JPWO2020014538A5

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Publication number: JPWO2020014538A5
Application number: JP2021500591A
Authority: JP
Publication date: 2022-07-19

Claims

ａ）第一のマイクロ流体デバイスに標的細胞を含む流体組成物を適用し、ここで標的細胞は１以上の形質転換剤を含むエレクトロポレーションバッファー中にあるか、または１以上の形質転換剤を含むエレクトロポレーションバッファーに移動される、そしてデバイスを介して標的細胞を流す工程；
ｂ）それらがデバイスを介して、またはデバイスの出口に接続されている導管中を流れるときに標的細胞をエレクトロポレーションする工程、ここで電場がデバイスまたは導管に沿って１以上の領域で生成され、かつ電場はフロー方向に垂直である；
ｃ）エレクトロポレーションバッファーおよび形質転換剤からそれらを除去するためにエレクトロポレーションされた細胞を分離する工程、
を含む、標的細胞の集団を操作する方法。
標的細胞が、デバイスの出口に接続されている導管中でエレクトロポレーションされる、請求項１に記載の方法。
エレクトロポレーションされた細胞が、第二のマイクロ流体デバイスでエレクトロポレーションバッファーおよび形質転換剤から分離される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
第二のマイクロ流体デバイスが導管により第一のマイクロ流体デバイスに接続されており、かつ前記方法が第一のマイクロ流体デバイスに標的細胞を適用することから、第二のマイクロ流体デバイスでエレクトロポレーションバッファーおよび形質転換剤からそれらを除去するためのエレクトロポレーションされた細胞の分離することまでの単一の連続プロセスとして実行される、請求項３に記載の方法。
工程ａ）において、標的細胞が粗流体組成物中にあり、ここで粗流体組成物が、血液、血液以外の生体液、アフェレーシス試料もしくは血液由来のその他の産物、成長培地または細胞培養培地からなる群から選択される、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の方法。
標的細胞が幹細胞または白血球であり、かつ第一のマイクロ流体デバイスに適用される前に前記細胞が血液、血液以外の生体液、アフェレーシス試料もしくは血液由来のその他の産物、成長培地または細胞培養培地から精製される、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の方法。
細胞が決定論的横置換により、またはマイクロビーズを用いて単離される、請求項６に記載の方法。
細胞が、標的細胞に特異的に結合する物質を保有する磁性マイクロビーズを使用して単離される、請求項６に記載の方法。
標的細胞に特異的に結合する物質が抗体である、請求項８に記載の方法。
ａ）標的細胞が、標的細胞とは異なるサイズの混入物質粒子および／または細胞も含む粗流体組成物中にあり；
ｂ）標的細胞が、第一のマイクロ流体デバイスで決定論的横置換（ＤＬＤ）を実行することにより、粗流体組成物における混入物質粒子および／または細胞から分離される、
ここで前記デバイスは：
ｉ）試料入口から少なくとも２つの流体出口まで延びる少なくとも１つのチャネルであって、ここでチャネルは第一の壁および第一の壁と反対側の第二の壁により囲まれている、チャネル；
ｉｉ）チャネルにおいていくつもの行をなして配列されている障害物のアレイであって、障害物のそれぞれの次の行が前の行に対して横方向へシフトしており、ここで、粗流体組成物が、デバイスの入口に適用され、チャネルを流体的に通過するときに標的細胞が１以上の産物出口に流れ、そこで標的細胞が濃縮された産物がデバイスを出ていき、かつ標的細胞と異なるサイズの混入物質細胞または粒子が産物出口とは別の１以上の廃棄物出口に流れるような様式で前記障害物が配置されている、アレイ；
を含む、
請求項１－９のいずれか一項に記載の方法。
混入物質粒子または細胞が廃棄物出口でデバイスから出て行き、標的細胞が産物出口でデバイスから出て行き、導管へ流れ、導管を通り、その間の時間でそれらがエレクトロポレーションされる、請求項１０に記載の方法。
粗流体組成物が、標的細胞として幹細胞または白血球を含み、混入物質細胞として血小板および／または赤血球を含む、請求項１１に記載の方法。
標的細胞がＴ細胞であり、第一のマイクロ流体デバイスでの分離の前、間、および／または後に、かつエレクトロポレーション前に、白血球が、アクチベーターに結合する、請求項１２に記載の方法。
アクチベーターが、結合していないか、担体に結合しているか、または磁性マイクロビーズに結合している抗体である、請求項１３に記載の方法。
標的細胞が抗ＣＤ３および／またはＣＤ２８抗体でコートされた磁性ビーズを用いて活性化される、請求項１３に記載の方法。
形質転換剤が核酸および／またはＣａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体を含む、請求項１－１５のいずれか一項に記載の方法。
第一のマイクロ流体デバイスに標的細胞を適用する前に、またはエレクトロポレーション前にＦｉｃｏｌｌ遠心分離工程を含まない、請求項１－１６のいずれか一項に記載の方法。
ＣＡＲＴ細胞を産生するために使用される、請求項１－１７のいずれか一項に記載の方法。