KR0138597B1 - 씨(c)형 간염 바이러스 외피 2단백질을 안정하게 발현하는 형질전환된 동물세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스 외피 2단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터에 의해 형질전환된, 상기 외피 2단백질 유전자를 안정적으로 발현시키는 차이니스 햄스터 오바리 세포주 및 상기 세포주를 배양하여 C형 간염 바이러스 외피 2단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

씨(C)형 간염 바이러스 외피 2단백질을 안정하게 발현하는 형질전환된 동물세포

제1도는 한국형 C형 간염 바이러스 KHCVL 클론의 외피 2유전자를 동물세포 발현용 바이시스트로닉 벡터 pCED2로 클로닝하는 과정을 도시한 것이고,

제2도는 상기 클로닝에 사용된 인간 인터루킨(IL)-2의 리더 서열을 포함하는 C형 간염 바이러스 외피 2단백질의 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제3도는 발현벡터 pCED2IL2-E2벡터로 포유동물 세포인 차이니스 햄스터 오바리(Chinese Hamster Ovary ; CHO) 세포를 형질전환시키고 IL2-E2 유전자를 발현시킨 후, 외피 2단백질의 발현을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.

본 발명은 한국형 C형 간염 바이러스형 간염 바이러스의 외피 2단백질을 계속적, 안정적으로 발현시키는 형질전환된 동물세포주에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외피 2유전자가 클로닝된 발현 벡터에 의해 형질전환된, 외피 2단백질을 생산할 수 있는 CHO 세포주 및 이를 이용한 외피 2단백질의 제조방법에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스가 비A 비B형 간염의 주요 원인 바이러스로서 처음 분리 및 확인(Alter. H.J. et al., Lancet 2, 838-841(1975))된 후, 브래들리 등이 C형 간염 환자의 혈장을 침판지에 수혈시켜 증폭된 C형 간염 바이러스를 최초로 분리확인함으로써 바이러스 증식의 동물모델을 확립하였고(Bradley, D.W. et al., Gastroenterology 88, 773-779(1985)), 츄(Choo)등은 cDNA 클로닝을 통해 이 바이러스의 유전물질의 크기가 약 10,000개의 염기이며, 3,010개의 아미노산으로 이루어진 다단백질 전구체를 암호화하는 하나의 오픈리딩프레임을 갖는 단일, 양성가닥 리보 핵산(single, positive-standed RNA)이라고 보고하였다(Choo, Q. L. et al., Science 244, 359-362(1989) , Choo, Q.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455(1991)).

히지카타 등은 하나의 다단백질 전구체로부터 실제 바이러스를 구성하는 단백질로 진화되는지를 연구하기 위해 세포의 리보 핵산 번역 방법을 이용하여 C형 간염 바이러스의 구조 단백질이 NH2-p22-gp35-gp70(E2)-COOH의 순으로 이루어져 있음을 밝혔다(Hijikata, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5547-5551(1991)).

최근에 아라쉬 등은 이 바이러스의 전체 cDNA를 벡시니아 바이러스의 pTM 벡터에 클로닝하여 일시 발현 분석(transient expression assay)을 통하여 BHK-21 세포에서 바이러스의 다단백질 및 9개의 절단된 산물이 합성되어 나오는 것을 확인하였는데 70킬로달톤의 외피 2단백질을 확인하였고 특히 외피 1과 외피 2단백질이 N-당화되어 있으며 이황화결합을 통해 서로 연결되어 있음을 밝힌 바 있다(Arash, G., et al., J. Virol 67, 1385-1395(1993)). 셀비(Selby) 등도 HepG2, Ost 7-1 등의 동물세포에서 전체 C형 바이러스 유전자를 일시적 발현시켜 각 단백질산물이 합성되어 나오는 것을 확인하였다(Selby, J.J., et al., J. General Virol 74, 1103-1113(1993)).

C형 간염 바이러스에 대한 감염 환자의 수는 전 세계적으로 매년 약 백만명씩 생기는 것으로 추정되며(Alter, J.J., in A.J. Zuckerman (ed.), Viral Hepatitis and Liver Disease, 537-542, Alan R. Liss. New York(1988)), 이 중 50∼60%가 만성 간염으로 진전되고 또 이중 20% 정도가 간경변 및 간암으로 진전된다는 사실이 밝혀졌다(Dienstag, J.L. et al., Seninar Liver Dis. 6, 67-81(1986)). 따라서 C형 간염 바이러스가 숙주의 면역체계를 피하는 기작에 대한 연구와 중화활성을 가지는 항체를 유도하기 위한 항원 단백질의 제조는 C형 간염에 대한 백신의 개발에 있어서 필수적인 것으로 알려져 있다.

C형 간염 바이러스의 두가지 외피 단백질중 외피 2단백질은 이 바이러스와 가장 유사한 바이러스인 페스티 바이러스의 gp53-55와 프라비 바이러스의 NS1 단백질에 해당되는 단백질인데 위 두 단백질에 대한 항체가 각 바이러스에 대해 중화 활성을 보이는 것으로 알려져 있다(Brandriss et al., J. Infect. Dis. 161, 1134-1139(1990), Konishi et al., Virology 188, 714-720(1992)). 따라서 C형 간염 바이러스의 외피 2 혹은 전체 외피 단백질과 비구조 2단백질의 복합체에 대한 항체가 이 바이러스에 대한 중화 활성을 나타낼 가능성 또한 높을 것으로 추정된다.

카토(Kato) 등은 바이러스의 외피 2단백질의 초 변화(hypervariability)는 환자의 면역체계에 의한 면역 선택의 결과로서 외피 2단백질이 숙주 면역 반응의 주요 목표일 가능성을 시사하였다.(Kato, N. et al., FEBS Letter 280, 325-328(1991)), 츄(Hsu) 등은 재조합 베큘로 바이러스를 이용하여 HCV 구조 단백질을 곤충 세포에서 발현시켜 분자량 68-73kd의 외피 2단백질이 합성되는 것을 확인하였고 엔도글리카나제 F(endoglycanase F) 절단을 통해 외피 2단백질이 막 당 단백질임을 입증하였다(H.H. Hsu et al., Hepatology, 17(5), 763-771(1993)).

한편 스패테(Spaete) 등은 카이론사에서 발표한 C형 간염 바이러스(HCV) H형의 외피 2단백질을 CHO 세포에서 발현시킨 바 있고 이 단백질이 세포내 소포체내에 만노스 당의 함량이 많은 형태로 발현되어 68-73kd 분자량의 세포내 부착 단백질로 나타나지만, 카르복실 말단의 막투과 지지 영역(transmembrane anchor-region)으로 추정되는 부위를 삭제한 경우 완전한 당화가 이루어지며 시알산(sialic acid)이 그 말단에 부착되고 세포 배양액으로 분비되는 것을 확인하였다(Spaete R.R. et al., Virology 188, 819-830(1992)).

카이론사에서는 H형의 HCV의 핵, 외피 1, 외피 2, 비구조 2유전자를 재조합 벡시니아 바이러스를 이용하여 HeLa 세포에서 발현시킨 다음 외피 1-외피 2-단백질의 복합체를 정제하고 침판지를 이용한 시험에서 외피 1 및 외피 2 단백질에 대한 항체가 측정되는 시기 동안은 보호 면역성이 나타난다는 결과를 국제 심포지움(The 3rd International Symposium on Viral hepatitis and Liver Disease, Tokyo. Japan, 1993)에서 발표한 바 있다. 이상과 같은 보고들을 종합해 볼 때, C형 간염 바이러스의 외피 2단백질은 C형 간염에 대한 백신 개발에 있어서 중요하며 완전히 당화가 이루어진 활성 형태의 단백질을 얻는 것이 필수적임을 알 수 있다.

본 발명자들은 한국형 C형 간염 환자의 혈청으로부터 C형 간염 바이러스 입자를 분리하여 그 유전자 구조를 규명하고 기존의 미국형 및 일본형 HCV와는 상이한 한국형 C형 간염 바이러스(KHCV)가 존재함을 규명하였는데(선행 한국 특허출원 제91-09510호 참조), 특히 외피 2단백질은 미국형과는 85% 유사성만을 나타내어 그 특이성의 차이를 확연히 보여주고 있다.

KHCV의 외피 2단백질은 유전공학적인 방법으로 대장균 및 효모에서 발현(선행 특허출원 제93-6842호, 제93-6841호 참조)되었고 당화 목적으로 인간 IL-2 전구서열을 외피 2단백질에 접합시켜 재조합 베큘로 바이러스를 만들고 이를 곤충세포에서 발현하였으며(선행 특허 제93-16562호 참조), pMJ-601 벡터를 이용해 재조합 벡시니아 바이러스를 만들고 HeLa S3 세포에서 발현시켜 분자량 약 68kd의 당화된 외피 2단백질이 합성되도록 하였다(선행 특허출원 제93-26250호 참조).

당화된 외피 2단백질을 다량 얻는데 베큘로 바이러스 또는 벡시니아 바이러스를 이용하는 것은 기술적으로 제한이 많기 때문에, 본 발명자들은 현탁 배양(suspension culture)이 가능하여 대량 배양을 할 수 있고 미연방 식품 의약국(FDA)이 의약품 제조용으로 허가된 CHO세포를 이용하여 외피 2단백질을 발현 시스템의 개발을 시도하였다.

이를 위한 동물 세포 발현벡터로 외래 유전자와 선별 유전자의 단백질을 암호화하는 두 개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 갖는 mRNA가 한 개의 프로모터로부터 전사되도록 되는 바이시스트로닉 벡터를 사용하는데, 예를 들면 선별유전자로 dhfr(dihydrofolate reductase)유전자를 갖는 pCED2(본 출원인의 선행 특허출원 제94-2967호 참조)를 사용할 수 있다. 외래 유전자를 포함하는 pCED2 벡터로 CHO 세포를 형질전환시킬 경우 외래 유전자와 선별 유전자가 염색체에 통합(integration)되고 선별 유전자인 dhfr의 저해자인 메소트랙세이트 (methotrexate, 이하 MTX)를 이용하여 외래 유전자를 증폭시키는데 있어서 외래 유전자가 제거되는 단점을 최소화할 수 있다. 상기 벡터의 외래 유전자를 클로닝 부위, 예를 들면 BamH I, Xho I 부위에 C형 간염 바이러스 외피 2유전자를 클로닝하여 발현 벡터를 제조할 수 있다.

외피 2단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위하여 상기 외피 2유전자가 클로닝된 발현벡터를 CHO 세포에 형질감염시킨다. 예를 들어, 상기 발현벡터를 CHO-dhfr- 세포에 칼슘포스페이트법으로 형질감염시킨 후 알파배지에서 선택배양하여 형질전환을 유도할 수 있다. 또한 형질전환된 세포의 유전자를 증폭시키기 위해 선별유전자인 dhfr의 저해자인 MTX를 배지에 포함하여 유전자 증폭을 유도한다(Kaufman, Method in Enzymology 185, 537-566(1989)).

초기 농도 0.05μM MTX로부터 시작해서 0.4μM 농도까지 서서히 높여가면서 세포주를 계속 선별함으로써 외피 2항원 단백질을 과량 합성할 수 있는 세포주를 개발하였고 MTX의 농도를 1mM까지 높일 경우 더 많은 양의 외피 2단백질 합성을 기대할 수 있다. 상기 선별된 세포주를 10% 소태아 혈청 알부민(FBS)을 포함하는 IMDM 배지(Gibco BRL Cat. # 12200-036) 등에서 약 37℃에서 약 3일동안 배양하여 당화된 외피 2항원 단백질을 얻을 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

[실시예]

단계 1) 발현벡터 pCED2 IL2·E3의 제조

본 출원인의 선행출원 C형 간염 바이러스의 외피 2단백질의 제조를 위한 재조합 벡시니아 바이러스 및 포유동물 세포에서의 발현(특허출원 제93-26250호 참조)에서의 IL-2 리더 서열과 융합되어 있는 외피 2단백질 유전자를 pCED2 벡터의 BamH I, Xho I 제한 효소 절단 부위에 클로닝시키기 위해 핵산 중합 효소 연쇄반응을 이용하였다. 먼저 Bam I 인자분위와 N-말단의 IL-2 리더 서열을 포함하는 올리고뉴클로오타이드 31-mer의 BamIL2 프라이머(5'-AATCGGATCCATGTACAGGATGCAACTCCTG-3')와 외피 2단백질의 C-말단서열과 Xho I인지 부위를 포함하는 33-mer의 올리고뉴클레오타이드 E2Xho 프라이머(5'-CGAACTCGAGTCACGCGTCCGCCAGAAGAAGGA-3')를 핵산 합성기(Applied Biosystem. Inc. U.S.A. 380B)로 합성한 후 변성 아크릴 아마이드젤에서 전기 영동으로 분리한 후 C18 칼럼인 SEP-PAK(Waters, Inc. U.S.A.)에서 부착시키고 25% 아세토나이트릴로 용출하여 순수정제하였다. 260nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정한 후 각 뉴클레오타이드를 약 5.0 A260의 농도가 되도록 준비하였다.

IL-2 리더 서열과 외피 2단백질 유전자를 포함하고 있는 벡시니아 발현 벡터 pMJ IL2-E2(야생형 벡시니아 바이러스 DNA와 벡터 pMJ IL2-E2를 함께 동물 세포에 형질감염시켜 제조한 재조합 벡시니아 바이러스 VVLUC-IL2 E2는 1993년 10월 8일자 American Type Culture Collection에 기탁번호 ATCC VR2435로 기탁되어 있음)를 주형으로 하고 BamIL2, E2Xho 프라이머를 이용해 중합 효소연쇄 반응을 수행하는데 그 조건은 10㎕의 10X 중합효소 완충용액(10mM Tris-Cl, pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.1%젤라틴), 10㎕의 dNTP(1.24mM dATP, dCTP, dGTP 및 TTP의 혼합액), 5㎕의 BamIL2프라이머, 5㎕의 E2Xho 프라이머, 1㎕의 주형 pMJIL2-E2 DNA(0.1ng), 67㎕의 증류수에 2단위의 AmpliTaq(Perkin-Elmer. U.S.A.)핵산 중합효소를 넣고 잘 혼합시켰다.

온도순환기(Thermocycler, Perkin-Elmer, U.S.A.)를 이용하는데 순환프로그램은 94℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 1분간의 순환을 25회 반복하였다. 이렇게 해서 약 1100 염기쌍의 IL2-E2 핵산을 얻은 후 페놀/클로로포름 처리하고 에탄올 침전시켰다. 얻어진 유전자 핵산을 10mM Tris·Cl pH7.0, 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM DTT 조건하에서 BamH I, Xho I 제한효소로 절단하고 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 1091 염기쌍의 핵산 절편을 전기영동에 의한 젤로부터의 핵산 추출방법(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed. CSH)으로 분리한 후 일루팁-D(Schuleicher Schuell, U.S.A.)를 이용하여 순수 정제하였다. 한편 특허출원 제94-2967호 신규 바이시스트로닉 벡터에서의 발현 벡터 pCED2 L-EPO(이 벡터로 형질 전환된 대장균 MC1061/P3(Escherichia coli MC1061/P3-EPO, pCED2-EPO)는 1993년 12월 8일자로 American Type Culture Collection에 기탁번호 ATCC 69513호로 기탁되어있음)를 위와 동일한 조건하에서 BamH I, Xho I 제한효소를 사용하여 절단하고 5200 염기쌍에 해당하는 벡터 절편을 얻었다. 얻은 두 개의 핵산 절편을 T4 DNA 리가제를 이용하여 반응시킨 후 그 반응액을 대장균 MC 1061/P3(Cat. #C663-03, Invitrogen Corp. U.S.A.; ara D139(araABC-Leu) 7679 galU galK lacX74(r-k, m+k) rpsL thi mcrB{p3 : amber ampr, amber terr, kmr} 컴피턴트 세포에 첨가시켜 주고 하나한의 방법(J. Mol. Biol. 116, 557(1983))에 따라 형질전환시킨 후 LB-엠피실린-테트라사이클린(Amp. 30㎛/㎖ Tet 7.5㎍/㎖을 포함하는 LB 배지)플레이트에서 대장균 형질전환체를 선별하여 이로부터 pCED 2IL2 E2 벡터 DNA를 분리하였고, DNA 플라스미드 정제 키트(Cat, #12125 Quiagen U.S.A.)를 이용하여 벡터 DNA를 순수정제하였다.

단계 2) 동물세포의 형질전환 및 유전자의 증폭

C형 간염 바이러스의 외피 2항원을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위하여 우선, CHO-dhfr-세포(ATCC CRL9096)를 35mm플레이트에 15배 정도 희석분양한 후 37℃에서 CO₂배양기에서 배양하였다. 다음날 세포가 플레이트에 70∼80% 정도 성장한 것을 확인한 후 칼슘 포스페이트 침전법(Graham et al., Virology 52, 456(1973))으로 pCED2IL2 E2 플라스미드 DNA를 사용하여 형질감염(transfection)시켰다. 이때 사용한 배지는 하이포산틴(hypoxanthine)과 티미딘(thymidine)이 각각 10㎍/㎖ 포함된 완전 알파배지[Complete a medium , Minimum Essential Medium(MEM)(Gibco BRL Cat. #12000-022)에 하이포산틴과 티미딘이 함유된 배지]을 사용했다. 형질감염 이틀 후에 세포를 15배 희석분양한 뒤 하이포산틴과 티미딘이 없는 알파배지에서 37℃에서 배양하여 형질전환된 CHO 세포만 성장할 수 있는 선택배양을 했다. 선택배양 시작 2주 후부터 살아남은 세포의 콜로니가 형성되기 시작하며 이중 성장속도가 가장 양호한 12개의 세포 콜로니를 클로닝하여 세포수가 10⁷이상 될 때까지 배양한 후 일부를 동결보관하고 일부는 유전자 증폭과정을 수행하였다.

단계 3) 형질전환된 동물세포의 유전자 증폭

형질전환된 유전자의 증폭과정은 dhfr의 저해자인 MTX(methotrexate)의 농도를 점차 증가시켜 세포를 배양함으로써 dhfr 유전자와 함께 형질전환된 외피 2항원 유전자의 증폭을 유도하는 과정이다.

MTX의 농도는 초기에 0.005μM부터 시작하여 4배씩 단계별로 증가시켜서 0.4μM의 농도까지 증가시켰다. 초기에 배지에 MTX를 첨가하면 세포의 성상이 변하며 성장이 둔화되었다. 그러나 계속 3일 간격으로 계대배양을 하게 되면 점차 세포의 성상과 성장이 정상상태로 돌아오게 되며, 이때 다시 MTX의 농도를 4배 증가시켰다. 이러한 과정을 반복적으로 실시하여 외피 2항원 단백질을 대량 생합성할 수 있는 세포주를 개발하였다.

단계 4) 외피 2단백질의 발현 및 확인

상기 단계 3)에서 얻어진 세포주들을 6공 배양판(35mm)에서 2㎖의 완전 알파배지로 48∼72시간 배양하여 세포수가 10^`/공(well)정도 자라면 배양액을 버리고, 6공 배양판에 1㎖의 0.25㎎/㎖ 트립신, 10mM EDTA 용액을 가하고 5∼10분 방치하여 세포들이 배양판에서 떨어지도록 한 후 1000rpm에서 5분 원심분리하여 세포 침전물을 얻고 이 세포침전물에 100㎕의 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴 아마이드 전기영동용 시료 완충액을 넣고 5분간 가열한 후 램리의 방법(Lammli, Nature 227, 680(1970))에 따라 13% 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하였다. 겔상에서 분리된 단백질을 토빈의 방법(Towbin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4750(1979))에 따라 나이트로 셀룰로스 필터로 전달시켰다.

이 필터를 0.2% 젤라틴이 함유된 인산염 완충 생리식염수(phosphate burrered saline, pH7.4)에 넣고 30분간 흔들면서 젤로부터 전달시킨 단백질 이외의 단백질 흡착부위를 차단시켰다. 그 다음, 0.25% 젤라틴, 1% 트리톤 X-100 및 0.02% 티메로살이 함유된 인산염 완충 생리식염수에 대장균으로부터 유래된 이피 2단백질(UB-E2N)(특허출원 제93-6842호 참조)을 토끼에 면역하여 얻은 항-외피 2항체(Northview Immunology Lab., CA., U.S.A.)를 1 : 1000으로 희석하여 첨가한 후 상온에서 1시간 흔들어 주면서 반응시켰다. 반응이 완료된 필터는 0.05% 트윈 20을 함유한 인산염 완충 생리식염수로 5분씩 4회 세척하였다. 세척된 필터는 10%(v/v) 혈청, 1%( v/v) 피콜(Ficoll), 0,05% 트윈-20 및 0.02%(w/v) 티메로살이 함유된 완충액으로 1 : 1000으로 희석된 서양고추냉이 퍼록시다아제 접합 항-토끼 면역글로불린 G 항체(Goat anti-Rabbit IgG-HRP, Amercan Qualex, Cat. No. A102PS)를 넣고 1시간 더 반응시킨 후 상기의 세척액으로 4회 세척한 후 50mM 트리스 완충액(pH 7.5)으로 2회 더 세척하였다. 이 필터를 400㎍/㎖의 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소가 함유된 50mM 트리스 완충액을 가하여 발색시켰다. 그 결과를 제3도에 나타내었다. 제3도에서(-)옅은 음성표준으로 CHO 세포만의 침전물을 나타낸 것이고, 제W열은 PMJIL2-E2로 재조합된 벡시니아 바이러스가 감염된 세포 침전물을 나타낸 것이고, 제2, 3, 5, 7, 8 및 9번으로 표시된 열은 각각 0.4μM MTX에서 선택된 세포주의 침전물인데 9번 시료가 외피 2단백질을 가장 많이 발현하였다(100㎍/1ℓ 배양액 정도). 상기 세포주는 CHO-E2라 명명되었으며 1994년 7월 19일자로 한국과학기술연구원 유전자 은행에 기탁번호 KCTC 0117BP로 기탁되었다.

Claims (3)

1. IL-2 리더 서열과 C형 간염 바이러스 외피 2단백질을 코딩하는 유전자의 융합유전자 및 디하이드로플레이트 환원효소(dhfr) 유전자를 하나의 프로모터 조절하에 포함하는 바이시스트로닉 발현벡터 pCED2 IL2 E2로 차이니스 햄스터 오바리(CHO) 세포주를 형질전환시키고, 형질전환체를 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 배지에서 배양하여 상기 외피 2단백질을 유전자를 증폭시킴으로써 제조된, 당화된 외피 2단백질을 안정적으로 생산하는 차이니스 햄스터 오바리(CHO) 세포주.
2. 제1항에 있어서, 차이니스 햄스터 오바리(CHO)-E2(KCTC 0117BP)인 세포주.
3. 제1항 또는 제2항의 세포주를 배양함을 포함하는, 당화된 C형 간염 바이러스 외피 2단백질을 제조하는 방법.