JPWO2020067400A1 - 抗原ペプチド−アジュバントヌクレオチドコンジュゲート体を含む免疫誘導剤及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

抗原ペプチド−アジュバントヌクレオチドコンジュゲート体を含む免疫誘導剤及びそれを含む医薬組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、抗原性を有するペプチドが、一端側でポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で抗原性を有するペプチドと共有結合したスペーサーを介して結合したポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを有効成分として含む免疫誘導剤及びそれを含む医薬組成物を提供する。

Description

本発明は、抗原ペプチドに特異的な免疫応答を誘導するための新規な抗原ペプチド−アジュバントヌクレオチドコンジュゲート体を含む免疫誘導剤及びそれを含む医薬組成物に関する。
ワクチンによる感染予防の基本的な原理は、人為的な擬似感染により、獲得免疫を誘導し、特定の病原体に対する抗体産生や細胞性免疫を誘導することにある。獲得免疫においては、免疫の「記憶」を担当するＴ細胞やＢ細胞が中心的な役割を果たし、ＤＮＡの再構成による抗体の可変領域の多様性が、無数の抗原への特異的な免疫反応を可能にしていることが知られている。一方、白血球、マクロファージ、樹状細胞等の食細胞が中心的な役割を果たしている自然免疫は、従来、病原体や異物を貪食する非特異的なプロセスであり、獲得免疫成立までの「一時しのぎ」としての役割のみを果たしていると考えられていたが、自然免疫の分子機構に関する研究の進展により、自然免疫においても、自己・非自己の特異的な認識が行われていることや、自然免疫が獲得免疫の成立に必須であることが明らかにされた。より具体的には、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等の抗原提示細胞に存在するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーが、様々な病原体と反応し、サイトカインの産生を誘導し、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化の促進、キラーＴ細胞の活性化等を通して、獲得免疫を誘導することが、最近の研究により明らかにされた。
一連のＴＬＲファミリーにより認識される病原体の構成成分は多岐にわたるが、その中の１つに、ＴＬＲ９のリガンドである、ＣｐＧモチーフを有するＤＮＡ（ＣｐＧ ＤＮＡ）がある。ＣｐＧモチーフは、中心部にシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）が並び、前後にプリン塩基及びピリミジン塩基が２つずつ並んだ６個の塩基を基本とし、−ＰｕＰｕ−ＣＧ−ＰｙＰｙ−（Ｐｕはプリン塩基を、Ｐｙはピリミジン塩基を表す。）で表される配列で（ヒトの場合には、ＧＴＣＧＴＴもＴＬＲ９に対するリガンド活性を有していることが知られている。）、ほ乳類には少なく、微生物には多く（確率により計算される頻度で）見られる塩基配列である。また、ほ乳類においては、少数存在するＣｐＧモチーフの殆どがメチル化を受けている。ほ乳類中に殆ど存在しない非メチル化ＣｐＧモチーフは、強力な免疫賦活活性を有している（例えば、非特許文献１〜３参照）。エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたＣｐＧ ＤＮＡは、ファゴソーム様小胞体に存在するＴＬＲ９により認識され、Ｔｈ１反応を強く誘導する。Ｔｈ１反応は、Ｔｈ２反応が優位なアレルギー反応を抑制すると共に、強い抗腫瘍活性を有する。そのため、ＣｐＧ ＤＮＡは、感染予防に加え、アレルギー疾患、腫瘍性疾患に対するアジュバントとしても期待されている（例えば非特許文献４参照）。
しかし、ＣｐＧ ＤＮＡを免疫療法のアジュバントとして使用する場合、細胞質や血漿中のヌクレアーゼによる分解や、タンパク質との非特異的な結合を回避しつつ、いかに標的細胞の内部にＣｐＧ ＤＮＡを到達させるかが問題となる。
本発明者らは、新規な遺伝子キャリアとしてβ−１，３−グルカン骨格を有する多糖（以下、「β−１，３−グルカン」と略称する場合がある。）に着目し、これまでに、β−１，３−グルカンが核酸医薬（アンチセンスＤＮＡ、ＣｐＧ ＤＮＡ）をはじめとする種々の核酸と新しいタイプの複合体を形成することを見出してきた（例えば、特許文献１、２、非特許文献５〜７参照）。
天然では３重らせんで存在するβ−１，３−グルカンを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の非プロトン性極性有機溶媒、或いは０．１Ｎ以上のアルカリ溶液に溶解して１本鎖に解離させた後に、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水或いは中性に戻すことによって、核酸１分子とβ−１，３−グルカン２分子とからなる３重らせん複合体が形成することを見出した。この場合、３重らせん複合体におけるβ−１，３−グルカン分子と核酸分子とは、主として水素結合と疎水性相互作用により分子間結合を形成しているものと考えられている（非特許文献８参照）。
上述のように、核酸をβ−１，３−グルカンと複合化することにより、ヌクレアーゼによる核酸分子の加水分解や、血漿タンパク質と核酸との非特異的な結合等の、核酸分子と生体内タンパク質との望ましくない相互作用を抑制しつつ、核酸を細胞の内部に到達させることが可能になった。β−１，３−グルカンと核酸との複合体、さらには抗原性を有するタンパク質を含む３元複合体を利用して、ＣｐＧ ＤＮＡの細胞内へのデリバリーに成功した（例えば、特許文献３、４、非特許文献９〜１１参照）。
しかしながら、上記従来の技術は、以下のような課題を有していた。例えば、非特許文献１１記載のβ−１，３−グルカン／抗原性を有するタンパク質／ＣｐＧ ＤＮＡの３元複合体の製造方法においては、過ヨウ素酸酸化により、β−１，３−グルカンの側鎖のグルコース残基上にホルミル基を生成させ、還元的アミノ化反応により、ホルミル基と抗原性を有するペプチド（以下、「抗原性ペプチド」と略称する場合がある。）のアミノ基とを反応させ、β−１，３−グルカンと抗原性を有するペプチドとが共有結合した複合体を形成するが、収率がきわめて低いという課題を有していた。かかる事情に鑑みて、例えば、特許文献４記載のβ−１，３−グルカン／抗原性タンパク質（抗原性を有するペプチド）／ＣｐＧ ＤＮＡの３元複合体の製造方法においては、側鎖にホルミル基を有するβ−１，３−グルカンと抗原性を有するペプチドとを、アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行う、或いはアルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行うことにより、β−１，３−グルカンの側鎖上のホルミル基と抗原性を有するペプチドのアミノ基との反応性及び収率を向上させている。しかしながら、ペプチドには複数のアミノ基が存在するため、反応点の制御が困難である。したがって、抗原性を有するペプチドの反応位置による免疫原性の違いや、β−１，３−グルカンとの反応生成物が複雑な混合物となることに起因する分離精製の困難性等の問題の発生が懸念される。また、水素結合による複合体形成を利用したβ−１，３−グルカンとＤＮＡとの複合体の形成に比べ、β−１，３−グルカンと抗原性を有するペプチドの共有結合の形成に基づく複合体の形成は煩雑である。これらの点において、特許文献４記載のβ−１，３−グルカン／抗原性を有するペプチド／ＣｐＧ ＤＮＡの３元複合体の製造方法は、生産性等の点で依然として課題を有している。
かかる課題に鑑みて、本発明者らは、生産性に優れ、高い免疫賦活活性を有するペプチド／β−１，３−グルカン複合体として、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、抗原性を有するペプチドが、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と共有結合を介して結合したペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートとを含み、前記ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、水素結合を介して結合し、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成していることを特徴とするペプチド／β−１，３−グルカン複合体を提案した（特許文献５参照）。しかしながら、特許文献５にはペプチド／β−１，３−グルカン複合体を構成するペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲート自体の免疫誘導活性については記載されていなかった。
ＣｐＧ ＤＮＡと抗原性を有するペプチドもしくはタンパク質とのコンジュゲートの免疫誘導活性を示唆するいくつかの報告は存在する（非特許文献１２、１３参照）。しかしながら、非特許文献１２では、ＣｐＧ ＤＮＡとオボアルブミン（ＯＶＡ）抗原由来の１８〜２４ｍｅｒのペプチドのコンジュゲートの投与により、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）でのＯＶＡ抗原提示活性を示しているが、明確なＣＴＬ細胞障害活性の誘導は示されていない。また非特許文献１３では、ＣｐＧ ＤＮＡとＯＶＡ抗原蛋白質とのコンジュゲートの投与により、ＣＴＬ細胞障害活性の誘導が示されているが、投与量が１０μｇ／マウスと高く、またその製造に当たってはＤＮＡの化学合成と抗原蛋白質の培養／精製による生産及びこれらのコンジュゲートという複雑な製造工程を必要とすることから、低用量での活性及び生産性に課題を有している。
国際公開第０１／３４２０７号 国際公開第０２／０７２１５２号 特開２０１０−１７４１０７号公報 特開２００７−７０３０７号公報 国際公開第２０１５／１１８７８９号
Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to Signal Infectious Danger, H. Wagner, Adv. Immunol., 73, 329-368 (1999). CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects, M. Krieg, Annu. Rev. Immunol., 20, 709-760 (2002). The discovery of immunostimulatory DNA sequence, S. Yamamoto, T. Yamamoto, and T. Tokunaga, Springer Seminars in Immunopathology, 22, 11-19 (2000). 「標準免疫学」第２版、医学書院、２００２年、３３３頁 Molecular Recognition of Adenine, Cytosine, and Uracil in a Single-Stranded RNA by a Natural Polysaccharide: Schizophyllan. K. Sakurai and S. Shinkai, J. Am. Chem. Soc., 122, 4520-4521 (2000). Polysaccharide-Polynucleotide Complexes. 2. Complementary Polynucleotide Mimic Behavior of the Natural Polysaccharide Schizophyllan in the Macromolecular Complex with Single-Stranded RNA and DNA. K. Sakurai, M. Mizu and S. Shinkai, Biomacromolecules, 2, 641-650 (2001). Dectin-1 targeting delivery of TNF-α antisense ODNs complexed with β-1,3-glucan protects mice from LPS-induced hepatitis. S. Mochizuki and K. Sakurai, J. Control. Release, 151 (2011) 155-161. Structural Analysis of the Curdlan/Poly (cytidylic acid) Complex with Semiempirical Molecular Orbital Calculations. K. Miyoshi, K. Uezu, K. Sakurai and S. Shinkai, Biomacromolecules, 6, 1540-1546 (2005). A Polysaccharide Carrier for Immunostimulatory CpG DNAs to Enhance Cytokine Secretion, M. Mizu, K. Koumoto, T. Anada, T. Matsumoto, M. Numata, S. Shinkai, T. Nagasaki and K. Sakurai, J. Am. Chem. Soc., 126, 8372-8373 (2004). Protection of Polynucleotides against Nuclease-mediated Hydrolysis by Complexation with Schizophyllan, M. Mizu, K. Koumoto, T. Kimura, K. Sakurai and S. Shinkai, Biomaterials, 25, 15, 3109-3116 (2004). Synthesis and in Vitro Characterization of Antigen-Conjugated Polysaccharide as a CpG DNA Carrier, N. Shimada, K. J. Ishii, Y. Takeda, C. Coban, Y. Torii, S. Shinkai, S. Akira and K. Sakurai, Bioconjugate Chem., 17 1136-1140 (2006). Distinct Uptake Mechanisms but Similar Intracellular Processing of Two Different Toll-like Receptor Ligand-Peptide Conjugates in Dendritic Cells, Khan S. et al., J. Biol. Chem. 282, 21145-21159 (2007). Intracellular Cleavable CpG Oligodeoxynucleotide-Antigen Conjugate Enhances Anti-tumor Immunity, Kramer K. et al., Mol. Ther. 25, 62-70 (2017).
ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲート単独での明確な免疫誘導活性については知られていなかった。
本発明者らは、β−１，３−グルカンと複合体を形成していないペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲート自体、特にＣｐＧモチーフを含むペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートが、単独で高い免疫誘導活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。かくして、本発明は、生産性に優れ、高い免疫賦活活性を有する免疫誘導体及びそれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、抗原性を有するペプチドが、一端側で前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で前記抗原性を有するペプチドと共有結合したスペーサーを介して結合したポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを有効成分として含む免疫誘導剤を提供することにより上記課題を解決するものである。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記抗原性を有するペプチドのアミノ酸長が５以上３０以下であってもよい。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記抗原性を有するペプチドのアミノ酸長が８以上１１以下であってもよい。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキキシヌクレオチド（ＤＮＡ）又はＤＮＡ誘導体であってもよい。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の塩基長が１５以上４０以下であってもよい。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の塩基長が２０以上３０以下であってもよい。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体であってもよい。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート結合で置換されていてもよい。
前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されていてもよい。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記スペーサーと前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合及び前記スペーサーと前記抗原性を有するペプチドとの間の共有結合との一方又は双方が生体環境中で切断可能な共有結合であることが好ましい。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを構成する前記抗原性を有するペプチドと、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体に結合した前記スペーサーとが、前記抗原性を有するペプチドのＮ末端のシステイン残基のチオール基と前記スペーサーの有するチオール基との反応により生成した共有結合（ジスルフィド結合）を介して結合していてもよい。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記スペーサーが、下記の式で表される繰り返し単位を含んでいてもよい。
Figure 2020067400
上記の式において、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表し（ここで各Ｘは同じであっても異なっていてもよい）、
Ｒは、（ＣＨ2）pＯ、（ＣＨ2）qＮＨ、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mのいずれかを表し（ｍ、ｐ及びｑは、それぞれ独立して１０以下の自然数を表す。）、
ｎは、１０以下の自然数を表す。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有していてもよい。
Figure 2020067400
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、
前記抗原性を有するペプチドのアミノ酸長が５以上３０以下であり、
前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はＤＮＡ誘導体であり、
前記ポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体であり、および、
前記スペーサーと前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合及び前記スペーサーと前記抗原性を有するペプチドとの間の共有結合との一方又は双方が生体環境中で切断可能な共有結合である構造を有することが好ましい。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、
前記抗原性を有するペプチドのアミノ酸長が８以上１１以下であり、
前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が２以上のＣｐＧモチーフを含み、塩基長が２０以上３０以下であるポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はＤＮＡ誘導体であり、
前記ポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体であり、
前記ポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを構成する前記抗原性を有するペプチドと、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体に結合した前記スペーサーとが、前記抗原性を有するペプチドのＮ末端のシステイン残基のチオール基と前記スペーサーの有するチオール基との反応により生成した共有結合（ジスルフィド結合）を介して結合しており、および、
前記スペーサーが、下記のいずれかの式
Figure 2020067400
で表される構造を有することがより好ましい。
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、アジュバントとして、免疫賦活活性を有する物質をさらに含んでいてもよい。
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤を含む医薬組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。
本発明の第２の態様は、腫瘍治療のための医薬組成物であってもよい。
本発明の別の態様によれば、本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患を治療または予防するための方法が提供される。この態様において、疾患は腫瘍であってもよい。
本発明のさらに別の態様によれば、疾患の治療または予防のための医薬の製造のための、本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤の使用が提供される。この態様において、疾患は腫瘍であってもよい。
本発明のペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートは、生産性に優れた高活性の免疫誘導剤として用いることができる。また、抗原性を有するペプチド及びポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を適宜組み合わせることにより、多様な抗原に対し免疫誘導活性を有する免疫誘導剤を容易に設計することができる。
実施例２におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例３におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例４におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例４におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例５におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例７におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例７におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。
本発明の第１の実施の形態に係る免疫誘導剤（以下、「免疫誘導剤」と略称する場合がある。）は、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、抗原性を有するペプチドが、一端側でポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で抗原性を有するペプチドと共有結合したスペーサーを介して結合したポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを有効成分として含んでいる。
ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートは、抗原性を有するペプチドと、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とが、共有結合を介して結合した複合体である。「抗原性を有するペプチド」としては、抗原性を有するもの、すなわち、生体の免疫系において異物であると認識され、特異的な抗体産生を引き起こす（免疫応答を誘導する）ものであれば、任意のアミノ酸配列及びアミノ酸残基数を有するものを、特に制限なく用いることができる。抗原性を有するペプチドの配列にシステイン（Ｃｙｓ）が無い場合は、本実施の形態では、抗原蛋白質由来の抗原エピトープペプチドのＮ末にさらにシステインを人為的に一つ付与したペプチドを抗原性を有するペプチドとして用いることができる。本実施の形態に係る免疫誘導剤の有効成分であるペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートの製造に用いられる抗原性を有するペプチドとしては、食物アレルギー等のアレルギーの原因となるタンパク質、細菌、ウィルス等の病原体、腫瘍細胞等を起源とするタンパク質のうち、エピトープとして作用しうる部分アミノ酸配列を有するものが挙げられる。抗原性を有するペプチドを構成するアミノ酸残基数は、エピトープとして作用しうる限りにおいて特に制限されないが、多くの場合、５〜３０の範囲内であり、大部分は、８〜１７程度の範囲内にある。
抗原性を有するペプチドは、起源となるタンパク質の酵素分解、ペプチド合成等の任意の公知の方法を用いて得ることができる。また、抗原性を有するペプチドのアミノ酸配列は、ペプチドアレイを用いたエピトープ解析等の任意の公知の方法を用いて決定することができる。
抗原性を有するペプチドとして用いることができるペプチドの例示としては、エピトープペプチドデータベースIEDB (www.iedb.org, last accessed: 08/11/2014)に登録されているMHC-1 T cell Epitopes、Chowellらの論文（TCR contact residue hydrophobicity is a hallmark of immunogenic CD8+ T cell epitopes PNAS April 7, 2015 112 (14) E1754-E1762), Table.S1）に記載のペプチド、下記表１〜７に示すものが挙げられる。これらの抗原性ペプチドのＮ末にさらにシステイン残基を一つ付与したペプチドが本実施の形態において、抗原性を有するペプチドとして用いることができる（ただし、抗原性ペプチドの配列中にすでにシステイン残基がある場合を除く。）。
Figure 2020067400
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ポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを構成する１本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、１又は複数（好ましくは複数）のＣｐＧモチーフを含む限りにおいて、任意の塩基配列及び塩基数を有するポリヌクレオチド又はその誘導体を特に制限なく用いることができる。ＣｐＧモチーフの具体例としては、ＡＧＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＴＣＧＴＴ等が挙げられる。ポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧモチーフの数は特に制限されないが、１から６のＣｐＧモチーフを含んでいることが好ましく、２から４のＣｐＧモチーフを含んでいることがさらに好ましい。前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はホスホロチオエート修飾されたＤＮＡ誘導体であることが好ましいが、一部にＲＮＡ又はＲＮＡ誘導体が含まれていてもよい。ＲＮＡ又はＲＮＡ誘導体が含まれる場合、それらのいずれか一又は複数の含量が、２０％以下（具体的には、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％以下）であることが好ましい。
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体に含まれる塩基数は、１５〜４０（具体的には、１５、１６，１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）であることが好ましく、２０〜３０（具体的には、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）であることがより好ましい。好ましいポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の具体例としては、下記表８に示されるものが挙げられる。
Figure 2020067400
ポリヌクレオチドは、生体内でヌクレアーゼによる分解を受けやすいので、生体内での安定性を向上させるために、ポリヌクレオチドの代わりにポリヌクレオチド誘導体を用いてもよい。ポリヌクレオチド誘導体の例としては、リボヌクレオチドの２'位のヒドロキシル基の全部又は一部がフッ素又はメトキシ基で置換されているもの、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のリン酸ジエステル結合の全部又は一部がホスホロチオエート結合で置換されているもの等が挙げられる。ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部がホスホロチオエート結合で置換されている場合、リン酸ジエステル結合の５０％以上（具体的には、５０、６０、７０、８０又は９０％以上）がホスホロチオエート結合で置換されていることが好ましく、９０％以上（具体的には、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％以上）がホスホロチオエート結合で置換されていることがより好ましく、実質的にすべてがホスホロチオエート結合で置換されていてもよい。ホスホロチオエート結合で置換されるリン酸ジエステル結合の位置は特に制限されず、連続した複数のリン酸ジエステル結合が置換されていてもよく、或いはホスホロチオエート結合が互いに隣り合わないように置換されていてもよい。
スペーサーを介して抗原性を有するペプチドと共有結合するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、抗原性を有するペプチドのＮ末端、Ｃ末端、或いは側鎖のいずれに結合していてもよいが、抗原性を有するペプチドのＮ末端側に結合していることが好ましい。抗原性を有するペプチドにＣｙｓ残基が含まれていない場合は、Ｎ末側にさらにシステイン残基を付与したペプチドを用いることができる。ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と抗原性を有するペプチドは、一端側でポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と共有結合し、他端側で抗原性を有するペプチドと共有結合したスペーサーを介して結合している。スペーサーとポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体及び抗原性を有するペプチドとの結合形成に使用される反応性官能基としては、抗原性を有するペプチド及びポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体に存在する官能基をそのまま、或いは化学修飾により活性化したものと反応して共有結合を形成できる任意のものが用いられる。ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体はその５'末端側又は３'末端の水酸基の酸素原子上で、スペーサーと結合していることが好ましい。抗原性を有するペプチドは、Ｃｙｓ残基側鎖のスルフヒドリル基の硫黄原子上で、スペーサーと結合していることが好ましい。
好ましいペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートの一例は、下記の式（Ａ）に示すように、抗原性を有するペプチドのＮ末端側に、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の３'又は５'末端側がスペーサーＳｐを介して結合した構造を有している。
式（Ａ）：［ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体］−Ｓｐ−［抗原性を有するペプチド］
スペーサーＳｐの一例としては、アルキレン基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられるが、下記の式で表されるリン酸ジエステル構造を含む繰り返し単位を含んでいてもよい。
Figure 2020067400
上記の式において、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表し（ここで各Ｘは同じであっても異なっていてもよい）、Ｒは、（ＣＨ2）pＯ、（ＣＨ2）qＮＨ、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mのいずれかを表し（ｍ、ｐ及びｑは、それぞれ独立して１０以下の自然数を表す。）、ｎは、１０以下の自然数を表す。
これらの繰り返し単位は、ヌクレアーゼによる加水分解を受けないため、Ｘが酸素原子であっても生体内での安定性が大きく低下することはない。例えば、Ｒが（ＣＨ2）3である場合、繰り返し単位のサイズがリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのサイズとほぼ等しくなるため、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の一部をこのスペーサーで置換することによる生産コストの低減が期待できる。スペーサーＳｐの具体例としては下記のものが挙げられる。
Figure 2020067400
Figure 2020067400
Figure 2020067400
Figure 2020067400
Figure 2020067400
Figure 2020067400
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Figure 2020067400
スペーサーＳｐのより好ましい例としては、下記のいずれかの構造を有するものが挙げられる。
Figure 2020067400
スペーサーとポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体及び抗原性を有するペプチドとの結合形成に使用される反応性官能基の組み合わせの例としては、エステル結合、アミド結合、リン酸エステル結合等に加え、例えば、バイオチップ表面への生体分子の固定に用いられる反応性官能基同士の組み合わせが挙げられ、より具体的には、下記に示すものが挙げられる。
（ａ）アルキンとアジド化合物
アルキンとアジド化合物（アジ化物）は、下記に示すような付加環化反応（フイスゲン反応）により、１，２，３−トリアゾール環を形成する。両者は、生体分子を含む多くの有機化合物に導入可能な安定な官能基であり、水を含む溶媒中でも迅速かつほぼ定量的に反応し、殆ど副反応を伴わず、余分な廃棄物を生成しないため、いわゆる「クリックケミストリー」の中心的な反応として、生化学の分野で広く用いられている。アルキン誘導体及びアジド基は、任意の公知の方法を用いて、抗原性を有するペプチド又はポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体に導入することができる。アルキン誘導体としては、プロパルギルアルコール、プロパルギルアミン等の反応性官能基を有するものが容易に入手でき、これらをカルボキシル基やヒドロキシル基等の反応性官能基と直接反応させ、或いはカルボニルジイミダゾール等と共に反応させ、生成するアミド結合、エステル結合、ウレタン結合等を介してアルキン誘導体を導入することができる。アジド基についても、任意の公知の方法を用いて、抗原性を有するペプチド又はポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体に導入することができる。なお、フイスゲン反応は銅触媒の存在下で行われるが、抗原性を有するペプチド及びリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合等の含硫黄官能基で置換されたポリヌクレオチド誘導体には、銅イオンに配位する硫黄原子が存在するため、銅の触媒活性が低下するおそれがある。反応率を向上させるために過剰量の銅を添加することが好ましい。
Figure 2020067400
（ｂ）マレイミド又はビニルスルホンとチオール基
電子求引性のカルボニル基又はスルホン基に隣接する二重結合を有するマレイミド又はビニルスルホンは、中性付近のｐＨで、下記に示すように、チオール基との付加反応（マイケル付加反応）により、安定なチオエーテル誘導体を生成する。適当なスペーサーを有するマレイミド及びビニルスルホン誘導体が市販されているため、抗原性を有するペプチド又はポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体にこれらの官能基を導入することは容易である。抗原性を有するペプチドにチオール基を導入する場合、システインを含む抗原性を有するペプチドの場合には、システイン残基側鎖のチオール基を利用できる。ただし、システインは、存在比が低いアミノ酸であるため、抗原性を有するペプチドのＮ末端側にシステインを導入したものを用いる。チオール基を含むポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体としては、これらの５'末端のヒドロキシル基をチオール基に変換したチオール化ポリヌクレオチドが用いられる。
Figure 2020067400
（ｃ）システイン側鎖のチオール基とチオール化ポリヌクレオチドのチオール基
上述のとおり、Ｎ末端側にシステインを導入した抗原性を有するペプチドのシステイン残基側鎖のチオール基と、チオール化ポリヌクレオチドのチオール基とを反応させ、ジスルフィド基を形成させる。ジスルフィド結合は、還元剤の存在下で切断されるため、上両者に比べ、安定性の点で劣る。ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体へのチオール基の導入は、任意の公知の方法を用いて行うことができるが、具体例としては、下式に示すような、アミノ化ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、ω−（２−ピリジルジチオ）脂肪酸のＮ−スクシイミジルエステルとの反応が挙げられる。
Figure 2020067400
これらのうち、生体内で容易に切断可能なシステイン側鎖のチオール基とチオール化ポリヌクレオチドのチオール基との組み合わせによるジスルフィド結合が好ましい。
本実施の形態に係る免疫誘導剤の有効成分として用いられるポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートは、フリー体、および、医薬上許容される塩の形態をとり得る。医薬上許容される塩としては、例えば、アルカリ金属（カリウム、ナトリウム、リチウム等）の塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム等）の塩、アンモニウム塩（テトラメチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等を含む）、有機アミン（トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、リジン、アルギニン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等）の塩、酸付加物塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩等の無機酸塩；及び、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸（メシル酸）塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、グルコン酸塩等の有機酸塩を含む）が挙げられる。また、医薬上許容される塩には、水和物も含まれる。
本発明の第２の実施の形態に係る医薬組成物（以下、単に「医薬組成物」と略称する場合がある。）は、本発明の第１の実施の形態に係る免疫誘導剤を含んでいる。医薬組成物の製造には、有効成分としてのペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートに加え、任意の公知の成分（医薬用途に許容される任意の担体、賦形剤及び添加物）及び製剤方法を用いることができる。免疫誘導剤を含む医薬組成物の製造には、有効成分としてのペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートに加え、任意の公知の成分（医薬用途に許容される任意の担体、賦形剤及び添加物）及び製剤方法を用いることができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない：グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン（triton）、トロメタミン（tromethamine）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール、ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、薬剤の重量に対して０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水性溶媒のｐＨは５〜１０が挙げられ、好ましくは６〜８である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。凍結乾燥製剤としてもよい。注射製剤の他には、経皮や粘膜吸収用の剤形（液剤スプレー、軟膏、ゲル、ローション、パッチ）、皮下局所徐放用の剤形（ナノゲルや生分解性マイクロ／ナノカプセルなどを含む懸濁液、温度応答性ゲル）、皮膚透過用経皮デバイス込みの製剤（イオントフォレシス、マイクロニードル）、粉末剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、エアゾールやドライパウダー等の吸入剤、等の形態をとることができる。
医薬組成物は、アジュバントとして免疫賦活活性を有する物質を更に含んでいてもよい。アジュバントは、限定はされないが、自然免疫を活性化する物質である。アジュバントは、好ましくは自然免疫レセプターのアゴニストである。自然免疫レセプターアゴニストとしては、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト）、ＲＬＲ（retinoic acid-inducible gene I (RIG-1)-like receptors）アゴニスト、ＳＴＩＮＧ（stimulator of Interferon genes）アゴニスト、ＮＬＲ（nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors）アゴニスト、ＣＬＲ（C-type lectin receptors）アゴニストなどが例示される。ＴＬＲアゴニストとしては、例えば、リポペプチド、Ｐｏｌｙ ＩＣ ＲＮＡ、イミキモド、レシキモド、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＣｐＧ−ＯＤＮなどが挙げられる。ＲＬＲアゴニストとしては、ｐｐｐＲＮＡ、Ｐｏｌｙ ＩＣ ＲＮＡなど、ＳＴＩＮＧアゴニストとしてはｃＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰなど、ＮＬＲアゴニストとしてはｉＥ−ＤＡＰ、ＦＫ５６５、ＭＤＰ、ムラブチドなど、ＣＬＲアゴニストとしてはベータグルカン、トレハロース６、６' −ジミコレートなどが挙げられる。アジュバントは、好ましくはＴＬＲアゴニストであり、より好ましくはＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト又はＴＬＲ９アゴニストであり、さらにより好ましくはイミキモド、レシキモド、ＭＰＬ又はＣｐＧ−ＯＤＮである。ある態様において、アジュバントは、イミキモド、ＭＰＬ又はＣｐＧ−ＯＤＮである。アジュバントとしては、ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートに導入された抗原性を有するペプチド等に応じて適宜選択されるが、例えば、ＣｐＧ ＤＮＡ等であってもよく、国際公開第２０１５／１１８７８９号に記載の、免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖とが、水素結合を介して結合し、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有するポリヌクレオチド／β−１，３−グルカン複合体であってもよい。
医薬組成物は、ヒト又は温血動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、サル等）に対し、経口及び非経口経路のいずれによっても投与可能である。非経口投与経路としては、皮下、皮内及び筋中注射、腹腔内投与、点滴、鼻粘膜や咽頭部への噴霧等が挙げられる。
医薬組成物の有効成分であるペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートの用量は、活性、治療対象となる疾患、投与対象となる動物の種類、体重、性別、年齢、疾患の重篤度、投与方法等に応じて異なる。体重６０ｋｇの成人を例に取ると、経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇであり、非経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇである。他の動物に投与する場合には、上記用量を単位体重当たりの用量に換算後、投与対象となる動物の体重を乗じて得られた用量を用いる。
本実施の形態に係る医薬組成物を、病原体感染症や癌の患者、癌や病原体感染症に罹患する可能性のある対象に投与することにより、該投与を受けた対象中の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を抗原特異的に活性化させ、該抗原特異的な抗体産生を誘導し、即ち、温血動物（好ましくは、ヒト）の防御免疫反応を誘導することにより、該感染症や癌を予防・治療することが出来る。即ち、該組成物は、上記感染症、癌等の疾患の予防又は治療のためのワクチンとして有用である。本発明において、用語「腫瘍」及び「癌」は交換可能に使用される。また、本発明において、腫瘍、悪性腫瘍、癌、悪性新生物、癌腫、肉腫等を総称して、「腫瘍」又は「癌」と表現する場合がある。また、用語「腫瘍」及び「癌」には、骨髄異型性症候群等、場合によっては前癌段階に区分される病態も含まれる。
治療の対象となる腫瘍の種類は本発明の医薬組成物に感受性が確認される腫瘍であれば特に限定されないが、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌等を含む）、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮体癌、腎癌、肝細胞癌、甲状腺癌、食道癌、骨肉腫、皮膚癌（メラノーマ等を含む）、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、頭頚部癌、睾丸腫瘍、大腸癌、血液癌（白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫等を含む）、網膜芽細胞腫、膵臓癌等が挙げられる。
本実施の形態に係る医薬組成物は、他の抗腫瘍剤と組み合わせて用いてもよい。例えば、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍性植物成分、ＢＲＭ（Biological Response Modifier：生物学的応答性制御物質）、ホルモン、ビタミン、抗腫瘍性抗体、分子標的薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤その他の抗腫瘍剤等が挙げられる。
より具体的に、アルキル化剤としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、ベンダムスチンもしくはクロラムブチル等のアルキル化剤、カルボコンもしくはチオテパ等のアジリジン系アルキル化剤、ディブロモマンニトールもしくはディブロモダルシトール等のエポキシド系アルキル化剤、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ニムスチンハイドロクロライド、ストレプトゾシン、クロロゾトシンもしくはラニムスチン等のニトロソウレア系アルキル化剤、ブスルファン、トシル酸インプロスルファン、テモゾロミド又はダカルバジン等が挙げられる。
各種代謝拮抗剤としては、例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニンもしくはチオイノシン等のプリン代謝拮抗剤、フルオロウラシル、テガフール、テガフール・ウラシル、カルモフール、ドキシフルリジン、ブロクスウリジン、シタラビン若しくはエノシタビン等のピリミジン代謝拮抗剤、メトトレキサートもしくはトリメトレキサート等の葉酸代謝拮抗剤等が挙げられる。
抗腫瘍性抗生物質としては、例えば、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ダウノルビシン、アクラルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ＴＨＰ−アドリアマイシン、４' −エピドキソルビシンもしくはエピルビシン、クロモマイシンＡ３又はアクチノマイシンＤ等が挙げられる。
抗腫瘍性植物成分及びそれらの誘導体としては、例えば、ビンデシン、ビンクリスチンもしくはビンブラスチン等のビンカアルカロイド類、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル等のタキサン類、又はエトポシドもしくはテニポシド等のエピポドフィロトキシン類が挙げられる。
ＢＲＭとしては、例えば、腫瘍壊死因子又はインドメタシン等が挙げられる。
ホルモンとしては、例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プラステロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、オキシメトロン、ナンドロロン、メテノロン、ホスフェストロール、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、メペチオスタン又はメドロキシプロゲステロン等が挙げられる。
ビタミンとしては、例えば、ビタミンＣ又はビタミンＡ等が挙げられる。
抗腫瘍性抗体、分子標的薬としては、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマム、ニモツズマブ、デノスマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アベルマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、ラムシルマブ、メシル酸イマチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、ラパチニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、コビメチニブ、パゾパニブ、パルボシクリブ、パノビノスタット、ソラフェニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、キザルチニブ、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イクサゾミブ、ミドスタウリン、ギルテリチニブ等が挙げられる。
その他の抗腫瘍剤としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、トレミフェンクエン酸塩、フルベストラント、ビカルタミド、フルタミド、ミトタン、リュープロレリン、ゴセレリン酢酸塩、カンプトテシン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセクラトン、シゾフィラン、ピシバニール、プロカルバジン、ピポブロマン、ネオカルチノスタチン、ヒドロキシウレア、ウベニメクス、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、エリブリン、トレチノイン又はクレスチン等が挙げられる。
治療の対象となる感染症の種類としては、ウイルス、真菌、細菌などの病原体による感染症が例示される。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＲＳウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、日本脳炎ウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱病ウイルスなどが例示される。細菌としては、ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、インフルエンザ菌、結核菌、肺炎球菌、ヘリコバクター・ピロリ、炭疽菌、腸チフス菌、髄膜炎菌、赤痢菌、コレラ菌などが挙げられる。真菌としては、カンジダ真菌、ヒストプラズマ真菌、クリプトコッカス真菌、アスペルギルス真菌などが例示される。これらの感染症の既存の治療薬と本発明の医薬組成物は組み合わせて用いてもよい。
本実施の形態に係る医薬組成物が、アジュバントや他の医薬と組み合わせて投与される場合、ある一定期間において、被投与対象が、両薬剤をその体内に取り込むことを意味する。両薬剤が単一製剤中に含まれた製剤が投与されてもよく、またそれぞれが別々に製剤化され、別々に投与されても良い。別々に製剤化される場合、その投与の時期は特に限定されず、同時に投与されてもよく、時間を置いて異なる時間に、又は、異なる日に、投与されても良い。それぞれ異なる時間又は日に投与される場合、その投与の順番は特に限定されない。通常、それぞれの製剤は、それぞれの投与方法に従って投与されるため、それらの投与は、同一回数となる場合もあり、異なる回数となる場合もある。また、それぞれが別々に製剤化される場合、各製剤の投与方法（投与経路）は同じであってもよく、異なる投与方法（投与経路）で投与されてもよい。また、両薬剤が同時に体内に存在する必要は無く、ある一定期間（例えば１ヶ月間、好ましくは１週間、さらに好ましくは数日間、さらにより好ましくは１日間）の間に体内に取り込まれていればよく、いずれかの投与時にもう一方の有効成分が体内から消失していてもよい。
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。なお、本実施例において、「ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）」は、ＣｐＧモチーフを含む塩基配列を有し、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合で置換されたＤＮＡ誘導体（ポリヌクレオチド誘導体の一例）を示す。実施例に記した化学構造式において、ポリヌクレオチド誘導体は、一文字塩基配列表記及び左側が５'末端側（右側が３'末端側）となるよう表記し、ペプチドはＮ末端のシステイン以外は三文字表記及び左側がＮ末端側（右側がＣ末端側）となるよう表記している。一文字塩基配列表記したポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合はすべてホスホロチオエート結合で置換されており、また末端構造は、スペーサーと結合している場合は末端ヌクレオシドの５'または３'水酸基の酸素原子までを、スペーサーと結合していない場合は末端ヌクレオシドの５'または３'水酸基（水素原子まで含む）を意味する。また、本実施例におけるＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートは、トリエチルアミン及び酢酸が付加した塩として調製される。
実施例１：ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの調製
任意の公知の方法にて合成されるアミノ基修飾ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）（５'末端に下記の式で表される構造を有するアミノ基が導入されたＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）誘導体。塩基配列：ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ（配列番号２２９：以下、「ＣｐＧ４０（Ｓ）と略称する。」）。リン酸ジエステル結合はすべてホスホロチオエート結合である。）１ｍｏｌと、スクシイミジル６−［３' −（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）３０ｍｏｌをリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で混合させた。４０℃で３時間静置させた後、ＮＡＰ−５カラムを用いてＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）を精製した。
Figure 2020067400
下記の式で表される構造を、以下「ｓｓＨアミノリンカー」と略称する。
Figure 2020067400
ＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）１ｍｏｌに対し、２５ｍｏｌの割合で、オボアルブミン（ＯＶＡ）由来の抗原性を有するペプチド（２５７〜２６４番目のアミノ酸；アミノ酸配列：ＳＩＩＮＦＥＫＬ：配列番号１９６）のＮ末側にシステインを付加したペプチド（アミノ酸配列：ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２５０：以下、「ＯＶＡｐｅｐ９」と略称する。））を、３０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）水溶液中で混合させた。４０℃で３時間静置させた後、ＨＰＬＣでＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートを分取した。ＨＰＬＣの条件はＡ液を０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ；ｐＨ ７．０）、Ｂ液をアセトニトリルとし、カラムはＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８を用いて以下のグラジェント条件で行った。
０分 Ａ：９０％ Ｂ：１０％
〜 ２５分 ７０％ ３０％
〜 ３０分 ０％ １００％
ＨＰＬＣを用いたＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）と、ＯＶＡ由来ペプチドとの反応後の溶液を分取において、検出はｄＡ４０（Ｓ）の２６０ｎｍの吸収をモニタすることにより行った。分取後のＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの溶出時間は、ＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）よりも遅れることが確認された。これは、疎水性のペプチドと結合することで溶出時間が遅くなったためと考えられる。また、分取後のクロマトグラムには未反応のＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）のピークは見られず、ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートのみのピークが検出されたことより、目的のＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲート（ＣｐＧ４０（Ｓ）−ＯＶＡｐｅｐ９コンジュゲート：構造式は下記参照）が純度高く得られたことが確認された。
Figure 2020067400
実施例２：ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートによる細胞傷害性Ｔ細胞誘導の評価
抗原としてＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートを、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス（♂、７週齢））に皮内投与した（１尾あたり２０ｎｇ、１回）。投与から１週間後、同系統のマウスのうち、投与を行っていない個体より脾細胞を取り出し、これを２つの群に分け、一方に、抗原として、オボアルブミン（卵白アルブミン、ＯＶＡ）由来の抗原性を有するペプチド（ペプチド配列；ＳＩＩＮＦＥＫＬ：配列番号１９６）を添加し、９０分静置することにより抗原保持脾細胞を作製し、ペプチドを添加していない脾細胞を抗原未保持脾細胞とした。５，６−カルボキシフルオレセインスクシイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて、抗原保持脾細胞及び抗原未保持脾細胞の両者を蛍光修飾した。このとき、ＣＦＳＥの濃度を変えることにより、抗原保持脾細胞（ＣＦＳＥ：５μＭ）の方が、抗原未保持脾細胞（ＣＦＳＥ：０．５μＭ）よりも蛍光強度が高くなるようにした。投与抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞をそれぞれ同数混合し、抗原としてＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートを投与したマウス個体に、投与から１週間後に尾静脈投与した。ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの投与量は、１尾あたりペプチド換算で２０ｎｇとした（この場合、ＣｐＧ４０（Ｓ）換算では２５０ｎｇである）。
上記の尾静脈投与から２４時間経過後に、マウスから脾細胞を取り出し、抗原保持脾細胞と抗原未保持脾細胞の割合をフローサイトメトリーで定量し、抗原保持脾細胞の減少量を評価することにより、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞の活性を評価した。フローサイトメトリーの測定結果を図１（図１（ｂ））に示す。比較のために、ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの代わりに、対照群としてＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を投与したマウス個体（図１（ａ））、抗原性を有するペプチドとＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）を個別に投与したマウス個体を用いて同様の条件で行った測定結果を併せて図１（図１（ｃ））に示す。
図１（ａ）に示すように、ＰＢＳを投与したマウス個体から採取した脾細胞には、抗原保持脾細胞と未保持脾細胞の割合が同数含まれていたが、図１（ｂ）に示すように、ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートを投与したマウス個体から採取された脾細胞からは、抗原保持脾細胞の約９５％が消失していた。このことよりＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの投与により、ペプチド抗原に特異的な免疫応答が誘導されていることが分かる。また、図１（ｃ）との比較より、その効果は、抗原性を有するペプチドとＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）を個別に投与したマウス個体よりも高いことが分かる。
実施例３：ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの投与量依存性
ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの投与量を変えてマウスに免疫し、実施例２と同様に、投与抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞をそれぞれ同数混合したものを尾静脈投与したマウス個体から採取した脾細胞中の、抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞の割合をフローサイトメトリーで定量し、抗原保持脾細胞の減少量を評価することにより、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞の活性を評価した。
フローサイトメトリーの測定結果を図２に示す。ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの投与量をペプチド換算で２０ｎｇより低減させると、徐々にその効果がなくなっていることが分かる。一般的なペプチド免疫では数μｇの投与量を必要とするが、実施例１で作製したＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートでは、その投与量を１００分の１〜１０００分の１に減少させることに成功した。
実施例４：ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートに含まれるＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）の塩基長及び塩基配列依存性
ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートに含まれるＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）として、実施例１で用いた塩基長４０のもの（塩基配列：ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ（配列番号２２９：以下、「ＣｐＧ４０（Ｓ）」と略称する。））以外に、塩基長３０のもの（塩基配列：ＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ（配列番号２２７：以下、「ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ」と略称する。）のもの及び塩基配列：ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ（配列番号２２８：以下、「ＣｐＧ３０（Ｓ）ｂ」と略称する。）のもの）、塩基長２４のもの（塩基配列：ＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ（配列番号２２５：以下、「ＣｐＧ２４（Ｓ）」と略称する。）のもの）及び塩基長２０のもの（配列番号２２２：塩基配列：ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ（以下、「ＣｐＧ２０（Ｓ）ａ」と略称する。）のもの及び塩基配列：ＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ（配列番号２２３：以下、「ＣｐＧ２０（Ｓ）ｂ」と略称する。）のもの）に変えて（構造式は下記参照）、それぞれ、実施例１と同様の方法でＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートを作製した（構造式、塩基配列については、下式及び下記表９参照。表９において、太字で下線を付した塩基配列はＣｐＧモチーフである。リン酸ジエステル結合はすべてホスホロチオエート結合である。）。
Figure 2020067400
Figure 2020067400
Figure 2020067400
Figure 2020067400
Figure 2020067400
Figure 2020067400
ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）の塩基長の異なるＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲート（ペプチド換算で１尾あたり２０ｎｇ）を用いてマウス個体を免疫し、実施例２と同様にマウス個体に尾静脈投与した抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞の割合をフローサイトメトリーで定量し、抗原保持脾細胞の減少量を評価することにより、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞の活性を評価した。
フローサイトメトリーの測定結果を図３、４に示す。ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）の塩基長を３０まで短くしても、抗原保持脾細胞が完全に消失していることが分かった。ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）の塩基長を２０まで減少させた場合、ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）に含まれるＣｐＧモチーフの数が１つだけの場合、抗原保持脾細胞の減少は見られないが、ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）に含まれるＣｐＧモチーフの数が２つの場合、抗原保持脾細胞の減少が観測され、ペプチド特異的な細胞障害性Ｔ細胞の活性が誘導されていることが分かる。
実施例５：ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートに含まれるペプチドのアミノ酸長依存性
実施例１で調製したＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートにおいて、抗原性を有するペプチドをＮ末端側に延長し、アミノ酸長１８（アミノ酸配列：ＣＥＶＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２５１：以下、「ＯＶＡｐｅｐ１８」と略称する。））、アミノ酸長２７（アミノ酸配列：ＣＭＳＭＬＶＬＬＰＤＥＶＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２５２：以下、「ＯＶＡｐｅｐ２７」と略称する。））としたペプチドを用いてＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートを調製し（構造式は下記参照）、これ（ペプチド換算で１尾あたり２０ｎｇ）を用いてマウス個体を免疫し、実施例２と同様にマウス個体に尾静脈投与した抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞の割合をフローサイトメトリーで定量し、抗原保持脾細胞の減少量を評価することにより、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞の活性を評価した。
Figure 2020067400
Figure 2020067400
フローサイトメトリーの測定結果を図５に示す。抗原性を有するペプチドのアミノ酸長を、１８又は２７まで延長すると、ペプチド特異的な細胞障害性Ｔ細胞の活性が低下する傾向があることが分かる。
実施例６：ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートのスペーサーの構造及びペプチドの結合位置に対する依存性
実施例１で調製したＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートにおいて、ｓｓＨアミノリンカーを下記の構造（以下、「Ｃ６アミノリンカー」と略称する。）に変更したＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲート（以下、化合物（Ｉ）とする）、ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）とｓｓＨアミノリンカーとの間にＰＥＧを有するＣ１８スペーサーを挿入したＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲート、ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）の５'側ではなく３'末端に化合物（Ｉ）と同じスペーサー構造を介して抗原性を有するペプチドが共有結合したＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートを用いて、実施例２と同様の手順により、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞の活性を評価した。その結果、いずれの場合においても、実施例１で調製したＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートと同程度の強いペプチド特異的な細胞障害性Ｔ細胞の活性が誘導されていることが確認された。
Figure 2020067400
Figure 2020067400
Figure 2020067400
Figure 2020067400
実施例７：腹腔マクロファージにおける抗原提示量の評価
マウスより採取した腹腔マクロファージを４８ウェルプレートに取り（１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ウェル）、アミノ酸長の異なる抗原性を有するペプチド（ＯＶＡｐｅｐ９、ＯＶＡｐｅｐ１８、ＯＶＡｐｅｐ２７）及び塩基長の異なるＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）（ＣｐＧ４０（Ｓ）、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ、ＣｐＧ３０（Ｓ）ｂ、ＣｐＧ２０（Ｓ）ａ）を用いて調製したＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートをペプチド換算２μｇ／ｍＬでウェルに添加し、２４時間培養した。培養後、ＯＶＡｐｅｐ８とＭＨＣの分子複合体に特異的な抗体（フィコエリスリン（ＰＥ）で蛍光標識：（以下、「PE labelled H-2Kb/FIINFEKL」と略称する。））を添加し、フローサイトメトリーで抗体が結合した腹腔マクロファージの定量を行い、抗原提示量の評価を行った。
フローサイトメトリーの測定結果を図６及び７に示す。これらの結果より、ＣｐＧ ＤＮＡ（Ｓ）の塩基長が抗原提示量に及ぼす影響は殆どないこと、抗原性を有するペプチドのアミノ酸長が長くなり１８又は２７になると、抗原提示量が減少する傾向があることが確認された。また、図７に「ＣｐＧ４０（Ｓ）−ＰＥＧ−ＯＶＡｐｅｐ９」で示した、スペーサーにポリオキシエチレン基を有するＣｐＧ４０（Ｓ）−ＯＶＡｐｅｐ９コンジュゲートにおいて、スペーサーへのポリオキシエチレン基が抗原提示量に殆ど影響を及ぼさないことが確認された。

Claims (16)

  1. ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、抗原性を有するペプチドが、一端側で前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で前記抗原性を有するペプチドと共有結合したスペーサーを介して結合したポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを有効成分として含む免疫誘導剤。
  2. 前記抗原性を有するペプチドのアミノ酸長が５以上３０以下であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫誘導剤。
  3. 前記抗原性を有するペプチドのアミノ酸長が８以上１１以下であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の免疫誘導剤。
  4. 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はＤＮＡ誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
  5. 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の塩基長が１５以上４０以下であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
  6. 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の塩基長が２０以上３０以下であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
  7. 前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
  8. 前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート結合で置換されていることを特徴とする請求項７に記載の免疫誘導剤。
  9. 前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されていることを特徴とする請求項７又は８に記載の免疫誘導剤。
  10. 前記スペーサーと前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合及び前記スペーサーと前記抗原性を有するペプチドとの間の共有結合との一方又は双方が生体環境中で切断可能な共有結合であることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
  11. 前記ポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを構成する前記抗原性を有するペプチドと、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体に結合した前記スペーサーとが、前記抗原性を有するペプチドのＮ末端のシステイン残基のチオール基と前記スペーサーの有するチオール基との反応により生成した共有結合（ジスルフィド結合）を介して結合していることを特徴とする請求項１０に記載の免疫誘導剤。
  12. 前記スペーサーが、下記の式で表される繰り返し単位を含むことを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
    Figure 2020067400
     上記の式において、
    Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を表し（ここで各Ｘは同じであっても異なっていてもよい）、
    Ｒは、（ＣＨ2）pＯ、（ＣＨ2）qＮＨ、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mのいずれかを表し（ｍ、ｐ及びｑは、それぞれ独立して１０以下の自然数を表す。）、
    ｎは、１０以下の自然数を表す。
  13. 前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有することを特徴とする請求項１から１２のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
    Figure 2020067400
  14. アジュバントとして、免疫賦活活性を有する物質をさらに含むことを特徴とする請求項１から１３のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
  15. 請求項１から１４のいずれか１項に記載の免疫誘導剤を含む医薬組成物。
  16. 請求項１から１４のいずれか１項に記載の免疫誘導剤を含む腫瘍治療のための医薬組成物。
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