JPWO2020037290A5 - - Google Patents
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Description
追加の実施形態は、以下の番号付きの項に従い得る。
１．
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
２．
ｃ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第３の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、項１に記載の混合物。
３．
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｃ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
４．
ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｅ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、項２に記載の混合物。
５．第３のオリゴヌクレオチドにおける標的バリアントヌクレオチドが、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、項２または４に記載の混合物。
６．第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、項２、４、および５のいずれか一項に記載の混合物。
７．検出可能な標識が、蛍光標識である、項６に記載の混合物。
８．検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、項６または７に記載の混合物。
９．第３のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、項６～８のいずれか一項に記載の混合物。
１０．消光部分が、第３のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、項９に記載の混合物。
１１．消光部分が、検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、項９または１０に記載の混合物。
１２．第１の末端ヌクレオチドが、５’末端ヌクレオチドである、項１０に記載の混合物。
１３．第２の末端ヌクレオチドが、３’末端ヌクレオチドである、項１０に記載の混合物。
１４．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、項２または４に記載の混合物。
１５．配列Ａ、Ｅ、およびＣが、第１の標的ポリヌクレオチド鎖上の一本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、項４に記載の混合物。
１６．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、項２または４に記載の混合物。
１７．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、配列ＤおよびＢが、標的相補体ポリヌクレオチド鎖上の二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置し、配列Ａ、Ｅ、およびＣが、標的ポリヌクレオチド鎖上の二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、項４に記載の混合物。
１８．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、二本鎖ポリヌクレオチド分子が、バリアントポリヌクレオチド鎖およびバリアント相補体ポリヌクレオチド鎖を含み、バリアントポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド鎖と実質的に同一であり、標的ポリヌクレオチド鎖とは標的バリアントヌクレオチドで異なるヌクレオチドを含み、バリアント相補体ポリヌクレオチド鎖が、バリアントポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、項２または４に記載の混合物。
１９．第３のオリゴヌクレオチドが、第１の配列の３～６つの連続するヌクレオチドを含む、項２または４に記載の混合物。
２０．第３のオリゴヌクレオチドが、第１の配列のヌクレオチドの配列と重複しない第１の標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの配列をさらに含む、項２または４に記載の混合物。
２１．混合物が、第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２２．混合物が、検出可能な標識を含む第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２３．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２４．混合物が、検出可能な標識および第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する配列を有する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２５．第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識および標的ポリヌクレオチド鎖の配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する混合物における唯一のオリゴヌクレオチドである、項２または４に記載の混合物。
２６．混合物が、３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化カリウムをさらに含む、項２または４に記載の混合物。
２７．塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭである、項２６に記載の混合物。
２８．塩化カリウムの濃度が、７０ｍＭ未満である、項２６に記載の混合物。
２９．塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭおよび７０ｍＭ未満である、項２６に記載の混合物。
３０．混合物が、１０ｍＭ～４０ｍＭの硫酸アンモニウムをさらに含む、項２または４に記載の混合物。
３１．硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭである、項３０に記載の混合物。
３２．硫酸アンモニウムの濃度が、３５ｍＭ未満である、項３０に記載の混合物。
３３．硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭおよび３５ｍＭ未満である、項３０に記載の混合物。
３４．硫酸アンモニウムの濃度が、２０～２５ｍＭである、項３０に記載の混合物。
３５．混合物が、
ａ）３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化カリウムの濃度と、
ｂ）１０ｍＭ～４０ｍＭの硫酸アンモニウムの濃度と、をさらに含む、項２または４に記載の混合物。
３６．塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ～７０ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０ｍＭ～３５ｍＭである、項３５に記載の混合物。
３７．塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ～４８ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０～２４ｍＭである、項３５に記載の混合物。
３８．塩化カリウムの濃度が、４５ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２２ｍＭである、項３５に記載の混合物。
３９．検出可能な標識が、ＤＮＡ結合色素、レポーター色素、蛍光プローブ、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、テトラクロロフルオレシン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ（商標））、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（ＪＯＥ（商標））、ＶＩＣ（商標）、カルボキシレート基の代わりにＳＯ3を含むフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト形態、ＣＹ５のホスホルアミダイト形態、非ＦＲＥＴ標識、フェロセン試薬、ＡＢＹ（商標）、ＮＥＤ（商標）ＪＵＮ（商標）、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＹＥ（商標）６６５、ＴＹＥ（商標）７０５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項６に記載の混合物。
４０．消光部分が、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、非蛍光消光剤（ＮＦＱ）、ブラックホールクエンチャー、アイオワブラッククエンチャー、ＱＳＹ消光剤、ＱＳＹ７消光剤、ＱＳＹ２１消光剤、ダブシルおよび／またはダブシルスルホネート／カルボキシレート消光剤からなる群から選択される、項９～１１のいずれか一項に記載の混合物。
４１．第３のオリゴヌクレオチドのＴmが、第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも５℃および２５℃以下高い、項２または４に記載の混合物。
４２．第３のオリゴヌクレオチドのＴmが、第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも８℃および１２℃以下高い、項４１に記載の混合物。
４３．第１のオリゴヌクレオチドのＴmが、第２のオリゴヌクレオチドのＴmの５℃以内である、項２または４に記載の混合物。
４４．第１のオリゴヌクレオチドのＴmが、４５～６０℃であり、第２のオリゴヌクレオチドのＴmが、４５～６０℃である、項４２または４３のいずれか一項に記載の混合物。
４５．第１および第２のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、項１～４のいずれか一項に記載の混合物。
４６．第１および第２のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、項１～４のいずれか一項に記載の混合物。
４７．第３のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、項２または４に記載の混合物。
４８．第３のオリゴヌクレオチドが、プローブである、項２または４に記載の混合物。
４９．第１、第２、および／または第３のオリゴヌクレオチドが、１０～４０個のヌクレオチドを含む、項２または４に記載の混合物。
５０．第３のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、項２または４に記載の混合物。
５１．遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、項５０に記載の混合物。
５２．ＭＧＢ部分が、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端および／または３’部分に位置している、項５１に記載の混合物。
５３．混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチドにおける第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチドを含み、第４のオリゴヌクレオチドが、第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第６のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、項２に記載の混合物。
５４．混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ｆ）にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチドにおける第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチド（「第２のバリアントヌクレオチド」）を含み、第４のオリゴヌクレオチドが、第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第２の配列（Ｇ）にハイブリダイズするように構成された第５のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列（Ｈ）に相補的であり、標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｈ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ｆ）から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第４の配列（Ｉ）にハイブリダイズするように構成された第６のオリゴヌクレオチドであって、第４の配列（Ｉ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第５の配列（Ｊ）に相補的であり、第５の配列（Ｊ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｊ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ｆ）と少なくとも部分的に重複し、第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、項４に記載の混合物。
５５．第６のオリゴヌクレオチドにおける標的バリアントヌクレオチドが、第６のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、項５３または５４に記載の混合物。
５６．第６のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、項５３、５４、または５５に記載の混合物。
５７．第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、蛍光標識である、項５６に記載の混合物。
５８．第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、項５６または５７に記載の混合物。
５９．第６のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、項５３、５４、または５６のいずれか一項に記載の混合物。
６０．第６のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第６のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、項５９に記載の混合物。
６１．第６のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、項５９または６０に記載の混合物。
６２．第４および第５のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、項５３または５４に記載の混合物。
６３．第４および第５のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、項５３または５４に記載の混合物。
６４．第６のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、項５３または５４に記載の混合物。
６５．第６のオリゴヌクレオチドが、プローブである、項５３または５４に記載の混合物。
６６．第４、第５、および／または第６のオリゴヌクレオチドが、１０～３０個のヌクレオチドを含む、項５３または５４に記載の混合物。
６７．第６のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、項５３または５４に記載の混合物。
６８．第６のオリゴヌクレオチドの遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、項６７に記載の混合物。
６９．第６のオリゴヌクレオチドのＭＧＢ部分が、第６のオリゴヌクレオチドの３’末端および／または３’部分に位置している、項６８に記載の混合物。
７０．混合物が、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第４のオリゴヌクレオチドであって、第４のオリゴヌクレオチドが、第１の配列に実質的にハイブリダイズするように構成され、その３’末端に標的バリアントヌクレオチドの相補体とは異なるヌクレオチドを含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第３のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、第５のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドの部位に異なるヌクレオチドを含む、第５のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、項２または４に記載の混合物。
７１．異なるヌクレオチドが、その３’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、項７０に記載の混合物。
７２．第５のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、項７０または７１に記載の混合物。
７３．第５のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、蛍光標識である、項７２に記載の混合物。
７４．第５のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、第５のオリゴヌクレオチドの第１の末端ヌクレオチド上にある、項７２または７３に記載の混合物。
７４．第５のオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識が、第３のオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識と区別可能である、項７２～７４のいずれか一項に記載の混合物。
７５．第５のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、項７２～７４のいずれか一項に記載の混合物。
７６．第５のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第５のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、項７５に記載の混合物。
７７．第５のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第５のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、項７５または７６に記載の混合物。
７８．第４のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、項７０に記載の混合物。
７９．第４のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、項７０に記載の混合物。
８０．第５のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、項７０に記載の混合物。
８１．第５のオリゴヌクレオチドが、プローブである、項７０に記載の混合物。
８２．第４および第５のオリゴヌクレオチドが、１０～４０個のヌクレオチドを含む、項７０に記載の混合物。
８３．第５のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、項７０に記載の混合物。
８４．第５のオリゴヌクレオチドの遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、項８３に記載の混合物。
８５．第５のオリゴヌクレオチドのＭＧＢ部分が、第５のオリゴヌクレオチドの３’末端および／または３’部分に位置している、項８４に記載の混合物。
８６．混合物であって、
複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
８７．各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第３の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、項８６に記載の混合物。
８８．
複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｃ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
８９．各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｅ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、項８８に記載の混合物。
９０．混合物が、ポリメラーゼをさらに含む、項１～８９のいずれか一項に記載の混合物。
９１．ポリメラーゼが、熱安定性である、項９０に記載の混合物。
９２．混合物が、ホットスタート成分をさらに含む、項９１に記載の混合物。
９３．ホットスタート成分が、熱安定性ポリメラーゼに向けられた抗体、オリゴヌクレオチド、アプタマー、および／またはポリメラーゼの化学修飾を含む、項９２に記載の混合物。
９４．混合物が、ヌクレオチド源をさらに含む、項１～９３のいずれか一項に記載の混合物。
９５．第３のオリゴヌクレオチドが、加水分解プローブである、項１～９４のいずれか一項に記載の混合物。
９６．第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含むことが疑われる核酸試料をさらに含む、項１～９５のいずれか一項に記載の混合物。
９７．標的バリアントヌクレオチドが、突然変異体対立遺伝子内にある、項１～９６のいずれか一項に記載の混合物。
９８．突然変異体対立遺伝子が、標的バリアントヌクレオチドにおけるプリンからプリンへの単一点突然変異またはピリミジンからピリミジンへの単一点突然変異のいずれかである、項９７に記載の混合物。
９９．突然変異体対立遺伝子が、ＫＲＡＳ癌遺伝子の対立遺伝子である、項９７または９８に記載の混合物。
１００．突然変異体対立遺伝子が、確率的突然変異である、項９７に記載の混合物。
１０１．標的バリアントヌクレオチドが、メジャー対立遺伝子バリアントまたはマイナー対立遺伝子バリアントに対応する同一性を有する、項１～１００のいずれか一項に記載の混合物。
１０２．標的バリアントヌクレオチドが、１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、項１０１に記載の混合物。
１０３．標的バリアントヌクレオチドが、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、項１０２に記載の混合物。
１０４．標的バリアントヌクレオチドが、一塩基多型の位置で発生する、項１～１０３のいずれか一項に記載の混合物。
１０５．混合物が、マスターミックスである、項１～９５のいずれか一項に記載の混合物。
１０６．マスターミックスが、４～８℃で最大１２ヶ月間安定である、項１０５に記載の混合物。
１０７．混合物が、反応混合物である、項１～１０４のいずれか一項に記載の混合物。
１０８．反応混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列を含むアンプリコンをさらに含む、項１０７に記載の混合物。
１０９．反応混合物が、任意の他の異なる（例えば、第２の）ポリヌクレオチド鎖の配列を含むアンプリコンを含まない、項１０８に記載の混合物。
１１０．混合物が、以下：
ａ）少なくとも１つの洗浄剤、
ｂ）グリセロール、および
ｃ）少なくとも１つの参照色素のうちの１つ以上をさらに含む、項１～１０９のいずれか一項に記載の混合物。
１１１．混合物が、ウシ血清アルブミンおよび／またはゼラチンをさらに含む、項１～１１０のいずれか一項に記載の混合物。
１１２．混合物が、凍結乾燥される、項１～１０６のいずれか一項に記載の混合物。
１１３．任意の前述の項に記載の混合物を含有する第１の容器と、第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有するポリヌクレオチド分子を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キット。
１１４．対照ポリヌクレオチド試料が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖全体を含む、項１１３に記載のキット。
１１５．対照ポリヌクレオチド試料が、標的バリアントヌクレオチドにおける第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有しない、項１１３に記載のキット。
１１６．試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と項２または４に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成されたアンプリコンを、第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）においてアンプリコンを検出することが、標的ポリヌクレオチド分子が試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
１１７．標的ポリヌクレオチド分子が、ポリヌクレオチド分子の混合物を含む試験ポリヌクレオチド試料において検出され、混合物が、標的バリアントヌクレオチドの第１のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）、および標的バリアントヌクレオチドの第２のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、項１１６に記載の方法。
１１８．試験ポリヌクレオチド試料が、標的ポリヌクレオチド配列を含まないポリヌクレオチド鎖（「非標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、項１１６または１１７に記載の方法。
１１９．試験試料が、標的ポリヌクレオチド分子よりも多くの非標的ポリヌクレオチド分子を含む、項１１８に記載の方法。
１２０．標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、項１１６～１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２１．非標的ポリヌクレオチド分子が、メジャー対立遺伝子または野生型ポリヌクレオチド配列である、項１１８～１２０のいずれか一項に記載の方法。
１２２．試験試料が、非標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の標的ポリヌクレオチド分子を含む、項１１８～１２１のいずれか一項に記載の方法。
１２３．試験試料が、第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子を含む、項１１７～１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２４．第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、項１１７～１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２５．第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、野生型ポリヌクレオチド配列である、項１１７～１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２６．ステップａ）～ｃ）の前の第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数を富化することをさらに含む、項１１７～１２５に記載の方法。
１２７．富化することが、ステップａ）～ｃ）のいずれかにおいて使用されるものと比較して異なる条件を含む増幅反応を含む、項１２６に記載の方法。
１２８．ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数が、第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍富化される、項１２６または１２７に記載の方法。
１２９．富化することが、第１のオリゴヌクレオチドの計算された融解温度（ＴM）よりも１２～１６度高い温度での１５～２５サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施される、項１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
１３０．ステップｂ）が、第３のオリゴヌクレオチドのＴMに近く、富化することが実施される温度よりも４～６度低い温度での３５～４０サイクルを使用して実施される、項１２６～１２９のいずれか一項に記載の方法。
１３１．試験ポリヌクレオチド試料が、哺乳動物もしくは非哺乳動物の動物組織もしくは細胞、または植物組織もしくは細胞に由来する、項１１６～１３０のいずれか一項に記載の方法。
１３２．試料が、唾液、頬組織、皮膚、毛髪、血液、血漿、尿、糞便、精液、および腫瘍試料からなる群から選択される、項１３１に記載の方法。
１３３．ポリヌクレオチド試験試料が、癌細胞に由来する、項１３１または１３２に記載の方法。
１３４．アンプリコンの検出が、試験ポリヌクレオチド試料が由来する組織内の癌細胞の存在を示す、項１３１～１３３のいずれか一項に記載の方法。
１３５．標的ポリヌクレオチドが、Ｒａｓ、ＥＦＧＲ、Ｋｉｔ、ｐＴＥＮ、および／もしくはｐ５３における少なくとも１つの突然変異、ならびに／または少なくとも１つのＫＲＡＳもしくはＮＲＡＳ突然変異を含む、項１１６～１３４のいずれか一項に記載の方法。
１３６．増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、項１１６～１３５のいずれか一項に記載の方法。
１３７．ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である、項１３６に記載の方法。
１３８．第３のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドのＴｍよりも８～１２℃高いＴｍを有し、ＰＣＲが、第１のオリゴヌクレオチドのＴｍの５℃以内であるアニーリング温度で実施される、項１３６または１３７に記載の方法。
１３９．方法が、少なくとも第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドを含有する第１の容器と、第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キットを使用して実施される、項１１６～１３８のいずれか一項に記載の方法。
１４０．方法が、突然変異を示す標的バリアントヌクレオチドを検出し、試験ポリヌクレオチド試料が、標的ポリヌクレオチドの１～１０コピーを含む、項１１６～１３９のいずれか一項に記載の方法。
１４１．標的バリアントヌクレオチドが、プリン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるプリン塩基を含む、項１１６～１４０のいずれか一項に記載の方法。
１４２．標的バリアントヌクレオチドが、ピリミジン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるピリミジン塩基を含む、項１１６～１４０のいずれか一項に記載の方法。
１４３．試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と項１～９４、１０４、１０５、および１０９～１１１のいずれか一項に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成されたアンプリコンを、第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）においてアンプリコンを検出することが、標的ポリヌクレオチド分子が試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
１４４．試験ポリヌクレオチド試料において、各々が標的バリアントヌクレオチドを含む、少なくとも２つの異なる標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と項５３または５４に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第１の標的ポリヌクレオチド分子の第１の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）第４および第５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第２の標的ポリヌクレオチド配列の第２のアンプリコンを生成することと、
ｄ）ステップｂ）およびｃ）において生成されたアンプリコンを、第３および第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｄ）においてアンプリコンを検出することが、第１および／または第２の標的ポリヌクレオチド分子が試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
１４５．第３および第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性が、蛍光標識である、項１４４に記載の方法。
１４６．第３および第６のオリゴヌクレオチドの各々の上の蛍光標識が異なる、項１４５に記載の方法。
１４７．混合物が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、項１～１１２のいずれか一項に記載の混合物。
１４８．キットが、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異の検出のために使用される、項１１３～１１５のいずれか一項に記載のキット。
１４９．方法が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、項１１６～１４６のいずれか一項に記載の方法。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
〔２〕ｃ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第３の配列が、前記標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、前記〔１〕に記載の混合物。
〔３〕ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、前記第３の配列（Ｃ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
〔４〕ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第５の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、前記第５の配列（Ｅ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖における前記第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、前記第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、前記〔２〕に記載の混合物。
〔５〕前記第３のオリゴヌクレオチドにおける前記標的バリアントヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔６〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、前記〔２〕、〔４〕、および〔５〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔７〕前記検出可能な標識が、蛍光標識である、前記〔６〕に記載の混合物。
〔８〕前記検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、前記〔６〕または〔７〕に記載の混合物。
〔９〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、前記〔６〕～〔８〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１０〕前記消光部分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、前記〔９〕に記載の混合物。
〔１１〕前記消光部分が、前記検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、前記〔９〕または〔１０〕に記載の混合物。
〔１２〕前記第１の末端ヌクレオチドが、５’末端ヌクレオチドである、前記〔１０〕に記載の混合物。
〔１３〕前記第２の末端ヌクレオチドが、３’末端ヌクレオチドである、前記〔１０〕に記載の混合物。
〔１４〕前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔１５〕配列Ａ、Ｅ、およびＣが、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖上の一本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、前記〔４〕に記載の混合物。
〔１６〕前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔１７〕前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、配列ＤおよびＢが、前記標的相補体ポリヌクレオチド鎖上の前記二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置し、配列Ａ、Ｅ、およびＣが、前記標的ポリヌクレオチド鎖上の前記二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、前記〔４〕に記載の混合物。
〔１８〕前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、二本鎖ポリヌクレオチド分子が、バリアントポリヌクレオチド鎖およびバリアント相補体ポリヌクレオチド鎖を含み、前記バリアントポリヌクレオチド鎖が、前記標的ポリヌクレオチド鎖と実質的に同一であり、前記標的ポリヌクレオチド鎖とは前記標的バリアントヌクレオチドで異なるヌクレオチドを含み、前記バリアント相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記バリアントポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔１９〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１の配列の３～６つの連続するヌクレオチドを含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２０〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１の配列のヌクレオチドの配列と重複しない前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの配列をさらに含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２１〕前記混合物が、第４のオリゴヌクレオチドを含まない、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２２〕前記混合物が、検出可能な標識を含む第４のオリゴヌクレオチドを含まない、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２３〕前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２４〕前記混合物が、検出可能な標識および前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する配列を有する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２５〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識および前記標的ポリヌクレオチド鎖の配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する混合物における唯一のオリゴヌクレオチドである、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２６〕前記混合物が、３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化カリウムをさらに含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２７〕塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭである、前記〔２６〕に記載の混合物。
〔２８〕塩化カリウムの濃度が、７０ｍＭ未満である、前記〔２６〕に記載の混合物。
〔２９〕塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭおよび７０ｍＭ未満である、前記〔２６〕に記載の混合物。
〔３０〕前記混合物が、１０ｍＭ～４０ｍＭの硫酸アンモニウムをさらに含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔３１〕硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭである、前記〔３０〕に記載の混合物。
〔３２〕硫酸アンモニウムの濃度が、３５ｍＭ未満である、前記〔３０〕に記載の混合物。
〔３３〕硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭおよび３５ｍＭ未満である、前記〔３０〕に記載の混合物。
〔３４〕硫酸アンモニウムの濃度が、２０～２５ｍＭである、前記〔３０〕に記載の混合物。
〔３５〕前記混合物が、
ａ）３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化カリウムの濃度と、
ｂ）１０ｍＭ～４０ｍＭの硫酸アンモニウムの濃度と、をさらに含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔３６〕塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ～７０ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０ｍＭ～３５ｍＭである、前記〔３５〕に記載の混合物。
〔３７〕塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ～４８ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０～２４ｍＭである、前記〔３５〕に記載の混合物。
〔３８〕塩化カリウムの濃度が、４５ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２２ｍＭである、前記〔３５〕に記載の混合物。
〔３９〕前記検出可能な標識が、ＤＮＡ結合色素、レポーター色素、蛍光プローブ、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、テトラクロロフルオレシン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ（商標））、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（ＪＯＥ（商標））、ＶＩＣ（商標）、カルボキシレート基の代わりにＳＯ 3 を含むフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト形態、ＣＹ５のホスホルアミダイト形態、非ＦＲＥＴ標識、フェロセン試薬、ＡＢＹ（商標）、ＮＥＤ（商標）ＪＵＮ（商標）、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＹＥ（商標）６６５、ＴＹＥ（商標）７０５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記〔６〕に記載の混合物。
〔４０〕前記消光部分が、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、非蛍光消光剤（ＮＦＱ）、ブラックホールクエンチャー、アイオワブラッククエンチャー、ＱＳＹ消光剤、ＱＳＹ７消光剤、ＱＳＹ２１消光剤、ダブシルおよび／またはダブシルスルホネート／カルボキシレート消光剤からなる群から選択される、前記〔９〕～〔１１〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔４１〕前記第３のオリゴヌクレオチドのＴ m が、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴ m よりも少なくとも５℃および２５℃以下高い、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔４２〕前記第３のオリゴヌクレオチドのＴ m が、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴ m よりも少なくとも８℃および１２℃以下高い、前記〔４１〕に記載の混合物。
〔４３〕前記第１のオリゴヌクレオチドのＴ m が、前記第２のオリゴヌクレオチドのＴ m の５℃以内である、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔４４〕前記第１のオリゴヌクレオチドのＴ m が、４５～６０℃であり、前記第２のオリゴヌクレオチドのＴ m が、４５～６０℃である、前記〔４２〕または〔４３〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔４５〕前記第１および第２のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔４６〕前記第１および第２のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、前記〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔４７〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔４８〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、プローブである、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔４９〕前記第１、第２、および／または第３のオリゴヌクレオチドが、１０～４０個のヌクレオチドを含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔５０〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔５１〕前記遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、前記〔５０〕に記載の混合物。
〔５２〕前記ＭＧＢ部分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの前記３’末端および／または３’部分に位置している、前記〔５１〕に記載の混合物。
〔５３〕前記混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチドにおける前記第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の前記第１の配列から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第６のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、前記〔２〕に記載の混合物。
〔５４〕前記混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ｆ）にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチドにおける前記第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチド（「第２のバリアントヌクレオチド」）を含み、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第２の配列（Ｇ）にハイブリダイズするように構成された第５のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列（Ｈ）に相補的であり、前記標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、前記第３の配列（Ｈ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列（Ｆ）から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第４の配列（Ｉ）にハイブリダイズするように構成された第６のオリゴヌクレオチドであって、前記第４の配列（Ｉ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第５の配列（Ｊ）に相補的であり、第５の配列（Ｊ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、前記第５の配列（Ｊ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖における前記第１の配列（Ｆ）と少なくとも部分的に重複し、前記第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、前記〔４〕に記載の混合物。
〔５５〕前記第６のオリゴヌクレオチドにおける前記標的バリアントヌクレオチドが、前記第６のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔５６〕前記第６のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、前記〔５３〕、〔５４〕、または〔５５〕に記載の混合物。
〔５７〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、蛍光標識である、前記〔５６〕に記載の混合物。
〔５８〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、前記〔５６〕または〔５７〕に記載の混合物。
〔５９〕前記第６のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、前記〔５３〕、〔５４〕、または〔５６〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔６０〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第６のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、前記〔５９〕に記載の混合物。
〔６１〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、前記〔５９〕または〔６０〕に記載の混合物。
〔６２〕前記第４および第５のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６３〕前記第４および第５のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６４〕前記第６のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６５〕前記第６のオリゴヌクレオチドが、プローブである、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６６〕前記第４、第５、および／または第６のオリゴヌクレオチドが、１０～３０個のヌクレオチドを含む、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６７〕前記第６のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６８〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、前記〔６７〕に記載の混合物。
〔６９〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記ＭＧＢ部分が、前記第６のオリゴヌクレオチドの前記３’末端および／または３’部分に位置している、前記〔６８〕に記載の混合物。
〔７０〕前記混合物が、
ａ）前記第１のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第１の配列に実質的にハイブリダイズするように構成され、その３’末端に前記標的バリアントヌクレオチドの相補体とは異なるヌクレオチドを含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第３のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、前記第５のオリゴヌクレオチドが、前記標的バリアントヌクレオチドの部位に異なるヌクレオチドを含む、第５のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔７１〕前記異なるヌクレオチドが、その３’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔７２〕前記第５のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、前記〔７０〕または〔７１〕に記載の混合物。
〔７３〕前記第５のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、蛍光標識である、前記〔７２〕に記載の混合物。
〔７４〕
［７４］ 前記第５のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、前記第５のオリゴヌクレオチドの第１の末端ヌクレオチド上にある、前記〔７２〕または〔７３〕に記載の混合物。
［７４］ 前記第５のオリゴヌクレオチド上の前記検出可能な標識が、前記第３のオリゴヌクレオチド上の前記検出可能な標識と区別可能である、前記〔７２〕～〔７４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔７５〕前記第５のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、前記〔７２〕～〔７４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔７６〕前記第５のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第５のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、前記〔７５〕に記載の混合物。
〔７７〕前記第５のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第５のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、前記〔７５〕または〔７６〕に記載の混合物。
〔７８〕前記第４のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔７９〕前記第４のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔８０〕前記第５のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔８１〕前記第５のオリゴヌクレオチドが、プローブである、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔８２〕前記第４および第５のオリゴヌクレオチドが、１０～４０個のヌクレオチドを含む、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔８３〕前記第５のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔８４〕前記第５のオリゴヌクレオチドの前記遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、前記〔８３〕に記載の混合物。
〔８５〕前記第５のオリゴヌクレオチドの前記ＭＧＢ部分が、前記第５のオリゴヌクレオチドの前記３’末端および／または３’部分に位置している、前記〔８４〕に記載の混合物。
〔８６〕複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの前記第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
〔８７〕各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第３の配列が、前記標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、前記〔８６〕に記載の混合物。
〔８８〕複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、前記第３の配列（Ｃ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの前記第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
〔８９〕各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第５の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、前記第５の配列（Ｅ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖における前記第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、前記第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、前記〔８８〕に記載の混合物。
〔９０〕前記混合物が、ポリメラーゼをさらに含む、前記〔１〕～〔８９〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔９１〕前記ポリメラーゼが、熱安定性である、前記〔９０〕に記載の混合物。
〔９２〕前記混合物が、ホットスタート成分をさらに含む、前記〔９１〕に記載の混合物。
〔９３〕前記ホットスタート成分が、熱安定性ポリメラーゼに向けられた抗体、オリゴヌクレオチド、アプタマー、および／または前記ポリメラーゼの化学修飾を含む、前記〔９２〕に記載の混合物。
〔９４〕前記混合物が、ヌクレオチド源をさらに含む、前記〔１〕～〔９３〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔９５〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、加水分解プローブである、前記〔１〕～〔９４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔９６〕前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含むことが疑われる核酸試料をさらに含む、前記〔１〕～〔９５〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔９７〕前記標的バリアントヌクレオチドが、突然変異体対立遺伝子内にある、前記〔１〕～〔９６〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔９８〕前記突然変異体対立遺伝子が、前記標的バリアントヌクレオチドにおけるプリンからプリンへの単一点突然変異またはピリミジンからピリミジンへの単一点突然変異のいずれかである、前記〔９７〕に記載の混合物。
〔９９〕前記突然変異体対立遺伝子が、ＫＲＡＳ癌遺伝子の対立遺伝子である、前記〔９７〕または〔９８〕に記載の混合物。
〔１００〕前記突然変異体対立遺伝子が、確率的突然変異である、前記〔９７〕に記載の混合物。
〔１０１〕前記標的バリアントヌクレオチドが、メジャー対立遺伝子バリアントまたはマイナー対立遺伝子バリアントに対応する同一性を有する、前記〔１〕～〔１００〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１０２〕前記標的バリアントヌクレオチドが、１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、前記〔１０１〕に記載の混合物。
〔１０３〕前記標的バリアントヌクレオチドが、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、前記〔１０２〕に記載の混合物。
〔１０４〕前記標的バリアントヌクレオチドが、一塩基多型の位置で発生する、前記〔１〕～〔１０３〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１０５〕前記混合物が、マスターミックスである、前記〔１〕～〔９５〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１０６〕前記マスターミックスが、４～８℃で最大１２ヶ月間安定である、前記〔１０５〕に記載の混合物。
〔１０７〕前記混合物が、反応混合物である、前記〔１〕～〔１０４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１０８〕前記反応混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列を含むアンプリコンをさらに含む、前記〔１０７〕に記載の混合物。
〔１０９〕前記反応混合物が、任意の他の異なる（例えば、第２の）ポリヌクレオチド鎖の配列を含むアンプリコンを含まない、前記〔１０８〕に記載の混合物。
〔１１０〕前記混合物が、以下：
ａ）少なくとも１つの洗浄剤、
ｂ）グリセロール、および
ｃ）少なくとも１つの参照色素のうちの１つ以上をさらに含む、前記〔１〕～〔１０９〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１１１〕前記混合物が、ウシ血清アルブミンおよび／またはゼラチンをさらに含む、前記〔１〕～〔１１０〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１１２〕前記混合物が、凍結乾燥される、前記〔１〕～〔１０６〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１１３〕任意の前述の態様に記載の混合物を含有する第１の容器と、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有するポリヌクレオチド分子を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キット。
〔１１４〕前記対照ポリヌクレオチド試料が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖全体を含む、前記〔１１３〕に記載のキット。
〔１１５〕前記対照ポリヌクレオチド試料が、前記標的バリアントヌクレオチドにおける前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有しない、前記〔１１３〕に記載のキット。
〔１１６〕試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも前記第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成された前記アンプリコンを、前記第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）において前記アンプリコンを検出することが、前記標的ポリヌクレオチド分子が前記試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
〔１１７〕前記標的ポリヌクレオチド分子が、ポリヌクレオチド分子の混合物を含む試験ポリヌクレオチド試料において検出され、前記混合物が、前記標的バリアントヌクレオチドの第１のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）、および前記標的バリアントヌクレオチドの第２のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、前記〔１１６〕に記載の方法。
〔１１８〕前記試験ポリヌクレオチド試料が、標的ポリヌクレオチド配列を含まないポリヌクレオチド鎖（「非標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、前記〔１１６〕または〔１１７〕に記載の方法。
〔１１９〕前記試験試料が、標的ポリヌクレオチド分子よりも多くの非標的ポリヌクレオチド分子を含む、前記〔１１８〕に記載の方法。
〔１２０〕前記標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、前記〔１１６〕～〔１１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２１〕前記非標的ポリヌクレオチド分子が、メジャー対立遺伝子または野生型ポリヌクレオチド配列である、前記〔１１８〕～〔１２０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２２〕前記試験試料が、非標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の標的ポリヌクレオチド分子を含む、前記〔１１８〕～〔１２１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２３〕前記試験試料が、第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子を含む、前記〔１１７〕～〔１１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２４〕前記第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、前記〔１１７〕～〔１１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２５〕前記第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、野生型ポリヌクレオチド配列である、前記〔１１７〕～〔１１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２６〕ステップａ）～ｃ）の前の前記第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、前記ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数を富化することをさらに含む、前記〔１１７〕～〔１２５〕に記載の方法。
〔１２７〕前記富化することが、ステップａ）～ｃ）のいずれかにおいて使用されるものと比較して異なる条件を含む増幅反応を含む、前記〔１２６〕に記載の方法。
〔１２８〕前記ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数が、前記第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍富化される、前記〔１２６〕または〔１２７〕に記載の方法。
〔１２９〕前記富化することが、前記第１のオリゴヌクレオチドの計算された融解温度（Ｔ M ）よりも１２～１６度高い温度での１５～２５サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施される、前記〔１２６〕～〔１２８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３０〕ステップｂ）が、前記第３のオリゴヌクレオチドのＴ M に近く、前記富化することが実施される温度よりも４～６度低い温度での３５～４０サイクルを使用して実施される、前記〔１２６〕～〔１２９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３１〕前記試験ポリヌクレオチド試料が、哺乳動物もしくは非哺乳動物の動物組織もしくは細胞、または植物組織もしくは細胞に由来する、前記〔１１６〕～〔１３０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３２〕前記試料が、唾液、頬組織、皮膚、毛髪、血液、血漿、尿、糞便、精液、および腫瘍試料からなる群から選択される、前記〔１３１〕に記載の方法。
〔１３３〕前記ポリヌクレオチド試験試料が、癌細胞に由来する、前記〔１３１〕または〔１３２〕に記載の方法。
〔１３４〕アンプリコンの検出が、前記試験ポリヌクレオチド試料が由来する組織内の癌細胞の存在を示す、前記〔１３１〕～〔１３３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３５〕前記標的ポリヌクレオチドが、Ｒａｓ、ＥＦＧＲ、Ｋｉｔ、ｐＴＥＮ、および／もしくはｐ５３における少なくとも１つの突然変異、ならびに／または少なくとも１つのＫＲＡＳもしくはＮＲＡＳ突然変異を含む、前記〔１１６〕～〔１３４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３６〕前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、前記〔１１６〕～〔１３５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３７〕前記ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である、前記〔１３６〕に記載の方法。
〔１３８〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴｍよりも８～１２℃高いＴｍを有し、前記ＰＣＲが、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴｍの５℃以内であるアニーリング温度で実施される、前記〔１３６〕または〔１３７〕に記載の方法。
〔１３９〕前記方法が、少なくとも前記第１のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチド、および前記第３のオリゴヌクレオチドを含有する第１の容器と、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キットを使用して実施される、前記〔１１６〕～〔１３８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４０〕前記方法が、突然変異を示す標的バリアントヌクレオチドを検出し、前記試験ポリヌクレオチド試料が、前記標的ポリヌクレオチドの１～１０コピーを含む、前記〔１１６〕～〔１３９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４１〕前記標的バリアントヌクレオチドが、プリン塩基を含み、前記標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるプリン塩基を含む、前記〔１１６〕～〔１４０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４２〕前記標的バリアントヌクレオチドが、ピリミジン塩基を含み、前記標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるピリミジン塩基を含む、前記〔１１６〕～〔１４０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４３〕試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と前記〔１〕～〔９４〕、〔１０４〕、〔１０５〕、および１０９～１１１のいずれか一項に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも前記第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成された前記アンプリコンを、前記第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）において前記アンプリコンを検出することが、前記標的ポリヌクレオチド分子が前記試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
〔１４４〕試験ポリヌクレオチド試料において、各々が標的バリアントヌクレオチドを含む、少なくとも２つの異なる標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）前記第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第１の標的ポリヌクレオチド分子の第１の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）前記第４および第５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第２の標的ポリヌクレオチド配列の第２のアンプリコンを生成することと、
ｄ）ステップｂ）およびｃ）において生成された前記アンプリコンを、前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｄ）において前記アンプリコンを検出することが、前記第１および／または第２の標的ポリヌクレオチド分子が前記試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
〔１４５〕前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な特性が、蛍光標識である、前記〔１４４〕に記載の方法。
〔１４６〕前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの各々の上の前記蛍光標識が異なる、前記〔１４５〕に記載の方法。
〔１４７〕前記混合物が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、前記〔１〕～〔１１２〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１４８〕前記キットが、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異の検出のために使用される、前記〔１１３〕～〔１１５〕のいずれか一項に記載のキット。
〔１４９〕前記方法が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、前記〔１１６〕～〔１４６〕のいずれか一項に記載の方法。
１．
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
２．
ｃ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第３の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、項１に記載の混合物。
３．
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｃ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
４．
ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｅ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、項２に記載の混合物。
５．第３のオリゴヌクレオチドにおける標的バリアントヌクレオチドが、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、項２または４に記載の混合物。
６．第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、項２、４、および５のいずれか一項に記載の混合物。
７．検出可能な標識が、蛍光標識である、項６に記載の混合物。
８．検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、項６または７に記載の混合物。
９．第３のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、項６～８のいずれか一項に記載の混合物。
１０．消光部分が、第３のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、項９に記載の混合物。
１１．消光部分が、検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、項９または１０に記載の混合物。
１２．第１の末端ヌクレオチドが、５’末端ヌクレオチドである、項１０に記載の混合物。
１３．第２の末端ヌクレオチドが、３’末端ヌクレオチドである、項１０に記載の混合物。
１４．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、項２または４に記載の混合物。
１５．配列Ａ、Ｅ、およびＣが、第１の標的ポリヌクレオチド鎖上の一本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、項４に記載の混合物。
１６．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、項２または４に記載の混合物。
１７．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、配列ＤおよびＢが、標的相補体ポリヌクレオチド鎖上の二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置し、配列Ａ、Ｅ、およびＣが、標的ポリヌクレオチド鎖上の二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、項４に記載の混合物。
１８．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、二本鎖ポリヌクレオチド分子が、バリアントポリヌクレオチド鎖およびバリアント相補体ポリヌクレオチド鎖を含み、バリアントポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド鎖と実質的に同一であり、標的ポリヌクレオチド鎖とは標的バリアントヌクレオチドで異なるヌクレオチドを含み、バリアント相補体ポリヌクレオチド鎖が、バリアントポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、項２または４に記載の混合物。
１９．第３のオリゴヌクレオチドが、第１の配列の３～６つの連続するヌクレオチドを含む、項２または４に記載の混合物。
２０．第３のオリゴヌクレオチドが、第１の配列のヌクレオチドの配列と重複しない第１の標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの配列をさらに含む、項２または４に記載の混合物。
２１．混合物が、第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２２．混合物が、検出可能な標識を含む第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２３．混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２４．混合物が、検出可能な標識および第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する配列を有する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、項２または４に記載の混合物。
２５．第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識および標的ポリヌクレオチド鎖の配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する混合物における唯一のオリゴヌクレオチドである、項２または４に記載の混合物。
２６．混合物が、３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化カリウムをさらに含む、項２または４に記載の混合物。
２７．塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭである、項２６に記載の混合物。
２８．塩化カリウムの濃度が、７０ｍＭ未満である、項２６に記載の混合物。
２９．塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭおよび７０ｍＭ未満である、項２６に記載の混合物。
３０．混合物が、１０ｍＭ～４０ｍＭの硫酸アンモニウムをさらに含む、項２または４に記載の混合物。
３１．硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭである、項３０に記載の混合物。
３２．硫酸アンモニウムの濃度が、３５ｍＭ未満である、項３０に記載の混合物。
３３．硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭおよび３５ｍＭ未満である、項３０に記載の混合物。
３４．硫酸アンモニウムの濃度が、２０～２５ｍＭである、項３０に記載の混合物。
３５．混合物が、
ａ）３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化カリウムの濃度と、
ｂ）１０ｍＭ～４０ｍＭの硫酸アンモニウムの濃度と、をさらに含む、項２または４に記載の混合物。
３６．塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ～７０ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０ｍＭ～３５ｍＭである、項３５に記載の混合物。
３７．塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ～４８ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０～２４ｍＭである、項３５に記載の混合物。
３８．塩化カリウムの濃度が、４５ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２２ｍＭである、項３５に記載の混合物。
３９．検出可能な標識が、ＤＮＡ結合色素、レポーター色素、蛍光プローブ、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、テトラクロロフルオレシン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ（商標））、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（ＪＯＥ（商標））、ＶＩＣ（商標）、カルボキシレート基の代わりにＳＯ3を含むフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト形態、ＣＹ５のホスホルアミダイト形態、非ＦＲＥＴ標識、フェロセン試薬、ＡＢＹ（商標）、ＮＥＤ（商標）ＪＵＮ（商標）、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＹＥ（商標）６６５、ＴＹＥ（商標）７０５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項６に記載の混合物。
４０．消光部分が、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、非蛍光消光剤（ＮＦＱ）、ブラックホールクエンチャー、アイオワブラッククエンチャー、ＱＳＹ消光剤、ＱＳＹ７消光剤、ＱＳＹ２１消光剤、ダブシルおよび／またはダブシルスルホネート／カルボキシレート消光剤からなる群から選択される、項９～１１のいずれか一項に記載の混合物。
４１．第３のオリゴヌクレオチドのＴmが、第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも５℃および２５℃以下高い、項２または４に記載の混合物。
４２．第３のオリゴヌクレオチドのＴmが、第１のオリゴヌクレオチドのＴmよりも少なくとも８℃および１２℃以下高い、項４１に記載の混合物。
４３．第１のオリゴヌクレオチドのＴmが、第２のオリゴヌクレオチドのＴmの５℃以内である、項２または４に記載の混合物。
４４．第１のオリゴヌクレオチドのＴmが、４５～６０℃であり、第２のオリゴヌクレオチドのＴmが、４５～６０℃である、項４２または４３のいずれか一項に記載の混合物。
４５．第１および第２のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、項１～４のいずれか一項に記載の混合物。
４６．第１および第２のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、項１～４のいずれか一項に記載の混合物。
４７．第３のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、項２または４に記載の混合物。
４８．第３のオリゴヌクレオチドが、プローブである、項２または４に記載の混合物。
４９．第１、第２、および／または第３のオリゴヌクレオチドが、１０～４０個のヌクレオチドを含む、項２または４に記載の混合物。
５０．第３のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、項２または４に記載の混合物。
５１．遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、項５０に記載の混合物。
５２．ＭＧＢ部分が、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端および／または３’部分に位置している、項５１に記載の混合物。
５３．混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチドにおける第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチドを含み、第４のオリゴヌクレオチドが、第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第６のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、項２に記載の混合物。
５４．混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ｆ）にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチドにおける第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチド（「第２のバリアントヌクレオチド」）を含み、第４のオリゴヌクレオチドが、第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第２の配列（Ｇ）にハイブリダイズするように構成された第５のオリゴヌクレオチドであって、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列（Ｈ）に相補的であり、標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｈ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ｆ）から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第４の配列（Ｉ）にハイブリダイズするように構成された第６のオリゴヌクレオチドであって、第４の配列（Ｉ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第５の配列（Ｊ）に相補的であり、第５の配列（Ｊ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｊ）が、第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ｆ）と少なくとも部分的に重複し、第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、項４に記載の混合物。
５５．第６のオリゴヌクレオチドにおける標的バリアントヌクレオチドが、第６のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、項５３または５４に記載の混合物。
５６．第６のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、項５３、５４、または５５に記載の混合物。
５７．第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、蛍光標識である、項５６に記載の混合物。
５８．第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、項５６または５７に記載の混合物。
５９．第６のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、項５３、５４、または５６のいずれか一項に記載の混合物。
６０．第６のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第６のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、項５９に記載の混合物。
６１．第６のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、項５９または６０に記載の混合物。
６２．第４および第５のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、項５３または５４に記載の混合物。
６３．第４および第５のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、項５３または５４に記載の混合物。
６４．第６のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、項５３または５４に記載の混合物。
６５．第６のオリゴヌクレオチドが、プローブである、項５３または５４に記載の混合物。
６６．第４、第５、および／または第６のオリゴヌクレオチドが、１０～３０個のヌクレオチドを含む、項５３または５４に記載の混合物。
６７．第６のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、項５３または５４に記載の混合物。
６８．第６のオリゴヌクレオチドの遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、項６７に記載の混合物。
６９．第６のオリゴヌクレオチドのＭＧＢ部分が、第６のオリゴヌクレオチドの３’末端および／または３’部分に位置している、項６８に記載の混合物。
７０．混合物が、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第４のオリゴヌクレオチドであって、第４のオリゴヌクレオチドが、第１の配列に実質的にハイブリダイズするように構成され、その３’末端に標的バリアントヌクレオチドの相補体とは異なるヌクレオチドを含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第３のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、第５のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドの部位に異なるヌクレオチドを含む、第５のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、項２または４に記載の混合物。
７１．異なるヌクレオチドが、その３’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、項７０に記載の混合物。
７２．第５のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、項７０または７１に記載の混合物。
７３．第５のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、蛍光標識である、項７２に記載の混合物。
７４．第５のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識が、第５のオリゴヌクレオチドの第１の末端ヌクレオチド上にある、項７２または７３に記載の混合物。
７４．第５のオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識が、第３のオリゴヌクレオチド上の検出可能な標識と区別可能である、項７２～７４のいずれか一項に記載の混合物。
７５．第５のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、項７２～７４のいずれか一項に記載の混合物。
７６．第５のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第５のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、項７５に記載の混合物。
７７．第５のオリゴヌクレオチドの消光部分が、第５のオリゴヌクレオチドの検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、項７５または７６に記載の混合物。
７８．第４のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、項７０に記載の混合物。
７９．第４のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、項７０に記載の混合物。
８０．第５のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、項７０に記載の混合物。
８１．第５のオリゴヌクレオチドが、プローブである、項７０に記載の混合物。
８２．第４および第５のオリゴヌクレオチドが、１０～４０個のヌクレオチドを含む、項７０に記載の混合物。
８３．第５のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、項７０に記載の混合物。
８４．第５のオリゴヌクレオチドの遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、項８３に記載の混合物。
８５．第５のオリゴヌクレオチドのＭＧＢ部分が、第５のオリゴヌクレオチドの３’末端および／または３’部分に位置している、項８４に記載の混合物。
８６．混合物であって、
複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
８７．各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列と少なくとも部分的に重複し、第３の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、項８６に記載の混合物。
８８．
複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、第３の配列（Ｃ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
８９．各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、第５の配列（Ｅ）が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、項８８に記載の混合物。
９０．混合物が、ポリメラーゼをさらに含む、項１～８９のいずれか一項に記載の混合物。
９１．ポリメラーゼが、熱安定性である、項９０に記載の混合物。
９２．混合物が、ホットスタート成分をさらに含む、項９１に記載の混合物。
９３．ホットスタート成分が、熱安定性ポリメラーゼに向けられた抗体、オリゴヌクレオチド、アプタマー、および／またはポリメラーゼの化学修飾を含む、項９２に記載の混合物。
９４．混合物が、ヌクレオチド源をさらに含む、項１～９３のいずれか一項に記載の混合物。
９５．第３のオリゴヌクレオチドが、加水分解プローブである、項１～９４のいずれか一項に記載の混合物。
９６．第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含むことが疑われる核酸試料をさらに含む、項１～９５のいずれか一項に記載の混合物。
９７．標的バリアントヌクレオチドが、突然変異体対立遺伝子内にある、項１～９６のいずれか一項に記載の混合物。
９８．突然変異体対立遺伝子が、標的バリアントヌクレオチドにおけるプリンからプリンへの単一点突然変異またはピリミジンからピリミジンへの単一点突然変異のいずれかである、項９７に記載の混合物。
９９．突然変異体対立遺伝子が、ＫＲＡＳ癌遺伝子の対立遺伝子である、項９７または９８に記載の混合物。
１００．突然変異体対立遺伝子が、確率的突然変異である、項９７に記載の混合物。
１０１．標的バリアントヌクレオチドが、メジャー対立遺伝子バリアントまたはマイナー対立遺伝子バリアントに対応する同一性を有する、項１～１００のいずれか一項に記載の混合物。
１０２．標的バリアントヌクレオチドが、１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、項１０１に記載の混合物。
１０３．標的バリアントヌクレオチドが、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、項１０２に記載の混合物。
１０４．標的バリアントヌクレオチドが、一塩基多型の位置で発生する、項１～１０３のいずれか一項に記載の混合物。
１０５．混合物が、マスターミックスである、項１～９５のいずれか一項に記載の混合物。
１０６．マスターミックスが、４～８℃で最大１２ヶ月間安定である、項１０５に記載の混合物。
１０７．混合物が、反応混合物である、項１～１０４のいずれか一項に記載の混合物。
１０８．反応混合物が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列を含むアンプリコンをさらに含む、項１０７に記載の混合物。
１０９．反応混合物が、任意の他の異なる（例えば、第２の）ポリヌクレオチド鎖の配列を含むアンプリコンを含まない、項１０８に記載の混合物。
１１０．混合物が、以下：
ａ）少なくとも１つの洗浄剤、
ｂ）グリセロール、および
ｃ）少なくとも１つの参照色素のうちの１つ以上をさらに含む、項１～１０９のいずれか一項に記載の混合物。
１１１．混合物が、ウシ血清アルブミンおよび／またはゼラチンをさらに含む、項１～１１０のいずれか一項に記載の混合物。
１１２．混合物が、凍結乾燥される、項１～１０６のいずれか一項に記載の混合物。
１１３．任意の前述の項に記載の混合物を含有する第１の容器と、第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有するポリヌクレオチド分子を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キット。
１１４．対照ポリヌクレオチド試料が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖全体を含む、項１１３に記載のキット。
１１５．対照ポリヌクレオチド試料が、標的バリアントヌクレオチドにおける第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有しない、項１１３に記載のキット。
１１６．試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と項２または４に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成されたアンプリコンを、第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）においてアンプリコンを検出することが、標的ポリヌクレオチド分子が試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
１１７．標的ポリヌクレオチド分子が、ポリヌクレオチド分子の混合物を含む試験ポリヌクレオチド試料において検出され、混合物が、標的バリアントヌクレオチドの第１のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）、および標的バリアントヌクレオチドの第２のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、項１１６に記載の方法。
１１８．試験ポリヌクレオチド試料が、標的ポリヌクレオチド配列を含まないポリヌクレオチド鎖（「非標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、項１１６または１１７に記載の方法。
１１９．試験試料が、標的ポリヌクレオチド分子よりも多くの非標的ポリヌクレオチド分子を含む、項１１８に記載の方法。
１２０．標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、項１１６～１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２１．非標的ポリヌクレオチド分子が、メジャー対立遺伝子または野生型ポリヌクレオチド配列である、項１１８～１２０のいずれか一項に記載の方法。
１２２．試験試料が、非標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の標的ポリヌクレオチド分子を含む、項１１８～１２１のいずれか一項に記載の方法。
１２３．試験試料が、第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子を含む、項１１７～１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２４．第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、項１１７～１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２５．第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、野生型ポリヌクレオチド配列である、項１１７～１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２６．ステップａ）～ｃ）の前の第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数を富化することをさらに含む、項１１７～１２５に記載の方法。
１２７．富化することが、ステップａ）～ｃ）のいずれかにおいて使用されるものと比較して異なる条件を含む増幅反応を含む、項１２６に記載の方法。
１２８．ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数が、第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍富化される、項１２６または１２７に記載の方法。
１２９．富化することが、第１のオリゴヌクレオチドの計算された融解温度（ＴM）よりも１２～１６度高い温度での１５～２５サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施される、項１２６～１２８のいずれか一項に記載の方法。
１３０．ステップｂ）が、第３のオリゴヌクレオチドのＴMに近く、富化することが実施される温度よりも４～６度低い温度での３５～４０サイクルを使用して実施される、項１２６～１２９のいずれか一項に記載の方法。
１３１．試験ポリヌクレオチド試料が、哺乳動物もしくは非哺乳動物の動物組織もしくは細胞、または植物組織もしくは細胞に由来する、項１１６～１３０のいずれか一項に記載の方法。
１３２．試料が、唾液、頬組織、皮膚、毛髪、血液、血漿、尿、糞便、精液、および腫瘍試料からなる群から選択される、項１３１に記載の方法。
１３３．ポリヌクレオチド試験試料が、癌細胞に由来する、項１３１または１３２に記載の方法。
１３４．アンプリコンの検出が、試験ポリヌクレオチド試料が由来する組織内の癌細胞の存在を示す、項１３１～１３３のいずれか一項に記載の方法。
１３５．標的ポリヌクレオチドが、Ｒａｓ、ＥＦＧＲ、Ｋｉｔ、ｐＴＥＮ、および／もしくはｐ５３における少なくとも１つの突然変異、ならびに／または少なくとも１つのＫＲＡＳもしくはＮＲＡＳ突然変異を含む、項１１６～１３４のいずれか一項に記載の方法。
１３６．増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、項１１６～１３５のいずれか一項に記載の方法。
１３７．ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である、項１３６に記載の方法。
１３８．第３のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドのＴｍよりも８～１２℃高いＴｍを有し、ＰＣＲが、第１のオリゴヌクレオチドのＴｍの５℃以内であるアニーリング温度で実施される、項１３６または１３７に記載の方法。
１３９．方法が、少なくとも第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチドを含有する第１の容器と、第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キットを使用して実施される、項１１６～１３８のいずれか一項に記載の方法。
１４０．方法が、突然変異を示す標的バリアントヌクレオチドを検出し、試験ポリヌクレオチド試料が、標的ポリヌクレオチドの１～１０コピーを含む、項１１６～１３９のいずれか一項に記載の方法。
１４１．標的バリアントヌクレオチドが、プリン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるプリン塩基を含む、項１１６～１４０のいずれか一項に記載の方法。
１４２．標的バリアントヌクレオチドが、ピリミジン塩基を含み、標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるピリミジン塩基を含む、項１１６～１４０のいずれか一項に記載の方法。
１４３．試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と項１～９４、１０４、１０５、および１０９～１１１のいずれか一項に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成されたアンプリコンを、第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）においてアンプリコンを検出することが、標的ポリヌクレオチド分子が試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
１４４．試験ポリヌクレオチド試料において、各々が標的バリアントヌクレオチドを含む、少なくとも２つの異なる標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と項５３または５４に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第１の標的ポリヌクレオチド分子の第１の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）第４および第５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第２の標的ポリヌクレオチド配列の第２のアンプリコンを生成することと、
ｄ）ステップｂ）およびｃ）において生成されたアンプリコンを、第３および第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｄ）においてアンプリコンを検出することが、第１および／または第２の標的ポリヌクレオチド分子が試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
１４５．第３および第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性が、蛍光標識である、項１４４に記載の方法。
１４６．第３および第６のオリゴヌクレオチドの各々の上の蛍光標識が異なる、項１４５に記載の方法。
１４７．混合物が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、項１～１１２のいずれか一項に記載の混合物。
１４８．キットが、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異の検出のために使用される、項１１３～１１５のいずれか一項に記載のキット。
１４９．方法が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、項１１６～１４６のいずれか一項に記載の方法。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
〔２〕ｃ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第３の配列が、前記標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、前記〔１〕に記載の混合物。
〔３〕ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、前記第３の配列（Ｃ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
〔４〕ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第５の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、前記第５の配列（Ｅ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖における前記第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、前記第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、前記〔２〕に記載の混合物。
〔５〕前記第３のオリゴヌクレオチドにおける前記標的バリアントヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔６〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、前記〔２〕、〔４〕、および〔５〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔７〕前記検出可能な標識が、蛍光標識である、前記〔６〕に記載の混合物。
〔８〕前記検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、前記〔６〕または〔７〕に記載の混合物。
〔９〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、前記〔６〕～〔８〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１０〕前記消光部分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、前記〔９〕に記載の混合物。
〔１１〕前記消光部分が、前記検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、前記〔９〕または〔１０〕に記載の混合物。
〔１２〕前記第１の末端ヌクレオチドが、５’末端ヌクレオチドである、前記〔１０〕に記載の混合物。
〔１３〕前記第２の末端ヌクレオチドが、３’末端ヌクレオチドである、前記〔１０〕に記載の混合物。
〔１４〕前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔１５〕配列Ａ、Ｅ、およびＣが、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖上の一本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、前記〔４〕に記載の混合物。
〔１６〕前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔１７〕前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、配列ＤおよびＢが、前記標的相補体ポリヌクレオチド鎖上の前記二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置し、配列Ａ、Ｅ、およびＣが、前記標的ポリヌクレオチド鎖上の前記二本鎖ポリヌクレオチド分子内に位置している、前記〔４〕に記載の混合物。
〔１８〕前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、二本鎖ポリヌクレオチド分子が、バリアントポリヌクレオチド鎖およびバリアント相補体ポリヌクレオチド鎖を含み、前記バリアントポリヌクレオチド鎖が、前記標的ポリヌクレオチド鎖と実質的に同一であり、前記標的ポリヌクレオチド鎖とは前記標的バリアントヌクレオチドで異なるヌクレオチドを含み、前記バリアント相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記バリアントポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔１９〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１の配列の３～６つの連続するヌクレオチドを含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２０〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１の配列のヌクレオチドの配列と重複しない前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの配列をさらに含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２１〕前記混合物が、第４のオリゴヌクレオチドを含まない、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２２〕前記混合物が、検出可能な標識を含む第４のオリゴヌクレオチドを含まない、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２３〕前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２４〕前記混合物が、検出可能な標識および前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に結合する配列を有する第４のオリゴヌクレオチドを含まない、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２５〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識および前記標的ポリヌクレオチド鎖の配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する混合物における唯一のオリゴヌクレオチドである、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２６〕前記混合物が、３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化カリウムをさらに含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔２７〕塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭである、前記〔２６〕に記載の混合物。
〔２８〕塩化カリウムの濃度が、７０ｍＭ未満である、前記〔２６〕に記載の混合物。
〔２９〕塩化カリウムの濃度が、少なくとも４０ｍＭおよび７０ｍＭ未満である、前記〔２６〕に記載の混合物。
〔３０〕前記混合物が、１０ｍＭ～４０ｍＭの硫酸アンモニウムをさらに含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔３１〕硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭである、前記〔３０〕に記載の混合物。
〔３２〕硫酸アンモニウムの濃度が、３５ｍＭ未満である、前記〔３０〕に記載の混合物。
〔３３〕硫酸アンモニウムの濃度が、少なくとも２０ｍＭおよび３５ｍＭ未満である、前記〔３０〕に記載の混合物。
〔３４〕硫酸アンモニウムの濃度が、２０～２５ｍＭである、前記〔３０〕に記載の混合物。
〔３５〕前記混合物が、
ａ）３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化カリウムの濃度と、
ｂ）１０ｍＭ～４０ｍＭの硫酸アンモニウムの濃度と、をさらに含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔３６〕塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ～７０ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０ｍＭ～３５ｍＭである、前記〔３５〕に記載の混合物。
〔３７〕塩化カリウムの濃度が、４０ｍＭ～４８ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２０～２４ｍＭである、前記〔３５〕に記載の混合物。
〔３８〕塩化カリウムの濃度が、４５ｍＭであり、硫酸アンモニウムの濃度が、２２ｍＭである、前記〔３５〕に記載の混合物。
〔３９〕前記検出可能な標識が、ＤＮＡ結合色素、レポーター色素、蛍光プローブ、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））、テトラクロロフルオレシン（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ（商標））、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（ＪＯＥ（商標））、ＶＩＣ（商標）、カルボキシレート基の代わりにＳＯ 3 を含むフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト形態、ＣＹ５のホスホルアミダイト形態、非ＦＲＥＴ標識、フェロセン試薬、ＡＢＹ（商標）、ＮＥＤ（商標）ＪＵＮ（商標）、Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＹＥ（商標）６６５、ＴＹＥ（商標）７０５、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記〔６〕に記載の混合物。
〔４０〕前記消光部分が、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、非蛍光消光剤（ＮＦＱ）、ブラックホールクエンチャー、アイオワブラッククエンチャー、ＱＳＹ消光剤、ＱＳＹ７消光剤、ＱＳＹ２１消光剤、ダブシルおよび／またはダブシルスルホネート／カルボキシレート消光剤からなる群から選択される、前記〔９〕～〔１１〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔４１〕前記第３のオリゴヌクレオチドのＴ m が、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴ m よりも少なくとも５℃および２５℃以下高い、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔４２〕前記第３のオリゴヌクレオチドのＴ m が、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴ m よりも少なくとも８℃および１２℃以下高い、前記〔４１〕に記載の混合物。
〔４３〕前記第１のオリゴヌクレオチドのＴ m が、前記第２のオリゴヌクレオチドのＴ m の５℃以内である、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔４４〕前記第１のオリゴヌクレオチドのＴ m が、４５～６０℃であり、前記第２のオリゴヌクレオチドのＴ m が、４５～６０℃である、前記〔４２〕または〔４３〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔４５〕前記第１および第２のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔４６〕前記第１および第２のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、前記〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔４７〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔４８〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、プローブである、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔４９〕前記第１、第２、および／または第３のオリゴヌクレオチドが、１０～４０個のヌクレオチドを含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔５０〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔５１〕前記遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、前記〔５０〕に記載の混合物。
〔５２〕前記ＭＧＢ部分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの前記３’末端および／または３’部分に位置している、前記〔５１〕に記載の混合物。
〔５３〕前記混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチドにおける前記第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の前記第１の配列から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第６のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、前記〔２〕に記載の混合物。
〔５４〕前記混合物が、
ａ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列（Ｆ）にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチドにおける前記第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチド（「第２のバリアントヌクレオチド」）を含み、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第２の配列（Ｇ）にハイブリダイズするように構成された第５のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列（Ｈ）に相補的であり、前記標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、前記第３の配列（Ｈ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列（Ｆ）から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｃ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の第４の配列（Ｉ）にハイブリダイズするように構成された第６のオリゴヌクレオチドであって、前記第４の配列（Ｉ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第５の配列（Ｊ）に相補的であり、第５の配列（Ｊ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、前記第５の配列（Ｊ）が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖における前記第１の配列（Ｆ）と少なくとも部分的に重複し、前記第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、前記〔４〕に記載の混合物。
〔５５〕前記第６のオリゴヌクレオチドにおける前記標的バリアントヌクレオチドが、前記第６のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔５６〕前記第６のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、前記〔５３〕、〔５４〕、または〔５５〕に記載の混合物。
〔５７〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、蛍光標識である、前記〔５６〕に記載の混合物。
〔５８〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、前記〔５６〕または〔５７〕に記載の混合物。
〔５９〕前記第６のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、前記〔５３〕、〔５４〕、または〔５６〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔６０〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第６のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、前記〔５９〕に記載の混合物。
〔６１〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、前記〔５９〕または〔６０〕に記載の混合物。
〔６２〕前記第４および第５のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６３〕前記第４および第５のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６４〕前記第６のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６５〕前記第６のオリゴヌクレオチドが、プローブである、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６６〕前記第４、第５、および／または第６のオリゴヌクレオチドが、１０～３０個のヌクレオチドを含む、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６７〕前記第６のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物。
〔６８〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、前記〔６７〕に記載の混合物。
〔６９〕前記第６のオリゴヌクレオチドの前記ＭＧＢ部分が、前記第６のオリゴヌクレオチドの前記３’末端および／または３’部分に位置している、前記〔６８〕に記載の混合物。
〔７０〕前記混合物が、
ａ）前記第１のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第１の配列に実質的にハイブリダイズするように構成され、その３’末端に前記標的バリアントヌクレオチドの相補体とは異なるヌクレオチドを含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第３のオリゴヌクレオチドに相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、前記第５のオリゴヌクレオチドが、前記標的バリアントヌクレオチドの部位に異なるヌクレオチドを含む、第５のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物。
〔７１〕前記異なるヌクレオチドが、その３’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔７２〕前記第５のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、前記〔７０〕または〔７１〕に記載の混合物。
〔７３〕前記第５のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、蛍光標識である、前記〔７２〕に記載の混合物。
〔７４〕
［７４］ 前記第５のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識が、前記第５のオリゴヌクレオチドの第１の末端ヌクレオチド上にある、前記〔７２〕または〔７３〕に記載の混合物。
［７４］ 前記第５のオリゴヌクレオチド上の前記検出可能な標識が、前記第３のオリゴヌクレオチド上の前記検出可能な標識と区別可能である、前記〔７２〕～〔７４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔７５〕前記第５のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、前記〔７２〕～〔７４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔７６〕前記第５のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第５のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、前記〔７５〕に記載の混合物。
〔７７〕前記第５のオリゴヌクレオチドの前記消光部分が、前記第５のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、前記〔７５〕または〔７６〕に記載の混合物。
〔７８〕前記第４のオリゴヌクレオチドが、伸長可能である、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔７９〕前記第４のオリゴヌクレオチドが、プライマーである、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔８０〕前記第５のオリゴヌクレオチドが、伸長不可能である、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔８１〕前記第５のオリゴヌクレオチドが、プローブである、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔８２〕前記第４および第５のオリゴヌクレオチドが、１０～４０個のヌクレオチドを含む、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔８３〕前記第５のオリゴヌクレオチドが、遮断部分を含む、前記〔７０〕に記載の混合物。
〔８４〕前記第５のオリゴヌクレオチドの前記遮断部分が、小溝結合剤（ＭＧＢ）部分である、前記〔８３〕に記載の混合物。
〔８５〕前記第５のオリゴヌクレオチドの前記ＭＧＢ部分が、前記第５のオリゴヌクレオチドの前記３’末端および／または３’部分に位置している、前記〔８４〕に記載の混合物。
〔８６〕複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの前記第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
〔８７〕各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第３の配列が、前記標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、前記〔８６〕に記載の混合物。
〔８８〕複数のオリゴヌクレオチドセットを含む混合物であって、各オリゴヌクレオチドセットが、
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、前記第３の配列（Ｃ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含み、
各セットの前記第１のオリゴヌクレオチドが、異なる第１の配列にハイブリダイズするように構成される、混合物。
〔８９〕各オリゴヌクレオチドセットが、
ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第５の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、前記第５の配列（Ｅ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖における前記第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、前記第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含み、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる第３の配列と配列類似性を共有し、
各セットの前記第３のオリゴヌクレオチドが、異なる区別可能な検出可能な標識を含む、前記〔８８〕に記載の混合物。
〔９０〕前記混合物が、ポリメラーゼをさらに含む、前記〔１〕～〔８９〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔９１〕前記ポリメラーゼが、熱安定性である、前記〔９０〕に記載の混合物。
〔９２〕前記混合物が、ホットスタート成分をさらに含む、前記〔９１〕に記載の混合物。
〔９３〕前記ホットスタート成分が、熱安定性ポリメラーゼに向けられた抗体、オリゴヌクレオチド、アプタマー、および／または前記ポリメラーゼの化学修飾を含む、前記〔９２〕に記載の混合物。
〔９４〕前記混合物が、ヌクレオチド源をさらに含む、前記〔１〕～〔９３〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔９５〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、加水分解プローブである、前記〔１〕～〔９４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔９６〕前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含むことが疑われる核酸試料をさらに含む、前記〔１〕～〔９５〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔９７〕前記標的バリアントヌクレオチドが、突然変異体対立遺伝子内にある、前記〔１〕～〔９６〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔９８〕前記突然変異体対立遺伝子が、前記標的バリアントヌクレオチドにおけるプリンからプリンへの単一点突然変異またはピリミジンからピリミジンへの単一点突然変異のいずれかである、前記〔９７〕に記載の混合物。
〔９９〕前記突然変異体対立遺伝子が、ＫＲＡＳ癌遺伝子の対立遺伝子である、前記〔９７〕または〔９８〕に記載の混合物。
〔１００〕前記突然変異体対立遺伝子が、確率的突然変異である、前記〔９７〕に記載の混合物。
〔１０１〕前記標的バリアントヌクレオチドが、メジャー対立遺伝子バリアントまたはマイナー対立遺伝子バリアントに対応する同一性を有する、前記〔１〕～〔１００〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１０２〕前記標的バリアントヌクレオチドが、１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、前記〔１０１〕に記載の混合物。
〔１０３〕前記標的バリアントヌクレオチドが、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有するマイナー対立遺伝子バリアントの同一性を有する、前記〔１０２〕に記載の混合物。
〔１０４〕前記標的バリアントヌクレオチドが、一塩基多型の位置で発生する、前記〔１〕～〔１０３〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１０５〕前記混合物が、マスターミックスである、前記〔１〕～〔９５〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１０６〕前記マスターミックスが、４～８℃で最大１２ヶ月間安定である、前記〔１０５〕に記載の混合物。
〔１０７〕前記混合物が、反応混合物である、前記〔１〕～〔１０４〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１０８〕前記反応混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列を含むアンプリコンをさらに含む、前記〔１０７〕に記載の混合物。
〔１０９〕前記反応混合物が、任意の他の異なる（例えば、第２の）ポリヌクレオチド鎖の配列を含むアンプリコンを含まない、前記〔１０８〕に記載の混合物。
〔１１０〕前記混合物が、以下：
ａ）少なくとも１つの洗浄剤、
ｂ）グリセロール、および
ｃ）少なくとも１つの参照色素のうちの１つ以上をさらに含む、前記〔１〕～〔１０９〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１１１〕前記混合物が、ウシ血清アルブミンおよび／またはゼラチンをさらに含む、前記〔１〕～〔１１０〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１１２〕前記混合物が、凍結乾燥される、前記〔１〕～〔１０６〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１１３〕任意の前述の態様に記載の混合物を含有する第１の容器と、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有するポリヌクレオチド分子を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キット。
〔１１４〕前記対照ポリヌクレオチド試料が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖全体を含む、前記〔１１３〕に記載のキット。
〔１１５〕前記対照ポリヌクレオチド試料が、前記標的バリアントヌクレオチドにおける前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有しない、前記〔１１３〕に記載のキット。
〔１１６〕試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と前記〔２〕または〔４〕に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも前記第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成された前記アンプリコンを、前記第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）において前記アンプリコンを検出することが、前記標的ポリヌクレオチド分子が前記試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
〔１１７〕前記標的ポリヌクレオチド分子が、ポリヌクレオチド分子の混合物を含む試験ポリヌクレオチド試料において検出され、前記混合物が、前記標的バリアントヌクレオチドの第１のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）、および前記標的バリアントヌクレオチドの第２のバリアント形態を含むポリヌクレオチド分子（「第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、前記〔１１６〕に記載の方法。
〔１１８〕前記試験ポリヌクレオチド試料が、標的ポリヌクレオチド配列を含まないポリヌクレオチド鎖（「非標的ポリヌクレオチド分子」）を含む、前記〔１１６〕または〔１１７〕に記載の方法。
〔１１９〕前記試験試料が、標的ポリヌクレオチド分子よりも多くの非標的ポリヌクレオチド分子を含む、前記〔１１８〕に記載の方法。
〔１２０〕前記標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、前記〔１１６〕～〔１１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２１〕前記非標的ポリヌクレオチド分子が、メジャー対立遺伝子または野生型ポリヌクレオチド配列である、前記〔１１８〕～〔１２０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２２〕前記試験試料が、非標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の標的ポリヌクレオチド分子を含む、前記〔１１８〕～〔１２１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２３〕前記試験試料が、第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子と比較して、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、または０．００１％未満の第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子を含む、前記〔１１７〕～〔１１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２４〕前記第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、突然変異体ポリヌクレオチド配列である、前記〔１１７〕～〔１１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２５〕前記第１のバリアント標的ポリヌクレオチド分子および／または第２のバリアント標的ポリヌクレオチド分子が、野生型ポリヌクレオチド配列である、前記〔１１７〕～〔１１９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２６〕ステップａ）～ｃ）の前の前記第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、前記ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数を富化することをさらに含む、前記〔１１７〕～〔１２５〕に記載の方法。
〔１２７〕前記富化することが、ステップａ）～ｃ）のいずれかにおいて使用されるものと比較して異なる条件を含む増幅反応を含む、前記〔１２６〕に記載の方法。
〔１２８〕前記ポリヌクレオチド試験試料における第１のバリアントポリヌクレオチド分子の数が、前記第２のバリアントポリヌクレオチド分子と比較して、少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍富化される、前記〔１２６〕または〔１２７〕に記載の方法。
〔１２９〕前記富化することが、前記第１のオリゴヌクレオチドの計算された融解温度（Ｔ M ）よりも１２～１６度高い温度での１５～２５サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施される、前記〔１２６〕～〔１２８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３０〕ステップｂ）が、前記第３のオリゴヌクレオチドのＴ M に近く、前記富化することが実施される温度よりも４～６度低い温度での３５～４０サイクルを使用して実施される、前記〔１２６〕～〔１２９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３１〕前記試験ポリヌクレオチド試料が、哺乳動物もしくは非哺乳動物の動物組織もしくは細胞、または植物組織もしくは細胞に由来する、前記〔１１６〕～〔１３０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３２〕前記試料が、唾液、頬組織、皮膚、毛髪、血液、血漿、尿、糞便、精液、および腫瘍試料からなる群から選択される、前記〔１３１〕に記載の方法。
〔１３３〕前記ポリヌクレオチド試験試料が、癌細胞に由来する、前記〔１３１〕または〔１３２〕に記載の方法。
〔１３４〕アンプリコンの検出が、前記試験ポリヌクレオチド試料が由来する組織内の癌細胞の存在を示す、前記〔１３１〕～〔１３３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３５〕前記標的ポリヌクレオチドが、Ｒａｓ、ＥＦＧＲ、Ｋｉｔ、ｐＴＥＮ、および／もしくはｐ５３における少なくとも１つの突然変異、ならびに／または少なくとも１つのＫＲＡＳもしくはＮＲＡＳ突然変異を含む、前記〔１１６〕～〔１３４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３６〕前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、前記〔１１６〕～〔１３５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３７〕前記ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である、前記〔１３６〕に記載の方法。
〔１３８〕前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴｍよりも８～１２℃高いＴｍを有し、前記ＰＣＲが、前記第１のオリゴヌクレオチドのＴｍの５℃以内であるアニーリング温度で実施される、前記〔１３６〕または〔１３７〕に記載の方法。
〔１３９〕前記方法が、少なくとも前記第１のオリゴヌクレオチド、前記第２のオリゴヌクレオチド、および前記第３のオリゴヌクレオチドを含有する第１の容器と、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キットを使用して実施される、前記〔１１６〕～〔１３８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４０〕前記方法が、突然変異を示す標的バリアントヌクレオチドを検出し、前記試験ポリヌクレオチド試料が、前記標的ポリヌクレオチドの１～１０コピーを含む、前記〔１１６〕～〔１３９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４１〕前記標的バリアントヌクレオチドが、プリン塩基を含み、前記標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるプリン塩基を含む、前記〔１１６〕～〔１４０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４２〕前記標的バリアントヌクレオチドが、ピリミジン塩基を含み、前記標的バリアントヌクレオチド位置における対応する野生型ヌクレオチドが、異なるピリミジン塩基を含む、前記〔１１６〕～〔１４０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４３〕試験ポリヌクレオチド試料において標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と前記〔１〕～〔９４〕、〔１０４〕、〔１０５〕、および１０９～１１１のいずれか一項に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）少なくとも前記第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチド分子の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）ステップｂ）において生成された前記アンプリコンを、前記第３のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｃ）において前記アンプリコンを検出することが、前記標的ポリヌクレオチド分子が前記試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
〔１４４〕試験ポリヌクレオチド試料において、各々が標的バリアントヌクレオチドを含む、少なくとも２つの異なる標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と前記〔５３〕または〔５４〕に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ｂ）前記第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第１の標的ポリヌクレオチド分子の第１の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）前記第４および第５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第２の標的ポリヌクレオチド配列の第２のアンプリコンを生成することと、
ｄ）ステップｂ）およびｃ）において生成された前記アンプリコンを、前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｄ）において前記アンプリコンを検出することが、前記第１および／または第２の標的ポリヌクレオチド分子が前記試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。
〔１４５〕前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な特性が、蛍光標識である、前記〔１４４〕に記載の方法。
〔１４６〕前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの各々の上の前記蛍光標識が異なる、前記〔１４５〕に記載の方法。
〔１４７〕前記混合物が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、前記〔１〕～〔１１２〕のいずれか一項に記載の混合物。
〔１４８〕前記キットが、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異の検出のために使用される、前記〔１１３〕～〔１１５〕のいずれか一項に記載のキット。
〔１４９〕前記方法が、表１および／または表２に列挙される１つ以上の突然変異を検出するために使用される、前記〔１１６〕～〔１４６〕のいずれか一項に記載の方法。
Claims (20)
- ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。 - ｃ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第３の配列が、前記標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の混合物。
- 前記第３のオリゴヌクレオチドにおける前記標的バリアントヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、請求項２に記載の混合物。
- 前記第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、請求項２に記載の混合物。
- 前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項４に記載の混合物。
- 前記検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、請求項４に記載の混合物。
- 前記第３のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、請求項４に記載の混合物。
- 前記消光部分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、請求項７に記載の混合物。
- 前記消光部分が、前記検出可能な標識からのシグナルを消光することができる、請求項７に記載の混合物。
- 前記第１の末端ヌクレオチドが、５’末端ヌクレオチドである、請求項８に記載の混合物。
- 前記第２の末端ヌクレオチドが、３’末端ヌクレオチドである、請求項８に記載の混合物。
- 前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、請求項２に記載の混合物。
- 前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、請求項２に記載の混合物。
- 前記混合物が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖および第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の標的相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的であり、二本鎖ポリヌクレオチド分子が、バリアントポリヌクレオチド鎖およびバリアント相補体ポリヌクレオチド鎖を含み、前記バリアントポリヌクレオチド鎖が、前記標的ポリヌクレオチド鎖と実質的に同一であり、前記標的ポリヌクレオチド鎖とは前記標的バリアントヌクレオチドで異なるヌクレオチドを含み、前記バリアント相補体ポリヌクレオチド鎖が、前記バリアントポリヌクレオチド鎖に実質的に相補的である、請求項２に記載の混合物。
- 前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１の配列の３～６つの連続するヌクレオチドを含む、請求項２に記載の混合物。
- 前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１の配列のヌクレオチドの配列と重複しない前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの配列をさらに含む、請求項２に記載の混合物。
- 任意の前述の請求項に記載の混合物を含有する第１の容器と、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖と配列類似性を共有するポリヌクレオチド分子を含む対照ポリヌクレオチド試料を含有する第２の容器と、を含む、キット。
- 試験ポリヌクレオチド試料において、各々が標的バリアントヌクレオチドを含む、少なくとも２つの異なる標的ポリヌクレオチド分子を検出するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験ポリヌクレオチド試料と請求項２に記載の混合物との反応混合物を形成することと、
ここで、前記混合物は、
ｄ）第２の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチドにおける前記第１の配列が、第２の標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第４のオリゴヌクレオチドが、前記第２の標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに含む、第４のオリゴヌクレオチドと、
ｅ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第５のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の前記第１の配列から５’上流に位置している、第５のオリゴヌクレオチドと、
ｆ）前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第６のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第２の標的ポリヌクレオチド鎖上の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第２の標的バリアントヌクレオチドを含む、第６のオリゴヌクレオチドと、をさらに含む、
ｂ）前記第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第１の標的ポリヌクレオチド分子の第１の標的ポリヌクレオチド配列のアンプリコンを生成することと、
ｃ）前記第４および第５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅反応を実施して、前記試験ポリヌクレオチド試料に存在する場合、第２の標的ポリヌクレオチド分子の第２の標的ポリヌクレオチド配列の第２のアンプリコンを生成することと、
ｄ）ステップｂ）およびｃ）において生成された前記アンプリコンを、前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの検出可能な特性における変化を検出することによって検出することと、を含み、
ステップｄ）において前記アンプリコンを検出することが、前記第１および／または第２の標的ポリヌクレオチド分子が前記試験ポリヌクレオチド試料内に存在することを示す、方法。 - 前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの前記検出可能な特性が、蛍光標識である、請求項１８に記載の方法。
- 前記第３および第６のオリゴヌクレオチドの各々の上の前記蛍光標識が異なる、請求項１９に記載の方法。
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