference electrode)과 지시전극(working electrode)으로 구성된 이전극계(2-electrode system)에 기초를 두고 있으나, 지시전극이 각각 2개인 차동증폭형이 된다.

즉, 시료중에 함유되어 있는 GPT는 기준전극 대비 일정한 인가전압하에 지시전극상에서 NAD(P)H가 NAD(P)+로 산화되는 반응이 일어나게 된다.

반면 글루타메이트 탈수소효소가 없는 지시전극 상에서는 GPT 반응과 무관한 신호가 나오게 되며 최종적으로 GPT에 의한 신호만을 검출함으로서 GPT의 양을 정량할 수 있게 된다.

마찬가지로 GOT의 경우는 기준전극 대비 일정한 인가전압하에 지시전극상에서 NAD(P)H가 NAD(P)+로 산화되는 반응이 일어나게 된다.

반면 글루타메이트 탈수소효소가 없는 지시전극상에서는 GOT 반응과 무관한 신호가 나오게 되며 최종적으로 GOT에 의한 신호만을 검출함으로서 GOT의 양을 정량할 수 있게 된다.

한편, GPT와 GOT에 공통으로 반응하는 기질인 알파케토글루타레이트의 경우 글루타메이트 탈수소효소 반응결과로도 생성되기 때문에 반응에 필요한 초기 알카케토글루타레이트의 양은 과량으로 존재하도록 한다.

다음에 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다.

그러나, 이 실시예는 본 발명을 더욱 용이하게 이해하도록 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해서는 본원의 특허청구의 범위를 벗어나지 않는 범위내에서의 변형, 개량 또는 개선 등이 행하여질 수 있음은 자명한 것이다.

[실시예 1]

1. GPT, GOT 동시측정용 다중 바이오센서의 제작

(1) 효소/고분자 카본페이스트 및 비효소/고분자 카본페이스트 제조효소/고분자 페이스트 제조방법은 다음과 같다.

효소는 활성 23[U/mg solid]인 소간에서 추출한 글루타메이트 탈수소효소(glutamate dehydrogenase, EC 1. 4. 1. 3.)를 사용한다.

막자사발에 글루타메이트 탈수소효소 200mg과 NAD+(β-nicotinamide-adenine dinucleotide) 50mg을 2% 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethl cellulose) 5ml과 함께 넣는 다음 충분히 섞어 균질의 효소용액을 만든다.

다음 1.3g의 탄소분말을 효소용액과 완전히 섞이도록 하여 효소/고분자 카본페이스트를 얻은 후 냉장고에 보관하면서 스크린프린팅시 일정량씩 사용한다.

다음, 비효소/고분자 카본페이스트 제조방법은 다음과 같다.

효소대신 소혈청 알부민(bovine serum albunin) 200ng, NAD+ 50mg을 2% 하이드록시에틸 셀룰로오즈 5ml과 함께 넣은 다음 충분히 섞어 균질의 비효소 단백질 용액을 만든다.

다음 1.3g의 탄소분말을 비효소 단백질 용액과 완전히 섞이도록 하여 비효소/고분자 카본페이스트를 얻은 후 냉장고에 보관하면서 스프린크린팅시 일정량식 사용한다.

(2) 아미노산/고분자 페이스트 제조

GPT 측정용 아미노산/고분자 페이스트는 6% 하이드록시에틸 셀룰로오즈 용액에 아라닌(L-alanine)과 알파케토글루타레이트(α-ketoglutarate)의 양이 각각 1M과 100mM이 되도록 균질하게 만든다.

반면, GOT 측정용 아미노산/고분자 페이스트는 6% 하이드록시에틸 셀룰로오즈 용액에 아스파테이트(L-aspartate)와 알파게토글루타레이트(α-ketoglutarate)의 양이 각각 50mM과 100mM이 되도록 균질하게 만든다.

(3) 스크린인쇄 방법을 이용한 바이오센서용전극 제작

제 3, 4도에서와 같이 두께 0.3mm인 폴리에스터(polyester) 절연성기판을 아세톤으로 세척한 후, 은(Ag) 페이스트를 인쇄하고(제3도 1), 110℃ 정도에서 10분간 열처리하여 전도성경로 및 접속패드를 구성한다.

다음, 4개의 지시전극(working electrode) 부위에 카본(carbon) 페이스트를 인쇄하고 열처리한다(제3도 2).

다음 절연페이스트를 인쇄한 후 열처리하여 절연층을 형성시킨 후(제3도 3), 절연층에 의해 노출된 전극부위를 100mM FeCl₃용액으로 1분간 처리한 후 증류수로 여분의 FeCl₃용액을 씻어내어 Ag/AgCl 기준전극을 형성시킨다(제3도 4).

여기에, 앞서 제조한 효소/고분자 카본페이스트와 비효소/고분자 카본페이스트를 각각 제3도 5, 6과 같이 스크린 인쇄하여 글루타메이트 탈수소효소가 있는 GPT와 GOT 측정용 지시전극(제4도 13, 16)과 글루타메이트 탈수소효소가 없는 GPT와 GOT 측정용 지시전극(제4도 11, 14)을 각각 형성시킨다.

다음, 아미노산/고분자 페이스트를 제3도 7, 8과 같이 스크린인쇄하여 각각 GPT, GOT 효소반응용 고분자층을 형성시키게 되면 제4도의 사시도에서처럼 GPT 측정용 지시전극 11, 13과 GOT 측정용 지시전극 14, 16이 형성된 다중 바이오센서가 완성된다.

제4도에서 처럼 기준전극 12, 15는 공통으로 작용하게 되는 구조를 갖고 있다.

전극은 기존의 전기화학적 원리를 이용한 센서와 같이 기준전극(reference electrode)과 지시전극(working electrode)으로 구성된 이전극계(2-electrode system)에 기초를 두고 있으나, 이미 기술한 바와 같이 지시전극이 각각 2개인 차동증폭형이 된다.

즉, 시료중에 함유되어 있는 GPT는 기준전극(12) 대비 일정한 인가전압하에 지시전극(13)상에 NAD(P)H가 NAD(P)+로 산화되는 반응이 일어나게 된다.

반면 글루타메이트 탈수소효소가 없는 지시전극 11 상에서는 GPT 반응과 무관한 신호가 나오게 되며 최종적으로 GPT에 의한 신호만을 검출함으로서 GPT의 양을 정량할 수 있게 된다.

마찬가지로 GOT의 경우는 기준전극(15) 대비 일정한 인가전압하에 지시전극(16) 상에서 NAD(P)H가 NAD(P)+로 산화되는 반응이 일어나게 된다.

반면 글루타메이트 탈수소효소가 없는 지시전극 14상에서는 GOT 반응과 무관한 신호가 나오게 되며 최종적으로 GOT에 의한 신호만을 검출함으로서 GOT의 양을 정량할 수 있게 된다.

(4) 시료분리형 투입구형성 및 바이오센서 완성

위와 같이 제작된 다중 바이오센서가 GPT, GOT 신호를 발생하게 하기 위해서는 신료가 반응중에 서로 섞이지 않는 구조를 가져야 한다.

이를 위해 본 발명에서는 제5도 17, 20과 같이 시료분리형 투입구를 제작, 형성시켰다.

시료분리 및 시료투입구 형성용 가이드층917)은 역시 절연층기판으로 되어있으나 그 양면에는 접착성 물질이 인쇄되어 있으며, 이러한 가이드(17)는 바이오센서(10)의 전극부위 및 절연성기판으로된 외부보호층(20)과 서로 접합되는 구조를 갖게 된다. 외부보호층(20) 상의 구멍(21)(22)은 시료투입시 각각의 시료분리형 투입부위 내부에서 모세관 작용이 촉진되도록 하여 시료가 전극부위와 잘 접촉하게 하는 역할을 하게 도니다.

이같이 완성된 다중 바이오센서를 실온건조시켜 각각 낱개로 기밀 포장한다.

본 발명은, 기존의 측정방법 보다 간단하게 글루타메이트 탈수소효소(glutamate dehydrogenase) 한가지만을 사용하여 간기능의 정상유무판단 및 초기간염의 정확한 진단을 하느데 그 지표가 될 수 있는 GPT 및 GOT 활성을 정확하게 측정할 수 있는 바이오센서 제작기술 및 측정방법을 제공한다.

이같은 발명은 기존의 스크린 인쇄기술을 이용하여 GPT 및 GOT 측정용 전극을 한 기판위에 구현시킬 수 있을 뿐만아니라, 각각 두개의 지시전극을 이용하여 동시에 차동방식으로 측정함으로써 기존의 측정 방법보다 감도를 크게 향상시키고, 다른 간섭물질의 영향을 배제시킬 수 있는 특징을 갖고 있다.

이러한 후막형 멀티일렉트로드 형태의 다중 바이오센서는 아직 개발된 바 없기 때문에, 본 발명의 바이오센서를 활용하여 간단한 스트립 형태로 휴대용 간기능 측정기, 병원임상용 자동분석기 등에 널리 이용될 수 있는 장점이 있다.

따라서, 기존 제품보다 분명한 제품의 차별화를 기대할 수 있다.

본 발명은 또한 센서제조방법으로 효소고정화를 포함하여 바이오센서를 제조하는 전프로세서를 스크린 인쇄기술을 이용하여 제조하는 후막프로세스에 모두 포함시킬 수 있기 때문에 바이오센서의 소형화 및 양산에 유리하며, 또한 효소막이 건조된 상태로 바이오센서를 보관할 수 있기 때문에 바이오센서의 보관성을 향상시킬 수 있어 본 발명의 효과는 매우 크다고 할 수 있다.

Claims (8)

1. 하기 단게들로 이루어지는, 글루타메이트-파이루베이트 트랜스아미네이즈와 글루타메이트-옥살로아세테이트 트랜스아미네이즈 효소활성 동시측정용 바이오센서의 제조방법 : 절연성 기판상에 기준전극을 형성하는 단계 ; 상기 기준전극 일측기판상에 제1, 제2 지시전극을 형성하는 단계 ㅣ 상기 기준전극 타측기판상에 상기 기준전극을 중심으로 각기 상기 제1, 제2지시전극에 대향되도록 제3, 제4 지시전극을 형성하는 단계 ; 상기 제1, 제2, 제3, 제4 지시전극상에 카본페이스트층을 형성하는 단계 ; 상기 제1, 제2 지시전극상의 카본페이스트상에 효소/고분자 카본페이스트층을 형성하는 단계 ; 상기 제3, 제4 지시전극상의 카본페이스트층상에 비효소/고분자 카본페이스트층을 형성하는 단계 ; 상기 제1 지시전극상에 형성된 효소/고분자 카본페이스트층과 제3 지시전극상에 형성된 비효소.고분자 카본페이스트층에 걸쳐 GPT 효소반응용 아미노산/고분자 페이스트층을 형성하는 단계 ; 및 상기 제2 지시전극상에 형성된 효소/고분자 카본페이스트층과 제4 지시전극상에 형성된 비효소/고분자 카본페이스트층에 걸쳐 GOT 효소반응용 아미노산/고분자 페이스트층을 형성하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 절연성기판은 폴리에스테르, PVC, 폴리카보네이트로 이루어진 군으로 부터 선택되는 고분자 기판인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 효소/고분자 카본페이스트상의 효소는 글루타메이트 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 효소/고분자 카본페이스트는 글루타메이트 탈수소효소와 NAD+, 하이드록시에틸셀룰로오즈, 탄소분말로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 비효소/고분자 카본페이스트는 소혈청 알부민과 NAD+, 하이드록시에틸 셀룰로오즈, 탄소분말로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법,.
6. 제1항에 있어서, GPT 효소반응용 아미노산/고분자 페이스트는 알라닌과 알파케토글루타레이트 및 하이드록시에틸 셀룰로오즈로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, GOT 효소반응용 아미노산/고분자 페이스트는 아스파테이트와 알파케토글루타레이트 및 하이드록시에틸 셀룰로오즈로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 방법.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 바이오센서의 전극부위 및 절연성기판으로된 외부보호층과 서로 접합하도록 형성되는 시료분리 및 시료투입구 형성용 가이드층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.