JPWO2021122998A5

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Publication number: JPWO2021122998A5
Application number: JP2022537736A
Authority: JP
Publication date: 2023-12-20

Description

（結論）
ＡＧ１８５６は、ＲＩＰをコードするナノプレックスの細胞毒性効果において極めて重要であった。このトランスフェクション増強剤がなければ、細胞毒性効果は観察されなかった。
なお、本発明は、態様として以下の内容を含む。
〔態様１〕
式（Ｉ）で表されるサポニン：

（式中、Ｒ ^１は、同一分子内の他のＲ ^１残基から独立しており、Ｈまたはアセチル残基であり、ただし、少なくとも２つのＲ ^１残基はアセチル残基であり；Ｒ ^２は、同一分子内の他のＲ ^２残基から独立しており、Ｈまたはアセチル残基であり、ただし、少なくとも２つのＲ ^２残基はアセチル残基である）。
〔態様２〕
態様１に記載のサポニンであって、４つのアセチル残基を有することを特徴とする、サポニン。
〔態様３〕
態様２に記載のサポニンであって、それぞれの場合において、１つのアセチル残基が、対応するキノボース残基のＣ３およびＣ４位置の酸素原子に結合しており、並びに、対応するグルコース残基のＣ４およびＣ６位置の酸素原子に結合していることを特徴とする、サポニン。
〔態様４〕
核酸、脂質、ペプチドおよび／またはタンパク質の細胞へのインビトロ送達における、態様１～３のいずれかに一項に記載のサポニンの使用。
〔態様５〕
態様４に記載の使用であって、細胞が真核生物細胞であることを特徴とする、使用。
〔態様６〕
核酸、脂質、ペプチドおよび／またはタンパク質をヒトまたは動物にインビボ送達することによる治療または診断に用いるための、態様１～３のいずれか一態様に記載のサポニン。
〔態様７〕
態様４若しくは５の使用、または態様６に用いられるサポニンであって、サポニンが、リポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群の中から選択される少なくとも１つのトランスフェクション試薬と組み合わせて適用されることを特徴とする、使用またはサポニン。
〔態様８〕
態様１～３のいずれか一態様に記載のサポニンを含む、トランスフェクション組成物。
〔態様９〕
態様８に記載のトランスフェクション組成物であって、リポソームベースのトランスフェクション試薬及びポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群の中から選択される少なくとも１つのトランスフェクション試薬を更に含むことを特徴とする、トランスフェクション組成物。
〔態様１０〕
インビトロトランスフェクションのための方法であって、態様１～３のいずれか一態様に記載のサポニンの存在下で細胞を核酸と一緒にインキュベートする工程を含む、方法。
〔態様１１〕
態様１０に記載の方法であって、前記細胞が真核細胞であることを特徴とする、方法。
〔態様１２〕
態様１０または１１に記載の方法であって、核酸がナノ粒子の一部を形成することを特徴とする、方法。
〔態様１３〕
態様１０～１２のいずれか一態様に記載の方法であって、サポニンが１μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬの範囲内の濃度で使用されることを特徴とする、方法。
〔態様１４〕
態様１０～１３のいずれか一態様に記載の方法であって、サポニンが、リポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群の中から選択される少なくとも1つのトランスフェクション試薬と組み合わせて使用されることを特徴とする、方法。
〔態様１５〕
態様１から３のいずれか一態様に記載のサポニンをＡｇｒｏｓｔｅｍｍａｇｉｔｈａｇｏＬ．から単離する方法であって、以下の工程：
ＡｇｒｏｓｔｅｍｍａｇｉｔｈａｇｏＬ．の種子を粉砕し、粉砕した種子を有機溶媒により脱脂して、脱脂粉砕種子を得る工程；
前記脱脂粉砕種子を凍結乾燥して種子粉末を得る工程；
前記種子粉末をアルコール溶媒で抽出し、種子抽出物を得る工程；
前記種子抽出物からアルコール溶媒を除去し、乾燥抽出物を得る工程；
前記乾燥抽出物を低濃度有機溶媒に溶解し、抽出物溶液を得る工程；
前記抽出物溶液を少なくとも１つのクロマトグラフィー分離工程に供して、精製されたサポニン溶液を得る工程；及び
前記精製されたサポニン溶液から溶媒を除去し、精製サポニン粉末を得る工程；
を含む、方法。 (Conclusion)
AG1856 was crucial in the cytotoxic effects of nanoplexes encoding RIP. Without this transfection enhancer, no cytotoxic effects were observed.
Note that the present invention includes the following aspects as aspects.
[Aspect 1]
Saponin represented by formula (I):

(wherein R ¹ is independent of other R ¹ residues in the same molecule and is H or an acetyl residue, with the proviso that at least two R ¹ residues are acetyl residues; R ² are independent of other R2 residues in the same molecule ^and are H or acetyl residues, provided that at least two ^R2 residues are acetyl residues).
[Aspect 2]
Saponin according to aspect 1, characterized in that it has four acetyl residues.
[Aspect 3]
Saponin according to aspect 2, in each case one acetyl residue is bonded to the oxygen atoms in the C3 and C4 positions of the corresponding quinobose residue, and in the C4 of the corresponding glucose residue. and a saponin bonded to an oxygen atom at the C6 position.
[Aspect 4]
Use of a saponin according to any one of aspects 1 to 3 in the in vitro delivery of nucleic acids, lipids, peptides and/or proteins to cells.
[Aspect 5]
Use according to aspect 4, characterized in that the cells are eukaryotic cells.
[Aspect 6]
Saponin according to any one of aspects 1 to 3 for use in therapy or diagnosis by in vivo delivery of nucleic acids, lipids, peptides and/or proteins to humans or animals.
[Aspect 7]
A saponin for use in embodiment 4 or 5, or in embodiment 6, wherein the saponin is combined with at least one transfection reagent selected from the group consisting of liposome-based transfection reagents and polymer-based transfection reagents. Use or saponins, characterized in that they are applied in combination.
[Aspect 8]
A transfection composition comprising a saponin according to any one of aspects 1 to 3.
[Aspect 9]
Transfection composition according to aspect 8, characterized in that it further comprises at least one transfection reagent selected from the group consisting of liposome-based transfection reagents and polymer-based transfection reagents. Transfection composition.
[Aspect 10]
A method for in vitro transfection, comprising incubating cells with a nucleic acid in the presence of a saponin according to any one of aspects 1 to 3.
[Aspect 11]
11. The method according to aspect 10, characterized in that said cell is a eukaryotic cell.
[Aspect 12]
12. A method according to aspect 10 or 11, characterized in that the nucleic acid forms part of the nanoparticle.
[Aspect 13]
Method according to any one of aspects 10 to 12, characterized in that the saponin is used at a concentration within the range of 1 μg/mL to 50 μg/mL.
[Aspect 14]
14. The method according to any one of embodiments 10 to 13, wherein saponin is combined with at least one transfection reagent selected from the group consisting of liposome-based transfection reagents and polymer-based transfection reagents. A method, characterized in that it is used in
[Aspect 15]
The saponin according to any one of aspects 1 to 3 is obtained from Agrostemma githago L. A method for isolating from
Agrostemma githago L. A step of pulverizing the seeds and defatting the pulverized seeds with an organic solvent to obtain defatted pulverized seeds;
freeze-drying the defatted pulverized seeds to obtain seed powder;
Extracting the seed powder with an alcohol solvent to obtain a seed extract;
removing the alcohol solvent from the seed extract to obtain a dry extract;
dissolving the dried extract in a low concentration organic solvent to obtain an extract solution;
subjecting the extract solution to at least one chromatographic separation step to obtain a purified saponin solution; and
removing the solvent from the purified saponin solution to obtain purified saponin powder;
including methods.