JPWO2020110330A1 - ペプチドチオエステル、ペプチドの新規製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、効率的かつ汎用性の高い、ペプチドチオエステル、およびペプチドの新規な製造方法を提供することを目的とする。
【解決手段】 （１）Ｃ末端にＣＧＣトリプレットを有するペプチドチオエステルを準備する工程、（２）ＣＧＣトリプレットにおけるＣ末端システインのＳＨ基とグリシンのカルボニル基との間で転移を生じさせ、Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルを得る工程、および（３）前記Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルにおいて、システインのＳＨ基とＸのカルボニル基との転移と、システインのアミノ基とグリシンのチオール基との転移とを生じさせて、ペプチドチオエステルを得る工程を含む、ペプチドチオエステルの製造方法、および当該方法により製造されたペプチドチオエステルを用いたペプチドの製造方法が提供される。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ペプチドチオエステル、およびペプチドの新規な製造方法に関する。

糖タンパク質の化学合成、特にサイズの大きな糖タンパク質の合成では、タンパク質をいくつかのペプチドフラグメントに分けて合成し、それらを連結することで全長糖タンパク質を得るということが行われている（例えば特許文献１および２など）。

この合成において鍵となるのが、全長糖タンパク質に組み込まれる糖ペプチドを効率的に製造することである。これまでに、糖タンパク質の製造方法として、糖鎖が結合したアミノ酸（糖鎖付加アミノ酸）を使用し、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖−ポリペプチド複合体を製造する方法（例えば特許文献３）が用いられている。固相合成、液相合成のいずれによる場合も、フリーのペプチドとフリーのアミノ酸を縮合剤を用いて縮合すると、アミノ酸がペプチドの側鎖官能基と反応するため、目的のペプチドを得るためには、反応点以外を保護してから縮合し、さらに脱保護するといった操作を繰り返さなければならない。糖ペプチドの合成における脱保護および縮合の繰り返し反応は、最終的に得られる糖ペプチドのトータル収率を低下させてしまうという問題がある。

また、糖タンパク質の合成おいては、ネイティブ・ケミカル・ライゲーション（ＮＣＬ）法を用いて、Ｃ末端にチオエステル部分を有するように操作した第１のペプチドと、システイン残基等を有する第２のペプチドとを連結することが行われている。

これまでにＣ末端チオエステルを有するペプチドの合成方法として、ペプチドのＣ末端に特有の配列を導入する方法が報告されている。Ｋａｗａｋａｍｉらは、天然配列であるシステイン−プロリン−ＣＯＯＲという配列をペプチドのＣ末端に導入して、チオエステル化する方法を開示している。この方法は、Ｃ末端をエステルで活性化する必要があるが、例えば大腸菌で発現したアミノ酸のＣ末端のみを特異的に化学修飾する方法はないため、発現系を用いて合成されたペプチドには応用することができない（非特許文献１）。Ｏｌｌｉｖｉｅｒらは、ビス（２−スルファニルエチル）アミンをペプチドのＣ末端に導入する方法であるが、同様に、発現系を用いて合成されたペプチドには応用することができない（非特許文献２）。Ａｄａｍｓらは、化学合成したペプチドの末端にあるＧｌｙ−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓなどの配列にヒドラジドまたはチオエステルを導入する方法であるが、配列特異的であり、また再現性が高くないという問題がある（非特許文献３）。

ＷＯ２０１０／０９２９４３ ＷＯ２０１４／１５７１０７ ＷＯ２００４／００５３３０

Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．Ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．５，５７０−５７４（２０１０） Ｏｌｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．２２，２０１０ Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１３，５２，１３０６２−１３０６６

本発明は、効率的かつ汎用性の高い、ペプチドチオエステル、およびペプチドの新規な製造方法を提供することを目的とする。

本発明は、以下の特徴を包含する。

［１］ペプチドチオエステルの製造方法であって、
（１）以下の配列：

［ここで、Ｒは、任意のアミノ酸配列を示し；Ｘは、任意のアミノ酸を示し；ＣＧＣは、システイン−グリシンーシステインのアミノ酸トリプレットを示す。］
を有するペプチドを準備する工程、
（２）ＣＧＣトリプレットにおけるＣ末端システインのＳＨ基とグリシンのカルボニル基との間で転移を生じさせ、Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルを得る工程、および
（３）前記Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルにおいて、システインのＳＨ基とＸのカルボニル基との転移と、システインのアミノ基とグリシンのチオエステルのカルボニル基との間での閉環縮合とを生じさせて、ペプチドチオエステルを得る工程、
を含む、
製造方法。

［２］ ［１］に記載の製造方法であって、
前記ペプチドは、化学合成により、または、発現系による発現により、取得されたものである、
製造方法。

［３］ ［１］または［２］に記載の製造方法であって、
前記工程（２）の反応は、２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）、２−アミノエタンチオール、およびビス（２−スルファニルエチル)アミンよりなる群から選択される少なくとも１種のチオールの存在下で行われる、
製造方法。

［４］ ［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法であって、
前記工程（３）の反応は、２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）、メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、２−メルカプトプロピオン酸、チオフェノール、ベンジルメルカプタン、３／４−メルカプトベンジルスルフォネートから選択される少なくとも１種のチオールの存在下で行われる、
製造方法。

［５］ ［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法であって、
（２−１）工程（２）の反応後、工程（３）の前に、Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルを精製する工程、
をさらに含む
製造方法。

［６］ ［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法であって、
前記ペプチドは、糖鎖付加ペプチドである、
製造方法。

［７］ ペプチドの製造方法であって、
（Ａ）［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法によって製造されたペプチドチオエステル、および
（Ｂ）アミノチオアシッドまたはペプチドチオアシッド
を縮合させて、ペプチドを得る工程を含み、
ここで、前記（Ａ）および（Ｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の少なくとも一部が未保護である、
ことを特徴とする、
製造方法。

［８］ ［７］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記（Ａ）および（Ｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の全てが未保護である、
製造方法。

［９］ ［７］または［８］に記載のペプチドの製造方法であって、
糖鎖付加ペプチドの製造方法である
ことを特徴とする、
製造方法。

［１０］ ［９］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記ペプチドチオエステルは、糖鎖付加ペプチドチオエステルである、
製造方法。

［１１］ ［９］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記アミノチオアシッドもしくはまたはペプチドチオアシッドは、糖鎖付加アミノチオアシッドまたは糖鎖付加ペプチドチオアシッドである、
製造方法。

［１２］ ［１１］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記糖鎖付加アミノチオアシッドは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＨｙｌまたはＨｙｐよりなる群から選択される糖鎖付加アミノ酸のチオアシッドである、
製造方法。

［１３］ ［１１］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記糖鎖付加ペプチドチオアシッド中の糖鎖付加アミノ酸は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＨｙｌまたはＨｙｐよりなる群から選択される糖鎖付加アミノ酸である、
製造方法。

［１４］ ［１１］または［１３］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記糖鎖付加ペプチドチオアシッドは、糖鎖付加アミノチオアシッドと、側鎖に前記糖鎖付加アミノチオアシッド中のチオ酸基（−ＳＨ）とジスルフィド結合を形成し得る修飾基を有するシステインをそのＮ末端に有するペプチドとを反応させ、反応後のペプチドのＣ末端にチオ酸基を導入することにより得られたものである、
製造方法。

［１５］ ［１４］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記修飾基は、下記より成る群から選択される修飾基である、
製造方法。

；

；および

［１６］ ペプチドの製造方法であって、
（ａ）［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法によって製造されたペプチドチオエステル、および
（ｂ）下記構造：

［式中、Ｘは、酸処理、塩基処理、光照射処理、または還元処理で分離する任意の置換基を示し；Ｙは、ケトンまたはアルデヒドを示す。］
を有する補助基がそのＮ末端に導入されたアミノ酸またはペプチド
を縮合させて、ペプチドを得る工程を含み、
ここで、前記（ａ）および（ｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の少なくとも一部が未保護である、
ことを特徴とする、
製造方法。

［１７］ ［１６］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記Ｘは、アリールである、
製造方法。

［１８］ ［１６］または［１７］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記（ａ）および（ｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の全てが未保護である、
製造方法。

［１９］ ［１６］〜［１８］のいずれかに記載のペプチドの製造方法であって、
糖鎖付加ペプチドの製造方法である
ことを特徴とする、
製造方法。

［２０］ ［１９］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記ペプチドチオエステルは、糖鎖付加ペプチドチオエステルである、
製造方法。

［２１］ ［１９］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記「補助基がそのＮ末端に導入されたアミノ酸またはペプチド」は、補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ペプチドである、
製造方法。

［２２］ ［２１］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、前記補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加Ａｓｎ、糖鎖付加Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｔｈｒおよび糖鎖付加Ｈｙｌよりなる群から選択される、
製造方法。

［２３］ ［２２］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、下記の構造：

［ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
を有する糖鎖付加アミノ酸である、
製造方法。

［２４］ ［２３］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記アミノ酸Ｘは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＨｙｌよりなる群から選択される、
製造方法。

［２５］ ［２２］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、下記の構造：

［ここで、Ｘ_１はＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｙｌを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
を有する糖鎖付加ジペプチドである、
製造方法。

［２６］ ペプチドの製造方法であって、
（ＡＡ）ペプチドチオエステル、および
（ＢＢ）アミノチオアシッドまたはペプチドチオアシッド
を縮合させて、ペプチドを得る工程を含み、
ここで、前記（ＡＡ）および（ＢＢ）を構成するアミノ酸の側鎖の少なくとも一部が未保護である、
ことを特徴とする、
製造方法。

［２７］ ［２６］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記（ＡＡ）および（ＢＢ）を構成するアミノ酸の側鎖の全てが未保護である、
製造方法。

［２８］ ［２６］または［２７］に記載のペプチドの製造方法であって、
糖鎖付加ペプチドの製造方法である
ことを特徴とする、
製造方法。

［２９］ ［２８］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記ペプチドチオエステルは、糖鎖付加ペプチドチオエステルである、
製造方法。

［３０］ ［２８］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記アミノチオアシッドもしくはまたはペプチドチオアシッドは、糖鎖付加アミノチオアシッドまたは糖鎖付加ペプチドチオアシッドである、
製造方法。

［３１］ ［３０］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記糖鎖付加アミノチオアシッドは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＨｙｌまたはＨｙｐよりなる群から選択される糖鎖付加アミノ酸のチオアシッドである、
製造方法。

［３２］ ［３０］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記糖鎖付加ペプチドチオアシッド中の糖鎖付加アミノ酸は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＨｙｌまたはＨｙｐよりなる群から選択される糖鎖付加アミノ酸である、
製造方法。

［３３］ ［３０］または［３２］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記糖鎖付加ペプチドチオアシッドは、糖鎖付加アミノチオアシッドと、側鎖に前記糖鎖付加アミノチオアシッド中のチオ酸基（−ＳＨ）とジスルフィド結合を形成し得る修飾基を有するシステインをそのＮ末端に有するペプチドとを反応させ、反応後のペプチドのＣ末端にチオ酸基を導入することにより得られたものである、
製造方法。

［３４］ ［３３］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記修飾基は、下記より成る群から選択される修飾基である、
製造方法。

；

；および

［３５］ ペプチドの製造方法であって、
（ａａ）ペプチドチオエステル、および
（ｂｂ）下記構造：

［ここで、Ｘは、酸処理、塩基処理、光照射処理、または還元処理で分離する任意の置換基を示し；Ｙは、ケトンまたはアルデヒドを示す。］
を有する補助基がそのＮ末端に導入されたアミノ酸またはペプチド
を縮合させて、ペプチドを得る工程を含み、
ここで、前記（ａａ）および（ｂｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の少なくとも一部が未保護である、
ことを特徴とする、
製造方法。

［３６］ ［３５］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記Ｘは、アリールである、
製造方法。

［３７］ ［３５］または［３６］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記（ａａ）および（ｂｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の全てが未保護である、
製造方法。

［３８］ ［３５］〜［３７］のいずれかに記載のペプチドの製造方法であって、
糖鎖付加ペプチドの製造方法である
ことを特徴とする、
製造方法。

［３９］ ［３８］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記ペプチドチオエステルは、糖鎖付加ペプチドチオエステルである、
製造方法。

［４０］ ［３８］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記「補助基がそのＮ末端に導入されたアミノ酸またはペプチド」は、補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ペプチドである、
製造方法。

［４１］ ［４０］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、前記補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加Ａｓｎ、糖鎖付加Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｔｈｒおよび糖鎖付加Ｈｙｌよりなる群から選択される、
製造方法。

［４２］ ［４０］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、下記の構造：

［ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
を有する糖鎖付加アミノ酸である、
製造方法。

［４３］ ［４２］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記アミノ酸Ｘは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＨｙｌよりなる群から選択される、
製造方法。

［４４］ ［４０］に記載のペプチドの製造方法であって、
前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、下記の構造：

［ここで、Ｘ_１はＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｙｌを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
を有する糖鎖付加ジペプチドである、
製造方法。

［４５］ 下記の構造を有する糖鎖付加アミノ酸。

［ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］

［４６］ ［４５］に記載の糖鎖付加アミノ酸であって、
前記アミノ酸Ｘは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＨｙｌよりなる群から選択される、
糖鎖付加アミノ酸。

［４７］ 下記の構造を有する糖鎖付加ジペプチド。

［ここで、Ｘ_１はＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｙｌを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］

以上述べた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれることを、当業者であれば理解するであろう。

本発明の製造方法によれば、効率的かつ汎用性の高い、ペプチドチオエステル、およびペプチドの新規な製造方法が提供される。

図１は、ｔｅｒｔ−Ｂｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＴｒｔの、精製後のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図２は、ｔｅｒｔ−Ｂｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＴｒｔの、精製後のＮＭＲスペクトルを示す。 図３は、Ｈ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＨの、精製後のＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図４は、Ｈ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＨの、精製後のＮＭＲスペクトルを示す。 図５は、ｔｅｒｔ−Ｂｏｃ−Ａｓｎ（アシアロオリゴサッカライド）−ＳＴｒｔの、精製後のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図６は、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＳＴｒｔの、精製後のＮＭＲスペクトルを示す。 図７は、Ｈ−Ｌｅｕ−ＳＨの、精製後のＮＭＲスペクトルを示す。 図８は、ペプチド−チオエステル ７の精製後のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図９は、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＨの、ＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図１０は、アラニンチオアシッドを用いたチオアンハイドライドライゲーション反応生成物のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す：０時点で、出発物質であるペプチドチオエステル７が存在していたが、３０分のカップリング後、目的のＨ−ＹＧＧＦＡ−ＳＨ ９が合成された。＊は、ペプチドチオエステルから切断された遊離チオールを指し、＋はＨ−ＹＧＧＦ−ＳＨを指す。 図１１は、アミノチオアシッド種に応じたアミド結合形成率を示す。図中の略号およびそのアミド結合形成率は、以下のとおりである：Ｇ＝Ｇｌｙ−チオアシッド、９７％；Ａ＝Ａｌａ−チオアシッド、９２％；Ｖ＝Ｖａｌ−チオアシッド、９１％；Ｓ＝Ｓｅｒ−チオアシッド、９１％；Ｔ＝Ｔｈｒ−チオアシッド、８９％；Ｍ＝Ｍｅｔ−チオアシッド、８８％；Ｆ＝Ｐｈｅ−チオアシッド、８３％；Ｙ＝Ｔｙｒ−チオアシッド、７８％；Ｌ＝Ｌｅｕ−チオアシッド、７３％；Ｅ＝Ｇｌｎ−チオアシッド、６８％。 図１２は、オリゴサッカライドを用いたチオアンハイドライドライゲーション反応生成物のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す：ｔ＜０で、出発物質であるペプチドチオエステル ７は存在していたが、３時間のカップリング後、目的のＨ−ＹＧＧＦＮ（シアリルオリゴサッカライド）−ＳＨ １０が合成された。１１はオリゴサッカライドアスパルチミドを指し、＋はＨ−ＹＧＧＦ−ＳＨを指す。 図１３は、オリゴサッカライドを用いたチオアンハイドライドライゲーション反応生成物のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。３時間のカップリング後、目的のＨ−ＹＧＧＦＮ（アシアロオリゴサッカライド）−ＳＨ １２が合成された。＋はＨ−ＹＧＧＦ−ＳＨを指す。 図１４は、オリゴペプチド １０とペプチド ８とのカップリング産物のＨＰＬＣプロフィールを示す。３時間のカップリング後、目的のＨ−ＹＧＧＦＮ（シアリルオリゴサッカライド）ＣＧＹＧ−ＯＨ １３が合成された。 図１５は、ジシアロ糖鎖に対する補助基導入反応後の反応生成物のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図１６は、ジシアロ糖鎖−補助基複合体に対する保護基導入反応後の反応生成物のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図１７は、糖鎖−補助基複合体とペプチドチオエステル体（ＬＲＬＲＧＧ−ＣＯＳＲ）とのライゲーション反応生成物のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図１８は、糖鎖−補助基複合体とペプチドチオエステル体（ＡＬＬＨ−ＣＯＳＲ）とのライゲーション反応生成物のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図１９は、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライドとＮＨ_２−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＮＨＮＨＢｏｃとの縮合反応後の反応生成物のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図２０は、糖鎖付加アミノ酸（セリン）のＣ末端アジド体をチオエステル体に変換する反応を行った後の、ＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図２１は、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−Ｓｅｒ−ＣＯＳＲとＡｕｘ（ＳＨ）−Ｓｅｒ−ＣＯＯＨとのライゲーション反応による反応生成物のＨＰＬＣプロファイルおよびＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。以降Ａｕｘは補助基を表す。 図２２は、ペプチド（Ｈ−ＳＳＴＧＷＣＧＣ−ＯＨ）１とＭＥＳＮａとの反応後のＬＣ／ＭＳの結果を示す。 図２３は、ペプチド（Ｈ−ＳＳＴＧＷＣＧ−ＭＥＳＮａ）２とＭＥＳＮａとの反応後のＬＣ／ＭＳの結果を示す。 図２４は、ペプチド（Ｈ−ＳＳＴＧＷＣＧ−ＭＥＳＮａ）２とＭＰＡＡとの反応後のＬＣ／ＭＳの結果を示す。 図２５は、ビス（２−スルファニルエチル）アミノ基をＣ末端にもつペプチドのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。 図２６は、ペプチド（Ｈ−ＬＱＮＩＨＣ−ＯＨ）８と、ビス（２−スルファニルエチル）アミン｛ＨＮ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＨ）_２・ＨＣｌ｝との反応後のＬＣ／ＭＳの結果を示す。

１．定義
本発明において、「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、すなわち、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）に加えて、アミノ酸変異体などの非天然アミノ酸を含む。したがって、本発明において、アミノ酸として、例えばＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；化学修飾されたアミノ酸：ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸：アミノ酸の側鎖置換基がさらに別の置換基によって置換された変異体（例えばヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ））などが含まれる。

本発明において、「アミノチオアシッド」とは、アミノ酸のカルボキシル基がチオ酸基（−ＣＯＳＨ）に変換されたアミノ酸を指し、典型的には、α−アミノ基を有する下記構造のものをいう：

上記化合物におけるＲは、任意のアミノ酸の側鎖を表しており、したがって、Ｒは、天然のアミノ酸の側鎖であってもよいし、非天然の側鎖に置換されたものであってもよい。

カルボキシル基にチオ酸基を導入する方法としては、様々な方法が知られている。例えば、そのような方法として、アンチモン触媒（例えば、Ｐｈ_３ＳｂＯ）の存在下、目的とするチオカルボン酸類に対応するカルボン酸と硫化リンとの反応で製造する方法（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ，１２３，２０８１−２０８２（１９９０））、硫化水素を硫化剤として用いる方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２５，１８０−１８２（１９６０））、カルボン酸を酸ハロゲン化物に変換した後、硫化水素の金属塩（ナトリウム塩又はカリウム塩）と反応させる方法（Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．，４，９２４（１９６３）；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．，９９８−１００４（２００５））、酸ハロゲン化物に、硫化剤として、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムチオアミドやチオアセトアミドを用いる方法（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，Ｓｕｌｆｕｒ，ａｎｄ Ｓｉｌｉｃｏｎ．，１７８，１６６１−１６６５（２００３））、クロロ炭酸エステルと対応するカルボン酸との反応により、混合酸無水物に変換後、硫化水素と反応させる（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３４，９９９−１０１４（１９８６））などが挙げられる。本発明においては、これらの公知の方法を用いて、アミノ酸をチオアシッドアミノ酸に変換して、本発明に用いることができる。あるいは、アミノ酸誘導体は、例えば、アミノ酸中のカルボキシル基のチオエステル基への変換と、硫黄原子の保護基の脱保護によって調製することができる。

本発明において、アミノ酸、アミノチオアシッドは、糖鎖が付加されていてもよいし、または糖鎖が付加されていなくてもよい。

本明細書中において、「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸であり、糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい。また、「糖鎖付加ペプチド」とは、ペプチドを構成する任意のアミノ酸の位置に糖鎖が結合しているペプチドであり、同様に、糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
糖鎖が結合するアミノ酸の種類に特に限定はなく、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれを用いることもできる。糖鎖付加アミノ酸が生体内に糖ペプチド（糖タンパク質）として存在するものと同一または類似の構造を有するという観点からは、糖鎖付加アミノ酸は、Ｎ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Ａｓｎ、Ｏ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Ｓｅｒおよび糖鎖付加Ｔｈｒ、糖鎖付加Ｈｙｌ、糖鎖付加Ｈｙｐが好ましく、特に糖鎖付加Ａｓｎが好ましい。

また、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖付加アミノ酸のアミノ酸は、アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２つ以上のカルボキシル基を持つアミノ酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上の窒素原子を持つアミノ酸、セリン、スレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸、システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸、アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸、が好ましい。特に、反応性の観点からは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンが好ましい。

本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類および多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。

また、本明細書中において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基またはアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明に使用できる糖鎖は特に限定されず、生体内で複合糖質（糖ペプチド（または糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよいし、生体内では複合糖質として存在しない糖鎖であってもよい。

生体内で複合糖質として存在する糖鎖は、生体に投与可能な糖アミノ酸、糖ペプチドが製造できるという観点から好ましい。かかる糖鎖としては、生体内で糖ペプチド（または糖タンパク質）としてペプチド（またはタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等が挙げられる。好ましくは、Ｎ−結合型糖鎖が用いられる。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。

本発明で使用できる例示的な複合型糖鎖としては、例えば、下記一般式：

［式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、

を示す。Ａｃはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。

２．ペプチドチオエステルの製造法
本発明は、一態様において、ペプチドチオエステルの製造方法（以下、「本発明のペプチドチオエステル製造法」とも称する）に関する。
本発明のペプチドチオエステル製造法は、
（１）以下の配列：

［ここで、Ｒは、任意のアミノ酸配列を示し；Ｘは、任意のアミノ酸を示し；ＣＧＣは、システイン−グリシンーシステインのアミノ酸トリプレットを示す。］
を有するペプチドを準備する工程、
（２）ＣＧＣトリプレットにおけるＣ末端システインのＳＨ基とグリシンのカルボニル基との間で転移を生じさせ、Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルを得る工程、および
（３）前記Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルにおいて、システインのＳＨ基とＸのカルボニル基との転移と、システインのアミノ基とグリシンのチオエステルのカルボニル基との間での閉環縮合とを生じさせて、ペプチドチオエステルを得る工程、
を含む。

工程（１）は、出発物質であるペプチド（１）を準備する工程である。ペプチド（１）は、ライゲーションの対象になる目的のアミノ酸配列を有しており、本発明においては、そのＣ末端にＣＧＣトリプレットを有するように設計されることを特徴とする。
ペプチド（１）は、化学合成により製造できるだけでなく、発現系により製造したものをそのまま用いることもできる。したがって、本発明は、化学合成での製造が困難な、サイズの大きなペプチドにも適用することができる点で、極めて汎用性が高いという利点を有している。

発現系によるペプチド（１）の製造には、細菌等の微生物や動植物の細胞を宿主細胞として用いる方法を用いることができる。そのような方法は、当業者に周知であり、典型的には、発現させる部分ペプチドをコードする核酸分子を調製する工程、調製した核酸分子を発現系の宿主細胞に導入し、導入により得た形質転換体を培養して増殖させ、所望の部分ペプチドを発現させ、必要に応じて産生されたポリペプチド鎖を精製することによって取得することができる。

発現させるポリペプチド鎖をコードする核酸分子の調製方法は、当該技術分野で既知の任意の手法を用いることができる。例えば、目的のポリペプチド鎖をコードするｃＤＮＡを作製し、これを鋳型に適切なプライマーでＰＣＲなどの核酸増幅法を行う方法が挙げられる。本発明においては、目的のポリペプチド鎖のＣ末端にＣＧＣトリプレット、および必要に応じて、特定の物質と結合性を有するポリペプチドからなる精製タグ（例えばＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ、Ｓタグ、Ｔ７タグなど）を含むペプチドとして発現するように設計すればよい。得られた核酸分子は、種々のベクターにクローニングして保存することができる。所定の宿主に適合する具体的なベクターは当業者によく知られており、その多くは市販されている。

本発明の一実施形態において、ペプチド（１）は、糖鎖付加ペプチドである。

本発明のペプチドチオエステル製造法において、ペプチドチオエステルの形成は、２段階の反応を経て、Ｃ末端のＣＧＣ−ＣＯＯＨ部分が、チオエステルを形成するとともに、１段階目の反応で形成したＣＧ−チオエステル置換基の部分でジケトピペラジンを形成して安定化することによって達成される。

工程（２）は、ペプチド（１）において、ＣＧＣトリプレットにおけるＣ末端システインのＳＨ基とグリシンのカルボニル基との間で転移を生じさせ、Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルを得る工程である（第１段階の反応）。

工程（２）の反応は、所与のチオールの存在下で促進することができる。工程（２）の反応に使用できるチオールは、これに限定されるものではないが、２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）、２−アミノエタンチオール、およびビス（２−スルファニルエチル)アミン等を挙げることができ、これらのチオールの１種を、または、複数種を組み合わせて、使用することができる。

工程（２）の反応におけるチオールの使用量は、原料ペプチドであるペプチド（１）のチオール基１残基に対して、１〜１０００当量とすることができ、好ましくは、１０〜１００当量、より好ましくは、１５〜３０当量とすることができる。

工程（２）の反応で使用される溶媒は、緩衝溶液（リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液）でよく、反応ｐＨは、ｐＨ１．０〜５．０、好ましくはｐＨ２．０〜４．０である。

工程（２）の反応で用いられる反応温度としては、特に制限はないが、３０℃〜７０℃の範囲で実施可能であり、好ましくは４５℃〜５５℃の範囲（例えば５０℃）で実施される。

工程（２）の反応における反応時間は、原料ペプチドであるペプチド（１）の量に応じて、１〜１２０時間、例えば２４〜７２時間、の間で適宜設定することができる。

本発明の一実施形態において、工程（２）の反応において、チオールとして、２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）、２−アミノエタンチオールまたはビス（２−スルファニルエチル）アミンが使用される。工程（２）の反応に２−アミノエタンチオールまたはビス（２−スルファニルエチル)アミンが使用される場合、工程（２）の反応に伴ってＣＧＣトリプレットから離脱する末端のシステインが、Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルに再度組み込まれることに起因する収量の低下を防止することが期待できる。

工程（３）は、工程（２）の結果として生じたＲ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルにおいて、システインのＳＨ基とＸのカルボニル基との転移と、システインのアミノ基とグリシンのカルボニル基との結合形成によるジケトピペラジンを生じさせて、ペプチドチオエステルを得る工程である（第２段階の反応）。

工程（３）の反応は、所与のチオールの存在下で促進することができる。工程（３）の反応に使用できるチオールは、これに限定されるものではないが、２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）、メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、２−メルカプトプロピオン酸、チオフェノール、ベンジルメルカプタン、３／４−メルカプトベンジルスルフォネート等を挙げることができ、これらのチオールの１種を、または、複数種を組み合わせて、使用することができる。

工程（３）の反応におけるチオールの使用量は、Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルのチオール基１残基に対して、１〜１０００当量とすることができ、好ましくは、１０〜１００当量、より好ましくは、１５〜３０当量とすることができる。

工程（３）の反応で使用される溶媒は、緩衝溶液（リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液）でよく、反応ｐＨは、工程（２）に比して、より中性また塩基性よりの条件、例えばｐＨ５．０〜１３．０の範囲内の任意のｐＨ、ｐＨ６．０〜１２．０の範囲内の任意のｐＨ、ｐＨ７．０〜１１．０の範囲内の任意のｐＨとすることができる。

工程（２）の反応で用いられる反応温度としては、特に制限はないが、２０℃〜５０℃の範囲で実施可能であり、好ましくは３０℃〜４０℃の範囲（例えば３７℃）で実施される。

工程（３）の反応における反応時間は、０．５〜１２時間、例えば１．０〜１２時間、の間で適宜設定することができる。

本発明の一実施形態において、工程（２）の反応後、工程（３）の反応の前に、工程（１）の反応生成物の精製が行われる。精製は、ペプチドの精製に慣用的に用いられる方法によって行うことができ、これに限定されるものではないが、例えば、結晶化、交流分配法、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等（ＨＰＬＣ）などを用いることができる。

本発明のペプチドチオエステル製造法において、ＣＧＣトリプレットに結合しているアミノ酸Ｘの種類は、特に制限されず、任意のアミノ酸とすることができる。なお、ペプチドチオエステルの効率的な製造の観点から、工程（３）の反応に使用されるチオールの種類に応じて、アミノ酸Ｘの種類を適宜変更することが好ましい。例えば、工程（３）の反応に２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）を使用する場合には、アミノ酸Ｘとして、セリン、メチオニンまたはアラニンのいずれかを使用することが好ましい。本発明の好ましい実施形態において、工程（３）の反応に２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）を使用する場合、アミノ酸Ｘとして、メチオニンが使用される。

３．ペプチドの製造方法
別の態様において、本発明は、ペプチドの製造方法（以下、「本発明のペプチド製造法」とも称する）に関する。
本発明のペプチド製造法は、
（Ａ）ペプチドチオエステル、および
（Ｂ）アミノチオアシッドもしくはペプチドチオアシッド、または、下記構造：

［式中、Ｘは、酸処理、塩基処理、光照射処理、または還元処理で分離する任意の置換基を示し；Ｙは、ケトンまたはアルデヒドを示す。］
を有する補助基（以下、本発明の補助基とも称する）がそのＮ末端に導入されたアミノ酸またはペプチド
を縮合させて、ペプチドを得る工程を含み、
ここで、上記（Ａ）および（Ｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の少なくとも一部が未保護であることを特徴とする。

本発明において、「アミノ酸の側鎖の少なくとも一部が未保護である」とは、アミノ酸の側鎖の少なくとも一部が、ペプチド合成における側鎖の保護またはアミノ基の保護に慣用的に使用される保護基によって保護されていないことを意味する。そのような保護基としては、例えば、メチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、アセチル（Ａｃ）基、トリメチルシリル（ＴＭＳ）基、トリエチルシリル（ＴＥＳ）基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳまたはＴＢＤＭＳ）基などの水酸基の保護基；９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（ｔｒｏｃ）基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基、カーボネート系またはアミド系の保護基、などのアミノ基の保護基を挙げることができるが、これらに限定されない。また、「アミノ酸側鎖の一部が未保護である」とは、ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖の少なくとも１つが未保護であることをいい、その数は問題としない。

本発明のペプチド製造法における好ましい実施形態において、上記（Ａ）および（Ｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の全てが未保護である。

上記（Ａ）のペプチドチオエステルは、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、Ｃ末端のカルボン酸をＰｙＢＯＰおよびＤＩＰＥＡを用いて活性化させ、過剰のアルキルチオールを加えることでペプチドのＣ末端をチオエステル化することができる。この手法を用いる場合、フラグメントＣ末端のアミノ酸のα炭素の立体配置を抑制するため、アルキルチオールの添加は低温にて行うのが好ましく、より好ましくは１０℃〜−８０℃、より好ましくは０℃〜−４０℃の温度で行う。また、上記チオエステル化は、Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０（２），５０１−５１０に記載のＦｍｏｃ法やＢｏｃ法などによっても行うことができる。

本発明の一実施形態において、上記（Ａ）のペプチドチオエステルは、本発明のペプチドチオエステル製造法によって製造されたペプチドチオエステルである。

本発明のペプチド製造法において、ペプチドまたはアミノ酸のＮ末端に導入される補助基は、ペプチドチオエステルとのスルフィド結合形成およびその後のＳ−Ｎアシル転移を可能にするためのものである。したがって、本発明の補助基の他、α，βもしくはγ−位にチオール基（−ＳＨ）を備えた任意の化合物も同様に使用できると考えられる。

本発明の補助基における置換基Ｘは、ペプチドチオエステルとのスルフィド結合形成、それに続くＳ−Ｎ転移によるアミド結合形成後の任意の段階で実施される分離処理によって分離し得る置換基である。前記分離処理に使用される例示的な酸処理としては、トリフルオロ酢酸による処理（例えば、０〜９５％ＴＦＡ中、１〜３時間、室温、０．１〜１Ｍの反応濃度条件での処理）などを挙げることができる。前記分離処理に使用される例示的な塩基処理としては、ホスフィン／モルフォリンによる処理（例えば、緩衝液（ｐＨ８．８）中、０．３Ｍ ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）および１．２Ｍモルフォリンによる、４０℃、３時間の処理）などを挙げることができる。前記分離処理に使用される例示的な光照射処理としては、３００ｎｍ以上の波長による処理（例えば、ペプチドの水または水／アセトニトリル（３：７）溶液（０．５〜１ｍＭ）＋ＴＣＥＰ（１当量）に、４２５〜３６５ｎｍのＵＶを、室温で３０分照射する処理）などを挙げることができる。前記分離処理に使用される例示的な還元処理としては、亜鉛／酢酸による処理（例えば、ペプチドの酢酸溶液（０．２〜１Ｍ程度）に亜鉛粉末（補助基に対して１０〜５０当量）を加え、４０度で３０分から１２０分攪拌する処理）などを挙げることができる。

本発明の補助基は、好ましい実施形態において、Ｘがアリールである化合物である。

本発明のペプチドの製造法において、アミノ酸またはペプチドのＮ末端への本発明の補助基の導入は、当業者に公知の手法を用いて導入することができる。例えば、アミノ酸またはペプチドのＮ末端への本発明の補助基の導入は、アミノ酸のアミノ基と補助基のケトンまたはアルデヒドとの間の還元的アミノ化を利用することによって導入することができる。還元的アミノ化は、当業者に慣用的に用いられる還元剤を用いることで促進することができる。本発明に使用することができる還元剤としては、これに限定されるものではないが、例えばギ酸、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、２−ピコリン−ボラン等を挙げることができ、これらの還元剤の１種をまたは複数種を組み合わせて用いることができる。

還元的アミノ化には、ヘキサン等のアルカン類、トルエン等の芳香族化合物類、ジエチルエーテルおよびテトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸エチル等のエステル類およびイソプロパノールのアルコール類やＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの極性溶媒等の溶媒を使用することができる。また反応時間は、導入するアミノ酸の種類または形態（例えば糖鎖の有無）などによって変化する場合があるが、１時間から２４時間（例えば１６時間）とすることができる。

アミノ酸またはペプチドに補助基を導入する際には、補助基のチオール基を保護することが好ましい。チオール基の保護には、これに限定されるものではないが、アセチル基、ピバロイル基、トリチル基、トリクロロアセチル基、ベンゾイル基、フェロセノイル基、２，４，６−トリイソプロピル基、ジメチルフェニルアセチル基、２−メトキシイソブチリル基またはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基などを用いることができる。

上記（Ａ）および（Ｂ）の化合物の縮合反応は、ペプチドチオエステルとアミノチオアシッドまたはペプチドチオアシッドのチオール基との間で、またはペプチドチオエステルと本発明の補助基のチオール基との間で、Ｓ−Ｎアシル転移を起こすことによって進行する。

上記（Ａ）および（Ｂ）の化合物の縮合反応は、必要に応じて、酸の存在下で行うことができる。本発明のペプチド製造法に使用することが可能な酸は、これに限定されるものではないが、硫酸等の無機酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（ＢＦ３・ＯＥｔ２）、トリフルオロメタンスルホン酸ジメチル（メチルチオ）スルホニウム（ＤＭＴＳＴ）、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、トリフルオロメタンスルホン酸トリエチルシリル、トリフルオロメタンスルホン酸トリプロピルシリル、トリフルオロメタンスルホン酸ジメチルエチルシリル、トリフルオロメタンスルホン酸トリベンジルシリル、トリフルオロメタンスルホン酸トリナフチルシリル又はトリフルオロメタンスルホン酸トリベンジルメチルシリル、トリフルオロメタンスルホン酸銀、シクロペンタジエニル塩化ハフニウム、シクロペンタジエニル塩化ジルコニウム、塩化錫等のルイス酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、無水トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、テトラフルオロメタンスルホン酸等の有機酸などを挙げることができる。これらの酸は、１種または２種以上を併用することができる。また、酸の使用量は、使用するペプチドチオエステルの量に応じて、当業者は適宜適切な量を設定することができる。

縮合反応に使用する溶媒は、反応に不活性な溶媒であれば制限されない。例えば、ヘキサン、ヘプタン、ペンタン等の脂肪族炭化水素類、シクロヘキサン等の脂環式炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、四塩化炭素、クロルベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、モノグライム等のエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、１，３−ジメチルイミダゾリジノン等のアミド類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、アセトニトリル、プロパンニトリル等のニトリル類又はこれらの混合溶媒等が挙げられる。

縮合反応に使用される温度は、−８０℃〜４０℃、例えば−４０℃〜２５℃の範囲とすることができる。

本発明のペプチドの製造法は、ペプチドチオエステルとのライゲーションに用いるアミノ酸またはペプチドとして、アミノチオアシッドまたはペプチドチオアシッド、または特定の構造をそのＮ末端に有するアミノ酸またはペプチドを用いることによって、これらのいずれかのアミノ酸側鎖に未保護のアミノ酸が存在していても、ペプチドチオエステルのチオエステル部位（−ＣＯＳＲ）と、アミノチオアシッドもしくはペプチドチオアシッドまたは補助基のチオ酸基（−ＣＯＳＨ）とを、選択的に結合することができるという新たな知見に基づいている。すなわち、本発明のペプチドの製造法は、アミノ酸側鎖の保護、脱保護、および縮合の繰り返しを回避してもなお、構造が制御された目的のペプチドが製造できるという利点を有している。さらに、製造目的とするペプチドが、糖鎖付加ペプチドである場合には、アミノ酸側鎖の保護、脱保護、および縮合の繰り返しを回避できる結果、得られる糖鎖付加ペプチドのトータル収量を増加することができる。

本発明のペプチド製造法は、一実施形態において、糖鎖付加ペプチドの製造方法である。

したがって、本発明のペプチド製造法は、一実施形態において、（Ａ）として糖鎖付加ペプチドチオエステルが使用される。

本発明のペプチド製造法は、別の実施形態において、（Ｂ）として、糖鎖付加アミノチオアシッドが使用される。

本発明のペプチド製造法は、さらに別の実施形態において、（Ｂ）として、糖鎖付加ペプチドチオアシッドが使用される。

本発明のペプチド製造法は、さらに別の実施形態において、（Ｂ）として、本発明の補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ペプチドが使用される。

本発明のペプチド製造法を糖鎖付加ペプチドの製造方法に応用する場合には、（Ａ）糖鎖付加ペプチドチオエステルに存在する糖鎖、または（Ｂ）糖鎖付加アミノチオアシッドもしくは糖鎖付加ペプチドチオアシッド、または本発明の補助基をそのＮ末端に有する糖鎖付加アミノ酸もしくは糖鎖付加ペプチドに存在する糖鎖は、その一部または全部が、当業者に公知の保護基で保護されていてもよいし、保護されていなくてもよい。これらの化合物中の糖鎖が、酸に対する感受性が高い部分（例えばシアル酸部分）を含んでいる場合には、（Ａ）と（Ｂ）の縮合反応の前に、これらの糖鎖部分に保護基を導入することが好ましい。本発明に使用することができる糖鎖の保護基として、例えば、これに限定されるものではないが、フェナシル基、ベンジル基、メチル基等を挙げることができる。

本発明のペプチド製造法において、（Ａ）として、糖鎖付加ペプチドチオエステルが使用される場合には、前記糖鎖付加ペプチドチオエステルは、例えば、ペプチドチオエステルと、糖鎖付加アミノチオアシッドとを縮合して糖鎖を導入し、その後、Ｃ末端をさらにチオエステル化することによって製造することができる。

糖鎖アミノチオアシッドは、例えば、常法に従って調製した糖鎖付加アスパラギン（Ａｓｎ）、糖鎖付加セリン（Ｓｅｒ）、糖鎖付加スレオニン（Ｔｈｒ）、糖鎖付加ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、糖鎖付加ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）などの糖鎖付加アミノ酸のＣ末端にチオ酸基を導入することによって製造すればよい。

また、本発明のペプチド製造法において、（Ｂ）として、糖鎖付加ペプチドチオアシッドが使用される場合には、前記糖鎖付加ペプチドチオアシッドは、例えば、側鎖に前記糖鎖付加アミノチオアシッド中のチオ酸基（−ＣＯＳＨ）とジスルフィド結合を形成し得る修飾基を有するシステインをそのＮ末端に有するペプチドとを反応させ、反応後のペプチドのＣ末端にチオ酸基を導入することにより製造することができる。当業者であれば、この目的に使用することができる修飾基を容易に設計することができる。具体的に、修飾基は、糖鎖付加アミノチオアシッドのチオ酸基（−ＣＯＳＨ）との間でジスルフィド結合を形成する際に分離するように設計すればよい。そのような修飾基の具体例として、下記に記載するＮｐｙｓ／Ｐｙｓ修飾を挙げることができる（例えばＬｉｕ，Ｃら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ．，１９９６，３７，９３３−９３６）。

；

；および

また、本発明のペプチド製造法において、（Ｂ）として、本発明の補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加ペプチドが使用される場合には、前記糖鎖付加ペプチドは、例えば、本発明の補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸のＣ末端にチオ酸基（−ＣＯＳＨ）を導入して本発明の保護基を有する糖鎖付加アミノチオアシッドを製造し、側鎖に前記糖鎖付加アミノチオアシッド中のチオ酸基（−ＣＯＳＨ）とジスルフィド結合を形成し得る修飾基を有するシステインをそのＮ末端に有するペプチドとを反応させることによって製造することができる。

本発明の一実施形態において、上記「本発明の補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、下記構造を有する糖鎖付加アミノ酸である。

［ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
上記糖鎖付加アミノ酸において、好ましくは、Ｘは、Ｘは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｙｌである。
上記糖鎖付加アミノ酸において、チオール基（−ＳＨ）は、保護されていても、保護されていなくてもよい。
上記糖鎖付加アミノ酸において、側鎖の糖鎖は、保護されていても、保護されていなくてもよい。

本発明の一実施形態において、上記「本発明の補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、下記構造を有する糖鎖付加ジペプチドである。

［ここで、Ｘ_１はＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｙｌを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
上記糖鎖付加ジペプチドにおいて、チオール基（−ＳＨ）は、保護されていても、保護されていなくてもよい。
上記糖鎖付加ジペプチドにおいて、側鎖の糖鎖は、保護されていても、保護されていなくてもよい。

なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。

また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。

異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。

第１の、第２のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第１の要素は第２の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。

［実施例１］ アミノチオアシッドを利用した糖ペプチドの合成
（１）糖鎖付加アミノチオアシッドの合成
（１−１）ｔｅｒｔ−Ｂｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＴｒｔの合成

Ｂｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＯＨ（１８．０ｍｇ、６．７μｍｏｌ）（Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｍ．；Ｋｉｕｃｈｉ，Ｔ．；Ｎｉｓｈｉｈａｒａ，Ｍ．；Ｔｅｚｕｋａ，Ｋ．；Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｒ．；Ｉｚｕｍｉ，Ｍ．；Ｋａｊｉｈａｒａ，Ｙ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ａｎｄ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ．２０１６．）をＤＭＦ（４８６．０μＬ）に溶かし、さらにトリフェニルメタンチオール（４７．２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２９．５ｍｇ、５６．６μｍｏｌ）および、ＤＩＥＡ（１０．０μＬ、５７．３μｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下、−１５℃において添加し、撹拌した。反応１５時間後、冷Ｅｔ_２Ｏ（２０ｍＬ）を加え、得られた白色懸濁溶液を遠心分離し、沈殿を回収した。以下の条件で得られた沈殿の精製を行った。ＨＰＬＣ（Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８ φ１０×２５０ｍｍ、１５ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：ＣＨ_２ＣＮ＝６５：３５〜２０：８０、８０分、流速３ｍＬ／分）。精製後は強酸性陽イオン交換カラムＤｏｗｅｘ樹脂を用いて脱塩処理を行い、凍結乾燥し、最終的にｔｅｒｔ−Ｂｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＴｒｔ（１１ｍｇ、５７％）の白色固体を得た（図１、図２）：ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．（ａ）に関し、Ｃ_１２８Ｈ_１７８Ｎ_８Ｏ_６７Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋１４６７．４、ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋１４６７．１．（ｂ）に関し、Ｃ_１０９Ｈ_１６４Ｎ_８Ｏ_６７Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋１３４６．３，ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋１３４６．１．

図１中、化合物（ｂ）はＢｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＴｒｔ １であり、化合物（ａ）は、ＥＳＩ−ＭＳの装置内でのＳＴｒｔ基が外れたＢｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＨである．

（１−２）Ｈ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＨの合成

得られたＢｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＴｒｔ １（８．５ｍｇ、２．９μｍｏｌ）に７５０μＬのＴＩＰＳ（５％、ｖ／ｖ）を含有するＴＦＡを加え、室温で撹拌した。ＴＬＣを用いて反応追跡を行い、反応３０分後、冷Ｅｔ_２Ｏ（１０ｍＬ）を加え、得られた白色懸濁溶液を遠心分離した。この操作を２回行い、得られた沈殿を０．１％ＴＦＡ水溶液に溶かし、凍結乾燥させることで、最終的にＨ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＨ（６．９ｍｇ、９２％）の白色固体を得た（図３、図４）：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ （ａ） Ｃ_１０４Ｈ_１５６Ｎ_８Ｏ_６５Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋１２９６．２、［Ｍ＋３Ｈ］^３＋８６４．５、ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋１２９６．５、［Ｍ＋３Ｈ］^３＋８６４．７。

（１−３）ｔｅｒｔ−Ｂｏｃ−Ａｓｎ（アシアロオリゴサッカライド）−ＳＴｒｔの合成

Ｂｏｃ−Ａｓｎ（アシアロオリゴサッカライド）−ＯＨ（１０．０ｍｇ、５．４μｍｏｌ）をＤＭＦ（２５０．０μＬ）に溶解させ、トリフェニルメタンチオール（４４．５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１７．０ｍｇ、３２．６μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（６．０μＬ、３４．４μｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下、−１５℃において添加し、撹拌した。反応１．５時間後、冷Ｅｔ_２Ｏ（４０ｍＬ）を加え、得られた白色懸濁溶液を遠心分離した後、沈殿を回収した。以下の条件で得られた沈殿の精製を行った。ＨＰＬＣ（ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ φ１０×２５０ｍｍ、０．１％ギ酸水溶液：０．１％ギ酸ＣＨ_２ＣＮ溶液＝８０：２０〜４０：６０、４５分、流速３ｍＬ／分）。

最終的にｔｅｒｔ−Ｂｏｃ−Ａｓｎ（アシアロオリゴサッカライド）−ＳＴｒｔ ３（６．７ｍｇ、５９％）の白色固体を得た（図５）：ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ_７１Ｈ_１１８Ｎ_６Ｏ_４９Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋９３６．８，ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋９３６．５。なお、観測されたＭＳは、ＥＳＩ−ＭＳの装置内でのＳＴｒｔ基が外れたＢｏｃ−Ａｓｎ（アシアロオリゴサッカライド）−ＳＨである。

（１−４）Ｈ−Ａｓｎ（アシアロオリゴサッカライド）−ＳＨの合成

得られたＢｏｃ−Ａｓｎ（アシアロオリゴサッカライド）−ＳＴｒｔ ３（２．０ｍｇ、０．９５μｍｏｌ）に６５．０μＬのＴＩＰＳ（５％、ｖ／ｖ）を含有するＴＦＡを加え、室温下で撹拌した。ＴＬＣを用いて反応追跡を行い、反応３０分後に冷Ｅｔ_２Ｏ（１０ｍＬ）を加え、撹拌した。得られた白色懸濁溶液を遠心分離後、白色沈殿を回収した。さらに、沈殿に冷Ｅｔ_２Ｏ（１０ｍＬ）を加え、撹拌し、生じた白色懸濁溶液を遠心分離する操作を２回行った。得られた沈殿を０．１％ＴＦＡ溶液に溶解させ、凍結乾燥処理を行うことで、Ｈ−Ａｓｎ（アシアロオリゴサッカライド）−ＳＨ ４（０．６ｍｇ、３４％）の白色固体を得た。

（２）アミノチオアシッドの合成
（２−１）Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＳＴｒｔの合成

Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（３０１ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）、トリフェニルメタンチオール、（６８４ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）およびＰｙＢＯＰ（１．２５ｇ、２．４０ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（１２．０ｍＬ）に溶解させ、Ａｒ雰囲気下、−２０℃において静置した。この溶液にＤＩＥＡ（４１９μＬ、２．４０ｍｍｏｌ）を添加し、１．５時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液で分液し、有機相を減圧下で濃縮した。得られた黄白色固体を少量のＤＣＭに溶解させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製することで、（酢酸エチル／ヘキサン＝１：８）、最終的にＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＳＴｒｔ ５（３０１ｍｇ、５１％）の白色粉末を得た（図６）。

（２−２）Ｈ−Ｌｅｕ−ＳＨの合成

得られたＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＳＴｒｔ ５（５０ｍｇ、１０２μｍｏｌ）に５．０ｍＬのＴＩＰＳ（５％、ｖ／ｖ）を含有するＴＦＡを添加し、室温で３０分間撹拌した。ＴＦＡを減圧下除去し、直ちに４０ｍＬの冷Ｅｔ_２Ｏを加えた。得られた白色懸濁溶液を遠心分離し、白色沈殿を得た。さらに白色沈殿に４０ｍＬの冷Ｅｔ_２Ｏを添加し、遠心分離する操作を計２回行った。得られた白色沈殿を０．１％ＴＦＡ水溶液で溶解させ、凍結乾燥処理を行い、Ｈ−Ｌｅｕ−ＳＨ ６（１２．４ｍｇ、８３％）の白色粉末を得た（図７）。

また、他の側鎖を有する下記のアミノ酸チオアシッドを同様の手法を用いて合成した。

（３）Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の手順
（３−１）ペプチドチオエステルの合成

用いたＦｍｏｃ−アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅである。ペプチド−α−チオエステル ７は，Ｄａｗｓｏｎ ＡＭ ｒｅｓｉｎを樹脂として用いたＦｍｏｃ ＳＰＰＳプロトコールを用いた。最初のＦｍｏｃ-アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、０．８４ｍｍｏｌ）は、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中で、ＨＢＴＵ（３１４ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１１４ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２１９μＬ、０．８４ｍｍｏｌ）により、１分間活性化させ、ＳＰＰＳチューブ内で樹脂（１４１μｍｏｌ）に加え、反応溶液を４５分間室温で撹拌した。さらなるＦｍｏｃ−アミノ酸の縮合は、上記と同様の手法を用いた。また、Ｆｍｏｃ基の脱保護は、ピペリジン（２０％、ｖ／ｖ）を含有するＤＭＦを樹脂に加え、１０分間撹拌した後、ＤＭＦで洗浄することで行った。最終残基の縮合後、Ｆｍｏｃ基を脱保護し、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。さらにペプチドを樹脂から切り出すために、樹脂に２．４ｍＬのＴＩＰＳ（５％、ｖ／ｖ）含有ＴＦＡを加え、室温で１時間撹拌した。得られた溶液に、冷Ｅｔ_２Ｏ（４０ｍＬ）を加え、遠心分離し、白色沈殿を回収した。同様の操作を２回行った後、凍結乾燥を行い、Ｈ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＤＢｚの黄色固体を得た。得られたＨ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＤＢｚ（７．０ｍｇ、１３μｍｏｌ）を、１．３ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ３．７）に溶解させ、−５℃の一定温度下で、１．０Ｍ ＮａＮＯ_２水溶液（１３０μＬ、１３０μｍｏｌ）を添加した。２分間撹拌した後、反応溶液に４−メルカプト安息香酸（２０．０ｍｇ、１２９μｍｏｌ）の溶解した１．３ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、１０分間撹拌した後、直ちに冷Ｅｔ_２Ｏ（１０ｍＬ）を加え、遠心分離を行った。同様の操作を２回行った後、水相を回収し、以下の条件で精製した。ＨＰＬＣ（Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ Ｃ８φ１０×２５０ｍｍ、０．１％ギ酸水溶液：０．１％ギ酸ＣＨ_２ＣＮ溶液＝９０：１０〜５０：５０、８０分、流速３ｍＬ／分）。得られた精製溶液を凍結乾燥させペプチド−チオエステル ７（２．３ｍｇ）の黄色粉末を得た（図８）：ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ_２９Ｈ_３０Ｎ_４Ｏ_７Ｓ：［Ｍ＋Ｈ］^＋５７９．２，ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋Ｈ］^＋５７９．２。

（３−２）Ｃｙｓ修飾ペプチドの合成

使用するＦｍｏｃ−アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ（Ｓ^ｔＢｕ）である。また上記構造中の下記構造部分を、以下ではＮｐｙｓと表記する。

ペプチド８は、Ｂａｒｌｏｓ Ｒｅｓｉｎ（６０μｍｏｌ）を樹脂として用いたＦｍｏｃ ＳＰＰＳプロトコールにより合成した。基本的なアミノ酸の縮合反応はペプチドチオエステル ７の合成と同様の操作により行った。最終残基を縮合後、Ｆｍｏｃ基を脱保護させ、ＤＭＦで洗浄した。次にシステインのｔｅｒｔ−ブタンチオールを脱離させるため、ＳＰＰＳチューブ内で樹脂に２．０ｍＬの２−メルカプトエタノール（２０％、ｖ／ｖ）含有ＤＭＦを加えた。５時間室温で撹拌し、ＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。さらにＮｐｙｓとジスルフィド結合を形成させるため、樹脂に２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（１８９．２ｍｇ、６１０μｍｏｌ）を含む３ｍＬのＤＭＦを加え、室温下で１８時間撹拌した。さらに，ＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄し、樹脂からペプチドを切り出すために、ＴＩＰＳ（５％、ｖ／ｖ）を含有する２．０ｍＬのＴＦＡを加え、３時間撹拌した。得られた溶液に、冷Ｅｔ_２Ｏ（４０ｍＬ）を加え、遠心分離し、黄色沈殿を回収した。同様の操作を２回行った後、凍結乾燥を行い、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＨの黄色固体を得た（図９）：ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ． Ｆｏｒ Ｃ_２１Ｈ_２４Ｎ_６Ｏ_８Ｓ_２：［Ｍ＋Ｈ］^＋５５３．１，ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋Ｈ］^＋５５３．４。

（４）チオアンハイドライドライゲーションの一般的な反応手順
合成したアミノチオアシッドに対してペプチドチオエステル ７（０．５〜２．０当量）およびＤＩＥＡ（５．０〜１０．０当量）を加え、Ａｒ雰囲気下室温で反応させた。反応溶液のアミノチオアシッドは、１０〜３０ｍＭで反応を効率的に進行させることができる。反応追跡は逆相ＨＰＬＣを用いて行った。反応は、通常、いずれの基質においても３〜６時間以内に完了する。

ペプチドチオエステルとのアミノチオアシッドとのカップリング

Ａｒ雰囲気下で、ペプチドチオエステル ７（０．１８ｍｇ、０．３１μｍｏｌ）を１０．０μＬのＤＩＥＡ（３２０ｍＭ）含有ＤＭＦに溶解させた。さらにＨ−Ａｌａ−ＳＨ（０．１２ｍｇ、１．１μｍｏｌ）を加えた。反応は３０分で収束した。反応追跡は、０．１％ギ酸５０％ＣＨ_２ＣＮ水溶液を大過剰加え、撹拌した後、溶液をＲＰ−ＨＰＬＣに通して行った（図１０）。反応収束後３０分で、アミド結合形成率は８７％であった。その際のアミド結合形成率は、ＨＰＬＣ上での面積強度の積分値から算出したものである。ＥＳＩ−ＭＳ：Ｈ−ＹＧＧＦＡ−ＳＨ ９ ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ． Ｆｏｒ Ｃ_２５Ｈ_３１Ｎ_５Ｏ_６Ｓ：［Ｍ＋Ｈ］^＋５３０．２， ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ５３０．２。

そして他のアミノチオアシッドにおいても同様の反応を行い、得られたペプチドチオエステルとアミノチオアシッド間でのアミド結合形成率（％）を図１１にまとめた。

ペプチドチオエステルとＨ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＨとのカップリング

Ａｒ雰囲気下、ペプチドチオエステル ７（０．０６０ｍｇ、０．１０μｍｏｌ）を、６．０μＬのＤＩＥＡ（１５０ｍＭ）含有ＤＭＦに溶解させた。さらに、この反応溶液に、合成で得られたＨ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＨ ２（０．５０ｍｇ、１．９μｍｏｌ）を加え、室温で反応させた。ＨＰＬＣによる反応追跡の結果、反応３時間で反応が収束した。この際の縮合でのアミド結合形成率は４６％であることが分かった（図１２）。その際のアミド結合形成率は，ＨＰＬＣ上での面積強度の積分値から算出したものである。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ． Ｆｏｒ Ｃ_１２６Ｈ_１８０Ｎ_１２Ｏ_７０Ｓ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋１５０８．５、［Ｍ＋３Ｈ］^３＋１００５．９、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋７５４．７， ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ １５０８．６，［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １００５．７，［Ｍ＋４Ｈ］^４＋７５４．８。

次に反応が完了した後、直ちに凍結乾燥を行い、得られたペプチド １０を以下の条件で精製した。ＨＰＬＣ（ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ φ１０×２５０ｍｍ、０．１％ＴＦＡ水溶液：０．１％ＴＦＡＣＨ_２ＣＮ溶液＝９０：１０〜５０：５０、５０分、流速３ｍＬ／分）。

ペプチドチオエステルとＨ−Ａｓｎ（アシアロオリゴサッカライド）−ＳＨとのカップリング

Ａｒ雰囲気下、ペプチドチオエステル ７（０．１５ｍｇ、０．０１７μｍｏｌ）を６．０μＬのＤＩＥＡ（３２０ｍＭ）含有ＤＭＦに溶解させた。この反応溶液に、合成で得られたＨ−Ａｓｎ（アシアロオリゴサッカライド）−ＳＨ ４（０．０１ｍｇ、０．０８２μｍｏｌ）を加え、室温で反応させた。ＨＰＬＣによる反応追跡の結果、反応３時間で反応が収束した。その際の縮合でのアミド結合形成率は３４％であることが分かった（図１３）。その際アミド結合形成率は、ＨＰＬＣ上での面積強度の積分値から算出したものである。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ． Ｆｏｒ Ｃ_８８Ｈ_１３４Ｎ_１０Ｏ_５２Ｓ ： ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ １０９８．４， ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ １０９８．６。

Ｈ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）−ＳＨとＨ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＯＨペプチドとのカップリング
本縮合反応は、ペプチドチオアシッドおよびＮ末端にＮｐｙｓ修飾を行ったペプチドとのライゲーション反応である。これはＴａｍらの方法を参考に行った（Ｌｉｕ，Ｃ．；Ｒａｏ，Ｃ．；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ． Ａｃｙｌ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｃｙｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ．，１９９６，３７，９３３−９３６．）。

得られたペプチド １０（０．２９ｍｇ、０．０９６μｍｏｌ）を１９．０μＬのＤＭＦへ溶解させ、さらにＮｐｙｓ修飾を行ったペプチド ８（０．１ｍｇ、０．１８μｍｏｌ）を添加した。反応２．５時間後、溶液にジチオスレイトールを添加し、反応を収束させ、ＨＰＬＣで反応を確認したところ、定量的にライゲーションが行われたことを確認した（図１４）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ． Ｆｏｒ Ｃ_１４２Ｈ_２００Ｎ_１６Ｏ_７６Ｓ ： ［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １１２７．４， ［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ８４５．８， ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ １１２７．１， ［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ８４５．６。

［実施例２］ 補助基を利用した糖ペプチドの合成
（１）糖鎖Ｎ末端側ライゲーション
（１−１）補助基の合成
下記反応スキームにしたがって、化学式Ｃ_２３Ｈ_２２ＯＳで示す補助基を合成した。

反応１
１−フェニルエタン−１，２−ジオール（３．９６ｇ、２８．９ｍｍｏｌ）、ＴｒｔＣｌ（８．７７ｇ、３１．８ｍｍｏｌ、１．１当量）、ＤＭＡＰ（０．３５４ｇ、２．８９ｍｍｏｌ、０．１当量）、および攪拌子をナスフラスコに入れ、真空ラインで１時間乾燥させた。アルゴン置換後、ピリジン（７２ｍｌ、４００ｍＭ）を加えて、５０℃のオイルバスで一晩攪拌させた。その間ＴＬＣ（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で反応追跡を行った。１６時間後、真空ポンプにより減圧濃縮し、ピリジンを除いた。十分にピリジンが除去された後、酢酸エチルで希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水、Ｈ_２Ｏで抽出した。有機層を減圧濃縮後、シリカゲルカラム精製（直径＝３０ｍｍ、展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝１１：１）にて目的物を得た。（１０．１ｇ，９２％）。
化学式：Ｃ_２７Ｈ_２４Ｏ_２
［Ｍ＋Ｎａ］^＋：Ｃａｌ．４０３．８ Ｆｏｕｎｄ．４０３．３
［Ｍ＋Ｋ］^＋：Ｃａｌ．４１９．８ Ｆｏｕｎｄ．４１９．３
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）
δ：７．４２−７．２３（ｍ，２０Ｈ），４．７６（ｍ，１Ｈ），３．４５（ｍ，１Ｈ），３，２８（ｍ，１Ｈ），２．７６（ｄ，１Ｈ）

反応２
１−フェニル−２−（トリチルオキシ）エタノール（７．１１ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（９５ｍＬ、２００ｍＭ）に溶かし、氷浴中でＤＩＥＡ（６．５ｍＬ、３７．４ｍｍｏｌ、２当量）を加えたのちゆっくりとＭｓＣｌ（１．７５ｍＬ、２２．４ｍｍｏｌ、１．２当量）を滴下した。滴下終了後、氷浴を外し徐々に室温へと戻した。この間ＴＬＣ（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で反応追跡を行った。５分後、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水、Ｈ_２Ｏで抽出した。有機層にＭｇＳＯ_４を加えてろ過した後、減圧濃縮して真空ラインで１時間乾燥させた。クルードのまま、ＤＭＦ（２５０ｍＬ，１５０ｍＭ）に溶かし、ＫｓＡｃ（４．２７ｇ、３７．４ｍｍｏｌ、２当量）加えて、４０℃のオイルバスで一晩攪拌させた。この間ＴＬＣ（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で反応追跡を行った。酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水で抽出した。減圧濃縮後、シリカゲルカラム精製（直径＝５０ｍｍ、展開溶媒 ヘキサン：トルエン＝１：１）によって目的物を得た（５．８２ｇ、７１％）。
化学式：Ｃ_２９Ｈ_２６Ｏ_２Ｓ
［Ｍ＋Ｎａ］^＋：Ｃａｌ．４６１．０ Ｆｏｕｎｄ． ４６１．３
［Ｍ＋Ｋ］^＋：Ｃａｌ．４７７．２ Ｆｏｕｎｄ． ４７７．５
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）
δ：７．３５−７．２１（ｍ，２０Ｈ），４．８５（ｔ，１Ｈ），３．４５（ｄ，１Ｈ），３，４１（ｄ，１Ｈ），２．３０（Ｓ，３Ｈ）

反応３
Ｓ−（１−フェニル−２−（トリチルオキシ）エチル）エタンチオエート（５．１９ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）をメタノール：酢酸エチル＝４：１（１１８ｍＬ、１００ｍＭ）に溶かし、ゆっくりとＮ_２Ｈ_４・Ｈ_２Ｏ（０．８６５ｍＬ、１７．９ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下して室温で攪拌した。その間ＴＬＣ（展開溶媒 ヘキサン：トルエン＝３：１）で反応追跡を行った。１時間後、酢酸エチルで希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水、Ｈ_２Ｏで抽出した。有機層を減圧濃縮してシリカゲルカラム精製（直径＝５０ｍｍ、展開溶媒 ヘキサン：トルエン＝３：１）によって目的物を得た（３．９８ｇ、８４％）。
化学式： Ｃ_２７Ｈ_２４ＯＳ
［Ｍ＋Ｎａ］^＋：Ｃａｌ．４１９．５ Ｆｏｕｎｄ． ４１９．４
［Ｍ＋Ｋ］^＋：Ｃａｌ．４３５．２ Ｆｏｕｎｄ． ４３５．１
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）
δ：７．４０−７．２０（ｍ，２０Ｈ），４．０９（ｑ，１Ｈ），３．４５（ｍ，２Ｈ），２．３３（Ｓ，１Ｈ）

反応４
１−フェニル−２−（トリチルオキシ）エタン−１−チオール （３．５８ｇ、９．０３ｍｍｏｌ）をギ酸：Ｅｔ_２Ｏ＝１：１（３０ｍＬ、３００ｍＭ）に溶かし、室温で攪拌した。その間ＴＬＣ（展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝６：１）で反応追跡を行った。直後、ピペリジン（約２０ｍＬ）を氷浴中でゆっくりと加えてクエンチし、反応溶液を酢酸エチルで希釈したのち、飽和炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水、Ｈ_２Ｏで抽出した。有機層を減圧濃縮してシリカゲルカラム精製（直径＝５０ｍｍ、展開溶媒 ヘキサン：酢酸エチル＝６：１）によって目的物を得た（２．８０ｇ、７８％）。
化学式：Ｃ_２７Ｈ_２４ＯＳ
［Ｍ＋Ｎａ］^＋：Ｃａｌ．４１９．５ Ｆｏｕｎｄ． ４１９．３
［Ｍ＋Ｋ］^＋：Ｃａｌ．４３５．２ Ｆｏｕｎｄ． ４３５．０
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）
δ：７．４４−７．２３（ｍ），３．４６（ｍ，１Ｈ），３．３８（ｔ，１Ｈ），３．３１（ｍ，１Ｈ），１．５０（ｔ，１Ｈ）

反応５
２−フェニル−２−（トリチルチオ）エタノール（１．９ｇ、４．９１ｍｍｏｌ）にＮａ_２ＣＯ_３（約６当量程度）を加え、ＤＣＭ５０ｍｌに溶かした。ここへデス−マーチンペルヨージナン（ＤＭＰ）（２．２９ｇ、５．４０ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＣＭ４８ｍｌに溶かしたものを少しずつ滴下した。反応は１０分で終了し、この間ＴＬＣ（展開溶媒 ヘキサン：ＤＣＭ＝１：３）で反応追跡を行った。これを過剰のＥｔ_２Ｏで希釈し、飽和炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水、Ｈ_２Ｏで抽出した。この時水層と有機層の間に白いポリマーのようなものができるが、抽出操作を続けるとほとんど水層に移動した。その後ドラフト内で減圧濃縮し、シリカゲルカラム精製（ヘキサン：ＤＣＭ＝１：３、直径３０ｍｍ）によって目的物を得た（１．３５ｇ、７０％）。
化学式：Ｃ_２７Ｈ_２２ＯＳ
［Ｍ＋Ｎａ］^＋：Ｃａｌ．４１７．１ Ｆｏｕｎｄ．４１７．２
［Ｍ＋Ｋ］^＋：Ｃａｌ．４３３．２ Ｆｏｕｎｄ．４３３．３
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）
δ：８．９９（ｄ，１Ｈ）７．４４−７．２１（２０Ｈ，ｍ），３．９９（ｄ，１Ｈ）

（１−２）セリンへの補助基の導入
上記のようにして合成した補助基を、下記の反応スキームにしたがってセリンに導入した。

２−フェニル−２−（トリチルチオ）アセトアルデヒド（１７３．５ｍｇ、０．４３８ｍｍｏｌ、１．１当量）をメタノールに溶かし、そこへＯ−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｌ−セリン（６４．２ｍｇ、０．３９８ｍｍｏｌ）、ボラン−２−ピコリンコンプレックス（８５．２ｇ、０．７９６ｍｍｏｌ、２当量）、ギ酸の順で加えた。この間ＴＬＣ（展開溶媒 酢酸エチル：メタノール＝１：１）で反応追跡を行った。５時間後、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水、Ｈ_２Ｏで抽出した。有機層を減圧濃縮し、シリカゲルカラム精製（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１、直径１５ｍｍ）にて目的物を得た（９６．１ｍｇ、４５％）。
化学式：Ｃ_３４Ｈ_３７ＮＯ_３Ｓ
［Ｍ＋Ｈ］^＋：Ｃａｌ．５４０．２５ Ｆｏｕｎｄ．５４０．１

（１−３）糖鎖付加アミノ酸への補助基の導入
また、下記の反応スキームにしたがって、補助基をジシアロ糖鎖付加アミノ酸に導入した。

Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（シアリルオリゴサッカライド）（５１．４ｍｇ、２１．４μｍｏｌ）をＨ_２Ｏ（０．６ｍＬ）に溶かしたものと、２−フェニル−２−（トリチルチオ）アセトアルデヒド（１２３．６ｍｇ、０．３２１ｍｍｏｌ、１５当量）をＤＭＦ（１．８ｍＬ）とイソプロパノール（０．２ｍＬ）に溶かしたものを混ぜ、ここに５％（ｖ／ｖ）になるようにギ酸を加えた。この溶液に、ボラン−２−ピコリンコンプレックス（３６．１ｍｇ、０．３２１ｍｍｏｌ、１５当量）を加え、３０℃で攪拌した。その間ＴＬＣ（展開溶媒 １Ｍ酢酸アンモニウム水溶液：イソプロパノール＝２：３）、およびＵＰＬＣで反応追跡を行った。３６時間後、溶液を真空ポンプで減圧濃縮してＤＭＦを除去したのち、逆相ＨＰＬＣ精製によって目的物を得た（３４．６ｍｇ、５９％、図１５）。
化学式：Ｃ_１１５Ｈ_１６６Ｎ_８Ｏ_６４Ｓ
［Ｍ＋Ｈ］^＋：Ｃａｌ．２７１５．９７ Ｆｏｕｎｄ．２７１５．８

（１−４）保護基の導入
下記の反応スキームにしたがって、糖鎖付加アミノ酸−補助基複合体の末端シアル酸に保護基を導入した。

Ａｕｘ−Ａｓｎ（シアリルオリゴサッカライド）（１０．６ｍｇ、３．６８μｍｏｌ）、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗ−ｅｘ５０に通して凍結乾燥させた。これを糖鎖１ｍｇに対し５００μＬの割合で蒸留水に溶かした溶液を、５０ｍｇ／ｍＬの炭酸セシウム水溶液でｐＨ４．０に調整したのち、再び凍結乾燥させた。その後、ＤＭＦ（３．６ｍＬ、１ｍＭ）に溶かし、ここへ２−ブロモ−１−フェニルエタン−１−オン（３．６２ｍｇ、１８．４ｍｍｏｌ）を加えて５時間常温で攪拌した。この間の反応追跡は、ＵＰＬＣで行い、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１５のゲルでゲルろ過後、逆相ＨＰＬＣ精製によって目的物を得た（２．３ｍｇ、２１％、図１６）。
化学式：Ｃ_１３１Ｈ_１７８Ｎ_８Ｏ_６６Ｓ
［Ｍ＋Ｈ］^＋：Ｃａｌ．２９５１．９４ Ｆｏｕｎｄ．２９５２．０

（１−５）補助基を介したＮ末端側ライゲーション
上記（１）〜（４）にしたがって取得した糖鎖付加アミノ酸−補助基複合体を、下記反応スキームにしたがって、ペプチドチオエステル体（ＬＲＬＲＧＧ−ＣＯＳＲおよびＡＬＬＸ−ＣＯＳＲ）とのライゲーションに用いた。

いずれの反応においても、糖鎖−補助基複合体（Ａｕｘ−Ａｓｎ（ジフェナシル-シアリルオリゴサッカライド）（２．５ｍＭ）、ペプチドチオエステル体（５ｍＭ）になるように、５０μｌの緩衝液（６Ｍ Ｇｄ・ＨＣｌ、２００ｍＭリン酸、２０ｍＭ ＴＣＥＰ、４０ｍＭ ＭＰＡＡ）に溶かし、ｐＨ７に調整した。これを常温で静置し、ＵＰＬＣによって反応を追跡した。

ＬＲＬＲＧＧ
ＭＰＡＡの付加体の形で得られたが、ＴＣＥＰを添加すると全て目的のライゲーションプロダクトとして得られた。（ＨＰＬＣ 面積収率＞９９％、図１７）
化学式：Ｃ_１４０Ｈ_２２０Ｎ_２０Ｏ_７２Ｓ
［Ｍ＋Ｈ］^＋ Ｃａｌｃｄ．３３６６．３９０３ Ｆｏｕｎｄ．３３６６．３９６２

ＡＬＬＨ
糖鎖からＰａｃ基が脱保護したライゲーションプロダクトも認められたため、反応系に２００ｍＭ ＭＥＳＮａ、０．５μＬのピペリジンを加えてＰａｃ基を全て脱保護したのち、面積収率を求めた（面積収率８８％、図１８）。
化学式：Ｃ_１１７Ｈ_１８６Ｎ_１４Ｏ_６８Ｓ
［Ｍ＋Ｈ］^＋Ｃａｌｃｄ．２９０８．１３ Ｆｏｕｎｄ．２９０８．２

ＡＬＬＳ
糖鎖からＰａｃ基が脱保護したライゲーションプロダクトも認められたため、脱保護体も含めて面積収率を求めた（面積収率７７％）。
化学式：Ｃ_１３０Ｈ_１９６Ｎ_１２Ｏ_７１Ｓ（Ｐａｃ基が外れていないライゲーションプロダクト）
［Ｍ＋Ｈ］^＋Ｃａｌｃｄ．３０９４．１８ Ｆｏｕｎｄ．３０９４．３２

ＡＬＬＶ
糖鎖からＰａｃ基が脱保護したライゲーションプロダクトも認められたため、脱保護体も含めて面積収率を求めた（面積収率７６％）。
化学式：Ｃ_１３２Ｈ_２００Ｎ_１２Ｏ_７０Ｓ
［Ｍ＋Ｈ］^＋Ｃａｌｃｄ．３１０６．２２ Ｆｏｕｎｄ．３１０６．３８

（２）糖鎖Ｎ末端側ライゲーション
（２−１）糖鎖アミノ酸の合成
下記に反応スキームにしたがって、アミノ酸（セリン）Ｃ末端のＮＨＮＨＢｏｃ化を行った。

Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｌ−セリン（１．０２ｇ、２．６１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２ｍＬ、２１７ｍＭ）に溶かし、ここへカルバジン酸 ｔｅｒｔ−ブチル（１．７３ｇ、１３．０ｍｍｏｌ、５当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．８６ｇ、９．７０ｍｍｏｌ、３．５当量）を加えて室温で攪拌した。この間ＴＬＣ（展開溶媒 酢酸エチルまたはヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で反応追跡を行った。３０分後、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で抽出した。有機層を減圧濃縮後、シリカゲルカラム精製（直径３０ｍｍ、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）にて目的物を得た（１．１７ｇ、９０％）。
化学式：Ｃ_２７Ｈ_３５Ｎ_３Ｏ_６
［Ｍ＋Ｎａ］^＋：Ｃａｌ．５２０．２ Ｆｏｕｎｄ． ５２０．２
［Ｍ＋Ｋ］^＋：Ｃａｌ． ５３６．３ Ｆｏｕｎｄ． ５３６．３
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）
δ：７．６５−７．２５（ｍ，１０Ｈ），５．７０（ｓ，１Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ），４．３２（ｓ，３Ｈ），３．８１（ｓ，１Ｈ），１．２６（ｓ，９Ｈ）

次いで、下記の反応スキームにしたがって糖鎖を導入した。

アミノ酸縮合および側鎖の脱保護
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル−シアリルオリゴサッカライド）（１０．１ｍｇ、３．５８μｍｏｌ）に、ＤＭＦ（７１５μＬ、５ｍＭ）にＮＨ_２−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＮＨＮＨＢｏｃ（４．９ｍｇ、１７．９μｍｏｌ、５当量）、およびＰｙＢＯＰ（９．５ｍｇ、１７．９μｍｏｌ、５当量）を溶かしたものを加えた。ここへＤＩＥＡ（４．２μＬ、２５．１μｍｏｌ、７当量）を追加して−２０℃で２０分間攪拌した。この間、反応追跡は、ＵＰＬＣで行い、反応終了後、ゲルろ過Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０、ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ＝１：１にて試薬を取り除き、凍結乾燥させた（９．２ｍｇ、８４％、図１９）。次にこのサンプルにＴＦＡ／ＴＩＰＳ（９５：５、２００μＬ）を加え、１時間氷浴中で攪拌した。その後、冷やした１０倍量のＥｔ_２Ｏによって、Ｂｏｃ、ｔＢｕの脱保護体を沈殿させて得た。その後、蒸留水を加えて希釈し、凍結乾燥させた（７．８ｍｇ、８９％）。

アミノ酸Ｃ末端の調整
次に、このサンプルに、１０ｍＭ ＮａＮＯ_２（６ＭＧｄ・ＨＣｌ、２００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ４．０）を５０μｌ加えて、−２０℃で攪拌した。３０分後、ＵＰＬＣによって、末端がアジド体になったことを確認したのち、サンプル中で２００ｍＭの濃度になるようＭＥＳＮａを加えてｐＨ７に調整した。３時間後、ＵＰＬＣによって、末端がチオエステル体になったことを確認したのち、ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０，ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ＝１：１）によって目的物を得た（６．１ｍｇ，７５％、図２０）。
化学式：Ｃ_１２４Ｈ_１７５Ｎ_９Ｏ_７２Ｓ_２
［Ｍ＋Ｈ］^＋：Ｃａｌ．３００７．９８ Ｆｏｕｎｄ．３００７．８４

（２−２）糖鎖Ｃ末端側へのアミノ酸のライゲーション
下位反応スキームにしたがって、糖鎖アミノ酸チオエステル体のＣ末端側でライゲーション反応を行った。

Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（ジフェナシル-シアリルオリゴサッカライド）−Ｓｅｒ−ＣＯＳＲ（０．４ｍｇ、０．１３μｍｏｌ、０．５ｍＭ）とＡｕｘ（ＳＨ）−Ｓｅｒ−ＣＯＯＨ（０．１６ｍｇ、０．６５μｍｏｌ、５ｍＭ）を緩衝液（６Ｍ Ｇｄ・ＨＣｌ、２００ｍＭ リン酸，２０ｍＭ ＴＣＥＰ、８０ｍＭ ＭＰＡＡ）に溶かして、ｐＨ７に調整した。これを常温で静置し、ＵＰＬＣによって反応追跡した。４時間で原料糖鎖は全て消失し、ＥＳＩ−ＭＳにより目的物の生成を確認した（図２１）。
化学式：Ｃ_１３３Ｈ_１８４Ｎ_１０Ｏ_７２Ｓ
［Ｍ＋Ｈ］^＋：Ｃａｌ．３１０６．９９ Ｆｏｕｎｄ．３１０７．０１

［実施例３］ ペプチドチオエステルの合成
（１）Ｃ末端ＣＧＣのＮＳ転移を伴うＭＥＮＳａチオエステル化

１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、ペプチド（Ｈ−ＳＳＴＧＷＣＧＣ−ＯＨ）１（１当量、０．５０ｍｇ、０．６μｍｏｌ）、２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ、１０％（ｗ／ｖ）、３１．３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を加え、６Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍクエン酸緩衝溶液に溶かし、ｐＨを３．５に調整し、反応させた。反応は５０°Ｃでおこなった。７２時間追跡し、ＬＣ／ＭＳにより確認した。反応は７２時間で終了とし、Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）により、反応溶液中の脱離システインを取り除き、凍結乾燥を行った（目的物２の質量分析結果 Ｍ／Ｚ ８２１．２）。この２を引き続き次の反応に用い、ＣｙｓＧｌｙ−チオエステルの脱離を伴う、トリプトファンがチオエステル化されものの合成をおこなった（図２２）。

（２）ＭＥＳＮａを用いたＣ末端ＣＧ−ＭＥＳＮａチオエステルの末端チオエステル化

１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、ペプチド（Ｈ−ＳＳＴＧＷＣＧ−ＭＥＳＮａ）２（１当量、０．５０ｍｇ、０．６μｍｏｌ）、２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ、１０％（ｗ／ｖ）、３１．３ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）を加え、６Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍクエン酸緩衝溶液に溶かし、ｐＨを６．５に調整して、反応させた。反応は５０°Ｃでおこなった。反応は８時間追跡し、ＬＣ／ＭＳにより確認した。その結果、ＣｙｓＧｌｙ−チオエステルの脱離によりペプチドチオエステル３を得た（図２３）。目的物３の質量分析結果 Ｍ／Ｚ ６６１．１。

（３）ＭＰＡＡを用いたＣ末端ＣＧ−ＭＥＳＮａチオエステルの末端チオエステル化

前述のペプチドチオエステル３を得る反応において、より脱離能の高いメルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）を用い、ＭＰＡＡが付加したチオエステル体４を得る検討をおこなった。１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、ペプチド（Ｈ−ＳＳＴＧＷＣＧ−ＭＥＳＮａ）２（１当量、０．５０ｍｇ、０．６μｍｏｌ）、メルカプトフェニル酢酸、１０％（ｗ／ｖ）、３１．３ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加え、６Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍクエン酸緩衝溶液に溶かし、ｐＨを６．５に調整し、反応させ目的物４を得た。反応は５０°Ｃでおこなった。反応は２時間追跡し、ＬＣ／ＭＳにより確認した（図２４）。目的物４の質量分析結果 Ｍ／Ｚ ６８７．２

（４）Ｃ末端ＧＣのＮＳ転移を伴うビス（２−スルファニルエチル）アミノ基の導入反応

ペプチド（Ｓｅｇ１）（１当量、０．５０ｍｇ）に、ビス（２−スルファニルエチル）アミン｛ＨＮ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＨ）_２・ＨＣｌ（５％（ｗ／ｖ）、７．５ｍｇ）｝を加え、６Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍクエン酸緩衝溶液に溶かし、ｐＨを３．５に調整し、反応させた。反応は５０℃でおこなった。反応は５０時間追跡し、ＬＣ／ＭＳにより確認した（図２５）。目的物であるビス（２−スルファニルエチル）アミノ基をＣ末端にもつペプチドの質量分析結果：［Ｍ＋１０Ｈ］^１０＋ ９４１．６９５５、［Ｍ＋９Ｈ］^９＋ １０４６．２１４９、［Ｍ＋８Ｈ］^８＋ １１７６．８６４１、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ １３４４．８４２８、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １５６８．８１４９。

（５）Ｃ末端のＮＳ転移を伴うビス（２−スルファニルエチル）アミノ基の導入

１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、ペプチド（Ｈ−ＬＱＮＩＨＣ−ＯＨ）８（１当量、０．５０ｍｇ）に、ビス（２−スルファニルエチル）アミン｛ＨＮ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＨ）_２・ＨＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）、３１．３ｍｇ｝を、６Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍクエン酸緩衝溶液に溶かしたものを加え、反応させた。反応は５０°Ｃでおこなった。反応は７２時間追跡し、ＬＣ／ＭＳにより確認した（図２６）。目的物９の質量分析結果 Ｍ／Ｚ ７４３．５。

Claims (47)

1. ペプチドチオエステルの製造方法であって、
   （１）以下の配列：
   

   

   ［ここで、Ｒは、任意のアミノ酸配列を示し；Ｘは、任意のアミノ酸を示し；ＣＧＣは、システイン−グリシンーシステインのアミノ酸トリプレットを示す。］
   を有するペプチドを準備する工程、
   （２）ＣＧＣトリプレットにおけるＣ末端システインのＳＨ基とグリシンのカルボニル基との間で転移を生じさせ、Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルを得る工程、および
   （３）前記Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルにおいて、システインのＳＨ基とＸのカルボニル基との転移と、システインのアミノ基とグリシンのチオエステルのカルボニル基との間での閉環縮合とを生じさせて、ペプチドチオエステルを得る工程、
   を含む、
   製造方法。
2. 請求項１に記載の製造方法であって、
   前記ペプチドは、化学合成により、または、発現系による発現により、取得されたものである、
   製造方法。
3. 請求項１または２に記載の製造方法であって、
   前記工程（２）の反応は、２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）、２−アミノエタンチオール、およびビス（２−スルファニルエチル)アミンよりなる群から選択される少なくとも１種のチオールの存在下で行われる、
   製造方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法であって、
   前記工程（３）の反応は、２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）、メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、２−メルカプトプロピオン酸、チオフェノール、ベンジルメルカプタン、３／４−メルカプトベンジルスルフォネートから選択される少なくとも１種のチオールの存在下で行われる、
   製造方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法であって、
   （２−１）工程（２）の反応後、工程（３）の前に、Ｒ−Ｘ−ＣＧ−チオエステルを精製する工程、
   をさらに含む
   製造方法。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法であって、
   前記ペプチドは、糖鎖付加ペプチドである、
   製造方法。
7. ペプチドの製造方法であって、
   （Ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたペプチドチオエステル、および
   （Ｂ）アミノチオアシッドまたはペプチドチオアシッド
   を縮合させて、ペプチドを得る工程を含み、
   ここで、前記（Ａ）および（Ｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の少なくとも一部が未保護である、
   ことを特徴とする、
   製造方法。
8. 請求項７に記載のペプチドの製造方法であって、
   前記（Ａ）および（Ｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の全てが未保護である、
   製造方法。
9. 請求項７または８に記載のペプチドの製造方法であって、
   糖鎖付加ペプチドの製造方法である
   ことを特徴とする、
   製造方法。
10. 請求項９に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記ペプチドチオエステルは、糖鎖付加ペプチドチオエステルである、
    製造方法。
11. 請求項９に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記アミノチオアシッドもしくはまたはペプチドチオアシッドは、糖鎖付加アミノチオアシッドまたは糖鎖付加ペプチドチオアシッドである、
    製造方法。
12. 請求項１１に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記糖鎖付加アミノチオアシッドは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＨｙｌまたはＨｙｐよりなる群から選択される糖鎖付加アミノ酸のチオアシッドである、
    製造方法。
13. 請求項１１に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記糖鎖付加ペプチドチオアシッド中の糖鎖付加アミノ酸は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＨｙｌまたはＨｙｐよりなる群から選択される糖鎖付加アミノ酸である、
    製造方法。
14. 請求項１１または１３に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記糖鎖付加ペプチドチオアシッドは、糖鎖付加アミノチオアシッドと、側鎖に前記糖鎖付加アミノチオアシッド中のチオ酸基（−ＳＨ）とジスルフィド結合を形成し得る修飾基を有するシステインをそのＮ末端に有するペプチドとを反応させ、反応後のペプチドのＣ末端にチオ酸基を導入することにより得られたものである、
    製造方法。
15. 請求項１４に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記修飾基は、下記より成る群から選択される修飾基である、
    製造方法。
    

    

    ；
    

    

    ；および
    

    
16. ペプチドの製造方法であって、
    （ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたペプチドチオエステル、および
    （ｂ）下記構造：
    

    

    ［式中、Ｘは、酸処理、塩基処理、光照射処理、または還元処理で分離する任意の置換基を示し；Ｙは、ケトンまたはアルデヒドを示す。］
    を有する補助基がそのＮ末端に導入されたアミノ酸またはペプチド
    を縮合させて、ペプチドを得る工程を含み、
    ここで、前記（ａ）および（ｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の少なくとも一部が未保護である、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
17. 請求項１６に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記Ｘは、アリールである、
    製造方法。
18. 請求項１６または１７に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記（ａ）および（ｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の全てが未保護である、
    製造方法。
19. 請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法であって、
    糖鎖付加ペプチドの製造方法である
    ことを特徴とする、
    製造方法。
20. 請求項１９に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記ペプチドチオエステルは、糖鎖付加ペプチドチオエステルである、
    製造方法。
21. 請求項１９に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記「補助基がそのＮ末端に導入されたアミノ酸またはペプチド」は、補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ペプチドである、
    製造方法。
22. 請求項２１に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、前記補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加Ａｓｎ、糖鎖付加Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｔｈｒ、糖鎖付加Ｈｙｌおよび糖鎖付加Ｈｙｐよりなる群から選択される、
    製造方法。
23. 請求項２２に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、下記の構造：
    

    

    ［ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
    を有する糖鎖付加アミノ酸である、
    製造方法。
24. 請求項２３に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記アミノ酸Ｘは、Ｘは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＨｙｌよりなる群から選択される、
    製造方法。
25. 請求項２２に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、下記の構造：
    

    

    ［ここで、Ｘ_１はＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｙｌを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
    を有する糖鎖付加ジペプチドである、
    製造方法。
26. ペプチドの製造方法であって、
    （ＡＡ）ペプチドチオエステル、および
    （ＢＢ）アミノチオアシッドまたはペプチドチオアシッド
    を縮合させて、ペプチドを得る工程を含み、
    ここで、前記（ＡＡ）および（ＢＢ）を構成するアミノ酸の側鎖の少なくとも一部が未保護である、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
27. 請求項２６に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記（ＡＡ）および（ＢＢ）を構成するアミノ酸の側鎖の全てが未保護である、
    製造方法。
28. 請求項２６または２７に記載のペプチドの製造方法であって、
    糖鎖付加ペプチドの製造方法である
    ことを特徴とする、
    製造方法。
29. 請求項２８に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記ペプチドチオエステルは、糖鎖付加ペプチドチオエステルである、
    製造方法。
30. 請求項２８に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記アミノチオアシッドもしくはまたはペプチドチオアシッドは、糖鎖付加アミノチオアシッドまたは糖鎖付加ペプチドチオアシッドである、
    製造方法。
31. 請求項３０に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記糖鎖付加アミノチオアシッドは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＨｙｌまたはＨｙｐよりなる群から選択される糖鎖付加アミノ酸のチオアシッドである、
    製造方法。
32. 請求項３０に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記糖鎖付加ペプチドチオアシッド中の糖鎖付加アミノ酸は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＨｙｌまたはＨｙｐよりなる群から選択される糖鎖付加アミノ酸である、
    製造方法。
33. 請求項３０または３２に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記糖鎖付加ペプチドチオアシッドは、糖鎖付加アミノチオアシッドと、側鎖に前記糖鎖付加アミノチオアシッド中のチオ酸基（−ＳＨ）とジスルフィド結合を形成し得る修飾基を有するシステインをそのＮ末端に有するペプチドとを反応させ、反応後のペプチドのＣ末端にチオ酸基を導入することにより得られたものである、
    製造方法。
34. 請求項３３に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記修飾基は、下記より成る群から選択される修飾基である、
    製造方法。
    

    

    ；
    

    

    ；および
    

    
35. ペプチドの製造方法であって、
    （ａａ）ペプチドチオエステル、および
    （ｂｂ）下記構造：
    

    

    ［ここで、Ｘは、酸処理、塩基処理、光照射処理、または還元処理で分離する任意の置換基を示し；Ｙは、ケトンまたはアルデヒドを示す。］
    を有する補助基がそのＮ末端に導入されたアミノ酸またはペプチド
    を縮合させて、ペプチドを得る工程を含み、
    ここで、前記（ａａ）および（ｂｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の少なくとも一部が未保護である、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
36. 請求項３５に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記Ｘは、アリールである、
    製造方法。
37. 請求項３５または３６に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記（ａａ）および（ｂｂ）を構成するアミノ酸の側鎖の全てが未保護である、
    製造方法。
38. 請求項３５〜３７のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法であって、
    糖鎖付加ペプチドの製造方法である
    ことを特徴とする、
    製造方法。
39. 請求項３８に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記ペプチドチオエステルは、糖鎖付加ペプチドチオエステルである、
    製造方法。
40. 請求項３８に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記「補助基がそのＮ末端に導入されたアミノ酸またはペプチド」は、補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ペプチドである、
    製造方法。
41. 請求項４０に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、前記補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加Ａｓｎ、糖鎖付加Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｔｈｒ、糖鎖付加Ｈｙｌおよび糖鎖付加Ｈｙｐよりなる群から選択される、
    製造方法。
42. 請求項４０に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、下記の構造：
    

    

    
    ［ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
    を有する糖鎖付加アミノ酸である、
    製造方法。
43. 請求項４２に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記アミノ酸Ｘは、Ｘは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＨｙｌよりなる群から選択される、
    製造方法。
44. 請求項４０に記載のペプチドの製造方法であって、
    前記「補助基がそのＮ末端に導入された糖鎖付加アミノ酸」は、下記の構造：
    

    

    ［ここで、Ｘ_１はＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｙｌを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
    を有する糖鎖付加ジペプチドである、
    製造方法。
45. 下記の構造を有する糖鎖付加アミノ酸。
    

    

    ［ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
46. 請求項４５に記載の糖鎖付加アミノ酸であって、
    前記アミノ酸Ｘは、Ｘは、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＨｙｌよりなる群から選択される、
    糖鎖付加アミノ酸。
47. 下記の構造を有する糖鎖付加ジペプチド。
    

    

    ［ここで、Ｘ_１はＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｙｌを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｇは任意の糖鎖を示す。］
    

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