JPWO2020081843A5 - - Google Patents

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JPWO2020081843A5
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本明細書で提供される開示のいくつかの実施形態は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
本開示は、例えば、以下に関する。
［１］
システムであって、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、
配列番号２２、２１、２８、３０、１８～２０、２３～２７、２９、３１～４４、および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸と、
関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）またはその機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を含む、システム。
［２］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む、前記［１］に記載のシステム。
［３］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む、前記［２］に記載のシステム。
［４］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む、前記［２］に記載のシステム。
［５］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む、前記［２］に記載のシステム。
［６］
前記ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む、前記［２］に記載のシステム。
［７］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である、前記［１］～［６］のいずれか一項に記載のシステム。
［８］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である、前記［１］～［７］のいずれか一項に記載のシステム。
［９］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、前記［１］～［８］のいずれか一項に記載のシステム。
［１０］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、前記［１］～［９］のいずれか一項に記載のシステム。
［１１］
前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、前記［１］～［１０］のいずれか一項に記載のシステム。
［１２］
前記ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、前記［１］～［１１］のいずれか一項に記載のシステム。
［１３］
前記ＧＯＩは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）タンパク質、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）タンパク質、第Ｘ因子（ＦＸ）タンパク質、プロテインＣ、セリンプロテアーゼ阻害剤Ｇ１（セルピンＧ１）、またはそれらのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする、前記［１］～［１１］のいずれか一項に記載のシステム。
［１４］
前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、前記［１３］に記載のシステム。
［１５］
前記ＧＯＩは、ＦＩＸタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、前記［１３］に記載のシステム。
［１６］
前記ＧＯＩは、セルピンＧ１タンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、前記［１３］に記載のシステム。
［１７］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、前記［１］～［１６］のいずれか一項に記載のシステム。
［１８］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、前記［１］～［１６］のいずれか一項に記載のシステム。
［１９］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、前記［１８］に記載のシステム。
［２０］
前記ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている、前記［１］～［１９］のいずれか一項に記載のシステム。
［２１］
前記ドナーテンプレートは、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、前記［２０］に記載のシステム。
［２２］
前記ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、前記［２１］に記載のシステム。
［２３］
前記ｇＲＮＡ標的部位は、前記システムにおけるｇＲＮＡのための標的部位である、前記［２１］または［２２］に記載のシステム。
［２４］
前記ドナーテンプレートの前記ｇＲＮＡ標的部位は、前記システムにおけるｇＲＮＡのためのゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、前記［２３］に記載のシステム。
［２５］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、前記［１］～［２４］のいずれか一項に記載のシステム。
［２６］
前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、前記ｇＲＮＡも含む、前記［２５］に記載のシステム。
［２７］
前記ｇＲＮＡと予め複合体化されて、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、前記［１］～［２６］のいずれか一項に記載のシステム。
［２８］
細胞においてゲノムを編集する方法であって、
前記細胞に、以下：
（ａ）配列番号２２、２１、２８、３０、１８～２０、２３～２７、２９、３１～４４、および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸と、
（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、
（ｃ）関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を提供することを含む、方法。
［２９］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む、前記［２８］に記載の方法。
［３０］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む、前記［２９］に記載の方法。
［３１］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む、前記［３０］に記載の方法。
［３２］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む、前記［２９］に記載の方法。
［３３］
前記ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む、前記［２９］に記載の方法。
［３４］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である、前記［２８］～［３３］のいずれか一項に記載の方法。
［３５］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である、前記［２８］～［３４］のいずれか一項に記載の方法。
［３６］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、前記［２８］～［３５］のいずれか一項に記載の方法。
［３７］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、前記［２８］～［３６］のいずれか一項に記載の方法。
［３８］
前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、前記［２８］～［３７］のいずれか一項に記載の方法。
［３９］
前記ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、前記［２８］～［３８］のいずれか一項に記載の方法。
［４０］
前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＩＸタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、セルピンＧ１、またはそれらのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする、前記［２８］～［３８］のいずれか一項に記載の方法。
［４１］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、前記［２８］～［４０］のいずれか一項に記載の方法。
［４２］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、前記［２８］～［４０］のいずれか一項に記載の方法。
［４３］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、前記［４２］に記載の方法。
［４４］
前記ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている、前記［２８］～［４３］のいずれか一項に記載の方法。
［４５］
前記ドナーテンプレートは、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、前記［２８］～［４４］のいずれか一項に記載の方法。
［４６］
前記ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、前記［４５］に記載の方法。
［４７］
前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための標的部位である、前記［４５］または［４６］に記載の方法。
［４８］
前記ドナーテンプレートの前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための前記細胞ゲノムにおけるｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、前記［４７］に記載の方法。
［４９］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、前記［２８］～［４８］のいずれか一項に記載の方法。
［５０］
前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、前記ｇＲＮＡも含む、前記［４９］に記載の方法。
［５１］
前記細胞に、前記ｇＲＮＡと予め複合体化された前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供し、ＲＮＰ複合体を形成することを含む、前記［２８］～［５０］のいずれか一項に記載の方法。
［５２］
（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）の前記ドナーテンプレートが前記細胞に提供されてから４日を超えた後に、前記細胞に提供される、前記［２８］～［５１］のいずれか一項に記載の方法。
［５３］
（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）が前記細胞に提供されてから少なくとも１４日後に、前記細胞に提供される、前記［２８］～［５２］のいずれか一項に記載の方法。
［５４］
１つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記細胞に提供される、前記［５２］または［５３］に記載の方法。
［５５］
１つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、前記ＧＯＩもしくは機能的誘導体をコードする前記核酸配列の標的化された組み込みの標的レベル、および／または前記ＧＯＩもしくは機能的誘導体をコードする前記核酸配列の発現の標的レベルが達成されるまで、前記第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記細胞に提供される、前記［５４］に記載の方法。
［５６］
前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、前記［２８］～［５５］のいずれか一項に記載の方法。
［５７］
前記細胞は、肝細胞である、前記［２８］～［５６］のいずれか一項に記載の方法。
［５８］
遺伝子改変細胞であって、前記細胞のゲノムは、前記［２８］～［５７］のいずれか一項に記載の方法によって編集されている、遺伝子改変細胞。
［５９］
前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記内因性アルブミンプロモーターの前記制御下で発現される、前記［５８］に記載の遺伝子改変細胞。
［６０］
前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、前記［５８］または［５９］に記載の遺伝子改変細胞。
［６１］
前記細胞は、肝細胞である、前記［５８］～［６０］のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
［６２］
対象における障害または健康状態を治療する方法であって、
前記対象における細胞に、以下：
（ａ）配列番号２２、２１、２８、３０、１８～２０、２３～２７、２９、３１～４４、および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸と、
（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、
（ｃ）関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を提供することを含む、方法。
［６３］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む、前記［６２］に記載の方法。
［６４］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む、前記［６３］に記載の方法。
［６５］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む、前記［６３］に記載の方法。
［６６］
前記ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む、前記［６３］に記載の方法。
［６７］
前記ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む、前記［６３］に記載の方法。
［６８］
前記ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、前記［６２］～［６７］のいずれか一項に記載の方法。
［６９］
前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＩＸタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、セルピンＧ１、またはそれらのそのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする、前記［６２］～［６７］のいずれか一項に記載の方法。
［７０］
前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、前記［６９］に記載の方法。
［７１］
前記ＧＯＩは、ＦＩＸタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、前記［６９］に記載の方法。
［７２］
前記ＧＯＩは、セルピンＧ１またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、前記［６９］に記載の方法。
［７３］
前記対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる患者である、前記［６２］～［７２］のいずれか一項に記載の方法。
［７４］
前記対象は、血友病Ａを有するか、または有することが疑われる患者である、前記［７３］に記載の方法。
［７５］
前記対象は、血友病Ｂを有するか、または有することが疑われる患者である、前記［７３］に記載の方法。
［７６］
前記対象は、ＨＡＥを有するか、または有することが疑われる患者である、前記［７３］に記載の方法。
［７７］
前記対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害または健康状態のリスクを有すると診断されている、前記［６２］～［７２］のいずれか一項に記載の方法。
［７８］
前記対象は、血友病Ａのリスクを有すると診断されている患者である、前記［７７］に記載の方法。
［７９］
前記対象は、血友病Ｂのリスクを有すると診断されている患者である、前記［７７］に記載の方法。
［８０］
前記対象は、ＨＡＥのリスクを有すると診断されている患者である、前記［７７］に記載の方法。
［８１］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である、前記［６２］～［８０］のいずれか一項に記載の方法。
［８２］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である、前記［６２］～［８１］のいずれか一項に記載の方法。
［８３］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、前記［６２］～［８２］のいずれか一項に記載の方法。
［８４］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、前記［６２］～［８３］のいずれか一項に記載の方法。
［８５］
前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、前記［６２］～［８４］のいずれか一項に記載の方法。
［８６］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、前記［６２］～［８５］のいずれか一項に記載の方法。
［８７］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、前記［６２］～［８５］のいずれか一項に記載の方法。
［８８］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、前記［８７］に記載の方法。
［８９］
（ａ）の前記ｇＲＮＡ、（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｃ）の前記ドナーテンプレート、のうちの１つ以上は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、前記［６２］～［８８］のいずれか一項に記載の方法。
［９０］
前記ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている、前記［６２］～［８９］のいずれか一項に記載の方法。
［９１］
前記ドナーテンプレートは、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、前記［６２］～［９０］のいずれか一項に記載の方法。
［９２］
前記ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、前記［９１］に記載の方法。
［９３］
前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための標的部位である、前記［９１］または［９２］に記載の方法。
［９４］
前記ドナーテンプレートの前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための前記細胞ゲノムにおける前記ｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、前記［９３］に記載の方法。
［９５］
前記ドナーテンプレートを前記細胞に提供することは、前記ドナーテンプレートを前記対象に投与することを含む、前記［６２］～［９４］のいずれか一項に記載の方法。
［９６］
前記投与は、静脈内経路を介する、前記［９５］に記載の方法。
［９７］
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、前記［６２］～［９６］のいずれか一項に記載の方法。
［９８］
前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、前記ｇＲＮＡも含む、前記［９７］に記載の方法。
［９９］
前記ｇＲＮＡおよび前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に提供することは、前記リポソームまたは脂質ナノ粒子を前記対象に投与することを含む、前記［９８］に記載の方法。
［１００］
前記投与は、静脈内経路を介する、前記［９９］に記載の方法。
［１０１］
前記細胞に、前記ｇＲＮＡと予め複合体化された前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供し、ＲＮＰ複合体を形成することを含む、前記［６２］～［１００］のいずれか一項に記載の方法。
［１０２］
（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）の前記ドナーテンプレートが前記細胞に提供されてから４日を超えた後に、前記細胞に提供される、前記［６２］～［１０１］のいずれか一項に記載の方法。
［１０３］
（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）の前記ドナーテンプレートが前記細胞に提供されてから少なくとも１４日後に、前記細胞に提供される、前記［６２］～［１０２］のいずれか一項に記載の方法。
［１０４］
１つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、前記第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記細胞に提供される、前記［１０２］または［１０３］に記載の方法。
［１０５］
１つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列の標的化された組み込みの標的レベルおよび／または前記ＧＯＩタンパク質または機能的誘導体をコードする前記核酸配列の発現の標的レベルが達成されるまで、前記第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記細胞に提供される、前記［１０４］に記載の方法。
［１０６］
（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に提供することは、前記対象に前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸および前記ｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を投与することを含む、前記［１０２］～［１０５］のいずれか一項に記載の方法。
［１０７］
（ｃ）の前記ドナーテンプレートを前記細胞に提供することは、前記対象に、ＡＡＶベクターにコードされた前記ドナーテンプレートを投与することを含む、前記［１０２］～［１０６］のいずれか一項に記載の方法。
［１０８］
前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、前記［６２］～［１０７］のいずれか一項に記載の方法。
［１０９］
前記細胞は、肝細胞である、前記［６２］～［１０８］のいずれか一項に記載の方法。
［１１０］
前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記対象の前記肝臓において発現される、前記［６２］～［１０９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１１］
対象における血友病Ａ、血友病Ｂ、または遺伝性血管浮腫を治療する方法であって、
前記［５８］～［６１］のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
［１１２］
前記遺伝子改変細胞は、前記対象に対して自家である、前記［１１１］に記載の方法。
［１１３］
前記対象からの生物学的試料を得ることをさらに含み、前記生物学的試料は、肝細胞の細胞を含み、前記遺伝子改変細胞は、前記肝細胞から調製される、前記［１１１］または［１１２］に記載の方法。
［１１４］
前記［１］～［２７］のいずれか一項に記載のシステムの１つ以上の要素を含み、かつ使用のための説明書をさらに含む、キット。

Some embodiments of the disclosure provided herein are further illustrated by the following non-limiting examples.
The present disclosure relates to, for example, the following.
[1]
a system,
a deoxyribonucleic acid (DNA) endonuclease or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease;
a guide RNA (gRNA) comprising a spacer sequence from any one of SEQ ID NOs: 22, 21, 28, 30, 18-20, 23-27, 29, 31-44, and 104, or a nucleic acid encoding said gRNA When,
a donor template comprising a nucleic acid sequence encoding a gene of interest (GOI) or a functional derivative thereof.
[2]
The system of [1] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from any one of SEQ ID NOs: 22, 21, 28, and 30.
[3]
The system according to [2] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:22.
[4]
The system according to [2] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:21.
[5]
The system of [2] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:28.
[6]
The system according to [2] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:30.
[7]
Any one of [1] to [6] above, wherein the DNA endonuclease recognizes a protospacer adjacent motif (PAM) having the sequence NGG or NNGG, and N is any nucleotide or functional derivative thereof. The system described in .
[8]
The system according to any one of [1] to [7] above, wherein the DNA endonuclease is a type II Cas endonuclease or a functional derivative thereof.
[9]
The system according to any one of [1] to [8], wherein the DNA endonuclease is Cas9.
[10]
The system according to any one of [1] to [9] above, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is codon-optimized for expression in a host cell.
[11]
The system according to any one of [1] to [10] above, wherein the nucleic acid sequence encoding the GOI or a functional derivative thereof is codon-optimized for expression in a host cell.
[12]
The system according to any one of [1] to [11] above, wherein the GOI encodes a polypeptide selected from the group consisting of therapeutic polypeptides and prophylactic polypeptides.
[13]
The GOI is Factor VIII (FVIII) protein, Factor IX (FIX) protein, alpha-1-antitrypsin, Factor XIII (FXIII) protein, Factor VII (FVII) protein, Factor X (FX) protein , protein C, serine protease inhibitor G1 (serpin G1), or any functional derivative thereof, according to any one of [1] to [11] above, which encodes a protein selected from the group consisting of system.
[14]
The system of [13] above, wherein the GOI encodes a FVIII protein or any functional derivative thereof.
[15]
The system of [13] above, wherein the GOI encodes a FIX protein or any functional derivative thereof.
[16]
The system of [13] above, wherein the GOI encodes a serpin G1 protein or any functional derivative thereof.
[17]
The system according to any one of [1] to [16] above, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is deoxyribonucleic acid (DNA).
[18]
The system according to any one of [1] to [16] above, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is ribonucleic acid (RNA).
[19]
The system according to [18] above, wherein the RNA encoding the DNA endonuclease is mRNA.
[20]
The system according to any one of [1] to [19] above, wherein the donor template is encoded in an AAV vector.
[21]
The system of [20] above, wherein said donor template comprises a donor cassette comprising said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative, said donor cassette being flanked on one or both sides by gRNA target sites. .
[22]
The system of [21] above, wherein the donor cassette is flanked on both sides by gRNA target sites.
[23]
The system of [21] or [22] above, wherein the gRNA target site is a target site for a gRNA in the system.
[24]
The system of [23] above, wherein the gRNA target site of the donor template is the reverse complement of a genomic gRNA target site for the gRNA in the system.
[25]
The system according to any one of [1] to [24] above, wherein the DNA endonuclease or the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is formulated in a liposome or lipid nanoparticle.
[26]
The system according to [25] above, wherein the liposome or lipid nanoparticle also contains the gRNA.
[27]
The system according to any one of [1] to [26] above, comprising the DNA endonuclease pre-complexed with the gRNA to form a ribonucleoprotein (RNP) complex.
[28]
A method of editing a genome in a cell comprising:
In said cells:
(a) a gRNA comprising a spacer sequence from any one of SEQ ID NOS: 22, 21, 28, 30, 18-20, 23-27, 29, 31-44, and 104, or a nucleic acid encoding said gRNA; ,
(b) a DNA endonuclease or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease;
(c) a donor template comprising a nucleic acid sequence encoding a gene of interest (GOI) or functional derivative.
[29]
The method of [28] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from any one of SEQ ID NOS: 22, 21, 28, and 30.
[30]
The method of [29] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:21.
[31]
The method of [30] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:22.
[32]
The method of [29] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:28.
[33]
The method of [29] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:30.
[34]
Any one of [28] to [33] above, wherein the DNA endonuclease recognizes a protospacer adjacent motif (PAM) having the sequence NGG or NNGG, and N is any nucleotide or functional derivative thereof. The method described in .
[35]
The method according to any one of [28] to [34] above, wherein the DNA endonuclease is a type II Cas endonuclease or a functional derivative thereof.
[36]
The method according to any one of [28] to [35] above, wherein the DNA endonuclease is Cas9.
[37]
The method of any one of [28]-[36] above, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is codon-optimized for expression in the cell.
[38]
The method of any one of [28]-[37] above, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or a functional derivative thereof is codon-optimized for expression in said cell.
[39]
The method of any one of [28]-[38] above, wherein the GOI encodes a polypeptide selected from the group consisting of therapeutic polypeptides and prophylactic polypeptides.
[40]
The GOI comprises a protein selected from the group consisting of FVIII protein, FIX protein, alpha-1-antitrypsin, FXIII protein, FVII protein, FX protein, protein C, serpin G1, or any functional derivative thereof. The method according to any one of [28] to [38] above, wherein the coding is performed.
[41]
The method according to any one of [28] to [40] above, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is deoxyribonucleic acid (DNA).
[42]
The method according to any one of [28] to [40] above, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is ribonucleic acid (RNA).
[43]
The method according to [42] above, wherein the RNA encoding the DNA endonuclease is mRNA.
[44]
The method of any one of [28]-[43] above, wherein the donor template is encoded in an AAV vector.
[45]
said donor template comprises a donor cassette comprising said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative, said donor cassette being flanked on one or both sides by gRNA target sites, said [28]-[44] The method according to any one of .
[46]
The method of [45] above, wherein the donor cassette is flanked on both sides by gRNA target sites.
[47]
The method of [45] or [46] above, wherein the gRNA target site is the target site for the gRNA of (a).
[48]
The method of [47] above, wherein the gRNA target site of the donor template is the reverse complement of a gRNA target site in the cellular genome for the gRNA of (a).
[49]
The method of any one of [28] to [48] above, wherein the DNA endonuclease or the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is formulated in a liposome or lipid nanoparticle.
[50]
The method of [49] above, wherein the liposome or lipid nanoparticle also contains the gRNA.
[51]
The method of any one of [28] to [50] above, comprising providing the cell with the DNA endonuclease pre-complexed with the gRNA to form an RNP complex.
[52]
The gRNA of (a) and the DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding the DNA endonuclease is added to the cell more than 4 days after the donor template of (c) is provided to the cell. The method according to any one of [28] to [51], provided in
[53]
wherein the gRNA of (a) and the DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding the DNA endonuclease are provided to the cell at least 14 days after (c) is provided to the cell; [28] The method according to any one of [52].
[54]
one or more additional doses of said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease is combined with said first dose of said gRNA of (a) and (b) or the nucleic acid encoding the DNA endonuclease of is subsequently provided to the cell.
[55]
One or more additional doses of said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease are targeted to said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative. of said first dose of said gRNA of (a) and (b) until a target level of integration and/or target level of expression of said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative is achieved. The method of [54] above, wherein the DNA endonuclease or a nucleic acid encoding the DNA endonuclease is subsequently provided to the cell.
[56]
The method of any one of [28]-[55] above, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative is expressed under the control of the endogenous albumin promoter.
[57]
The method according to any one of [28] to [56] above, wherein the cells are hepatocytes.
[58]
A genetically modified cell, wherein the genome of said cell has been edited by the method of any one of [28] to [57] above.
[59]
The genetically modified cell of [58] above, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative is expressed under said control of said endogenous albumin promoter.
[60]
The genetically modified cell of [58] or [59] above, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or a functional derivative thereof is codon-optimized for expression in said cell.
[61]
The genetically modified cell according to any one of [58] to [60] above, wherein the cell is a hepatocyte.
[62]
A method of treating a disorder or condition in a subject comprising:
Cells in said subject to:
(a) a gRNA comprising a spacer sequence from any one of SEQ ID NOS: 22, 21, 28, 30, 18-20, 23-27, 29, 31-44, and 104, or a nucleic acid encoding said gRNA; ,
(b) a DNA endonuclease or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease;
(c) a donor template comprising a nucleic acid sequence encoding a gene of interest (GOI) or functional derivative.
[63]
The method of [62] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from any one of SEQ ID NOs: 22, 21, 28, and 30.
[64]
The method of [63] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:22.
[65]
The method of [63] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:21.
[66]
The method of [63] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:28.
[67]
The method of [63] above, wherein the gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:30.
[68]
The method of any one of [62]-[67] above, wherein the GOI encodes a polypeptide selected from the group consisting of therapeutic polypeptides and prophylactic polypeptides.
[69]
said GOI is a protein selected from the group consisting of FVIII protein, FIX protein, alpha-1-antitrypsin, FXIII protein, FVII protein, FX protein, protein C, serpin G1, or any functional derivative thereof The method according to any one of [62] to [67] above, which encodes
[70]
The method of [69] above, wherein said GOI encodes a FVIII protein or any functional derivative thereof.
[71]
The method of [69] above, wherein said GOI encodes a FIX protein or any functional derivative thereof.
[72]
The method of [69] above, wherein said GOI encodes Serpin G1 or any functional derivative thereof.
[73]
said subject has a disorder selected from the group consisting of hemophilia A, hemophilia B, MPS II, MPS1H, alpha-1-antitrypsin deficiency, FXIII deficiency, FVII deficiency, FX deficiency, protein C deficiency, and HAE Or the method of any one of the above [62] to [72], wherein the patient has or is suspected of having a medical condition.
[74]
The method of [73] above, wherein the subject is a patient having or suspected of having hemophilia A.
[75]
The method of [73] above, wherein the subject is a patient having or suspected of having hemophilia B.
[76]
The method of [73] above, wherein the subject is a patient having or suspected of having HAE.
[77]
said subject has a disorder selected from the group consisting of hemophilia A, hemophilia B, MPS II, MPS1H, alpha-1-antitrypsin deficiency, FXIII deficiency, FVII deficiency, FX deficiency, protein C deficiency, and HAE Or the method of any one of the above [62] to [72], which has been diagnosed as having a health condition risk.
[78]
The method of [77] above, wherein the subject is a patient diagnosed as having hemophilia A risk.
[79]
The method of [77] above, wherein the subject is a patient diagnosed as having hemophilia B risk.
[80]
The method of [77] above, wherein the subject is a patient diagnosed to be at risk for HAE.
[81]
Any one of [62] to [80] above, wherein the DNA endonuclease recognizes a protospacer adjacent motif (PAM) having the sequence NGG or NNGG, and N is any nucleotide or functional derivative thereof. The method described in .
[82]
The method according to any one of [62] to [81] above, wherein the DNA endonuclease is a type II Cas endonuclease or a functional derivative thereof.
[83]
The method according to any one of [62] to [82], wherein the DNA endonuclease is Cas9.
[84]
The method of any one of [62]-[83] above, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is codon-optimized for expression in the cell.
[85]
The method of any one of [62]-[84] above, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or a functional derivative thereof is codon-optimized for expression in said cell.
[86]
The method according to any one of [62] to [85] above, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is deoxyribonucleic acid (DNA).
[87]
The method of any one of [62] to [85] above, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is ribonucleic acid (RNA).
[88]
The method of [87] above, wherein the RNA encoding the DNA endonuclease is mRNA.
[89]
one or more of the gRNA of (a), the DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding the DNA endonuclease, and the donor template of (c) are formulated in a liposome or lipid nanoparticle. The method according to any one of [62] to [88] above.
[90]
The method of any one of [62]-[89] above, wherein the donor template is encoded in an AAV vector.
[91]
said donor template comprises a donor cassette comprising said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative, said donor cassette being flanked on one or both sides by gRNA target sites, said [62]-[90] The method according to any one of .
[92]
The method of [91] above, wherein the donor cassette is flanked on both sides by gRNA target sites.
[93]
The method of [91] or [92] above, wherein the gRNA target site is the target site for the gRNA of (a).
[94]
The method of [93] above, wherein the gRNA target site of the donor template is the reverse complement of the gRNA target site in the cellular genome for the gRNA of (a).
[95]
The method of any one of [62] to [94] above, wherein providing the donor template to the cells comprises administering the donor template to the subject.
[96]
The method of [95] above, wherein the administration is via an intravenous route.
[97]
The method of any one of [62] to [96] above, wherein the DNA endonuclease or the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is formulated in a liposome or lipid nanoparticle.
[98]
The method of [97] above, wherein the liposome or lipid nanoparticle also contains the gRNA.
[99]
The method of [98] above, wherein providing the gRNA and the DNA endonuclease or a nucleic acid encoding the DNA endonuclease to the cell comprises administering the liposome or lipid nanoparticle to the subject.
[100]
The method of [99] above, wherein the administration is via an intravenous route.
[101]
The method of any one of [62]-[100] above, comprising providing said cell with said DNA endonuclease pre-complexed with said gRNA to form an RNP complex.
[102]
The gRNA of (a) and the DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding the DNA endonuclease is added to the cell more than 4 days after the donor template of (c) is provided to the cell. The method according to any one of [62] to [101], provided in
[103]
said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or nucleic acid encoding said DNA endonuclease is provided to said cell at least 14 days after said donor template of (c) is provided to said cell; The method according to any one of [62] to [102] above.
[104]
one or more additional doses of said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or nucleic acid encoding said DNA endonuclease are combined with said first dose of said gRNA of (a) and (b) ), or the nucleic acid encoding the DNA endonuclease, is provided to the cell subsequently to the method of [102] or [103].
[105]
One or more additional doses of said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease are targeted to said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative. of said first dose of said gRNA of (a) and (b) until a target level of integration and/or target level of expression of said nucleic acid sequence encoding said GOI protein or functional derivative is achieved. The method of [104] above, wherein the DNA endonuclease or a nucleic acid encoding the DNA endonuclease is subsequently provided to the cell.
[106]
Providing said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease to said cell comprises: The method according to any one of [102] to [105], comprising administering nanoparticles.
[107]
Any one of [102] to [106] above, wherein providing the donor template of (c) to the cell comprises administering to the subject the donor template encoded in an AAV vector. described method.
[108]
The method of any one of [62]-[107] above, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative is expressed under the control of said endogenous albumin promoter.
[109]
The method according to any one of [62] to [108] above, wherein the cells are hepatocytes.
[110]
The method of any one of [62]-[109] above, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative is expressed in said liver of said subject.
[111]
A method of treating hemophilia A, hemophilia B, or hereditary angioedema in a subject, comprising:
A method comprising administering the genetically modified cell of any one of [58] to [61] to the subject.
[112]
The method of [111] above, wherein the genetically modified cell is autologous to the subject.
[113]
Said [111] or [112], further comprising obtaining a biological sample from said subject, said biological sample comprising cells of hepatocytes, said genetically modified cells being prepared from said hepatocytes. ] The method described in .
[114]
A kit comprising one or more elements of the system according to any one of [1] to [27] and further comprising instructions for use.

Claims (114)

システムであって、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、
配列番号２２、２１、２８、３０、１８～２０、２３～２７、２９、３１～４４、および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸と、
関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）またはその機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を含む、システム。 a system,
a deoxyribonucleic acid (DNA) endonuclease or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease;
a guide RNA (gRNA) comprising a spacer sequence from any one of SEQ ID NOs: 22, 21, 28, 30, 18-20, 23-27, 29, 31-44, and 104, or a nucleic acid encoding said gRNA When,
a donor template comprising a nucleic acid sequence encoding a gene of interest (GOI) or a functional derivative thereof. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む、請求項１に記載のシステム。 2. The system of claim 1, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from any one of SEQ ID NOS:22, 21, 28, and 30. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む、請求項２に記載のシステム。 3. The system of claim 2, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:22. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む、請求項２に記載のシステム。 3. The system of claim 2, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:21. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む、請求項２に記載のシステム。 3. The system of claim 2, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:28. 前記ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む、請求項２に記載のシステム。 3. The system of claim 2, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:30. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である、請求項１～６のいずれか一項に記載のシステム。 7. A DNA endonuclease according to any one of claims 1 to 6, wherein said DNA endonuclease recognizes a protospacer adjacent motif (PAM) having the sequence NGG or NNGG, N being any nucleotide or functional derivative thereof. system. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である、請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。 The system according to any one of claims 1 to 7, wherein said DNA endonuclease is a type II Cas endonuclease or a functional derivative thereof. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項１～８のいずれか一項に記載のシステム。 The system of any one of claims 1-8, wherein the DNA endonuclease is Cas9. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～９のいずれか一項に記載のシステム。 The system of any one of claims 1-9, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is codon-optimized for expression in a host cell. 前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のシステム。 A system according to any one of claims 1 to 10, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or a functional derivative thereof is codon-optimized for expression in a host cell. 前記ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステム。 The system of any one of claims 1-11, wherein the GOI encodes a polypeptide selected from the group consisting of therapeutic polypeptides and prophylactic polypeptides. 前記ＧＯＩは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）タンパク質、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）タンパク質、第Ｘ因子（ＦＸ）タンパク質、プロテインＣ、セリンプロテアーゼ阻害剤Ｇ１（セルピンＧ１）、またはそれらのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステム。 The GOI is Factor VIII (FVIII) protein, Factor IX (FIX) protein, alpha-1-antitrypsin, Factor XIII (FXIII) protein, Factor VII (FVII) protein, Factor X (FX) protein , protein C, serine protease inhibitor G1 (serpin G1), or any functional derivative thereof. 前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項１３に記載のシステム。 14. The system of claim 13, wherein said GOI encodes a FVIII protein or any functional derivative thereof. 前記ＧＯＩは、ＦＩＸタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項１３に記載のシステム。 14. The system of claim 13, wherein said GOI encodes a FIX protein or any functional derivative thereof. 前記ＧＯＩは、セルピンＧ１タンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項１３に記載のシステム。 14. The system of claim 13, wherein said GOI encodes a serpin G1 protein or any functional derivative thereof. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。 The system of any one of claims 1-16, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is deoxyribonucleic acid (DNA). 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。 The system of any one of claims 1-16, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is ribonucleic acid (RNA). 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、請求項１８に記載のシステム。 19. The system of claim 18, wherein said RNA encoding said DNA endonuclease is mRNA. 前記ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている、請求項１～１９のいずれか一項に記載のシステム。 The system of any one of claims 1-19, wherein the donor template is encoded in an AAV vector. 前記ドナーテンプレートは、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項２０に記載のシステム。 21. The system of claim 20, wherein said donor template comprises a donor cassette comprising said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative, said donor cassette flanked on one or both sides by gRNA target sites. 前記ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項２１に記載のシステム。 22. The system of claim 21, wherein the donor cassette is flanked on both sides by gRNA target sites. 前記ｇＲＮＡ標的部位は、前記システムにおけるｇＲＮＡのための標的部位である、請求項２１または２２に記載のシステム。 23. The system of claim 21 or 22, wherein said gRNA target site is a target site for a gRNA in said system. 前記ドナーテンプレートの前記ｇＲＮＡ標的部位は、前記システムにおけるｇＲＮＡのためのゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項２３に記載のシステム。 24. The system of claim 23, wherein said gRNA target site of said donor template is the reverse complement of a genomic gRNA target site for the gRNA in said system. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項１～２４のいずれか一項に記載のシステム。 25. The system of any one of claims 1-24, wherein the DNA endonuclease or nucleic acid encoding the DNA endonuclease is formulated in a liposome or lipid nanoparticle. 前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、前記ｇＲＮＡも含む、請求項２５に記載のシステム。 26. The system of claim 25, wherein said liposomes or lipid nanoparticles also contain said gRNA. 前記ｇＲＮＡと予め複合体化されて、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のシステム。 27. The system of any one of claims 1-26, comprising said DNA endonuclease pre-complexed with said gRNA to form a ribonucleoprotein (RNP) complex. 細胞においてゲノムを編集するエクスビボの方法であって、
前記細胞に、以下：
（ａ）配列番号２２、２１、２８、３０、１８～２０、２３～２７、２９、３１～４４、および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸と、
（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、
（ｃ）関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートと、を提供することを含む、方法。 An ex vivo method of genome editing in a cell comprising:
In said cells:
(a) a gRNA comprising a spacer sequence from any one of SEQ ID NOS: 22, 21, 28, 30, 18-20, 23-27, 29, 31-44, and 104, or a nucleic acid encoding said gRNA; ,
(b) a DNA endonuclease or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease;
(c) a donor template comprising a nucleic acid sequence encoding a gene of interest (GOI) or functional derivative. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む、請求項２８に記載の方法。 29. The method of claim 28, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from any one of SEQ ID NOs:22, 21, 28, and 30. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む、請求項２９に記載の方法。 30. The method of claim 29, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:21. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む、請求項３０に記載の方法。 31. The method of claim 30, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:22. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む、請求項２９に記載の方法。 30. The method of claim 29, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:28. 前記ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む、請求項２９に記載の方法。 30. The method of claim 29, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:30. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。 34. A DNA endonuclease according to any one of claims 28 to 33, wherein said DNA endonuclease recognizes a protospacer adjacent motif (PAM) having the sequence NGG or NNGG, N being any nucleotide or functional derivative thereof. Method. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。 A method according to any one of claims 28-34, wherein said DNA endonuclease is a type II Cas endonuclease or a functional derivative thereof. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の方法。 36. The method of any one of claims 28-35, wherein the DNA endonuclease is Cas9. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の方法。 37. The method of any one of claims 28-36, wherein said nucleic acid encoding said DNA endonuclease is codon-optimized for expression in said cell. 前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の方法。 A method according to any one of claims 28-37, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or a functional derivative thereof is codon-optimized for expression in said cell. 前記ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の方法。 39. The method of any one of claims 28-38, wherein the GOI encodes a polypeptide selected from the group consisting of therapeutic polypeptides and prophylactic polypeptides. 前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＩＸタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、セルピンＧ１、またはそれらのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の方法。 The GOI comprises a protein selected from the group consisting of FVIII protein, FIX protein, alpha-1-antitrypsin, FXIII protein, FVII protein, FX protein, protein C, serpin G1, or any functional derivative thereof. A method according to any one of claims 28-38, wherein coding. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項２８～４０のいずれか一項に記載の方法。 The method of any one of claims 28-40, wherein said nucleic acid encoding said DNA endonuclease is deoxyribonucleic acid (DNA). 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項２８～４０のいずれか一項に記載の方法。 The method of any one of claims 28-40, wherein said nucleic acid encoding said DNA endonuclease is ribonucleic acid (RNA). 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、請求項４２に記載の方法。 43. The method of claim 42, wherein said RNA encoding said DNA endonuclease is mRNA. 前記ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている、請求項２８～４３のいずれか一項に記載の方法。 44. The method of any one of claims 28-43, wherein the donor template is encoded in an AAV vector. 前記ドナーテンプレートは、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項２８～４４のいずれか一項に記載の方法。 45. Any of claims 28-44, wherein said donor template comprises a donor cassette comprising said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative, said donor cassette being flanked on one or both sides by gRNA target sites. The method according to item 1. 前記ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項４５に記載の方法。 46. The method of claim 45, wherein the donor cassette is flanked on both sides by gRNA target sites. 前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための標的部位である、請求項４５または４６に記載の方法。 47. The method of claim 45 or 46, wherein said gRNA target site is the target site for said gRNA of (a). 前記ドナーテンプレートの前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための前記細胞ゲノムにおけるｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項４７に記載の方法。 48. The method of claim 47, wherein said gRNA target site of said donor template is the reverse complement of a gRNA target site in said cellular genome for said gRNA of (a). 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項２８～４８のいずれか一項に記載の方法。 49. The method of any one of claims 28-48, wherein the DNA endonuclease or nucleic acid encoding the DNA endonuclease is formulated in a liposome or lipid nanoparticle. 前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、前記ｇＲＮＡも含む、請求項４９に記載の方法。 50. The method of claim 49, wherein said liposomes or lipid nanoparticles also contain said gRNA. 前記細胞に、前記ｇＲＮＡと予め複合体化されて、ＲＮＰ複合体を形成する前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供することを含む、請求項２８～５０のいずれか一項に記載の方法。 51. The method of any one of claims 28-50, comprising providing said cell with said DNA endonuclease pre-complexed with said gRNA to form an RNP complex . （ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）の前記ドナーテンプレートが前記細胞に提供されてから４日を超えた後に、前記細胞に提供される、請求項２８～５１のいずれか一項に記載の方法。 The gRNA of (a) and the DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding the DNA endonuclease is added to the cell more than 4 days after the donor template of (c) is provided to the cell. A method according to any one of claims 28-51, provided for （ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）が前記細胞に提供されてから少なくとも１４日後に、前記細胞に提供される、請求項２８～５２のいずれか一項に記載の方法。 wherein said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease are provided to said cell at least 14 days after (c) is provided to said cell. 53. The method of any one of paragraphs 28-52. １つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記細胞に提供される、請求項５２または５３に記載の方法。 one or more additional doses of said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease is combined with said first dose of said gRNA of (a) and (b) 54. The method of claim 52 or 53, wherein said DNA endonuclease of or nucleic acid encoding said DNA endonuclease is subsequently provided to said cell. １つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、前記ＧＯＩもしくは機能的誘導体をコードする前記核酸配列の標的化された組み込みの標的レベル、および／または前記ＧＯＩもしくは機能的誘導体をコードする前記核酸配列の発現の標的レベルが達成されるまで、前記第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記細胞に提供される、請求項５４に記載の方法。 One or more additional doses of said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease are targeted to said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative. of said first dose of said gRNA of (a) and (b) until a target level of integration and/or target level of expression of said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative is achieved. 55. The method of claim 54, wherein said DNA endonuclease or nucleic acid encoding said DNA endonuclease is subsequently provided to said cell. 前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項２８～５５のいずれか一項に記載の方法。 56. A method according to any one of claims 28-55, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative is expressed under the control of the endogenous albumin promoter. 前記細胞は、肝細胞である、請求項２８～５６のいずれか一項に記載の方法。 57. The method of any one of claims 28-56, wherein the cells are hepatocytes. 遺伝子改変細胞であって、前記細胞のゲノムは、請求項２８～５７のいずれか一項に記載の方法によって編集されている、遺伝子改変細胞。 A genetically modified cell, wherein the genome of said cell has been edited by the method of any one of claims 28-57. 前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記内因性アルブミンプロモーターの前記制御下で発現される、請求項５８に記載の遺伝子改変細胞。 59. The genetically modified cell of claim 58, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative is expressed under said control of said endogenous albumin promoter. 前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項５８または５９に記載の遺伝子改変細胞。 60. The genetically modified cell of claim 58 or 59, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or a functional derivative thereof is codon optimized for expression in said cell. 前記細胞は、肝細胞である、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。 61. The genetically modified cell of any one of claims 58-60, wherein said cell is a hepatocyte. （ａ）配列番号２２、２１、２８、３０、１８～２０、２３～２７、２９、３１～４４、および１０４のいずれか１つからのスペーサ配列を含むｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸と、
（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、
（ｃ）関心対象の遺伝子（ＧＯＩ）または機能的誘導体をコードする核酸配列を含むドナーテンプレートとを含む、対象における障害または健康状態を治療するための薬剤。 ( a) a gRNA comprising a spacer sequence from any one of SEQ ID NOs: 22, 21, 28, 30, 18-20, 23-27, 29, 31-44, and 104, or a nucleic acid encoding said gRNA; ,
(b) a DNA endonuclease or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease;
(c) a donor template comprising a nucleic acid sequence encoding a gene of interest (GOI) or functional derivative ; and a medicament for treating a disorder or condition in a subject . 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、および３０のいずれか１つからのスペーサ配列を含む、請求項６２に記載の薬剤。 63. The agent of claim 62, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from any one of SEQ ID NOs:22, 21, 28, and 30. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサ配列を含む、請求項６３に記載の薬剤。 64. The agent of claim 63, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:22. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサ配列を含む、請求項６３に記載の薬剤。 64. The agent of claim 63, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:21. 前記ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサ配列を含む、請求項６３に記載の薬剤。 64. The agent of claim 63, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:28. 前記ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサ配列を含む、請求項６３に記載の薬剤。 64. The agent of claim 63, wherein said gRNA comprises a spacer sequence from SEQ ID NO:30. 前記ＧＯＩは、治療用ポリペプチドおよび予防用ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項６２～６７のいずれか一項に記載の薬剤。 Agent according to any one of claims 62 to 67, wherein said GOI encodes a polypeptide selected from the group consisting of therapeutic polypeptides and prophylactic polypeptides. 前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＩＸタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、ＦＸＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩタンパク質、ＦＸタンパク質、プロテインＣ、セルピンＧ１、またはそれらのそのいずれかの機能的誘導体からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項６２～６７のいずれか一項に記載の薬剤。 said GOI is a protein selected from the group consisting of FVIII protein, FIX protein, alpha-1-antitrypsin, FXIII protein, FVII protein, FX protein, protein C, serpin G1, or any functional derivative thereof 68. The agent of any one of claims 62-67, which encodes a 前記ＧＯＩは、ＦＶＩＩＩタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項６９に記載の薬剤。 70. The agent of claim 69, wherein said GOI encodes a FVIII protein or any functional derivative thereof. 前記ＧＯＩは、ＦＩＸタンパク質またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項６９に記載の薬剤。 70. The agent of claim 69, wherein said GOI encodes a FIX protein or any functional derivative thereof. 前記ＧＯＩは、セルピンＧ１またはそのいずれかの機能的誘導体をコードする、請求項６９に記載の薬剤。 70. The agent of claim 69, wherein said GOI encodes Serpin G1 or any functional derivative thereof. 前記対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害もしくは健康状態を有するか、または有することが疑われる患者である、請求項６２～７２のいずれか一項に記載の薬剤。 said subject has a disorder selected from the group consisting of hemophilia A, hemophilia B, MPS II, MPS1H, alpha-1-antitrypsin deficiency, FXIII deficiency, FVII deficiency, FX deficiency, protein C deficiency, and HAE or a patient having or suspected of having a condition. 前記対象は、血友病Ａを有するか、または有することが疑われる患者である、請求項７３に記載の薬剤。 74. The agent of claim 73, wherein the subject is a patient having or suspected of having hemophilia A. 前記対象は、血友病Ｂを有するか、または有することが疑われる患者である、請求項７３に記載の薬剤。 74. The agent of claim 73, wherein the subject is a patient having or suspected of having hemophilia B. 前記対象は、ＨＡＥを有するか、または有することが疑われる患者である、請求項７３に記載の薬剤。 74. The agent of claim 73, wherein the subject is a patient having or suspected of having HAE. 前記対象は、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ１Ｈ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、ＦＸＩＩＩ欠乏症、ＦＶＩＩ欠乏症、ＦＸ欠乏症、プロテインＣ欠乏症、およびＨＡＥからなる群から選択される障害または健康状態のリスクを有すると診断されている、請求項６２～７２のいずれか一項に記載の薬剤。 said subject has a disorder selected from the group consisting of hemophilia A, hemophilia B, MPS II, MPS1H, alpha-1-antitrypsin deficiency, FXIII deficiency, FVII deficiency, FX deficiency, protein C deficiency, and HAE or has been diagnosed as being at risk for the condition. 前記対象は、血友病Ａのリスクを有すると診断されている患者である、請求項７７に記載の薬剤。 78. The agent of claim 77, wherein the subject is a patient diagnosed as having hemophilia A risk. 前記対象は、血友病Ｂのリスクを有すると診断されている患者である、請求項７７に記載の薬剤。 78. The agent of claim 77, wherein the subject is a patient diagnosed as having hemophilia B risk. 前記対象は、ＨＡＥのリスクを有すると診断されている患者である、請求項７７に記載の薬剤。 78. The agent of claim 77, wherein the subject is a patient diagnosed as being at risk for HAE. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、配列ＮＧＧまたはＮＮＧＧを有するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、Ｎは、任意のヌクレオチドまたはその機能的誘導体である、請求項６２～８０のいずれか一項に記載の薬剤。 81. A DNA endonuclease according to any one of claims 62 to 80, wherein said DNA endonuclease recognizes a protospacer adjacent motif (PAM) having the sequence NGG or NNGG, N being any nucleotide or functional derivative thereof. drug . 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその機能的誘導体である、請求項６２～８１のいずれか一項に記載の薬剤。 Agent according to any one of claims 62 to 81, wherein said DNA endonuclease is a type II Cas endonuclease or a functional derivative thereof. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項６２～８２のいずれか一項に記載の薬剤。 The agent of any one of claims 62-82, wherein said DNA endonuclease is Cas9. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、前記対象における細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６２～８３のいずれか一項に記載の薬剤。 84. The agent of any one of claims 62-83, wherein said nucleic acid encoding said DNA endonuclease is codon-optimized for expression in cells in said subject . 前記ＧＯＩまたはその機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記対象における細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６２～８４のいずれか一項に記載の薬剤。 Agent according to any one of claims 62 to 84, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or a functional derivative thereof is codon optimized for expression in cells in said subject . 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項６２～８５のいずれか一項に記載の薬剤。 86. The agent of any one of claims 62-85, wherein the nucleic acid encoding the DNA endonuclease is deoxyribonucleic acid (DNA). 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項６２～８５のいずれか一項に記載の薬剤。 The agent of any one of claims 62-85, wherein said nucleic acid encoding said DNA endonuclease is ribonucleic acid (RNA). 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、請求項８７に記載の薬剤。 88. The agent of claim 87, wherein said RNA encoding said DNA endonuclease is mRNA. （ａ）の前記ｇＲＮＡ、（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、および（ｃ）の前記ドナーテンプレート、のうちの１つ以上は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項６２～８８のいずれか一項に記載の薬剤。 one or more of the gRNA of (a), the DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding the DNA endonuclease, and the donor template of (c) are formulated in a liposome or lipid nanoparticle. The medicament of any one of claims 62-88, wherein 前記ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターにコードされている、請求項６２～８９のいずれか一項に記載の薬剤。 Agent according to any one of claims 62 to 89, wherein said donor template is encoded in an AAV vector. 前記ドナーテンプレートは、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットは、片側または両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項６２～９０のいずれか一項に記載の薬剤。 91. Any of claims 62 to 90, wherein said donor template comprises a donor cassette comprising said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative, said donor cassette being flanked on one or both sides by gRNA target sites. The drug according to item 1. 前記ドナーカセットは、両側でｇＲＮＡ標的部位によって隣接されている、請求項９１に記載の薬剤。 92. The agent of claim 91, wherein said donor cassette is flanked on both sides by gRNA target sites. 前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための標的部位である、請求項９１または９２に記載の薬剤。 93. The agent of claim 91 or 92, wherein said gRNA target site is the target site for said gRNA of (a). 前記ドナーテンプレートの前記ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）の前記ｇＲＮＡのための前記対象における細胞ゲノムにおける前記ｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項９３に記載の薬剤。 94. The agent of claim 93, wherein said gRNA target site of said donor template is the reverse complement of said gRNA target site in the cellular genome in said subject for said gRNA of (a). 前記ドナーテンプレートが前記対象に投与される、請求項６２～９４のいずれか一項に記載の薬剤。 Agent according to any one of claims 62 to 94, wherein said donor template is administered to said subject. 前記投与は、静脈内経路を介する、請求項９５に記載の薬剤。 96. The agent of claim 95, wherein said administering is via an intravenous route. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項６２～９６のいずれか一項に記載の薬剤。 97. The agent of any one of claims 62-96, wherein said DNA endonuclease or nucleic acid encoding said DNA endonuclease is formulated in a liposome or lipid nanoparticle. 前記リポソームまたは脂質ナノ粒子は、前記ｇＲＮＡも含む、請求項９７に記載の薬剤。 98. The agent of claim 97, wherein said liposomes or lipid nanoparticles also contain said gRNA. 前記リポソームまたは脂質ナノ粒子が前記対象に投与される、請求項９８に記載の薬剤。 99. The agent of claim 98, wherein said liposomes or lipid nanoparticles are administered to said subject. 前記投与は、静脈内経路を介する、請求項９９に記載の薬剤。 100. The agent of claim 99, wherein said administering is via an intravenous route. 前記ｇＲＮＡと予め複合体化されて、ＲＮＰ複合体を形成する前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが前記対象における細胞に提供される、請求項６２～１００のいずれか一項に記載の薬剤。 101. The agent of any one of claims 62-100, wherein said DNA endonuclease pre-complexed with said gRNA to form an RNP complex is provided to cells in said subject . （ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）の前記ドナーテンプレートが前記対象における細胞に提供されてから４日を超えた後に、前記対象における細胞に提供される、請求項６２～１０１のいずれか一項に記載の薬剤。 said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease, after more than 4 days after said donor template of (c) has been provided to cells in said subject , 102. The agent of any one of claims 62-101, provided to cells in said subject . （ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）の前記ドナーテンプレートが前記対象における細胞に提供されてから少なくとも１４日後に、前記対象における細胞に提供される、請求項６２～１０２のいずれか一項に記載の薬剤。 said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease is administered to said subject at least 14 days after said donor template of (c) has been provided to cells in said subject ; 103. The agent of any one of claims 62-102, which is provided to a cell in １つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、前記第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記対象における細胞に提供される、請求項１０２または１０３に記載の薬剤。 one or more additional doses of said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or nucleic acid encoding said DNA endonuclease are combined with said first dose of said gRNA of (a) and (b) 104. The agent of claim 102 or 103, wherein said DNA endonuclease of ) or nucleic acid encoding said DNA endonuclease is provided to a cell in said subject . １つ以上の追加用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列の標的化された組み込みの標的レベルおよび／または前記ＧＯＩタンパク質または機能的誘導体をコードする前記核酸配列の発現の標的レベルが達成されるまで、前記第１の用量の、（ａ）の前記ｇＲＮＡおよび（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸に続いて、前記対象における細胞に提供される、請求項１０４に記載の薬剤。 One or more additional doses of said gRNA of (a) and said DNA endonuclease of (b) or a nucleic acid encoding said DNA endonuclease are targeted to said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative. of said first dose of said gRNA of (a) and (b) until a target level of integration and/or target level of expression of said nucleic acid sequence encoding said GOI protein or functional derivative is achieved. 105. The agent of claim 104, wherein said DNA endonuclease or nucleic acid encoding said DNA endonuclease is subsequently provided to a cell in said subject . 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸および前記ｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子が前記対象に投与される、請求項１０２～１０５のいずれか一項に記載の薬剤。 106. The agent of any one of claims 102-105, wherein lipid nanoparticles comprising a nucleic acid encoding said DNA endonuclease and said gRNA are administered to said subject . ＡＡＶベクターにコードされた前記ドナーテンプレートが前記対象に投与される、請求項１０２～１０６のいずれか一項に記載の薬剤。 107. The agent of any one of claims 102-106, wherein said donor template encoded in an AAV vector is administered to said subject . 前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項６２～１０７のいずれか一項に記載の薬剤。 Agent according to any one of claims 62 to 107, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative is expressed under the control of said endogenous albumin promoter. 前記対象における肝細胞に提供される、請求項６２～１０８のいずれか一項に記載の薬剤。 109. The agent of any one of claims 62-108, provided to hepatocytes in said subject . 前記ＧＯＩまたは機能的誘導体をコードする前記核酸配列は、前記対象の前記肝臓において発現される、請求項６２～１０９のいずれか一項に記載の薬剤。 Agent according to any one of claims 62 to 109, wherein said nucleic acid sequence encoding said GOI or functional derivative is expressed in said liver of said subject. 請求項５８～６１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞を含む、対象における血友病Ａ、血友病Ｂ、または遺伝性血管浮腫を治療するための医薬組成物。 A pharmaceutical composition for treating hemophilia A, hemophilia B, or hereditary angioedema in a subject comprising the genetically modified cells of any one of claims 58-61 . 前記遺伝子改変細胞は、前記対象に対して自家である、請求項１１１に記載の医薬組成物。 112. The pharmaceutical composition of Claim 111, wherein said genetically modified cell is autologous to said subject. 前記遺伝子改変細胞が、前記対象から得られた肝細胞から調製される、請求項１１１または１１２に記載の医薬組成物。 113. The pharmaceutical composition of claim 111 or 112, wherein said genetically modified cells are prepared from hepatocytes obtained from said subject . 請求項１～２７のいずれか一項に記載のシステムの１つ以上の要素を含み、かつ使用のための説明書をさらに含む、キット。 A kit comprising one or more elements of the system of any one of claims 1-27 and further comprising instructions for use.
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