JPWO2020040286A1 - 副交感神経細胞の作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
下記実施例において使用した試薬情報(試薬名、製品番号、製造元、略称など)は下記の通りである。
・mTeSR1-cGMP (Stemcell Technologies: ST-85850G) - mTeSR1
・DMEM/Ham's F-12 (和光: 048-29785)
・DMEM (high-glucose) (和光: 043-30085) - DMEM
・Opti-MEM (Life Technologies: 31985-070)
・Fetal Bovine Serum (オーストラリア産) (和光: SFBS) - FBS
・Knockout Serum Replacement (Life Technologies: 10828-028) - KSR
・N2 supplement with transferrin (Apo) (和光: 141-09041) - N2 supplement
・MEM non-essential amino acids solution (和光: 139-15651) - NEAA
・Monothioglycerol solution (和光: 195-15791)
・Penicillin-streptomycin solution (和光: 168-23191) - P/S
・Brain Derived Neurotrophic Factor, Human, recombinant (和光: 020-12913) - BDNF
・Glial-cell Derived Neurotrophil Factor, Human, recombinant (和光: 075-04153) - GDNF
・Nerve Growth Factor-β, Human, recombinant (和光: 141-07601) - NGF
・Neurotrophin-3, Human, recombinant (和光: 141-06643) - NT-3
・L-アスコルビン酸エステルマグネシウム塩n水和物 (和光: 01319641) - Ascorbic Acid
・Y-27632 (和光: 253-00513)
・Forskolin (和光: 067-02191) - FSK
・Dorsomorphin (Simga-Aldrich: P5499-5MG) - DM
・SB431542 hydrate (Sigma-Aldrich: S4317-5MG) - SB
・CHIR99021 (Cayman Chemical Company: 13122) - CHIR
・IWR-1 (Sigma-Aldrich: I0161-5MG)
・SANT-1 (Sigma-Aldrich: S4572-5MG)
・骨形成因子4(truncated)、ヒト、組換え体 (和光: 022-17071) - BMP4線維芽細胞成長因子(塩基性)(basic FGF)、ヒト、組換え体 (和光: 064-04541) - bFGF
・iMatrix-511 (ニッピ: 892002)
・MPC polymer (日油: Lipidure CM5206E)
・Poly-L-ornithine hydrobromide (Sigma-Aldrich: P3655-10MG) - PLO
・Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement
・membrane (Sigma-Aldrich: L2020-1MG) - Laminin
・Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (和光: 162-23591) - PMA
・Reitonic acid (Sigma-Aldrich: R2625-50MG) - RA
・Accutase (Life Technologies: A11105-01)
・TrypLE express (Life Technologies: 12604-013)
・Ultrapure distilled water (Life Technologies: 10977-015) - DW
・D-PBS(-) (和光: 045-29795) - PBS
・Tris Buffer Powder, pH7.4 (タカラバイオ: T9153)
・塩酸 (和光: 080-01066)
・Albumin, from Bovine Serum (和光: 017-23294) - BSA
・ジメチルスルホキシド (和光: 074-29353) - DMSO
・ホルムアルデヒド液 (和光: 064-00406)
・10w/v%ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート溶液 (和光: 161-24801) - Tween-20
・ブロックエース粉末 (DSファーマバイオメディカル: UKB80)
・Can Get Signal(登録商標) Immunostain Solution A (東洋紡: NKB-501)
・Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody (rabbit polyclonal) (Merck Millipore: AB152)
・Anti-Choline Acetyltransferase antibody (rabbit polyclonal) (abcam: ab68779)
・Anti-PHOX2B antibody (mouse monoclonal) (proteintech: 66254-1-lg)
・Anti-PHOX2B antibody (rabbit monoclonal) (abcam: ab183741)
・Anti-MAP2 antibody (mouse monoclonal) (abcam: ab11267)
・Hoechst 33342 solution (同仁化学: 346-07951)
・F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor(登録商標) 488 conjugate (Life Technologies: A11017) - Alexa Fluor488
・F(ab')2-Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor(登録商標) 555 conjugate (Life Technologies: A21430) - Alexa Fluor555
・fluo-4/AM (Invitrogen :F14201, 50 μg×10本)
・(-)-Nicotine (Sigma-Aldrich: N3876-5ML)
(i) ヒト幹細胞(hES)培地
20% KSR、1% NEAA、1% Monothioglycerol solution、および1% P/Sを含有するDMEM/Ham’s F-12を、ヒト幹細胞用培地(hESM)として用いた。
(ii)N2培地
1% N2 supplement、1% NEAA、および1% P/Sを含有するDMEM/Ham’s F-12を、N2培地として用いた。
・FSK stock solutionは、DMSOを用いて10 mM stock solutionとして調製した。
・DM stock solutionは、DMSOを用いて1 mM stock solutionとして調製した。
・SB stock solutionは、DMSOを用いて10 mM stock solutionとして調製した。
・CHIR stock solutionは、DMSOを用いて3 mM stock solutionとして調製した。
・IWR-1 stock solutionは、DMSOを用いて10 mM stock solutionとして調製した。
・SANT-1 stock solutionは、DMSOを用いて250 μM stock solutionとして調製した。
・BMP4 stock solutionは、0.1% BSAを添加した4 mM塩酸溶液を用いて100 μg/ml stock solutionとして調製した。
・bFGF stock solutionは、1mM Tris buffer (pH 7.4)で500 μg/mlに調整後、DMEMを用いて10 μg/ml stock solutionとして調製した。
・BDNF、GDNF、NGF、および、NT-3 stock solutionは、PBSを用いて10 μg/ml stock solutionとして調製した。
・Ascorbic Acid stock solutionは、PBSを用いて50 mg/ml stock solutionとして調製した。
・Y-27632 stock solutionは、Opti-MEMを用いて10 mM stock solutionとして調製した。
・PLO stock solutionは、DWを用いて1 mg/ml stock solutionとして調製した。
・PMA stock solutionは、DMSOを用いて10 μg/ml stock solutionとして調製した。
・RA stock solutionは、DMSOを用いて1 mM stock solutionとして調製した。
(1-1. iPS細胞の培養)
ヒトiPS細胞(201B7株)は、理化学研究所バイオリソースセンターより入手した。6-well plateの各ウェルにPBSを1.5 ml加え、さらにiMatrix-511(ニッピ:892002)を0.5 μg/cm2で加えて1時間コーティング処理を行った。その後、各ウェルから溶液を除去して、mTeSR1を2 ml添加し、さらにY-27632 stock solutionを最終濃度10 μMとなるように加えた。iPS細胞を、4×104〜1×105細胞/ウェル(4×102〜1×104細胞/cm2)で播種し、播種した翌日以降はY-27632を含まないmTeSR1により毎日培地交換しながら培養を継続した。
(i) iPS細胞の事前調整
MPC polymerを6-well plateの各ウェルに加え(〜300 μl)、クリーンベンチ内で1時間乾燥させることにより、ウェル表面を非接着性処理した。PBSにより各ウェルを洗浄後、10 μMのY-27632を含有するmTeSR1を2 ml加え、iPS細胞を1×106細胞/ウェルで播種した。その後、10 μMのY-27632を含有するmTeSR1により毎日培地交換しながら、細胞塊が形成されるまで2〜3日間培養した。
以下の工程1〜3により、iPS細胞を神経堤細胞へと分化させ、さらに、以下の工程4および5の事前調整処理により、細胞内シグナルを調整した自律神経前駆細胞を得た。
工程1: 最終濃度2 μMのDM、10 μMのSB、および10 ng/mlのbFGFを含有するhESMに交換し、2日間培養した。
工程2: 最終濃度3 μMのCHIR、20 μMのSB、および10 ng/mlのbFGFを含有するhESMに交換し、3日間培養した。
工程3: 最終濃度3 μMのCHIR、および10 ng/mlのbFGFを含有するhESM:N2(3:1)混合培地に交換し、2日間培養した。
工程4: 最終濃度10 μMのIWR-1、250 nMのSANT-1、25 ng/mlのBMP4、および10 ng/mlのbFGFを含有するhESM:N2(1:1)混合培地に交換し、2日間培養した。
工程5: 最終濃度10 μMのIWR-1、250 nMのSANT-1、25 ng/mlのBMP4、および10 ng/mlのbFGFを含有するhESM:N2(1:3)混合培地に交換し、3日間培養し、新しい同培地に交換し、さらに1日間培養した。
以下の手順により、ポリ-L-オルニチンおよびラミニンによりコートされた24-well plateを準備した。DWで調製したPLO溶液(20 μg/ml)により1時間コーティングした後、DWで1回洗浄し、PBSで調製したラミニン溶液(5 μg/ml)により2時間コーティングした。次にN2培地に、FSK(最終濃度10 μM)、BDNF(最終濃度10 ng/ml)、GDNF(最終濃度10 ng/ml)、NT-3(最終濃度10 ng/ml)、NGF(最終濃度10 ng/ml)、およびAscrobic Acid(最終濃度50 μg/ml)を添加して、neural differentiation medium(NDM)を調製した。
分化誘導培地1: NDM + PMA (最終濃度10 ng/ml)
分化誘導培地2: NDM + RA (最終濃度1 μM)
分化誘導培地3: NDM + PMA (最終濃度10 ng/ml) + RA (最終濃度1 μM)
分化誘導培地4: NDMのみ (従来方法)
培養物をPBSで洗浄後、3.7%ホルムアルデヒド/PBS溶液で20分間固定した。その後、PBSで洗浄し、0.2% Tween-20/PBS溶液を加え、5分間インキュベートした。その後、0.2% Tween-20/PBS溶液を除去し、4%ブロックエース/0.2% Tween-20/PBS溶液を加え、30分間ブロッキングした。その後、0.2% Tween-20/PBSにより1回洗浄し、一次抗体/Can Get Signal Solution A(TOYOBO)を加え、4℃で一晩静置した。使用した一次抗体を以下に示す。
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) antibody: 1/200倍希釈
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) antibody: 1/500倍希釈
Anti-PHOX2B (mouse monoclonal) antibody: 1/100倍希釈
Anti-PHOX2B (rabbit monoclonal) antibody: 1/100倍希釈
Anti-MAP2 (mouse monoclonal) antibody: 1/500倍希釈
さらに、細胞内カルシウムイメージングにより、分化誘導培地3(NDM + PMA + RA)で培養することにより得られた副交感神経細胞について、ニコチン刺激に対する応答性を評価した。1 mg/mlのfluo-4-AM (Invitrogen, F14201)/DMSOを、最終濃度5 μg/mlとなるように分化誘導培養24日目の培地に直接加えた。インキュベーター(37℃、5% CO2)内で30分間静置後、培地を除去し、リンガー液(149 mM NaCl、2.8 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10m M HEPES、10 mM D-(+)-glucose (pH7.4))に置換した後、蛍光強度変化を検出することにより細胞内カルシウム濃度変化を測定した。測定にはオリンパス顕微鏡(IX81)、EM-CCD (Andor iXon+)、Metamorphソフトウェア(Molecular Devices)を用い、フレームレート2 fpsで300フレームの撮影を行った。また、ニコチン刺激は、最終濃度1 μMになるようにニコチンをリンガー液に添加することにより行った。測定後のデータ解析にはImageJを用いた。
Claims (12)
- 神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞から副交感神経細胞を作製する方法であって、
(a)前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞を、cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、ビタミンC、プロテインキナーゼC活性化剤、およびレチノイン酸受容体アゴニストの存在下で培養するステップ
を含む方法。 - 前記プロテインキナーゼC活性化剤が、ホルボールエステルまたはインゲノールエステルである、請求項1に記載の方法。
- 前記レチノイン酸受容体アゴニストが、レチノイン酸、タミバロテン、またはCh55である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記プロテインキナーゼC活性化剤が、ホルボール12-ミリスタート13-アセタートであり、前記レチノイン酸受容体アゴニストが、オールトランスレチノイン酸である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- (b)前記ステップ(a)の前に、前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞を、BMPシグナル経路活性化剤、SHHシグナル経路阻害剤、およびWntシグナル経路阻害剤の存在下で培養するステップ
をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記BMPシグナル経路活性化剤が、BMP2、BMP4、BMP7、またはBMP2/4であり、前記SHHシグナル経路阻害剤が、SANT-1、SANT-2、JK184、またはジェルビンであり、前記Wntシグナル経路阻害剤が、IWR-1、XAV939、またはIWP-2である、請求項5に記載の方法。
- 前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞が、2×105〜5×105細胞/cm2の濃度で播種される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞が、ヒト由来である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞が、多能性幹細胞から分化誘導されたものである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法により得られた副交感神経細胞。
- 前記副交感神経細胞が、PHOX2B、CHAT、およびMAP2を発現している、請求項10に記載の副交感神経細胞。
- cAMP産生促進剤、BDNFシグナル経路活性化剤、GDNFシグナル経路活性化剤、NGFシグナル経路活性化剤、NT-3シグナル経路活性化剤、ビタミンC、プロテインキナーゼC活性化剤、およびレチノイン酸受容体アゴニストを含んでなる、神経堤細胞またはそれに由来する自律神経前駆細胞から副交感神経細胞を作製するためのキット。
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