JPWO2020040272A1 - mRNA送達用キャリアおよびこれを含む組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)非電荷親水性ポリマーブロック(例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール)とアミノ基の一部または全部が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるよう修飾された−(CH2)n−NH2{nは、2〜5の自然数}を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体とmRNAとのポリプレックスミセル。
(2)−(CH2)n−NH2{nは、2〜5の自然数}を側鎖に有するアミノ酸が、オルニチン若しくはリジンまたはその両方である、上記(1)に記載のmRNAとのポリプレックスミセル。
(3)共重合体が、側鎖のアミノ基の10〜40%が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるよう修飾された共重合体である、上記(1)または(2)に記載のポリプレックスミセル。
(4)共重合体が、側鎖のアミノ基の20〜30%が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるよう修飾された共重合体である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のポリプレックスミセル。
(5)前記メルカプトプロリル基同士が共重合体間でジスルフィド結合によって架橋されている、上記(1)〜(4)のいずれかに記載のポリプレックスミセル。
(6)上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリプレックスミセルと薬学上許容可能な賦形剤を含む、組成物。
(7)mRNAの体内への送達用ポリプレックスミセルを調製することに用いるための、ポリエチレングリコールとリジンおよび/またはオルニチン側鎖のアミノ基の一部または全部が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるように修飾されたポリリジンおよび/またはポリオルニチンとの共重合体を含む、組成物。
ある態様では、ポリエチレングリコール(PEG)ブロックは、重量平均分子量(Mw)において、例えば、1kDa〜20kDa、例えば、1.5kDa〜15kDaのPEGであり得る。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、オキサゾリン、例えば、エチルオキサゾリンおよびプロピルオキサゾリンからなる群から選択される1種以上のオキサゾリンを単量体単位として含む重合体であり得る。この態様では、ポリオキサゾリンブロックは、重量平均分子量(Mw)において、例えば、1kDa〜50kDa、例えば、5kDa〜40kDa、例えば、10kDa〜30kDaであり得る。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、ポリエチルオキサゾリンブロックを含む。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、ポリプロピルオキサゾリンブロックを含む。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、ポリエチルオキサゾリンブロックとポリプロピルオキサゾリンブロックとを含む。
PEGは、1kDa〜20kDaの重量平均分子量を有し、
ペプチドは、例えば、60〜90の重合度を有し、
単量体単位の10%〜40%が、1−アミジン−3−メルカプトプロリル基により置換されている、
ポリプレックスミセルであり得る。
mは、5〜20,000のいずれかの自然数であり得、
pは、10〜100のいずれかの自然数であり得、50〜100のいずれかの自然数であり得、または60〜90のいずれかの自然数であり得、
nは、2〜5のいずれかの自然数であり得、
y/(x+y)は、0.01〜1、0.1〜0.5、0.15〜0.45、0.2〜0.4、0.15〜0.3、0.1〜0.4、または0.2〜0.3であり得、x+yは、pである。}で示される化合物であり得る。本発明では、このような化合物も提供される。本発明では、このような化合物とmRNAとを含むポリプレックスミセル、およびこれを含む組成物が提供される。
本発明によれば、非電荷親水性ポリマーブロック(例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール)とアミノ基の一部または全部が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるよう修飾された−(CH2)n−NH2{nは、2〜5の自然数}を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体の、mRNAを含むポリプレックスミセルを含む組成物の調製における使用が提供される。
ポリエチレングリコールとアミノ基の一部または全部が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるよう修飾された−(CH2)n−NH2{nは、2〜5の自然数}を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、前記mRNAとのポリプレックスミセルを、細胞と接触させることを含む、方法が提供される。
非電荷親水性ポリマーブロック(例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール)とアミノ基の一部または全部が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるよう修飾された−(CH2)n−NH2{nは、2〜5の自然数}を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、前記mRNAとのポリプレックスミセルを、細胞と接触させることを含む、方法が提供される。
非電荷親水性ポリマーブロック(例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール)とアミノ基の一部または全部が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるよう修飾された−(CH2)n−NH2{nは、2〜5の自然数}を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、前記mRNAとのポリプレックスミセルを、当該対象に投与することを含む、方法が提供される。
ポリエチレングリコールとアミノ基の一部または全部が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるよう修飾された−(CH2)n−NH2{nは、2〜5の自然数}を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、当該タンパク質をコードするmRNAとのポリプレックスミセルを、当該対象に投与することを含む、方法が提供される。
本実施例では、以下式(I)で表される化合物:
以下式(II)で表される化合物:
ポリプレックスミセル(PM)は、各共重合体とmRNAとを混合して調製した。混合は、N/P比が2となるように行った{ここで、Nは、共重合体中のアミノ基およびアミジン基の数の合計であり、Pは、mRNA中のリン酸基の数である}。これにより、内包されるmRNAと共重合体のチャージ比を異なる共重合体を用いたPM間で一定とした。
培養細胞におけるタンパク質発現の誘導機能についてPMを評価した。PMに内包させるmRNAとしては、分泌型ルシフェラーゼであるガウシアルシフェラーゼ(GLuc)をコードするmRNAを用いた。また、培養細胞としては、ヒト肝細胞がん細胞株(HuH−7)を用いた。培養細胞へのPMの導入では、HuH−7細胞を12 wellプレートに50,000個/well蒔き、10% FBS, 1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む培地で24時間培養した。その後、培地を新しいものに交換し、GLuc mRNAを0.5 μg/well含むミセルを添加した。その後、培地を10 μLずつ採取し、GloMax(商標) 96 Microplate Luminometer (Promega Co., Madison, WI) とthe Renilla Luciferase Assay System (Promega Co., Madison, WI)を用い、培地に含まれるGLucの量を測定した。
本実施例では、類似する構造を有する異なる共重合体によるPMに内包されたmRNAの安定性を評価した。具体的には、Christie R. James el at., Biomacromolecules 2011, 12, 3174−3185において、siRNAの安定化に適するとされたPEG−PLys(IM)のPMに内包されたmRNAの安定性を、実施例1〜3で試験したPEG−PLys(AMP)のPMと比較した。
また、図9には、重合度20のPLysブロックを有するポリマーで同様の実験を行った場合においても、PEG−PLys(IM)(単に「IM」と表記することがある)では、mRNAの保護能力を消失させたのに対して、PEG−PLys(AMP)では、mRNAの高い保護能力を獲得した。
これまでに報告した方法[J Drug Target. 2019;27(5−6):670−680]に従い、チオール化の程度が異なる一連のPEtOx−PnPrOx−PLy(AMP−X)ポリマーを、ホモ二官能性イミドエステル系のチオール化試薬であるDTBP(Thermo Scientific, Rockford, IL)を用いてPLysセグメントの側鎖ω−NH2基および主鎖ω−NH2基に1−アミジン−3−メルカプトプロピル(AMP)を導入して合成した。簡単に述べると、PEtOx−PnPrOx−PLys(10mg、0.35μmol)を、室温で10分間撹拌しながら、100mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)に溶解した。その後、100 mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH 9.0)に新たに溶解したDTBP(3.1 mg、10.0 μmol)を、室温で1時間恒常的に攪拌しながらPEtOx−PnPrOx−PLys溶液に滴下した。その後、ポリマー溶液をPBS緩衝液(pH7.4)に対して2時間以内に4回透析し、未反応のDTBPを除去した。透析溶液中のポリマーを室温で1時間DTT(100mM)処理して、ポリマー内および/またはポリマー間の予め形成されたジスルフィド架橋を切断し、隣接するAMP基にチオールを含むポリマーを生じた(以下、「PEtOx−PnPrOx−PLy(AMP)」という)。PEtOx−PnPrOx−PLys(AMP)をPBS緩衝液(pH7.4)に対して3時間以内に4回透析してDTTを除去し、最後に脱イオン水に対して3時間以内に6回透析してPBSを除去した。ポリマー溶液を濾過し(0.22μmフィルター)、凍結乾燥して粉末として得た。1H NMRスペクトルから、AMP基のメルカプトエチルプロトン[HS−(CH2)2、= 2.7〜2.9ppm]に対するリジン単位[(CH2)3、= 1.3〜1.9ppm]のβ−、γ−、およびδ−メチレンプロトンのピーク強度比を計算して、AMP導入の程度を20%と決定した。反応中のPLysの−NH2基に対するDTBPの供給比の様々な化学量論を変えることにより、様々な段階的な程度のAMP導入が生じた。PEtOx−PnPrOx−PLysのPLysセグメントの総−NH2基にAMP導入度がX%のPEtOx−PnPrOx−PLys(AMP−X)ポリマーは、PEtOx−PnPrOx−PLys(AMP−X)と略記された。
PEtOx−PnPrOx−PLysおよびPEtOx−PnPrOx−PLys(AMP−X)ポリマーを10mM HEPES緩衝液(pH7.3)に別々に溶解した。mRNAも10mM HEPES緩衝液(pH7.3)に別々に溶解した。
非架橋PM(非CPM)は、1単位体積のPEtOx−PnPrOx−Plys溶液を2単位体積のmRNA溶液に高速ボルテックス混合することにより、ブロック共重合体(N)の[mRNA(P)のリン酸基](N/P)に対する[アミノ基およびアミジン基]の残留モル比を2として調製した。
架橋PMは、PEtOx−PnPrOx−PLys(AMP−X)ポリマーから調製した。簡潔に述べると、PEtOx−PnPrOx−PLys(AMP−X)ポリマーを10mM DTTを含む10mM HEPES緩衝液(pH7.3)で処理し、ポリマー内の望ましくないジスルフィド架橋を切断してmRNAとの複合体形成前にチオール基を誘導化するために、少なくとも30分間室温でインキュベートした。PMは、N/P比2でDTTなしで10mM HEPES緩衝液(pH7.3)中のmRNA溶液中へのDTT前処理AMP−Xポリマー溶液の高速ボルテックス混合により調製した。この条件では、チオール基はポリマー間のジスルフィド架橋を形成していない。PMを4℃で4時間インキュベートし、続いてDMSO(5%v/v)で4℃で1日間インキュベートした。添加されたDMSOはチオール基の穏和な酸化剤であり、PEtOx−PnPrOx−PLys(AMP−X)ポリマーのリジン残基間のジスルフィド架橋の形成を促進する。
GLuc mRNAを積載したAMP−Xの非CPMおよびCPMを、150mM NaClを含む10mM HEPES緩衝液200μL中の40μgのmRNAの用量で、マウスに別々に尾静脈を介して静脈内注射した。血流内のPMの保護mRNAの量は、RNeasy Mini Preparation Kit(Qiagen,Hilden,Germany)を用いて製造のガイドラインに従って抽出した。要するに、注射後の測定時点(2.5、5および10分)で、尾静脈切断から2μLの血液を取り出し、直ちに、100mM DTTおよびβ―メルカプトエタノール(最終濃度1%)、RLT溶液(RNeasy Mini Preparation Kitから)(350μL)を補充した緩衝液に移し、直ちに液体窒素で凍結した。凍結したサンプルを37℃で1時間インキュベートした。この間に、DTTは、mRNAを効果的に抽出するために、CPMのコア内のジスルフィド架橋の減少を促進すると予想される。非CPMもCPMと同様にDTTおよびRLT混合物による処理を受けた。インキュベーション後、mRNAを、製造業者のプロトコルに記載されたさらなる工程に従うことにより抽出した。抽出したmRNAを逆転写し、ReverTra Ace(商標)qPCRRTキット(Toyobo Life Sciences、大阪、日本)を用いて相補的DNA(cDNA)を形成した。cDNAを、ABI Prism 7500 Sequence Detector(Applied Biosystems, Foster City, CA)およびGLuc mRNAの204bp配列を増幅するGLuc特異的プライマー対(フォワードプライマー:GGAGGTGCTCAAAGAGATGG、及びリバースプライマー:TTGAACCCAGGAATCTCAGG)を用いた定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)のために使用した。
Claims (7)
- 非電荷親水性ポリマーブロックとアミノ基の一部または全部が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるよう修飾された−(CH2)n−NH2{nは、2〜5の自然数}を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体とmRNAとのポリプレックスミセル。
- −(CH2)n−NH2{nは、2〜5の自然数}を側鎖に有するアミノ酸が、オルニチン若しくはリジンまたはその両方である、請求項1に記載のmRNAとのポリプレックスミセル。
- 共重合体が、側鎖のアミノ基の10〜40%が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるよう修飾された共重合体である、請求項1または2に記載のポリプレックスミセル。
- 共重合体が、側鎖のアミノ基の20〜30%が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるよう修飾された共重合体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリプレックスミセル。
- 前記メルカプトプロリル基同士がジスルフィド結合によって架橋されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリプレックスミセル。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリプレックスミセルと薬学上許容可能な賦形剤を含む、組成物。
- mRNAの体内への送達用ポリプレックスミセルを調製することに用いるための、非電荷親水性ポリマーブロックとリジンおよび/またはオルニチン側鎖のアミノ基の一部または全部が1−アミジン−3−メルカプトプロリル基となるように修飾されたポリリジンおよび/またはポリオルニチンとの共重合体を含む、組成物。
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