JP2020507326A - 組換え事象および再編成事象の検出に関する方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下、2017年2月13日に出願された米国特許仮出願第62/458,244号の恩典を主張し、その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
本発明は、米国立衛生研究所によって授与された助成金番号AI020047の下で政府支援によってなされた。米国政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子提出されている配列表を含有し、これは、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。2018年2月9日に作成されたASCIIコピーは、701039-086701-PCT_SL.txtと命名され、16,157バイトサイズである。
本明細書に記載の技術は、細胞における組換え事象および/または再編成事象、例えば、V(D)J組換えのハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング(HTGTS)に基づく方法を介した検出に関する。
V(D)J組換え事象の同定および特徴決定は、免疫系の理解の促進と抗体に基づく治療学の開発および最適化との両方とって興味深い。V(D)J組換えを検出する既存のDNAに基づく方法は、上流縮重Vプライマーおよび下流縮重Jプライマーの使用に依拠しており、これは、全てではないがほとんどのV(D)Jエクソンをカバーすることができ、かつ、推定されるエクソンの不均一なカバレッジを提供することができる。加えて、そのようなアプローチは、これらの2つのプライマー間の再編成された配列しか検出せず、したがって、RAGによって生成された結合をほとんどのオフターゲット配列に対して見いだすことはないと考えられる。RNAに基づくアプローチは、減少した転写レベルが原因で非生産的再編成を大幅に過小評価し、発現の欠如が原因で遺伝子座内の多くのオフターゲット再編成を見逃す。
組換え事象および/または再編成事象、例えば、Ig遺伝子座における組換え事象および/または再編成事象を検出するための増強されたHTGTSアプローチが本明細書に記載される。本明細書に記載のアッセイ法および方法は、任意のそのような事象の検出および特徴決定を既存の方法より高感度および低バイアスで可能にする。
a. 細胞からゲノムDNAおよび/またはmRNAを抽出する工程;
b. 任意で、断片化されたDNAおよび/またはmRNAサンプルを産生する工程;
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介 (LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ/または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程;
d. 工程(c)において産生された一本鎖PCR産物またはcDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび/またはcDNA産物を産生する工程であって、アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部;
ランダムヌクレオチドの近位部;および
3’オーバーハング
を含む、工程;
e. 工程(d)のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、組換え事象および/または再編成事象を含む核酸配列を増幅する工程;
f. 任意で、工程(e)のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程;
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定されたネステッドPCR産物を産生する工程;ならびに
h. 配列決定されたネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程
を含む。
細胞における組換え事象および/または再編成事象を同定する、ロバストなリニア増幅媒介ハイスループットゲノムワイド転座シーケンシング(HTGTS)法が本明細書に記載される。いずれかの局面のいくつかの態様において、組換え事象は、V(D)J組換え事象である。該方法は、Ig遺伝子座での組換えおよび/または再編成を同定することに特に関連する。
a. 細胞からゲノムDNAおよび/またはmRNAを抽出する工程;
b. 任意で、断片化されたDNAおよび/またはmRNAサンプルを産生する工程;
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介(LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ/または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程;
d. 工程(c)において産生された一本鎖PCR産物またはcDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび/またはcDNA産物を産生する工程であって、アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部;
ランダムヌクレオチドの近位部;および
3’オーバーハング
を含む、工程;
e. 工程(d)のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、Igレパートリー配列を含む核酸配列を増幅する工程;
f. 任意で、工程(e)のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程;
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定されたネステッドPCR産物を産生する工程;ならびに
h. 配列決定されたネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程
を含む。
1. 以下の工程を含む、細胞における組換え事象および/または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング(HTGTS)に基づく検出のための方法:
a. 細胞からゲノムDNAおよび/またはmRNAを抽出する工程;
b. 任意で、断片化されたDNAおよび/またはmRNAサンプルを産生する工程;
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介(LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ/または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程;
d. 工程(c)において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび/またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部;
ランダムヌクレオチドの近位部;および
3’オーバーハング
を含む、該工程;
e. 工程(d)のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、組換え事象および/または再編成事象を含む核酸配列を増幅する工程;
f. 任意で、工程(e)のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程;
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程;ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。
2. 前記組換え事象がV(D)J組換え事象である、項目1の方法。
3. 前記細胞が、成熟Bリンパ球、発生期Bリンパ球、成熟Tリンパ球、または発生期Tリンパ球からなる群より選択される、項目2の方法。
4. 抗原で免疫化された動物から得られた前記細胞を提供する工程をさらに含む、項目2または3の方法。
5. 体細胞超突然変異を起こしたV(D)Jエクソンを含む前記細胞を提供する工程をさらに含む、項目2〜4のいずれかの方法。
6. 前記細胞が胚中心Bリンパ球である、項目5の方法。
7. 工程(a)を実施する前に、
動物を抗原で免疫化する工程;および
該動物から細胞を得る工程
をさらに含む、項目2〜6のいずれかの方法。
8. 複数の一次遺伝子座特異的プライマーおよび/または二次遺伝子座特異的プライマーの使用をさらに含む、項目1〜7のいずれかの方法。
9. 前記複数のプライマーが、異なるV、D、またはJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、項目8の方法。
10. 工程(a)を実施する前に、ソース細胞またはソース組織を分化させてV(D)J組換えを開始させる工程をさらに含む、項目1〜9のいずれかの方法。
11. 前記ソース細胞が人工多能性幹細胞である、項目10の方法。
12. 前記ソース細胞が初代幹細胞である、項目10の方法。
13. 工程(a)を実施する前に、前記細胞またはソースが、RAG1/2エンドヌクレアーゼを用いて形質導入されて、V(D)J組換えを開始する、項目1〜12のいずれかの方法。
14. 前記細胞と、V(D)J組換えを開始させる1つまたはそれ以上の試薬とを接触させる工程をさらに含む、項目1〜13のいずれかの方法。
15. V(D)J組換えを開始させる前記試薬がイマチニブである、項目14の方法。
16. 前記細胞が、v-ablウイルスで形質転換されたB細胞である、項目15の方法。
17. 前記再編成事象が、がん遺伝子および/またはRAGオフターゲット切断部位を伴う、項目1の方法。
18. 前記細胞が、
AID発現細胞;がん細胞;RAGエンドヌクレアーゼ発現細胞;または神経系細胞
からなる群より選択される、項目1または17の方法。
19. 前記一次遺伝子座特異的プライマーが親和性タグを含む、項目1〜18のいずれかの方法。
20. 工程(c)の産物を親和性精製によって単離する工程をさらに含む、項目19の方法。
21. 前記親和性タグがビオチンである、項目19または20の方法。
22. 前記親和性精製が、ビオチンとストレプトアビジンとを結合する工程を含む、項目21の方法。
23. 前記親和性精製が、工程(c)の産物を基質に結合することを含む、項目20〜22のいずれかの方法。
24. 前記基質がビーズである、項目23の方法。
25. 前記ネステッドPCR工程のために使用される前記プライマーがバーコード配列を含む、項目1〜24のいずれかの方法。
26. 前記断片化が、超音波処理または制限酵素消化によって実施される、項目1〜25のいずれかの方法。
27. 前記断片化が、ゲノムDNAをランダムに剪断することによって、または高頻度切断制限酵素を用いて実施される、項目1〜26のいずれかの方法。
28. 工程(c)の産物をアダプターにライゲーションする工程が、該産物と、同じ遠位部配列およびランダム近位部配列を有するアダプター集団とを接触させる工程を含む、項目1〜27のいずれかの方法。
29. 前記アダプターの近位部が3〜10個のヌクレオチド長である、項目1〜28のいずれかの方法。
30. 前記アダプターの近位部が5〜6個のヌクレオチド長である、項目1〜29のいずれかの方法。
31. 前記アダプターが、遠位部と近位部との間にバーコード配列を含む、項目1〜30のいずれかの方法。
32. 工程(e)において産生された前記PCR産物が、シーケンシングの前に選択されたサイズである、項目1〜31のいずれかの方法。
33. 前記細胞が工程(a)の前に組織中に存在する、項目1〜32のいずれかの方法。
34. 前記シーケンシングが、次世代シーケンシング法を使用して実施される、項目1〜33のいずれかの方法。
35. 前記アライメントする工程がヒト以外の機械によって実施される、項目1〜34のいずれかの方法。
36. 前記ヒト以外の機械がコンピュータ実行可能ソフトウェアを備える、項目35の方法。
37. 前記アライメントする工程の結果をディスプレイするためのディスプレイモジュールをさらに含む、項目35の方法。
38. 前記アライメント工程の結果が、V(D)J再編成のセット全体にわたるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の突然変異プロファイルである、項目34〜37のいずれかの方法。
39. 前記細胞が哺乳動物細胞である、項目1〜38のいずれかの方法。
40. ブロッキング消化工程(f)が省略される、項目1〜39のいずれかの方法。
41. 末端修復が工程(c)の前に実施されない、項目1〜40のいずれかの方法。
42. 前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32より選択される配列を含む、項目1〜41のいずれかの方法。
43. 前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32より選択される、項目1〜41のいずれかの方法。
1. 以下の工程を含む、細胞における組換え事象および/または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング(HTGTS)に基づく検出のための方法:
a. 細胞からゲノムDNAおよび/またはmRNAを抽出する工程;
b. 任意で、断片化されたDNAおよび/またはmRNAサンプルを産生する工程;
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介(LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ/または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程;
d. 工程(c)において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび/またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部;
ランダムヌクレオチドの近位部;および
3’オーバーハング
を含む、該工程;
e. 工程(d)のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、組換え事象および/または再編成事象を含む核酸配列を増幅する工程;
f. 任意で、工程(e)のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程;
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程;ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。
2. 前記組換え事象がV(D)J組換え事象である、項目1の方法。
3. 以下の工程を含む、細胞におけるIgレパートリー配列のハイスループットなレパートリーシーケンシングに基づく検出のための方法:
a. 細胞からゲノムDNAおよび/またはmRNAを抽出する工程;
b. 任意で、断片化されたDNAおよび/またはmRNAサンプルを産生する工程;
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介(LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ/または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程;
d. 工程(c)において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび/またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部;
ランダムヌクレオチドの近位部;および
3’オーバーハング
を含む、該工程;
e. 工程(d)のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、該Igレパートリー配列を含む核酸配列を増幅する工程;
f. 任意で、工程(e)のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程;
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程;ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。
4. 検出されたレパートリーが、V(D)J組換え事象および/または体細胞超突然変異(SMH)を含む、項目3の方法。
5. 検出されたレパートリーが、Ig重鎖、Ig軽鎖、V使用頻度、およびCDR3レパートリーを含む、項目3または4の方法。
6. 前記細胞が、成熟Bリンパ球、発生期Bリンパ球、成熟Tリンパ球、発生期Tリンパ球、胚中心から得られた細胞、およびパイエル板から得られた細胞からなる群より選択される、項目1〜5のいずれかの方法。
7. 抗原で免疫化された動物から得られた前記細胞を提供する工程をさらに含む、項目1〜6のいずれかの方法。
8. 体細胞超突然変異を起こしたV(D)Jエクソンを含む前記細胞を提供する工程をさらに含む、項目1〜7のいずれかの方法。
9. 前記細胞が、胚中心Bリンパ球またはパイエル板Bリンパ球である、項目8の方法。
10. 工程(a)を実施する前に、
動物を抗原で免疫化する工程;および
該動物から細胞を得る工程
をさらに含む、項目1〜9のいずれかの方法。
11. 前記少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーが、J遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、項目1〜10のいずれかの方法。
12. 複数の一次遺伝子座特異的プライマーおよび/または二次遺伝子座特異的プライマーの使用をさらに含む、項目1〜11のいずれかの方法。
13. 前記複数のプライマーの各々が、異なるV、D、および/またはJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、項目12の方法。
14. 前記複数のプライマーの各々が、V(D)J組換えの前に前記細胞または生物のゲノム中に存在する各異なるJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、項目13の方法。
15. 集団的に前記複数のプライマーが、JH1、JH2、JH3、またはJH4の各々における1つの配列に特異的にアニーリングする、項目14の方法。
16. 集団的に前記複数のプライマーが、V(D)J組換えの前に前記細胞または生物のゲノム中に存在するJH、JK、およびJL遺伝子セグメントの各々における少なくとも1つの配列に特異的にアニーリングする、項目14の方法。
17. 前記少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーが、標的にされた前記遺伝子セグメントの縮重領域に特異的にアニーリングする、項目1〜16のいずれかの方法。
18. 工程(a)を実施する前に、ソース細胞またはソース組織を分化させてV(D)J組換えを開始させる工程をさらに含む、項目1〜17のいずれかの方法。
19. 前記ソース細胞が人工多能性幹細胞である、項目18の方法。
20. 前記ソース細胞が初代幹細胞である、項目18の方法。
21. 工程(a)を実施する前に、前記細胞またはソースが、RAG1/2エンドヌクレアーゼを用いて形質導入されて、V(D)J組換えを開始する、項目1〜20のいずれかの方法。
22. 前記細胞と、V(D)J組換えまたはSHMを開始させる1つまたはそれ以上の試薬とを接触させる工程をさらに含む、項目1〜21のいずれかの方法。
23. V(D)J組換えを開始させる前記試薬がイマチニブである、項目22の方法。
24. 前記細胞が、v-ablウイルスで形質転換されたB細胞である、項目23の方法。
25. 前記再編成事象が、がん遺伝子および/またはRAGオフターゲット切断部位を伴う、項目1〜24のいずれかの方法。
26. 前記細胞が、
AID発現細胞;がん細胞;RAGエンドヌクレアーゼ発現細胞;または神経系細胞
からなる群より選択される、項目1〜25のいずれかの方法。
27. 前記一次遺伝子座特異的プライマーが親和性タグを含む、項目1〜26のいずれかの方法。
28. 工程(c)の産物を親和性精製によって単離する工程をさらに含む、項目27の方法。
29. 前記親和性タグがビオチンである、項目27または28の方法。
30. 前記親和性精製が、ビオチンとストレプトアビジンとを結合する工程を含む、項目29の方法。
31. 前記親和性精製が、工程(c)の産物を基質に結合することを含む、項目28〜30のいずれかの方法。
32. 前記基質がビーズである、項目31の方法。
33. 前記ネステッドPCR工程のために使用される前記プライマーがバーコード配列を含む、項目1〜32のいずれかの方法。
34. 前記断片化が、超音波処理または制限酵素消化によって実施される、項目1〜33のいずれかの方法。
35. 前記断片化が、ゲノムDNAをランダムに剪断することによって、または高頻度切断制限酵素を用いて実施される、項目1〜34のいずれかの方法。
36. 工程(c)の産物をアダプターにライゲーションする工程が、該産物と、同じ遠位部配列およびランダム近位部配列を有するアダプター集団とを接触させる工程を含む、項目1〜35のいずれかの方法。
37. 前記アダプターの近位部が3〜10個のヌクレオチド長である、項目1〜36のいずれかの方法。
38. 前記アダプターの近位部が5〜6個のヌクレオチド長である、項目1〜37のいずれかの方法。
39. 前記アダプターが、遠位部と近位部との間にバーコード配列を含む、項目1〜38のいずれかの方法。
40. 工程(e)において産生された前記PCR産物が、シーケンシングの前に選択されたサイズである、項目1〜39のいずれかの方法。
41. 前記細胞が工程(a)の前に組織中に存在する、項目1〜40のいずれかの方法。
42. 前記シーケンシングが、次世代シーケンシング法を使用して実施される、項目1〜41のいずれかの方法。
43. 前記アライメントする工程がヒト以外の機械によって実施される、項目1〜42のいずれかの方法。
44. 前記ヒト以外の機械がコンピュータ実行可能ソフトウェアを備える、項目43の方法。
45. 前記アライメントする工程の結果をディスプレイするためのディスプレイモジュールをさらに含む、項目43の方法。
46. 前記アライメント工程の結果が、V(D)J再編成のセット全体にわたるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の突然変異プロファイルである、項目1〜45のいずれかの方法。
47. 前記細胞が哺乳動物細胞である、項目1〜46のいずれかの方法。
48. ブロッキング消化工程(f)が省略される、項目1〜47のいずれかの方法。
49. 末端修復が工程(c)の前に実施されない、項目の1〜48いずれかの方法。
50. 前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32または43〜65より選択される配列を含む、項目1〜49のいずれかの方法。
51. 前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32および43〜65より選択される、項目1〜50のいずれかの方法。
LAM-HTGTSは、DSB関連ベイト配列に結合するプレイ配列を同定する(Frock et al. 2015)。V(D)J組換えは、V、D、およびJセグメントの境界での連結を伴う再編成を生成するので、これらの遺伝子セグメントのいずれかに対するプライマーをベイトとして用いて、RAGによって生成されたDSBの部位を、V(D)J組換えを受ける前駆リンパ球または先駆リンパ球と成熟リンパ球の両方において同定して、さかのぼって発生早期に起こったV(D)J組換え事象を同定することができる。内因性のRAGによって生成されたDSBを用いるLAM-HTGTSは、RAGによって生成されたオンターゲット連結およびオフターゲット連結を発生期B細胞系列およびT細胞系列において同定するが、これは、先行アッセイ法においては検出できなかった(Hu et al., 2015;Zhao et al.,;また以下を参照)。ベイトプライマーが存在するDSBの部位がどれかに応じて、LAM-HTGTSは、染色体または切除サークルに存在する結合(Hu et al., 2015)を含め、全てのV(D)Jコーディング結合または対応するRSS結合を同定する(例えば、Hu et al., 2015)。定量的かつ極めて高感度である他に、LAM-HTGTSは、生産的および非生産的結合に関してバイアスがなく、単一ベイトPCRプライマーしか必要とせず、欠失結合と逆結合の両方を読み出し、そして、先行アッセイ法では見ることができなかったCACオフターゲットで生じるものなどの非常に低頻度の組換え事象でさえ容易に同定する。LAM-HTGTSはまた、これらの結合をいくつかのMb長組換えドメイン全体にわたって検出する(Hu et al., 2015)。加えて、LAM-HTGTSを使用して、V(D)J結合中間体の様々なタイプの結合を、例えば特定のDJH再編成の結合を追跡することによって、追跡することができる(Hu et al., 2015)。LAM-HTGTSはまた、個々のDまたはVをLAM-HTGTSベイトとして使用することによって、それらの結合を明らかにする。
現在、免疫療法市場および抗体研究分野は共に、関心対象の抗原に対する新規の高親和性抗体の発見を容易にできかつワクチン開発を理解する助けとなり得る、バイアスのないハイスループットアッセイ法を至急探し求めている。そのようなアッセイ法はまた、新規の抗体の工学設計を容易にすると考えられる。この必要性に取り組むために、ハイスループットアプローチを介してレパートリーシーケンシングを実施および体細胞超突然変異を解明する新規アプローチが本明細書に記載される。
本明細書に記載の方法は、以下の点で以前の方法と異なる。
1. HTGTS-Rep-seqライブラリーを生成するためにmRNAを使用することができる。
2. プライマーを、意図するベイトコーディング末端の20〜50bp下流に置くことができ;先行方法では、プライマーは、コーディング末端から少なくとも100bpであった。
3. 本明細書に記載のプライマーは、普遍的プライマーであり、全てのユーザーからのHTGTS-Rep-seqライブラリーにこれを使用することができる。
(表1)
4. HTGTS-Rep-seqに酵素ブロッキングは必要ないが、ほとんどの先行HTGTS用途は酵素ブロッキングを必要とする。
5. V(D)J再編成は、ほとんどの用途において、一般的な転座よりも高頻度に生じると予想されるので、通常、先行方法よりも少ない量の出発物質をHTGTS-Rep-seqのために使用することができる。
6. 重複全てが通常HTGTS-Rep-seq解析において維持される一方で、これは先行HTGTS用途のほとんどで当てはまらない。
7. IgBlastを使用して、HTGTS-Rep-seqライブラリーを解析し;したがって、HTGTS-Rep-seqは、抗原受容体遺伝子座内のV、D、およびJの使用頻度に関する情報を与える。
8. HTGTS-Rep-seqパイプライン(IgBlastを使用した)は、単離されたV(D)Jエクソンについての生産的および非生産的再編成情報を提供する。
9. HTGTS-Rep-seqパイプラインは、単離されたV(D)JエクソンについてのCDR3情報を提供する。
10. HTGTS-Rep-seqパイプラインは、いくつかのV(D)Jエクソンについての体細胞超突然変異情報を提供する一方で、先行の適用解析パイプラインでは突然変異は無視される。
11. HTGTS-Rep-seqパイプラインは、配列決定された断片中の1つの(V-J組換え)または2つの(V-D-J組換え)V含有結合についての情報を提供する。
12. LAM-HTGTSパイプラインは、配列決定された断片中のD-J結合およびRAGオフターゲット結合についての情報を与える。
13. HTGTS-Rep-seqを使用して、配列リード類似性によって定義されたクローン系列を同定し、アノテーションされていないV対立遺伝子および/またはセグメントを同定することができる。
発生期Bリンパ球は、V(D)J組換えを受けて、生殖系列V、D、およびJ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン(Ig)重鎖(H)および軽鎖(L)の抗原結合可変領域をコードするエクソンにアセンブルする。IgH鎖およびIgL鎖は会合して、B細胞受容体(BCR)を形成し、そこに抗原が結合するとB細胞が活性化され、BCRを抗体として分泌する。膨大な数のクローン非依存的なB細胞の各々が、IgH可変領域およびIgL可変領域の特異的セットを発現する。V(D)J組換えが膨大な初代B細胞レパートリーを生成できることは、多数の異なるV、D、およびJセグメントのコンビナトリアルアソートメントと、抗原接触のための相補性決定領域3(CDR3)を生成するそれらのセグメント間の連結の多様化と相まってもたらされる。一次抗体レパートリーの含量を綿密に評価するための、最終的には、一次抗体レパートリーがどのように二次突然変異および親和性成熟プロセスによってさらに形作られるかを研究するためのアプローチは、B細胞発生、ワクチンおよび抗体分野にとって極めて重要である。抗体レパートリーを定量するための、HTGTSレパートリーシーケンシング(HTGTS-Rep-seq)と称される、バイアスのない高感度で容易に使用可能なアッセイ法が本明細書に記載される。HTGTS-Rep-seqは、前駆および成熟マウスB細胞系列から、特定のJプライマーの使用を介して、IgHおよびIgL V(D)Jエクソンの大多数を定量的に同定し、IgHおよびIgL V(D)Jエクソンはそれらの特異的CDR3配列を含む。HTGTS-Rep-seqはまた、生産的構成または非生産的構成のいずれかにおいてDJH中間体およびV(D)Jエクソンを正確に定量する。HTGTS-Rep-seqは、クローン性B細胞増大を含むヒトサンプルの研究に、また抗体親和性成熟プロセスの追跡にも有用であるはずである。
Bリンパ球抗原受容体(BCR)は、同一の免疫グロブリン重鎖(IgH)およびIg軽鎖(IgL)から構成される。抗体は、BCRの分泌形態である。V(D)J組換えプロセスは、生殖系列V、D、およびJ遺伝子セグメントを、BCRの抗原結合可変領域エクソンをコードするエクソンにアセンブルする。RAG 1および2エンドヌクレアーゼ(RAG)は、V、DおよびJ遺伝子セグメントとそれらの隣接する組換えシグナル配列(RSS)との間でDNA二本鎖破断(DSB)を生成することによって、V(D)J組換えを開始する(1)。このプロセスでは、V、D、およびJコーディング末端は、古典的非相同末端結合によって結合される前に、開口されなければならずかつさらにプロセシングされることの多い、共有結合ヘアピンとして生成される(2)。V、D、Jコーディング末端のプロセシングは、連結領域におけるヌクレオチドの欠失または挿入の生成を伴うことができる(2);V(D)J組換えプロセスのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ成分によるヌクレオチドの高頻度のデノボ付加を含む(3)。とりわけ、V(D)J連結領域は、相補性決定領領域3(CDR3)として知られている抗体可変領域の主要抗原接触領域をコードし、したがって、これらの連結多様化プロセスは、抗体多様性に大きく寄与する。
LAM-HTGTS適応レパートリーシーケンシングの概説。HTGTS-Rep-seqライブラリーについて、Jセグメントのベイトコーディング末端を用いて、マウスIgH DJHレパートリーを、プロB細胞および末梢B細胞の両細胞由来の生産的および非生産的の両方のIgH V(D)Jレパートリーと共に、バイアスのない様式で同定した。同様に、末梢B細胞由来のマウスの生産的および非生産的Igκレパートリーも同定した。解析される全てのサンプルについて、所与のタイプのB細胞のプールから単離されたゲノムDNAを超音波処理して、およそ1kbの平均サイズを有する、したがってIgH V(D)JもしくはDJ再編成、Igκ VJ再編成、または再編成されていないJHもしくはJκを保有すると予想される断片を生成した(図11B)。
初代プロB細胞IgHレパートリーと末梢Bリンパ球のものとの間の相違を検出するHTGTS-Rep-seqの能力を試験するために、野生型C57BL/6マウスの骨髄から初代B220+CD43+IgM-プロB細胞を濃縮し、そして、脾臓からB220+IgM+ B細胞を精製した。これらの細胞集団から単離されたゲノムDNA 2μgを使用して、JH4コーディング末端ベイトプライマーを用いたHTGTS-Rep-seqを実施し、VHDJH4およびDJH4再編成を取得した(図7A;表2)。両方の細胞タイプ由来のライブラリーは、IgH可変領域遺伝子座全体にわたって、VHDJH4再編成におけるVHの広範な使用頻度を示したが、いくつかのVH(例えば、VH5-2、VH2-2、VH3-6、VH1-26、VH1-64、VH1-72、VH1-81)がより高頻度に用いられた(図7B)。C57BL/6 IgH遺伝子座は、16種類のファミリーに分類された、およそ110個の潜在的に機能的なVHおよび74個の偽VHを有する(24)。JH4コーディング末端ベイトを用いて生成されたIgHレパートリーライブラリーでは、VHDJHエクソンにおいて全16種類のファミリー由来の107の機能的VHの他に、比較的保存されたRSSを有する21個の偽VHが検出された(図17C)。とりわけ、HTGTS-Rep-seqによって検出されない3つの「機能的」VH(VH1-62-1、VH2-6-8、VH7-2)は、別のハイスループットレパートリーシーケンシング法(25)によっても発見できず、このことは、これらが、V(D)J組換えを受ける能力に関して実際に非機能的であり得ることを示している。
HTGTS-Rep-seqは、わずか1つのベイトPCRプライマーしか必要とせず、欠失および逆V(D)J結合の両方を読み出し、そして、先行レパートリーシーケンシングアッセイ法では発見できない低頻度組換え事象を同定するために容易に適応できる、DNAに基づく方法である(22)。加えて、HTGTS-Rep-seqを使用して、生産的および非生産的Vエクソン使用頻度を総合的に研究することができる。また、HTGTS-Rep-seqを用いて、V(D)J中間体の頻度を、最も注目すべきは特定のDJH再編成の頻度を定量的に同定することによって、発生的に評価することができる(22)(図7E、7F)。また、個々のDまたはVをベイトとして使用することによってそれらの結合パターンを明らかにするために、HTGTS-Rep-seqを適応させることもできる。したがって、このアッセイ法またはその適応は、発生中または免疫応答中に起こるレパートリーの変化を検出するために有用である。
マウス。野生型129SVEおよびC57BL/6マウスを、Charles River Laboratories Internationalから購入した。全ての動物実験は、ボストン小児病院の動物管理使用委員会によって承認されたプロトコール下で実施した。
&マウス1、2、3は、3匹の異なるマウスから実験を実施したことを意味し;繰り返し1、2、3は、同じマウス由来のDNAを使用して実験を実施したことを意味する。
*相関係数値(r)は、エクセルのCORREL関数を介して生産的V(D)Jエクソンの2セットから導出した(%)。その値が大きいほど、2セットのデータは類似する。
Bリンパ球は、2つの主な機序を通して、それらの抗原受容体レパートリーを多様化する:V(D)J組換えおよびSHM1。V(D)J組換えは、骨髄で起こり、そして、生殖系列V、(D)およびJセグメントのコンビナトリアルアセンブルを、抗原接触のための相補性決定領域3(CDR3)を生成するそれらの間の連結の多様化と相まって引き起こす1。抗原活性化胚中心B細胞において2、活性化誘導シチジンデアミナーゼ(AID)によって開始されるSHMは、V(D)J配列全体にわたる短いホットスポットモチーフに点突然変異を導入する3。濾胞中に存在しているナイーブB細胞が抗原によって活性化されるようになると、これらは、濾胞間領域に移動し、同族T細胞と相互作用して、これらのB細胞の完全活性化およびT細胞にとってのT濾胞性ヘルパー(TFH)細胞表現型の獲得を導く。次いで、比較的高い抗原親和性を有するTFH細胞およびB細胞は、濾胞の中心に戻り、GCの形成を施す2,4。GC内部では、B細胞は、暗帯域で急速増殖およびSHMを受けて、抗原提示濾胞樹状細胞(FDC)およびTFH細胞によって選択される明帯域に向かい5、そこで、改善された抗原結合親和性を有するB細胞が陽性選択されて、暗帯域に再度侵入し、そして、減少した親和性または不活性化B細胞受容体(BCR)を有するものが陰性選択されて、アポトーシスを受ける。2つの帯域間の再循環は、B細胞増殖、SHM、および選択の繰り返されたラウンドを容易にし、BCRクローン性増大および親和性成熟を導く。選択されたB細胞はまた、AIDによって開始されるクラススイッチ組換え(CSR)を受けて、これらが産生する抗体のクラスを変化させ、最終的に、形質細胞およびメモリB細胞に分化することができる。
脾臓またはPP胚中心B細胞の生理学的抗体レパートリーを解明するため、かつ、それを選択または成熟し得るメカニズムに発展させるため、ハイスループット抗体レパートリーシーケンシングアッセイ法(HTGTS-V(D)J SHM-seq)を開発し、これは、脾臓B細胞抗原特異的応答を追跡し、かつ、V使用頻度の完全IgHおよびIgLレパートリー、CDR3ならびにPP GC B細胞における現SHMパターンを解明するのに十分に高感度である。普遍的ナイーブB細胞レパートリーからのC57BL/6マウスのPPおよび脾臓サンプルを使用し、そして、そこからGCレパートリーを異なる様式で形成するレパートリー細胞を選択した。PP GCにおいて、特定のVHおよびクローン型選択がマウスを通してかつ個々のPPを通してさえも観察されたが、これは、特定の抗原選択の非存在下で固有のSHMターゲティングパターンを主に表す広範囲に及ぶ体細胞超突然変異(SHM)のパターンを示す。AIDは、この拘束されたBCR選択がPP GCにおいて起こるのに必須ではないが、選択されたVDJのスペクトルに影響を及ぼさない。
HTGTS-V(D)J-SHM-seqの概説
HTGTS-V(D)J SHM-seqは、V使用頻度およびCDR3レパートリーに加えて、Ig重鎖およびIg軽鎖の両方のレパートリー全体にわたる完全長V(D)J SHMプロファイルを提供する。この方法は、DNAに基づくことおよびJセグメントプライマーだけを使用したリニア増幅を用いるという点で高度に非バイアスである。IgHレパートリーについて(図24)、超音波処理されたゲノムDNA(例えば、GC B細胞から)から、混合ビオチン化JH1、JH2、JH3、JH4ベイトプライマーを使用して、VDJ連結の全てをリニア増幅した。次いで、増幅産物を、ストレプトアビジンビーズで濃縮し、Illumina社のMiseq(商標)に基づく次世代シーケンシングのために過去に記載の通りタグ化した17,18。
特異的免疫応答を追跡するHTGTS-V(D)J SHM-seqを検証するために、十分に特徴決定された免疫原:ニワトリガンマグロブリンにコンジュゲートされたNP(NP-CGG)を用いた。C57BL/6マウスをNP-CGGで腹腔内(IP)免疫化して、脾臓GC応答を刺激した。脾臓を免疫化の10日後収集し、B220+GL7+CD38- GC B細胞およびB220+GL7-CD38+非GC B細胞をFACSによってソーティングし、そして、両集団についてHTGTS-V(D)J SHM-seqライブラリーを構築した。解析用のGCおよびナイーブB細胞のより純粋な集団を得るために、かつ、FACSソーティング中の潜在的なクロスコンタミネーションを排除するために、B220+GL7+CD38-サンプルについての突然変異リードをGC B細胞としておよびB220+GL7-CD38+サンプルについての非突然変異リードをナイーブB細胞として維持することによって、Miseqリードをさらにフィルタした。脾臓GC B細胞由来のIgHレパートリーとナイーブB細胞由来のIgHレパートリーを比較することによって、以前の研究によって同定されたNP抗体に対して使用された優性VH 20〜22であるVH1-72(V186.2)の顕著なGCエンリッチメントを生産的VDJ連結において検出することが可能であった(図19A)。クローン性解析は、VH1-72連結内の上位2つの優性クローン型が、上位クローンとしてアッセイされた全ての3つのマウスによって共有されたことを明らかにし(図19B)、このことは、脾臓GCにおける強いBCR選択を示している。両方のクローン型は、DH1-1(DFL16.1)およびJH2を含有し、優性DおよびJセグメントがNP応答について報告され20〜22、それぞれ33ntおよび36ntの異なるCDR3長を有していた(図19B)。
同じNP-CGG IP免疫化マウスにおいて、また、各マウスから小腸に沿ってPPを全て切開し、そして、B220+GL7+CD38- GC B細胞およびB220+GL7-CD38+非GC B細胞をFACSによって単離した。HTGTS-V(D)J SHM-seqによって、PP由来のナイーブおよびGC B細胞 IgHレパートリーを測定し、脾臓のものと比較した。驚くことに、PPおよび脾臓ナイーブB細胞のVHレパートリーは、全ての3匹のマウスで同一であり(図20A)、相関係数r=0.99であったが、このことは、これらの組織間のナイーブB細胞の循環を示している。これと一致して、内因性PP B細胞の移動を3日間にわたって光変換技法を使用して追跡する研究は、PPと脾臓との間での顕著なナイーブB細胞交換を見いだした26。さらに、異なるマウス間のナイーブB細胞についての安定なVH組成は、極めて小さなエラーバーによって反映される通り(図20A)、共通のベースラインIgHレパートリーが全てのマウスにわたって用いられることを示している。
マウス全体のPP GCレパートリーの比較的大きな変動を考慮すれば、クローナル選択がPP GCの形成および機能において役割を果たしているかどうかを理解するために、6匹のよりナイーブなマウス由来のPPレパートリーをアッセイした。NP-CGG IP免疫化は、PP GC応答を刺激しなかったので、NP-CGG-免疫化マウスを、6匹のナイーブマウスと共に、PP GC対ナイーブIgHレパートリーの解析に含めた。PP GCにおいてBCR依存性クローナル選択がなかった場合、各マウスについてのVHのランダムエンリッチメントが予想され、したがって、9匹のマウス由来の平均のVHレパートリーは、共通のナイーブB細胞レパートリーと似ていると考えられる。代わりに、PP GCとナイーブVHレパートリーとの間の相関係数は低く(r=0.65)、いくつかのVH(VH1-47、VH11-2、VH6-6、VH6-3)の顕著なエンリッチメントがある(図21A、図27A)。VH1-47およびVH11-2がナイーブレパートリー中にほとんど存在せず、それぞれ、PP GCレパートリーにおけるその使用頻度の平均14.3倍および43.6倍の増加があったことに留意されたい。VH6-6およびVH6-3の頻度は、5.2および2.6倍増加した。具体的には、VH1-47は、4匹のマウスにおいて大きく富化され、そして、DH2-1、JH4、および36nt CDR3を含有したその上位クローン型は、3匹のマウスによって共有された(図21B)。VH11-2は、4匹のマウスにおいて富化され、上位2つのクローン型が各々2匹のマウスによって共有された(図27B)。それ故、強いBCR依存性クローナル選択は、PPにおけるGC応答の基礎になる。
6〜12個のPPが典型的にはC57BL/6マウスにおいて見いだされ、小腸の長さに沿って分布していた33。腸管微生物叢の組成が消化(GI)管に沿って異なる場所で変化し、腸上部で好気性の種が多く、腸下部および大腸で嫌気性菌が群生していることが知られている31。一例として、セグメント糸状性細菌(SFB)がGI管に沿って近位から遠位の方向に次第に増加することが見いだされた34。PP GC応答が局所共生細菌によって影響されるかどうかを理解するために、HTGTS-V(D)J SHM-seqアプローチを使用して、同じマウスにおいて個々のPP由来のGCおよびナイーブB細胞レパートリーを調べた(図22A)。全体のGC VH組成は、同一のナイーブレパートリーにも関わらず、5つの連続的な単一PP間で高度に変動可能であった(図22B)。それにも関わらず、いくつかのVH:PP3およびPP5におけるVH1-47、PP5、およびPP6におけるVH1-15、PP6、およびPP7におけるVH1-82およびVH1-12(図22B)が、1を超えるPPで富化していることが見いだされ、このことは、PP GCにおける抗原特異的BCR選択を裏付けている。VH1-47がより近位PPにおいて優占的に用いられ、そして、VH1-15、VH1-82およびVH1-12が主に遠位PPに関与する距離効果がこの選択に観察され、小腸に沿った微生物叢種の変化と相関している可能性が高い。
マウスVB1-8 VDJ IgHエクソンを使用して、PP GCにおいて、VHエクソンが選択なしで突然変異する12。この知見は、PP GC B細胞の慢性活性化が、細胞選択の非存在下で、SHMを介した一次抗体レパートリーの増大を可能にし得るという非常に興味深い可能性を提起した。あるいは、VB1-8モデルにおいて生産的VDJ配列が1つしかなかったので、SHM選択の欠乏は、VB1-8エクソンが任意の腸管抗原とマッチしない可能性に起因し得る。PP GCにおいて腸管抗原に応答して循環的に富化されたいくつかのVH(図21A)が同定されたので、それらの突然変異パターンを調査した。驚くことに、プールされた非生産的配列から生成された固有の突然変異パターンと比較して、PP GCにおける最も高度に富化されたVH1-47およびVH11-2は、突然変異を蓄積したが、CDR領域突然変異においていかなる循環選択も示さず(図23)、このことは、PPにおける親和性成熟の欠如を示している。VB1-8モデルの過去の知見と一致して、ナイーブレパートリーにおける高いベースラインレベルに起因する可能性の高い、顕著に富化されていないにも関わらずPP GCにおいて最も高頻度に用いられた同じVH1-72(図21A)はまた、配列内在性SHMを蓄積した(図29A)。したがって、PP GCは、SHM選択において従来のGCとは異なって挙動すると考えられる。
HTGTS-Rep-seqを使用して、末梢血B細胞由来のヒトIGH、IGK、およびIGLレパートリーを解析した(図30)。
Claims (51)
- 以下の工程を含む、細胞における組換え事象および/または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング(HTGTS)に基づく検出のための方法:
a. 細胞からゲノムDNAおよび/またはmRNAを抽出する工程;
b. 任意で、断片化されたDNAおよび/またはmRNAサンプルを産生する工程;
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介(LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ/または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程;
d. 工程(c)において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび/またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部;
ランダムヌクレオチドの近位部;および
3’オーバーハング
を含む、該工程;
e. 工程(d)のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、組換え事象および/または再編成事象を含む核酸配列を増幅する工程;
f. 任意で、工程(e)のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程;
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程;ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。 - 前記組換え事象がV(D)J組換え事象である、請求項1に記載の方法。
- 以下の工程を含む、細胞におけるIgレパートリー配列のハイスループットなレパートリーシーケンシングに基づく検出のための方法:
a. 細胞からゲノムDNAおよび/またはmRNAを抽出する工程;
b. 任意で、断片化されたDNAおよび/またはmRNAサンプルを産生する工程;
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介(LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ/または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程;
d. 工程(c)において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび/またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部;
ランダムヌクレオチドの近位部;および
3’オーバーハング
を含む、該工程;
e. 工程(d)のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、該Igレパートリー配列を含む核酸配列を増幅する工程;
f. 任意で、工程(e)のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程;
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程;ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。 - 検出されたレパートリーが、V(D)J組換え事象および/または体細胞超突然変異(SMH)を含む、請求項3に記載の方法。
- 検出されたレパートリーが、Ig重鎖、Ig軽鎖、V使用頻度、およびCDR3レパートリーを含む、請求項3または4に記載の方法。
- 前記細胞が、成熟Bリンパ球、発生期Bリンパ球、成熟Tリンパ球、発生期Tリンパ球、胚中心から得られた細胞、およびパイエル板から得られた細胞からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 抗原で免疫化された動物から得られた前記細胞を提供する工程をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 体細胞超突然変異を起こしたV(D)Jエクソンを含む前記細胞を提供する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、胚中心Bリンパ球またはパイエル板Bリンパ球である、請求項8に記載の方法。
- 工程(a)を実施する前に、
動物を抗原で免疫化する工程;および
該動物から細胞を得る工程
をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーが、J遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の一次遺伝子座特異的プライマーおよび/または二次遺伝子座特異的プライマーの使用をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のプライマーの各々が、異なるV、D、および/またはJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、請求項12に記載の方法。
- 前記複数のプライマーの各々が、V(D)J組換えの前に前記細胞または生物のゲノム中に存在する各異なるJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、請求項13に記載の方法。
- 集団的に前記複数のプライマーが、JH1、JH2、JH3、またはJH4の各々における1つの配列に特異的にアニーリングする、請求項14に記載の方法。
- 集団的に前記複数のプライマーが、V(D)J組換えの前に前記細胞または生物のゲノム中に存在するJH、JK、およびJL遺伝子セグメントの各々における少なくとも1つの配列に特異的にアニーリングする、請求項14に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーが、標的にされた前記遺伝子セグメントの縮重領域に特異的にアニーリングする、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)を実施する前に、ソース細胞またはソース組織を分化させてV(D)J組換えを開始させる工程をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- 前記ソース細胞が人工多能性幹細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記ソース細胞が初代幹細胞である、請求項18に記載の方法。
- 工程(a)を実施する前に、前記細胞またはソースが、RAG1/2エンドヌクレアーゼを用いて形質導入されて、V(D)J組換えを開始する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞と、V(D)J組換えまたはSHMを開始させる1つまたはそれ以上の試薬とを接触させる工程をさらに含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- V(D)J組換えを開始させる前記試薬がイマチニブである、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞が、v-ablウイルスで形質転換されたB細胞である、請求項23に記載の方法。
- 前記再編成事象が、がん遺伝子および/またはRAGオフターゲット切断部位を伴う、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、
AID発現細胞;がん細胞;RAGエンドヌクレアーゼ発現細胞;または神経系細胞
からなる群より選択される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。 - 前記一次遺伝子座特異的プライマーが親和性タグを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)の産物を親和性精製によって単離する工程をさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 前記親和性タグがビオチンである、請求項27または28に記載の方法。
- 前記親和性精製が、ビオチンとストレプトアビジンとを結合する工程を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記親和性精製が、工程(c)の産物を基質に結合することを含む、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基質がビーズである、請求項31に記載の方法。
- 前記ネステッドPCR工程のために使用される前記プライマーがバーコード配列を含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記断片化が、超音波処理または制限酵素消化によって実施される、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記断片化が、ゲノムDNAをランダムに剪断することによって、または高頻度切断制限酵素を用いて実施される、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)の産物をアダプターにライゲーションする工程が、該産物と、同じ遠位部配列およびランダム近位部配列を有するアダプター集団とを接触させる工程を含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アダプターの近位部が3〜10個のヌクレオチド長である、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アダプターの近位部が5〜6個のヌクレオチド長である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アダプターが、遠位部と近位部との間にバーコード配列を含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(e)において産生された前記PCR産物が、シーケンシングの前に選択されたサイズである、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が工程(a)の前に組織中に存在する、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シーケンシングが、次世代シーケンシング法を使用して実施される、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アライメントする工程がヒト以外の機械によって実施される、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒト以外の機械がコンピュータ実行可能ソフトウェアを備える、請求項43に記載の方法。
- 前記アライメントする工程の結果をディスプレイするためのディスプレイモジュールをさらに含む、請求項43に記載の方法。
- 前記アライメント工程の結果が、V(D)J再編成のセット全体にわたるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の突然変異プロファイルである、請求項1〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項1〜46のいずれか一項に記載の方法。
- ブロッキング消化工程(f)が省略される、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 末端修復が工程(c)の前に実施されない、請求項の1〜48いずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32または43〜65より選択される配列を含む、請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32および43〜65より選択される、請求項1〜50のいずれか一項記載の方法。
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