JPWO2021151114A5 - - Google Patents
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Description
従来の２％および３％のＳＨＭカットオフが、ｉ）変異ＣＬＬ（ＭＣＬＬ）を分離する場合、３％超のＳＨＭおよびかかる個体は良好な予後を有すると考えられ、ｉｉ）２％～３％カットオフの中間ＣＬＬおよびかかる個体は、不均一な転帰を有すると考えられ、ｉｉｉ）２％未満のＳＨＭを有する未変異ＣＬＬ（ＵＣＬＬ）およびかかる個体は、不良な予後を有すると考えられ、提案される４つのサブグループに重ね合わされる。２～３％のＳＨＭサブセットは、グループＩＩとＩＶの混合からなることに注意されたい。グループＩＩは、一般的に不良な予後を有すると仮定され、グループＩＶは、良好な予後を有すると仮定される。＞３％のＳＨＭを有する試料は、グループＩＩＩおよびＩＶで高められており、最良の予後を有すると仮定される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕自己免疫疾患または障害を有する対象の療法に対する臨床応答を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて予測する方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、
ｄ）前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンのサブクラス、その上、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭおよび／またはＩｇＤならびにスイッチ化ＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＥ発現細胞の頻度を決定することと、
ｅ）前記対象を、（ｉ）前記ＳＨＭ頻度が、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞で頻度閾値未満であり、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合に、化学療法に対する応答者、（ｉｉ）前記ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法に対する非応答者、および／または（ｉｉｉ）前記ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法に対する応答者、の可能性が高いとして特定することと、を含む、方法。
〔２〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：
（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴ m 、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔５〕に記載の方法。
〔８〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、前記〔５〕に記載の方法。
〔９〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔９〕に記載の方法。
〔１２〕前記ＳＨＭ頻度のカットオフが、８％である、前記〔１〕に記載の方法。
〔１３〕ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１４〕前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１６〕生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕自己免疫疾患または障害の症状を有する対象を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて慢性可変免疫不全障害を有するとして診断する方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、
ｄ）前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンのクラススイッチ組換え頻度を決定することと、
ｅ）前記ＳＨＭ頻度がスイッチ化アイソタイプで頻度閾値未満であり、前記試料におけるクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の前記頻度が、頻度閾値未満であり、前記免疫レパートリーで、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、前記対象を原発性免疫不全障害を有するとして特定し、それによって前記対象が慢性可変免疫不全障害を有すると診断することと、を含む、方法。
〔１８〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：
（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴ m 、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、前記〔１７〕または〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、前記〔１７〕～〔１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２１〕前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔１７〕～〔２１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２２〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２４〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２５〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔１７〕～〔２０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２６〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、前記〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔２５〕に記載の方法。
〔２８〕ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２９〕前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、前記〔２８〕に記載の方法。
〔３０〕前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔３１〕生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３２〕自己免疫疾患または障害を有する対象を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するための方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、
ｄ）前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンのクラススイッチ組換え頻度を決定することと、
ｅ）前記対象を、（ｉ）前記ＳＨＭ頻度が、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞で頻度閾値未満であり、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法を用いて、（ｉｉ）前記ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法を用いて、治療することと、を含む、方法。
〔３３〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：
（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴ m 、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちの任意の１つ以上を有する、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、前記〔３２〕または〔３３〕に記載の方法。
〔３５〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、前記〔３２〕～〔３４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３６〕前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔３２〕～〔３５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３７〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記〔３６〕に記載の方法。
〔３８〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔３６〕に記載の方法。
〔３９〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、前記〔３６〕に記載の方法。
〔４０〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔３２〕～〔３５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４１〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、前記〔４０〕に記載の方法。
〔４２〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔４０〕に記載の方法。
〔４３〕前記ＳＨＭ頻度のカットオフが、８％である、前記〔３２〕に記載の方法。
〔４４〕ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、前記〔３２〕に記載の方法。
〔４５〕前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、前記〔４４〕に記載の方法。
〔４６〕前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、前記〔３２〕に記載の方法。
〔４７〕生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、前記〔４６〕に記載の方法。
〔４８〕前記対象が、関節リウマチを有する、先行態様のいずれか一項に記載の方法。
〔４９〕前記免疫療法が、チェックポイント遮断剤、またはＢ細胞枯渇剤を含む、先行態様のいずれか一項に記載の方法。
〔５０〕前記化学療法が、メトトレキサートを含む、先行態様のいずれか一項に記載の方法。
〔５１〕白血病を有する対象の予後を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて予測する方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）の頻度を特定することと、
ｄ）ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度、ならびに／またはスイッチ化アイソタイプの少なくとも１つおよび／もしくは組み合わせが、前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンの同じ可変系統で特定される進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度、を決定することと、
ｅ）前記レパートリークローンを、以下のサブクラス：
クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、
クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、
ｆ）前記対象の予後を、前記Ｂ細胞免疫レパートリーの前記細分類に基づいて、
クラスＩ：最悪の予後、
クラスＩＩ：不良な予後、
クラスＩＩＩ：良好な予後、
クラスＩＶ：最良の予後、に特定することと、を含む、方法。
〔５２〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：
（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴ m 、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちの任意の１つ以上を有する、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５３〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、前記〔５１〕または〔５２〕に記載の方法。
〔５４〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、前記〔５１〕～〔５３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５５〕前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔５１〕～〔５４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５６〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記〔５５〕に記載の方法。
〔５７〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔５５〕に記載の方法。
〔５８〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、前記〔５５〕に記載の方法。
〔５９〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔５１〕～〔５４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６０〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、前記〔５９〕に記載の方法。
〔６１〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔５９〕に記載の方法。
〔６２〕前記クラスＩＩＩの平均ＳＨＭ頻度が、約２％である、前記〔５１〕に記載の方法。
〔６３〕ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、前記〔５１〕に記載の方法。
〔６４〕前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、前記〔６３〕に記載の方法。
〔６５〕前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、前記〔５１〕に記載の方法。
〔６６〕生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、前記〔６５〕に記載の方法。
〔６７〕白血病を有する対象を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するための方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することと、
ｄ）ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度、ならびに／またはスイッチ化アイソタイプの少なくとも１つおよび／もしくは組み合わせが、前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンの同じ可変系統で特定される進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度、を決定することと、
ｅ）前記レパートリークローンを、以下のサブクラス：
クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、
クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、
ｆ）前記対象を、前記Ｂ細胞免疫レパートリーの前記細分類に基づいて、
クラスＩ：化学療法、放射線、またはＤＮＡ修復誘導剤のうちのいずれかの任意選択的な追加を用いた幹細胞療法、
クラスＩＩ：任意選択的なＤＮＡ修復誘導剤を用いた化学療法、放射線、または免疫療法、
クラスＩＩＩ：化学療法または免疫療法、および
クラスＩＶ：標準的な化学療法または免疫療法、で治療することと、を含む、方法。
〔６８〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：
（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴ m 、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する、前記〔６７〕に記載の方法。
〔６９〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、前記〔６７〕または〔６８〕に記載の方法。
〔７０〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、前記〔６７〕～〔６９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７１〕前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔６７〕～〔７０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７２〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記〔７１〕に記載の方法。
〔７３〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔７１〕に記載の方法。
〔７４〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、前記〔７１〕に記載の方法。
〔７５〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔６７〕～〔７０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７６〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、前記〔７５〕に記載の方法。
〔７７〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔７５〕に記載の方法。
〔７８〕前記ＳＨＭ頻度のカットオフが、８％である、前記〔６７〕に記載の方法。
〔７９〕ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、前記〔６７〕に記載の方法。
〔８０〕前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、前記〔７９〕に記載の方法。
〔８１〕前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、前記〔６７〕に記載の方法。
〔８２〕生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、前記〔８１〕に記載の方法。
〔８３〕前記対象が、慢性リンパ性白血病を有する、前記〔５１〕～〔８２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８４〕前記免疫療法が、標的化した生物学的薬剤、またはＢ細胞枯渇剤を含む、前記〔５１〕～〔８３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８５〕前記化学療法が、フルダラビンを含む、前記〔５１〕～〔８３〕に記載の方法。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕自己免疫疾患または障害を有する対象の療法に対する臨床応答を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて予測する方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、
ｄ）前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンのサブクラス、その上、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭおよび／またはＩｇＤならびにスイッチ化ＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＥ発現細胞の頻度を決定することと、
ｅ）前記対象を、（ｉ）前記ＳＨＭ頻度が、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞で頻度閾値未満であり、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合に、化学療法に対する応答者、（ｉｉ）前記ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法に対する非応答者、および／または（ｉｉｉ）前記ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法に対する応答者、の可能性が高いとして特定することと、を含む、方法。
〔２〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：
（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴ m 、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔５〕に記載の方法。
〔８〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、前記〔５〕に記載の方法。
〔９〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔９〕に記載の方法。
〔１２〕前記ＳＨＭ頻度のカットオフが、８％である、前記〔１〕に記載の方法。
〔１３〕ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１４〕前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１６〕生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕自己免疫疾患または障害の症状を有する対象を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて慢性可変免疫不全障害を有するとして診断する方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、
ｄ）前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンのクラススイッチ組換え頻度を決定することと、
ｅ）前記ＳＨＭ頻度がスイッチ化アイソタイプで頻度閾値未満であり、前記試料におけるクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の前記頻度が、頻度閾値未満であり、前記免疫レパートリーで、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、前記対象を原発性免疫不全障害を有するとして特定し、それによって前記対象が慢性可変免疫不全障害を有すると診断することと、を含む、方法。
〔１８〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：
（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴ m 、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、前記〔１７〕または〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、前記〔１７〕～〔１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２１〕前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔１７〕～〔２１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２２〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２４〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２５〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔１７〕～〔２０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２６〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、前記〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔２５〕に記載の方法。
〔２８〕ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２９〕前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、前記〔２８〕に記載の方法。
〔３０〕前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔３１〕生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３２〕自己免疫疾患または障害を有する対象を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するための方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、
ｄ）前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンのクラススイッチ組換え頻度を決定することと、
ｅ）前記対象を、（ｉ）前記ＳＨＭ頻度が、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞で頻度閾値未満であり、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法を用いて、（ｉｉ）前記ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法を用いて、治療することと、を含む、方法。
〔３３〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：
（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴ m 、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちの任意の１つ以上を有する、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、前記〔３２〕または〔３３〕に記載の方法。
〔３５〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、前記〔３２〕～〔３４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３６〕前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔３２〕～〔３５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３７〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記〔３６〕に記載の方法。
〔３８〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔３６〕に記載の方法。
〔３９〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、前記〔３６〕に記載の方法。
〔４０〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔３２〕～〔３５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４１〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、前記〔４０〕に記載の方法。
〔４２〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔４０〕に記載の方法。
〔４３〕前記ＳＨＭ頻度のカットオフが、８％である、前記〔３２〕に記載の方法。
〔４４〕ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、前記〔３２〕に記載の方法。
〔４５〕前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、前記〔４４〕に記載の方法。
〔４６〕前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、前記〔３２〕に記載の方法。
〔４７〕生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、前記〔４６〕に記載の方法。
〔４８〕前記対象が、関節リウマチを有する、先行態様のいずれか一項に記載の方法。
〔４９〕前記免疫療法が、チェックポイント遮断剤、またはＢ細胞枯渇剤を含む、先行態様のいずれか一項に記載の方法。
〔５０〕前記化学療法が、メトトレキサートを含む、先行態様のいずれか一項に記載の方法。
〔５１〕白血病を有する対象の予後を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて予測する方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）の頻度を特定することと、
ｄ）ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度、ならびに／またはスイッチ化アイソタイプの少なくとも１つおよび／もしくは組み合わせが、前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンの同じ可変系統で特定される進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度、を決定することと、
ｅ）前記レパートリークローンを、以下のサブクラス：
クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、
クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、
ｆ）前記対象の予後を、前記Ｂ細胞免疫レパートリーの前記細分類に基づいて、
クラスＩ：最悪の予後、
クラスＩＩ：不良な予後、
クラスＩＩＩ：良好な予後、
クラスＩＶ：最良の予後、に特定することと、を含む、方法。
〔５２〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：
（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴ m 、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちの任意の１つ以上を有する、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５３〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、前記〔５１〕または〔５２〕に記載の方法。
〔５４〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、前記〔５１〕～〔５３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５５〕前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔５１〕～〔５４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５６〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記〔５５〕に記載の方法。
〔５７〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔５５〕に記載の方法。
〔５８〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、前記〔５５〕に記載の方法。
〔５９〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔５１〕～〔５４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６０〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、前記〔５９〕に記載の方法。
〔６１〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔５９〕に記載の方法。
〔６２〕前記クラスＩＩＩの平均ＳＨＭ頻度が、約２％である、前記〔５１〕に記載の方法。
〔６３〕ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、前記〔５１〕に記載の方法。
〔６４〕前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、前記〔６３〕に記載の方法。
〔６５〕前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、前記〔５１〕に記載の方法。
〔６６〕生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、前記〔６５〕に記載の方法。
〔６７〕白血病を有する対象を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するための方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することと、
ｄ）ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度、ならびに／またはスイッチ化アイソタイプの少なくとも１つおよび／もしくは組み合わせが、前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンの同じ可変系統で特定される進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度、を決定することと、
ｅ）前記レパートリークローンを、以下のサブクラス：
クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、
クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、
ｆ）前記対象を、前記Ｂ細胞免疫レパートリーの前記細分類に基づいて、
クラスＩ：化学療法、放射線、またはＤＮＡ修復誘導剤のうちのいずれかの任意選択的な追加を用いた幹細胞療法、
クラスＩＩ：任意選択的なＤＮＡ修復誘導剤を用いた化学療法、放射線、または免疫療法、
クラスＩＩＩ：化学療法または免疫療法、および
クラスＩＶ：標準的な化学療法または免疫療法、で治療することと、を含む、方法。
〔６８〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：
（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴ m 、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する、前記〔６７〕に記載の方法。
〔６９〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、前記〔６７〕または〔６８〕に記載の方法。
〔７０〕前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、前記〔６７〕～〔６９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７１〕前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔６７〕～〔７０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７２〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記〔７１〕に記載の方法。
〔７３〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔７１〕に記載の方法。
〔７４〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、前記〔７１〕に記載の方法。
〔７５〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、前記〔６７〕～〔７０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７６〕前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、前記〔７５〕に記載の方法。
〔７７〕前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、前記〔７５〕に記載の方法。
〔７８〕前記ＳＨＭ頻度のカットオフが、８％である、前記〔６７〕に記載の方法。
〔７９〕ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、前記〔６７〕に記載の方法。
〔８０〕前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、前記〔７９〕に記載の方法。
〔８１〕前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、前記〔６７〕に記載の方法。
〔８２〕生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、前記〔８１〕に記載の方法。
〔８３〕前記対象が、慢性リンパ性白血病を有する、前記〔５１〕～〔８２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８４〕前記免疫療法が、標的化した生物学的薬剤、またはＢ細胞枯渇剤を含む、前記〔５１〕～〔８３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８５〕前記化学療法が、フルダラビンを含む、前記〔５１〕～〔８３〕に記載の方法。
Claims (18)
- 自己免疫疾患または障害を有する対象の療法に対する臨床応答を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて予測する方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、
ｄ）前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンのサブクラス、その上、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭおよび／またはＩｇＤならびにスイッチ化ＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＥ発現細胞の頻度を決定することと、
ｅ）前記対象を、（ｉ）前記ＳＨＭ頻度が、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞で頻度閾値未満であり、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合に、化学療法に対する応答者、（ｉｉ）前記ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法に対する非応答者、および／または（ｉｉｉ）前記ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法に対する応答者、の可能性が高いとして特定することと、を含む、方法。 - 前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：
（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有し、
任意に、前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、請求項１に記載の方法。 - 前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項４に記載の方法。
- 前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、請求項４に記載の方法。
- 前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、または
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、請求項７に記載の方法。 - 前記ＳＨＭ頻度のカットオフが、８％である、請求項１または２に記載の方法。
- ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含み、
任意に、前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、請求項１に記載の方法。 - 前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含み、
任意に、生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、請求項１に記載の方法。 - 自己免疫疾患または障害の症状を有する対象を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて慢性可変免疫不全障害を有するとして診断する方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、
ｄ）前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンのクラススイッチ組換え頻度を決定することと、
ｅ）前記ＳＨＭ頻度がスイッチ化アイソタイプで頻度閾値未満であり、前記試料におけるクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の前記頻度が、頻度閾値未満であり、前記免疫レパートリーで、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、前記対象を原発性免疫不全障害を有するとして特定し、それによって前記対象が慢性可変免疫不全障害を有すると診断することと、を含む、方法。 - 前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、請求項２～１１に定義される基準のうちのいずれか１つ以上を有する、請求項１２に記載の方法。
- 前記対象が、関節リウマチを有する、請求項１、２、１２または１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫療法が、チェックポイント遮断剤、またはＢ細胞枯渇剤を含み、および／または
前記化学療法が、メトトレキサートを含む、請求項１、２、１２または１３のいずれか一項に記載の方法。 - 白血病を有する対象の予後を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて予測する方法であって、
ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）の頻度を特定することと、
ｄ）ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度、ならびに／またはスイッチ化アイソタイプの少なくとも１つおよび／もしくは組み合わせが、前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンの同じ可変系統で特定される進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度、を決定することと、
ｅ）前記レパートリークローンを、以下のサブクラス：
クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、
クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、
ｆ）前記対象の予後を、前記Ｂ細胞免疫レパートリーの前記細分類に基づいて、
クラスＩ：最悪の予後、
クラスＩＩ：不良な予後、
クラスＩＩＩ：良好な予後、
クラスＩＶ：最良の予後、に特定することと、を含む、方法。 - 前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、請求項２～１１に定義される基準のうちのいずれか１つ以上を有する、請求項１６に記載の方法。
- 前記クラスＩＩＩの平均ＳＨＭ頻度が、約２％である、請求項１６または１７に記載の方法。
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