JPWO2020264185A5 - - Google Patents

Claims (27)

1. （ａ）核酸結合タンパク質に複合化された核酸分子を含む、安定化された生体サンプルを得る工程、
   （ｂ）核酸分子を複数のセグメントへと切断するために、前記安定化された生体サンプルを非特異的エンドヌクレアーゼに接触させる工程、
   （ｃ）１つの接合部にて、前記複数のセグメントの第１のセグメントと第２のセグメントを付着させる工程、および、
   （ｄ）複数の選択されたセグメントを得るために、前記複数のセグメントをサイズ選択にかける工程を含む、方法であって、
   前記付着させる工程は、少なくとも前記第１のセグメントと前記第２のセグメントを架橋オリゴヌクレオチドに接触させることを含む、方法。
2. 前記複数の選択されたセグメントは、約１００～約２５００ｂｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. （ｄ）に先立って、前記複数のセグメントから配列決定ライブラリを調整する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. サイズ選択されたライブラリを得るために、前記配列決定ライブラリをサイズ選択にかける工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記方法は、１つのＱＣ値を得るために、複数の選択されたセグメントを解析する工程をさらに含む、請求項１から４のいずれか１つに記載の方法。
6. （ｂ）に続いて、前記複数のセグメントを１つ以上の表面に結合させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記安定化された生体サンプルは、安定化された細胞溶解物、安定化された無傷細胞、または安定化された無傷の核を含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
8. （ｂ）は、前記無傷細胞あるいは前記無傷の核の溶解に先立って実施されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. （ｃ）に先立ち、前記安定化された生体サンプル中の細胞および／または核を溶解する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記安定化された生体サンプルは３，０００，０００未満の細胞を含むことを特徴とする、請求項１から９のいずれか１つに記載の方法。
11. 前記安定化された生体サンプルは１０μｇ未満のＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１から１０のいずれか１つに記載の方法。
12. 前記非特異的エンドヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ ＩＩ、およびミクロコッカスヌクレアーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
13. 前記安定化された生体サンプルは、化学的固定剤または紫外線から選択される橋架剤で処置されていることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか１つに記載の方法。
14. 前記化学的固定剤はホルムアルデヒド、ソラレン、グルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）、またはエチレングリコールビス（コハク酸スクシンイミジル）（ＥＧＳ）を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
15. 前記選択された複数のセグメントを抗体に接触させる工程、および複数のセグメントについて免疫沈降を行なう工程をさらに含む、請求項１から１４のいずれか１つに記載の方法。
16. 前記免疫沈降は前記付着させる工程の後に行なわれることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. 前記付着させる工程は、ビオチンをタグ付けされたヌクレオチドを使用して粘着末端を埋めること、タグ付けされていないヌクレオチドを使用して粘着末端を埋めること、平滑末端をライゲーションすること、オーバーハングを付加すること、または第１のセグメントと第２のセグメントをバーコードに接触させることを含む、請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
18. 前記架橋オリゴヌクレオチドは、バーコード配列、またはアフィニティタグを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
19. 前記付着させる工程は、前記第１のセグメントと前記第２のセグメントを複数の架橋オリゴヌクレオチドに連続して接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
20. 前記付着させる工程は、前記安定化された生体サンプルのサンプル、細胞、核、染色体、または核酸分子が前記架橋オリゴヌクレオチドの固有の配列を受け取ることをもたらす、請求項１９に記載の方法。
21. 前記架橋オリゴヌクレオチドが、１つの免疫グロブリン結合タンパク質あるいはその断片に連結され、ここで、前記免疫グロブリン結合タンパク質は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、およびプロテインＬから選択されることを特徴とする、請求項１から２０のいずれか１つに記載の方法。
22. （ｅ）第１のリードペアを生成するために、前記接合部の両側で少なくともいくつかの配列を得る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
23. （ｆ）コンティグのセットに前記第１のリードペアをマッピングする工程、および、
    （ｇ）順序および／またはゲノムへの配向を表現する前記コンティグのセットにわたる経路を決定する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
24. （ｆ）コンティグのセットに第１のリードペアをマッピングする工程、および、
    （ｇ）前記コンティグのセットから、安定化された生体サンプルにおける構造的変異体の存在またはヘテロ結合性の減少を判定する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
25. （ｆ）コンティグのセットに前記第１のリードペアをマッピングする工程、および、
    （ｇ）前記コンティグのセットにおける変異体をフェーズに割り当てる工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
26. 前記変異体はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）変異体、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）変異体であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
27. ＤＮａｓｅは、免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に連結または融合されることを特徴とする、請求項１から２６のいずれか１つに記載の方法。