JPWO2019233285A5

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Publication number: JPWO2019233285A5
Application number: JP2020568229A
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Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2039-05-23

Description

図１は、ヒトＬＶＮＣ心筋細胞の遺伝的および機能的特性を示す。図１Ａ：ＴＮＮＴ２（Ｒ１４１Ｗ）およびＭＹＰＮ（Ｓ１２９６Ｔ）におけるヘテロ接合型ミスセンス変異を有するＬＶＮＣ家族の患者のｈｉＰＳＣ（患者：ＬＶＮＣ＃１：ｉＦ＆ＬＶＮＣ＃２：ｉＨ）に由来するヒト心筋細胞は、健康な患者（ｉＭ）に由来するヒト心筋細胞と比較して、インビトロでの分化後７０日目に心筋細胞収縮の減少が観察される。図１Ｂ：細胞短縮速度は、健康なヒト心筋細胞（ｉＭ）では筋細胞の成熟中（３０日目から７０日目）に著しく増加するが、ＬＶＮＣ患者の心筋細胞（ｉＦａ＆ｉＨ）では徐々に減少している。図１Ｃ：ＬＶＮＣ患者の心筋細胞（ｉＦａ＆ｉＨ）は、インビトロでイソプレナリン（β－アドレナリン受容体アゴニスト）に対する陽性変力反応を失う。図１Ｄ：ミトコンドリア呼吸機能の低下は、健康群（ｉＭ）と比較してＬＶＮＣ心筋細胞（ｉＨ）で見られる。ＯＣＲは酸素消費率を示し、ＥＣＡＲは細胞外酸性化率を示す。ＯＣＲはミトコンドリアの呼吸率を測定する。ＥＣＡＲは解糖速度を測定する。ＦＣＣＰはカルボニルシアニド４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾンである。図１Ｅ：ＬＶＮＣ心筋細胞では、オミクス分析（ＲＮＡシーケンシングによるトランスクリプトーム（Ｔ）およびＬＣＭＳ／ＭＳによるプロテオーム（Ｐ）を含む）により、ＬＶＮＣ心筋細胞における特定のエピジェネティックレギュレーターと構造遺伝子（ＧＯＢＰ：クロマチン組織（Ｔ：クラスター［４］＆Ｐ：クラスター［１０］）およびＧＯＢＰ：アクチンフィラメントバンドル（Ｔ：クラスター［７］＆Ｐ：クラスター［２］）を含む）のアップレギュレーションに関連して、ミトコンドリア呼吸鎖および代謝過程（（１）ＧＯＢＰ（ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｃｅｓｓ、遺伝子オントロジー生物学的過程）：グルコース代謝過程（Ｔ：クラスター［３］＆Ｐ：クラスター［１］）、（２）ＧＯＣＣ（ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙＣｅｌｌｕｌａｒＣｏｍｐｏｎｅｎｔ）：アクチンフィラメントバンドル（Ｔ：クラスター［６］＆Ｐ：クラスター［６］）、（３）ＧＯＢＰ：筋肉の収縮（Ｔ：クラスター［８］＆Ｐ：クラスター［４］）を含む）の抑制と一致する堅牢な遺伝子／タンパク質パターンが明らかになる。図１Ｆ：２Ｄ濃縮分析では、ＬＶＮＣ心筋細胞の筋肉の収縮（上のパネル）とミトコンドリア呼吸鎖（下のパネル）に関与する機能遺伝子の異常な発現が見つかる。図中、Ｈは、健康対照であり、ｉＨは、ＬＶＮＣ＃２対照である。図２は、ヒトＬＶＮＣ心筋細胞のエピジェネティックな異常が心機能障害に関連していることを示す。図２Ａ：ＳＴＲＩＮＧ機能的なタンパク質相互作用ネットワークは、図１Ｅ～１Ｆのオミクス分析から大幅に変更された分子によって構築される。ＳＭＹＤ１は、筋肉の遺伝子発現の調節に関連する。エピジェネティックレギュレーターＰＣＲ２（ＥＺＨ２／ＳＵＺ１２／ＥＰＣ１を含む）は、ミトコンドリア呼吸鎖と代謝過程の遺伝子発現の調節に関与する。図２Ｂ：リアルタイムＰＣＲの絶対定量化は、エピジェネティックレギュレーターの発現を検証するために実行される。１８Ｓは、内部ローディング対照として使用される。ＥＺＨ２発現の有意な増加は、ｉＦａ－およびｉＨ－ＬＶＮＣ心筋細胞で見られる。ＥＺＨ２は、メチルトランスフェラーゼとして機能するか、他のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を動員して、エピジェネティックな修飾を生成することができる。図２Ｃ：ゼブラリン（ｚｅｂ、ＤＮＭＴ阻害剤、５０μＭ）は、ＬＶＮＣ心筋細胞のＯＣＲおよびＥＣＡＲを改善することができる。ＧＳＫ５０３（ｇｓｋ、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ阻害剤、５μＭ）は、ＬＶＮＣ心筋細胞のＯＣＲまたはＥＣＡＲを大幅に改善しない。これらの結果から、ＬＶＮＣにおける異常なエピジェネティックな作用を媒介するのは、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼではなく、ＥＺＨ２で動員されたＤＮＭＴであることを示す。したがって、ＤＮＭＴの動員を減らすことによって心臓エピジェネティクスを正常化するためのユニークな治療戦略は、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性を直接阻害するのではなく、ＬＶＮＣ筋細胞におけるＥＺＨ２ダウンレギュレーターによるＥＺＨ２の異常なアップレギュレーションを阻害するはずである。ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、病状特異的作用の利点で、ＬＶＮＣ心筋細胞の心機能を回復させることができる。図中、ｉＨ，ｃｔｒｌは、治療なしのＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｚｅｂは、ゼブラリンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｇｓｋは、ＧＳＫ５０３で処理されたＬＶＮＣ心筋細胞である。図３は、シンバスタチンが、ＬＶＮＣ心筋細胞における異常なＥＺＨ２過剰発現を弱め、心臓機能を回復することができるＥＺＨ２ダウンレギュレーターの１つとして識別されることを示す。図３Ａ：ドラッグリポジショニングスクリーニングにより、シンバスタチンがＬＶＮＣ心筋細胞におけるＥＺＨ２発現を選択的に正常化できることがわかる。図３Ｂ：シンバスタチン（５μＭ）は、最小から最大のプロット（ボックス内の平均線とＳＥＭのエラーバーを含む）に示されているように、イソプレナリン（３回の投与：０．０３、０．１、１μＭ）によって誘発されたβ刺激に対する心臓収縮と陽性変力反応を有意に回復することができる。５μＭの同じ濃度で、シンバスタチンの有効性は、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチンなどの他のスタチンの有効性よりも優れている。心臓機能遺伝子発現の回復のために異常なヒストンメチル化を阻害する戦略に加えて、ヒストンのアセチル化状態を維持することによって遺伝子発現も回復できるかどうかをさらに調べる。ＳＡＨＡ（ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、５μＭ）はＬＶＮＣ心臓機能を改善できないことが実証されている。図３Ｃ：シンバスタチン（５μＭ）は、ＬＶＮＣ心筋細胞のミトコンドリア機能を著しく改善することができる。シンバスタチンは、心臓代謝機能の改善における低用量（５μＭ）での効果が高用量（１０μＭ）での効果よりも優れている。図３Ｄ：シンバスタチンは、ＣＹＢ５Ｒ２やＣＹＢＲＤ１のようなミトコンドリア呼吸鎖遺伝子の発現を回復させることができる。ゼブラリン（ｚｅｂ、１００μＭ）は、シンバスタチンと同様の効果を生み出すことができる。図３Ｅ：シンバスタチンは、用量依存的に心臓代謝遺伝子の発現を回復させることができる。図中、対照は、治療なしのＬＶＮＣ心筋細胞であり、シンバスタチンは、シンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ＳＡＨＡは、ＳＡＨＡで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、アトルバスタチンは、アトルバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、フルバスタチンは、フルバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ロバスタチンは、ロバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｃｔｒｌは、治療なしのＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｓ５は、５μＭシンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｓ１０は、１０μＭシンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｓは、シンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｚｅｂは、ゼブラリンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＭは、健康なヒト心筋細胞であり、ｉＨは、ＬＶＮＣ心筋細胞である。図４は、シンバスタチンがＬＶＮＣ心筋細胞の正常な細胞サイズ、心臓の代謝および筋肉タンパク質の発現を維持できることを示す。図４Ａ：シンバスタチン（５μＭ）は、ＬＶＮＣ心筋細胞の拡大を阻害することができる。ＳＡは、サルコメアアクチニンαであり、ＴＮＮＴ２は、トロポニンＴであり、ＤＡＰＩは、核対比染色である。図４Ｂ：シンバスタチンの有りまたは無しで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞のプロテオミクスの階層的クラスタリングプロットと主成分分析から、シンバスタチン治療群のタンパク質プロファイルは、健康群のタンパク質プロファイルに著しく近づいている。図４Ｃ：ＳＴＲＩＮＧ機能的タンパク質相互作用ネットワークは、健康／ｉＨ，ｃｔｒｌとｉＨ，ｓ／ｉＨ，ｃｔｒｌの両方とも高度に発現される６９種のタンパク質の交差点における機能的タンパク質の主要な回復を強調する。回復されたタンパク質は、筋肉の収縮、細胞構造、プロモーター活性、およびグルコース代謝に関与する。図４Ｄ：２人のＬＶＮＣ患者（ｉＦａ＆ｉＨ）間のＬＶＮＣ心筋細胞のタンパク質プロファイリングに対するシンバスタチンの同じ効果と、タンパク質の機能がさらに特徴づけられる。ｉＦ，ｓ／ｉＦ，ｃｔｒｌとｉＨ，ｓ／ｉＨ，ｃｔｒｌの両方で有意にアップレギュレートされる２７種のタンパク質がある。遺伝子オントロジーのＧＯ濃縮分析では、タンパク質機能の大部分は、代謝過程、細胞構成要素の構成、および生物調節の上位３つが含まれていることがわかる。図中、ｉＨ，ｃｔｒｌは、治療を受けていないｉＨ患者のＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｓは、シンバスタチンで治療されたｉＨ患者からのＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＦａ，ｃｔｒｌは、治療を受けていないｉＦａ患者のＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＦａ，ｓは、シンバスタチンで治療されたｉＦａ患者からのＬＶＮＣ心筋細胞である。図５は、シンバスタチンが、遺伝子標的ノックインＴｎｎｔ２（Ｒ１５４Ｗ）およびＭｙｐｎ（Ｓ１２９１Ｔ）の変異に関するヘテロ接合（Ｔｎｎｔ２^{Ｒ１５４Ｗ／＋}：：Ｍｙｐｎ^{Ｓ１２９１Ｔ／＋}）ＬＶＮＣマウスのインビボでの心臓代謝および心機能を有意に改善することを示す。図５Ａ：動的小動物^１８Ｆ－ＦＤＧＰＥＴスキャンを実施して、シンバスタチンの有りまたは無しで治療されたＴｎｎｔ２^{Ｒ１５４Ｗ／＋}：：Ｍｙｐｎ^{Ｓ１２９１Ｔ／＋}ＬＶＮＣマウスの左心室のグルコース代謝率（ＭＲＧｌｕ）を推定する。異なる年齢の１０、１２、１４週齢のＴｎｎｔ２^{Ｒ１５４Ｗ／＋}：：Ｍｙｐｎ^{Ｓ１２９１Ｔ／＋}ＬＶＮＣマウスに浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴモデル２００６）を移植して、シンバスタチン（３．５ｍｇ／３．６μＬ／ｋｇ／日、青い四角）またはＤＭＳＯ（３．６μＬ／ｋｇ／日、赤い丸）を６週間連続投与する。^１８Ｆ－ＦＤＧＰＥＴスキャンの前に、マウスを１６～２０時間絶食させる。心臓のグルコース代謝率は、空腹時血漿グルコースで補正されたＰａｔｌａｋプロットによって計算される。線形回帰分析を実行して、ＤＭＳＯベヒクル群では、Ｙ＝－１．６６７Ｘ＋３９．３１（Ｒ^２＝０．２５８５、非ゼロ勾配、Ｐ＝０．４９１６）の結果を取得し、シンバスタチン群では、Ｙ＝４．２０５Ｘ－５７．４３（Ｒ^２＝０．９９９８、非ゼロ勾配、Ｐ＝０．００９５）の結果を取得し、ベヒクル群とシンバスタチン群との間で、ＭＲＧｌｕ対年齢の勾配に有意差（Ｐ＝０．００３４）がある。図５Ｂ：ベヒクル（ＤＭＳＯ、３．６μＬ／ｋｇ／日）またはシンバスタチン（３．５ｍｇ／３．６μＬ／ｋｇ／日）で治療されたＬＶＮＣマウスの左心室駆出率（ＬＶＥＦ％）は、タイムラインに示されているように、１～８４日間または１～１２６日間の期間において、薬物送達浸透圧ポンプの移植前日および移植後１２６日目に、心エコー検査（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓＶｅｖｏ２１００システム）によって測定される。線形回帰は、治療が効果的かどうかを判断するために実行される。ベヒクルＤＭＳＯ群において、傾きはゼロから有意的な偏差がない（Ｙ＝０．０１０１３＊Ｘ＋３２．０６、Ｐ＝０．７７６９、Ｒ^２＝０．０１７５７、ｎ＝４）。１２６日間の連続シンバスタチン治療群（Ｓ（ｄ１－１２６））では、勾配はゼロから大幅にずれている（Ｙ＝０．１０９８＊Ｘ＋２９．５５、Ｐ＝０．０２９７、Ｒ^２＝０．６４４５、ｎ＝４）。Ｓ（ｄ１－８４）群では、ＬＶＮＣマウスは最初の８４日間でシンバスタチンで治療し、その後、さらに４２日間で薬物治療を中止する（休薬期間）。Ｓ（ｄ１－８４）群の心臓機能変化の勾配は、ゼロから大きくずれていない（Ｙ＝０．０５０３１＊Ｘ＋３１．９５、Ｐ＝０．１３２６、Ｒ^２＝０．３３５２、ｎ＝４）。これは、ＬＶＮＣ心臓機能の良好な予後を維持するために、継続的な低用量シンバスタチン治療が必要であることを示す。図中、ベヒクルは、ＤＭＳＯで処理されたＬＶＮＣマウスであり、シンバスタチンは、シンバスタチンで治療されたＬＶＮＣマウスであり、対照は、治療なしのＬＶＮＣマウスであり、ＤＭＳＯは、ＤＭＳＯで処理されたＬＶＮＣマウスである。図６は、シンバスタチン（１～５μＭ）が、（図６Ａ）バース症候群（ＴＡＺ（ｃ．１５３Ｃ＞Ｇ、ＮＭ＿０００１１６．４）および（図６Ｂ）デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー（ＤＭＤ（ｃ．１０９９７＿１０９９９ｄｅｌＣＣＴ、ＮＭ＿００４００６．２））のような合併症を伴う他のＬＶＮＣ患者に由来するＬＶＮＣ心筋細胞のミトコンドリア機能も改善できることを示す。図中、対照は、治療なしのＬＶＮＣ心筋細胞であり、Ｓ１μＭは、１μＭシンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、Ｓ５μＭは、５μＭシンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞である。

Claims

ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量を含む、対象における心筋緻密化障害を治療するための医薬組成物。
前記心筋緻密化障害は、左心室緻密化障害を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
前記ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量は、病原性突然変異で引き起こされるＥＺＨ２過剰発現を阻害することにより、心筋緻密化障害を治療するのに十分である、請求項１に記載の医薬組成物。
前記ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量は、心臓機能を改善することにより、心筋緻密化障害を治療するのに十分である、請求項１に記載の医薬組成物。
前記心臓機能は、心臓代謝および心室機能を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
前記ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、少なくとも４週間、毎日対象に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
前記ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、スタチンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
前記スタチンはシンバスタチンである、請求項７に記載の医薬組成物。
前記対象は心筋緻密化障害に罹患しているヒトである、請求項１に記載の医薬組成物。
前記ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にある、請求項１に記載の医薬組成物。
前記シンバスタチンの治療上有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にある、請求項８に記載の医薬組成物。