JPWO2021140143A5

JPWO2021140143A5 -

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Publication number: JPWO2021140143A5
Application number: JP2022541879A
Authority: JP
Publication date: 2024-01-25

Description

ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは、ＯＧＮＴ１、ＯＧＮＴ２、及びＯＧＮＴＬ、ならびにそれらの相同ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは、ＯＧＮＴ１、ＯＧＮＴ２、及び／またはＯＧＮＴＬと相同的なＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼである。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの数は、１つ、２つ、または３つである。

（Ａ）ＬｅｉｓｈｍａｎｉａｔａｒｅｎｔｏｌａｅＳｔ１０５６９における３つのＯＧＮＴ候補遺伝子のゲノム位置。染色体ＬＴＡＲ＿１７上にはＯＧＮＴ－２（ＬＴＡＲ＿１７００２０９００）が見られ、染色体ＬＴＡＲ＿２上にはＯＧＮＴ－１及びＯＧＮＴ－Ｌ（それぞれＬＴＡＲ＿０２０００６８００及びＬＴＡＲ＿０２０００６９００）が見られる。矢印は、遺伝子の方向性（５’→３’）を示す。両矢印は、染色体末端までのおよその距離を示す。（Ｂ）他のＫｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｉｄａのＯＧＮＴホモログ。Ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｉｄａゲノムをｔｒｉｔｒｙｐｄｂ．ｏｒｇからダウンロードし、Ｔ．ｃｒｕｚｉＯＧＮＴを参照クエリーとして使用し、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅＯＧＮＴに対する相互ベストヒット（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｂｅｓｔｈｉｔ）によってマッチを試験した。それぞれの種について、代表的な分離株を１つ選択し、全部で８１個の配列を使用することで、Ｔ－ｃｏｆｆｅｅを使用する多重配列アライメントによる系統樹の構築及びＲＡｘＭＬを使用する系統樹の構築を行った。系統発生関係は、矩形樹（図５Ｂ）として図示されている。（Ｃ）他のＫｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｉｄａのＯＧＮＴホモログ。Ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｉｄａゲノムをｔｒｉｔｒｙｐｄｂ．ｏｒｇからダウンロードし、Ｔ．ｃｒｕｚｉＯＧＮＴを参照クエリーとして使用し、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅＯＧＮＴに対する相互ベストヒットによってマッチを試験した。それぞれの種について、代表的な分離株を１つ選択し、全部で８１個の配列を使用することで、Ｔ－ｃｏｆｆｅｅを使用する多重配列アライメントによる系統樹の構築及びＲＡｘＭＬを使用する系統樹の構築を行った。系統発生関係は、放射樹（図５Ｃ）として図示されている。

ＩｌｌｕｍｉｎａディープシークエンシングによってＯＧＮＴ欠失を検証した。ＩＧＶゲノミクスブラウザにおいてそれぞれのＯＧＮＴ領域と一致するリードが存在しないことが示されたことから、Ｓｔ１６２４８株、Ｓｔ１６２５７株、及びＳｔ１６２４９株における単一ＯＧＮＴ遺伝子の欠失（Ａ）に成功したことが確認されている。ＩｌｌｕｍｉｎａディープシークエンシングによってＯＧＮＴ欠失を検証した。ＩＧＶゲノミクスブラウザにおいてそれぞれのＯＧＮＴ領域と一致するリードが存在しないことが示されたことから、Ｓｔ１６６３６株におけるＯＧＮＴ－１及びＯＧＮＴ－Ｌのダブルノックアウト（Ｂ）に成功したことが確認されている。

（ｉｉ）ＯＧＮＴの欠失のためのＤＮＡコンストラクト設計
ＯＧＮＴの欠失のために、３つの異なる様式のコンストラクト組成を用いた。すべての場合において、組み込みコンストラクトは、そのコンストラクト内の、２００ｂｐのオーバーラップ領域を含む２つ以上の断片（約１０００～２５００ｂｐ）へと分割し、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅゲノムへの完全なコンストラクトの相同組換えを可能とした。

（Ｃ）構成的なＣａｓ９発現を伴わないトランスフェクションのためのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の調製
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性のゲノム編集用のｇＲＮＡについては、サーマルサイクラー中で９５℃、５分間の変性を行った後、０．１℃／秒の緩徐な冷却を行うことによって上記のように等モル量のｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）からアセンブリした。このアセンブリを使用ｃｒＲＮＡごとに個別に実施してから、等モル量の異なるｇＲＮＡを混合した。次に、１２２ｐｍｏｌの組換え発現Ｃａｓ９タンパク質（すなわち、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｓ．ｐ．ＨｉＦｉＣａｓ９ヌクレアーゼＶ３（ＩＤＴ、＃１０８１０６１））を３６０ｐｍｏｌのｇＲＮＡ混合物に添加し、室温で１５分間インキュベートしてＲＮＰが形成されるようにした。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒによるトランスフェクション（セクションＥを参照のこと）に使用する最終体積は６μｌを超えないことになる。最後に、ＲＮＰ混合物を１μｌのＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ９電気穿孔エンハンサー（ＩＤＴ、＃１０８１０７２）と共に、以下に記載の修復ＤＮＡ含有トランスフェクション溶液に添加した。

（Ｆ）ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌ（商標）（Ｂｉｏｒａｄ）を用いるトランスフェクション
トランスフェクション（静置、２６℃）の前日にＢＨＩＨ中での高密度増殖培養物を１：１０希釈することによってトランスフェクション用のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ培養物の調製を実施した。光度計を用いて使い捨てキュベット中で６００ｎｍでのＯＤを測定し、効率を最適化するために、このＯＤが０．４～１．０（４～６×１０^＊７個細胞）の範囲に入るようにした。細胞は対数増殖期に入っていることになり、このことは、円形及び滴状の細胞の混合集団が存在することによって示される。円形の細胞が多い方が好ましかった。１つのトランスフェクションに１０ｍｌの培養物を使用し、それぞれの選択マーカーに対する陰性対照として、常に１つの培養物をｄｄＨ２Ｏと共に電気穿孔に供した。トランスフェクションについては、培養物を１’８００×ｇでのスピンに室温で５分間供した。上清を除去し、ペレットを５ｍｌのトランスフェクション緩衝液（２００ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、６ｍＭの無水デキストロース（グルコース）、ろ過滅菌（孔径０．２２ｕｍ）済）に再浮遊させた。細胞を再び遠心分離し、ペレットを４００μｌのトランスフェクション緩衝液に再浮遊させた。４００μｌの細胞をＤＮＡに添加し、キュベットに移し、氷上で１０分間インキュベートした。低電圧プロトコール（指数関数的減衰波：４５０Ｖ、４５０ｕＦ、５～６ミリ秒、キュベット：ｄ＝２ｍｍ）を使用してＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌ（商標）（Ｂｉｏｒａｄ）で電気穿孔を実施し、その直後に正確に１０分間氷上に置いた。キュベットの全内容物を、いずれの選択マーカーも含まない１０ｍｌのＢＨＩＨに移し、暗所で通気しながら細胞を２６℃で２０～２４時間静置培養して増殖させた。ポリクローナル細胞株の選択については、半分濃度の選択マーカーを添加し、培養物を２６℃で１～２日間インキュベートした後、完全濃度の選択マーカーを含む１０ｍｌのＢＨＩＨ中で比を１：１０として継代した。暗所、２６℃で細胞をさらに増殖させた。７日後に培養物が濁った培養物へと変化すれば、細胞は１’８００×ｇでの５分間のスピンダウンに室温で供されることになり、完全濃度の選択マーカーを含む新たなＢＨＩＨ培地にペレットが再浮遊される。

（ｖｉｉｉ）ウエスタンブロットによる発現分析
（Ａ）試料調製及びウエスタンブロットによる発現分析
細胞を２６℃で静置培養して２～３日間増殖させた（この増殖培養は、例えば、６ウェルプレート中３ｍｌで実施した）。ＯＤ値０．０５相当の全細胞抽出物（ＷＣＥ）及びＯＤ値０．０５相当の無細胞培養上清の分析はウエスタンブロットによって行われる。上清分析については、増殖培養物を１８００ｇ、室温での遠心分離に５分間供し、無細胞上清を新たなチューブに移し、還元条件または非還元条件の下でＬａｅｍｍｌｉ色素と混合した。ＷＣＥ用の細胞ペレットについては、１×ＰＢＳで洗浄し、１８００ｇ、室温での遠心分離に再び５分間供し、－８０℃で最小限に３０分間凍結した。このペレットを室温で再び解凍した後、ペレットをＬｅａｍｍｌｉ（還元）緩衝液に溶解し、９５℃で１０分間、再び煮沸し、激しくボルテックスした後、ＭＯＰＳ泳動緩衝液を使用する２００Ｖでの４～１２％ビス－トリスＳＤＳＰＡＧＥに６０分間供した。Ｉｂｌｏｔ装置を使用して７分間かけてＰＶＤＦ膜へのゲルのブロッティングを実施した。１０％の乳中での膜のブロッキング処理を室温で少なくとも３０分間実施した。１％の乳を含む１×ＰＢＳＴでの１：２０００希釈液としてポリクローナルウサギ抗ＨＡ抗体（Ｈ６９０８、Ｓｉｇｍａ）を４℃での一晩のインキュベートに使用した。その後、１×ＰＢＳＴでの５分間の洗浄にそのブロットを３回供した後、１％の乳を含む１×ＰＢＳＴでの１：４０００希釈液として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合型ヤギ抗ウサギ抗体（１７０－６５１５、ＢｉｏＲａｄ）を用いて３０℃で回転させながら３時間の二次抗体検出に供し、その後に１×ＰＢＳＴでの５分間の洗浄に３回供し、比色検出のための３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（１液組成タイプ）（ＴＭＢＭ－１０００－０１、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）での染色に供した。

（ｉｉｉ）アダリムマブの小スケール発現、精製
１４０ｒｐｍで振とうしながらＢＨＩＨ中での５０ｍｌ培養を行って宿主細胞を２６℃で４８時間所定通り増殖させた。培養物を収集し、１８００×ｇの遠心分離に室温で１０分間供した。培地上清を孔径０．２２μｍのフィルター（Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ、ＳＣＧＰ００５２５）に通してろ過し、ＥＤＴＡ（０．５ＭｐＨ８）の１：１００希釈液を各ロードに添加した。各株の培地上清を、Ｆａｌｃｏｎチューブ当たり１００μｌのプロテインＡ樹脂（プロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＢＦａｓｔＦｌｏｗ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｐ９４２４）と共に回転させながらバッチで４時間、室温でインキュベートした。プロテインＡ樹脂での処理後、試料を５００×ｇの遠心分離に５分間供し、素通り部(FT)を捨て、樹脂をスピンカラムに移した。１００μｌの樹脂に対して５００μｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ＨＣｌでｐＨを７．２０に調整した））（５ＣＶ）を使用して洗浄を３回実施した。この洗浄では、各ステップ間で１０００×ｇの遠心分離を室温で１分間実施した。溶出は、１００μｌの樹脂に対して１００μｌの緩衝液Ｂ（０．１Ｍの酢酸、１００ｍＭのＮａＣｌ（１ＭのＮａＯＨでｐＨを３．２０に調整した））を使用して実施した（いくつかのＣＶで実施）。この溶出（例えば、１ＣＶで３回及び０．５ＣＶで１回）では、各ステップ間で１０００×ｇの遠心分離を室温で１分間実施した。

（ｉｖ）ＩｄｅＳによって得られるサブユニットを分析するための試料調製
それぞれが約２５ｋＤａのｍＡｂサブユニットを生成させるために、配合緩衝液中でＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ、Ｇｅｎｏｖｉｓ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）によるｍＡｂの消化を実施した。各μｇのｍＡｂに１ユニットのＩｄｅＳを添加し、静置して３７℃で３０分間反応させた。その後、６ＭのＧｄｎＣｌ及び３０ｍＭのＴＣＥＰと共に室温で３０分間インキュベートすることによってｍＡｂの変性及び還元を行った。最後に、溶液を１％のＴＦＡに曝露して酸性化することによって反応を停止した。分析については、０．１％のＦＡ水溶液で試料を希釈してその最終濃度を１μｇ／μｌとした。

－データ依存的分析：上位１０

簡潔に記載すると、市販のＨｕｍｉｒａまたはＬ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅから精製したアダリムマブ２ｍｇをＰＮＧａｓｅＦと共に最初にインキュベート（５０Ｕ添加、３７℃で３時間）してＮ－グリカンを除去することで、単糖分析の間にＮ－グリカン由来の単糖による妨害が生じる可能性を低減した。次に、このＰＮＧａｓｅＦ処理試料をＰＢＳ（ｐＨ７．１）中、３７℃でＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（２０００Ｕ）と共に一晩インキュベートした。この消化物をバッチでのＣａｐｔｏＬ精製ステップ（室温で３時間）に供して精製することでＦｃ／２断片を除去した。残存Ｆ（ａｂ）２断片を、ＰｉｅｒｃｅＰＥＳ３ｋＤａカラムを用いて濃縮し、ＺｅｂａＳｐｉｎカラムを用いて０．１Ｍのトリス（０．１ＭのＮａＣｌ含有、ｐＨ８．０）に含めて再度緩衝下に置いた。再度緩衝下に置いたこの試料を、２ｍＭのシステインの存在下でＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ（２０００Ｕ）と共に３７℃で一晩インキュベートした。ＴＣＥＰ（２０ｍＭ）を用いて試料を２０分間還元した後、Ｏ－ＨｅｘＮＡｃ部位を含む１４アミノ酸ペプチドを、１０ｋＤａＰｉｅｒｃｅＰＥＳカラム（ＬＣ断片及びＦｄ断片は保持される）を使用して精製した。Ｏ－ＨｅｘＮＡｃ修飾を有する１４アミノ酸ペプチド及びＯ－ＨｅｘＮＡｃ修飾を有さない１４アミノ酸ペプチドの存在をＭＡＬＤＩによって確認した。ＭＡＬＤＩ測定の間、サブユニット（ＬＣ、Ｆｃ／２、Ｆｄ）は同定されなかった。

製造者の説明に従ってＣ１８ＺｉｐＴｉｐピペットチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて試料を脱塩した後、グラウンドスチールターゲットプレート上で、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ；トリフルオロ酢酸含有率０．１％の４０％アセトニトリル中に５ｍｇ／ｍｌのＨＣＣＡを含むもの）マトリックスにスポットした。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳは、ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅマトリックス支援レーザー脱離／イオン化－飛行時間／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ）質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）をリフレクターポジティブイオンモードで操作して実施した。機器の操作はｆｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌ３．４（Ｂｒｕｋｅｒ）で行い、その際、レーザー強度を３０～４０％、質量範囲をｍ／ｚ７００～３５００、検出器ゲインを２×、サンプリングレートを２．５ＧＳ／秒とした。５００回のショットステップで実施した３０００回のレーザーショットを積算した。シグナル／ノイズカットオフ値を５とし、ＴｏｐＨａｔアルゴリズムを使用するスムージング及びベースライン補正を行ってｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ３．４（Ｂｒｕｋｅｒ）でスペクトルを処理した。目的ピークの選択は、同じペプチドの非グリコシル化バージョン及びＯ－グリコシル化バージョンを考慮して手作業で実施した。Ｏ－グリコシル化ペプチドの相対存在量は、モノアイソトピック質量のＨ^＋イオン及びＮａ^＋イオンの面積を積分し、それらをすべての同定ペプチド形態の強度の積算値と関連付けることによって決定した。

したがって、ＧｌｃＮＡｃを転移させることが生化学的によく特徴付けられた近縁Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ酵素に焦点を当てることとした。Ｔ．ｃｒｕｚｉにおけるムチン中のＯ－グリカンの生合成は、ウリジンジホスホ－Ｎ－アセチルグルコサミン：ポリペプチド－α－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｐｐＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）によってＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ（活性化糖ドナー）からＧｌｃＮＡｃ残基がタンパク質中のセリン残基またはスレオニン残基に付加されることで開始される（Ｐｒｅｖｉａｔｏ，ｅｔａｌ（１９９８）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２７３（２４），ｐｐ．１４９８２－１４９８８）。この反応は、Ｔ．ｃｒｕｚｉでのＯ－グリコシル化と哺乳類でのＯ－グリコシル化との間の主な違いになっている。哺乳類では、オルソログ酵素は、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃからＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をペプチドに転移させるＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼである（Ｈａｇｅｎ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１３（１），１Ｒ－１６）。この違いは、Ｔ．ｃｒｕｚｉがＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃとＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃとを相互変換する能力を有さないという事実に起因するものであり得る（Ｒｏｐｅｒ，ｅｔａｌ（２００２）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９９（９），ｐｐ．５８８４－５８８９）。Ｔ．ｃｒｕｚｉ酵素は、ほとんどのグリコシルトランスフェラーゼで見られるように、活性のために二価金属陽イオンを必要とし、Ｍｎ２＋が最も有効である。このことは、ヒト細胞質Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが金属イオン依存性を示さないこととは対照的である。もっとも際立つことは、Ｔ．ｃｒｕｚｉ酵素はアルファ結合を介してＧｌｃＮＡｃをヒドロキシル化アミノ酸に付加する一方で、上記細胞質酵素のアノマー特異性はベータであるということである（Ｐｒｅｖｉａｔｏ，ｅｔａｌ（１９９８）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２７３（２４），ｐｐ．１４９８２－１４９８８）。Ｔ．ｃｒｕｚｉにおいては、ｐｐＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ活性をコードするＴｃＯＧＮＴ－２遺伝子についても報告された。酵素的な分析から、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ活性及びＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃヒドロラーゼ活性のレベルが高く、両方の活性がＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃに特異的であることが示された（Ｈｅｉｓｅ，ｅｔａｌ．（２００９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１９（８），ｐｐ．９１８－９３３）。ペプチド選択性及び至適ｐＨは、Ｔ．ｃｒｕｚｉのミクロソーム画分において以前に報告された天然のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ活性と同等である（Ｐｒｅｖｉａｔｏ，ｅｔａｌ（１９９８）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２７３（２４），ｐｐ．１４９８２－１４９８８）。

ＯＧＮＴ－２（６３８アミノ酸、７２．２ｋＤａ）：ＩＰＲ０２１０６７；ファミリー：ＧｌｃＮＡｃ（ＰＦ１１３９７ａａ１６０～３１６）（ＧＴ－Ａ折り畳みが共通する）。Ｐｈｏｂｉｕｓ（膜貫通（ＴＭ）及びシグナルペプチド（ＳＰ）の複合予測プログラム）（ａａ１～２８細胞質、２９～５０ＴＭ、５１～６３８非細胞質）。

ＯＧＮＴ－１（１１３６アミノ酸、１２４．８ｋＤａ）：ＩＰＲ０２１０６７；ファミリー：ＧｌｃＮＡｃ（ＰＦ１１３９７ａａ７４２～１１２１）（ＧＴ－Ａ折り畳みが共通する）。Ｐｈｏｂｉｕｓ（１～３０２非細胞質、３０３～３２５ＴＭ、３２６～１１３６細胞質）。ＯＧＮＴ－１は、ヌクレオチド－ジホスホ－糖トランスフェラーゼ（ＩＰＲ０２９０４４）スーパーファミリーと繋がる痕跡も有する。

ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ／ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮでの二重消化後に得られたＭＡＬＤＩスペクトルを解析し、モノアイソトピック質量のＨ＋イオン及びＮａ＋イオンの面積を積分し、すべての同定ペプチドの積算強度と関連付けることによって同じペプチドの非グリコシル化バージョン及びＯ－グリコシル化バージョンの相対存在量を決定した。ＭＡＬＤＩは修飾ペプチド及び非修飾ペプチドの相対的定量化に適するものと見なすことができるが、ターゲット上へのスポットの間に形成される結晶の品質には差異があることから、得られる絶対強度及びノイズレベルは試料間で異なり得る。したがって、Ｏ－ＨｅｘＮＡｃのレベルが低いことが予想される試料は、シグナル対ノイズレベルの変化に起因して、場合によっては肯定的な確認となり得るものであり、スポットが弱いものについては確認に至らない可能性がある。したがって、ＫＯ株のいくつかについては、標的指向型の糖ペプチド分析またはサブユニット分析によってもＯ－ＨｅｘＮＡｃレベルを決定した。表３は、得られた結果のまとめである。

まとめると、組換えアダリムマブ内にＯ－グリカンが完全に存在しない完全なＯＧＮＴ欠失細胞株が生成されたことで、こうした宿主細胞は、望ましくない修飾を有さない組換え抗体または抗体形式を製造する上で理想的なものとなった。

アダリムマブを発現する株（のみならずｓｓｕ遺伝子座、Ｓｔ１５４４９）に直鎖化コンストラクト（ｐ５９３２、ｐ５９３３、ｐ５９３４）をトランスフェクションした。得られた株が、ＯＧＮＴ－２＿３×ＨＡ（Ｓｔ１５８８４）、ＯＧＮＴ－１＿３×ＨＡ（Ｓｔ１５８８５）、またはＯＧＮＴ－Ｌ＿３×ＨＡ（Ｓｔ１５８８６）のいずれかを予想通りに発現したことは、ウエスタンブロットによって確認することができた。次に、これらの株からプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによってアダリムマブを濃縮し、サブユニット分析によってＯ－ＨｅｘＮＡｃレベルを定量化した。ＯＧＮＴ－Ｌ過剰発現株でのアダリムマブ上のＯ－ＨｅｘＮＡｃ修飾レベルはほぼ野生型のレベルであったが、ＯＧＮＴ－１過剰発現株及びＯＧＮＴ－２過剰発現株の両方については、アダリムマブヒンジ領域上に生じたＯ－グリコシル化は少なくなっていた。この影響は、ＯＧＮＴ－１過剰発現株で非常に顕著であり、野生型対照由来のアダリムマブと比較してＯ－ＨｅｘＮＡｃ量が１０分の１に減少して１．９％となった（表４）。さらなる分析は行っていないが、タンパク質一次配列がＴＨＴ反復区間を含むことから、自己グリコシル化による制御に起因してこの影響が生じたと推測され得る。あるいは、別の仮説はＨｅｉｓｅ（Ｈｅｉｓｅ，ｅｔａｌ．（２００９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１９（８），ｐｐ．９１８－９３３）に基づき得るものであり、Ｈｅｉｓｅの説明によれば、ＯＧＮＴ－１はトランスフェラーゼ活性だけでなく、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃに対する加水分解活性も有していることから、ペプチド濃度が下がった場合（タンパク質基質の減少）、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの分解を生じさせる。タンパク質基質濃度が不変のままＯＧＮＴ－１が過剰発現すると、ＯＧＮＴ－１活性がＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃの加水分解へとシフトすることから、細胞中のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃが枯渇し得ると予想され得る。しかしながら、これらの仮説は、さらなる究明を必要とするものである。

６．５実施例５－ＯＧＮＴ欠失株の表現型に影響は存在しない－バイオリアクター中での増殖
ＯＧＮＴ欠失株（Ｓｔ１６７０４（ＯＧＮＴ－１／ＬＫＯ）及びＳｔ１６６３６（ＯＧＮＴ－１／２／ＬＫＯ））の表現型に影響が存在するかどうかを分析するために、これらのＯＧＮＴ欠失株を流加発酵に供した。両方の株がバイオリアクター中で安定して増殖し、発酵終了時点では最大ＯＤ値が１８及び２０に到達した。このことは、野生型ＯＧＮＴ遺伝子型を有する株（Ｓｔ１２４２７など）を同じ条件の下で増殖させた場合と完全に同等である。さらに、発酵後に上清からのプロテインＡ濃縮によって全長抗体を単離することが可能であり、この全長抗体をＭＡＬＤＩベースの相対的Ｏ－ＨｅｘＮＡｃ定量化に供した。両方の試料において、Ｏ－ＨｅｘＮＡｃ修飾ペプチドを検出することは不可能であった（表９）。したがって、ＯＧＮＴのノックアウトは、培養スケールとは無関係にＯ－ＨｅｘＮＡｃ修飾を枯渇させ、発酵の間の増殖に影響を及ぼすことはない。

Claims

Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞におけるポリペプチド上でのＯ－結合型ＧｌｃＮＡｃの形成が低減または除去されるように遺伝的に操作された前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞であって、
遺伝的に操作される前の該Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞におけるＯ－結合型ＧｌｃＮＡｃの形成が、少なくとも１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）トランスフェラーゼによって触媒されるものであり、かつ、該少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、下方制御される、機能的に不活化される、欠失される、変異導入される、または過剰発現される、前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをコードする遺伝子が下方制御される、機能的に不活化される、欠失される、または変異導入される、請求項１に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをコードする遺伝子が機能的に不活化される、請求項１または２に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをコードする遺伝子が下方制御される、請求項１または２に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをコードする遺伝子が欠失または変異導入される、請求項１または２に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼをコードする遺伝子が過剰発現される、請求項1に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記Ｏ－結合型ＧｌｃＮＡｃの形成が、参照Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞における前記Ｏ－結合型ＧｌｃＮＡｃの形成と比較して少なくとも５％、７％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低減される、請求項１～６のいずれか１項に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが、ＯＧＮＴ１、ＯＧＮＴ２、及びＯＧＮＴＬ、ならびにそれらの相同ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの数が、１つ、２つ、または３つである、請求項１～８のいずれか１項に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の増殖速度が、参照Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞の増殖速度の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である、請求項１～９のいずれか１項に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞がＬｅｉｓｈｍａｎｉａｔａｒｅｎｔｏｌａｅである、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記ポリペプチドが、アダリムマブ、リツキシマブ、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞が、異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞が、１つ以上の異種グリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項１３に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
前記異種グリコシルトランスフェラーゼが、Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、及び／または異種ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び／または異種シアリルトランスフェラーゼである、請求項１４に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞。
ポリペプチドの調製方法であって、（ａ）請求項１～１５のいずれか１項に記載のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞を、ポリペプチド産生に適した条件の下で培養すること、及び（ｂ）前記ポリペプチドを単離すること、を含む、前記方法。