JP2021525782A

JP2021525782A - 心筋緻密化障害の治療方法

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Publication number: JP2021525782A
Application number: JP2020568229A
Authority: JP
Inventors: 陳文彬; 呉美環; 何弘能
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Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2021-09-27
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Abstract

心筋緻密化障害（ｎｏｎ−ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ、ＮＣＣ）に罹患している対象に、スタチンを含むＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量を含有する医薬組成物を投与することによる、心筋緻密化障害に罹患している対象を治療する方法。【選択図】図５Ｂ

Description

発明の分野
本発明は、心筋緻密化障害（ＮＣＣ）に罹患している対象を治療する方法であって、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量を含む医薬組成物を上記の対象に投与することを含む方法に関する。特に、上記のＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、ＮＣＣの病原性突然変異によって誘発されるＥＺＨ２の過剰発現を阻害することができ、その結果、エピジェネティックな変化を引き起こすＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）の動員を減少させる。したがって、上記のＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、左心室心筋緻密化障害（ＬＶＮＣ）における機能的な遺伝子発現を回復することにより、心臓代謝および疾患の進行を改善することができる。

先行技術の説明
左心室心筋緻密化障害（ＬＶＮＣ）は、特に左心室の心尖部に異常な小柱形成を伴う海綿状の左心室（ＬＶ）心筋を特徴とする明確な心筋症である。人口調査によると、新たに診断された症例の平均年間発生率は、１０歳未満の子供１０万人あたり０．１１であり、生後１年で最も高かった（乳児１０万人あたり０．８３）。診断から１０年後に死亡または移植がなかったのはわずか４８％であった。通常、乳児期初期に主な拡張表現型の症状を示した子供は、長期転帰がさらに悪化した。ＬＶＮＣは、孤立した状態として現れるか、先天性心疾患、神経筋疾患、または遺伝性症候群に関連する可能性がある。ＬＶＮＣの病因に関与する遺伝子変異には、ＭＩＢ１、ＴＢＸ２０、ＴＡＺとＬＭＮＡの２つのカルシウム処理遺伝子、ＮＵＭＢ／ＮＵＭＢＬ、ミトコンドリアゲノム変異（遠位２２ｑ１１・２）、およびサルコメアをコードする遺伝子（ＭＹＨ７、ＡＣＴＣ１、ＴＮＮＴ２、ＭＹＢＰＣ３、ＴＰＭ１、ＬＤＢ３、およびＴＮＮＩ３）の変異が含まれる。心血管代謝機能障害は、ＬＶＮＣの病態生理学の一部としても説明されている。

心不全を伴うＬＶＮＣの最先端の治療法には、血栓塞栓症を予防するためのうっ血防止薬（利尿薬、ＡＣＥ阻害薬、ＡＴ１受容体遮断薬、ベータ遮断薬）と抗血小板療法が含まれる。医学的管理に失敗した人のために、心臓移植が考慮される。一部の患者では最初に左心室機能が改善されたにもかかわらず、６．３年の中央値間隔で後期悪化が依然として発生してしまった。そのような患者の予後不良を改善するために、精密医療は、新しい治療法を特定するための別の戦略的アプローチを効果的に提供することが可能である。

発明の概要
本発明は、ＮＣＣに罹患している対象に、ＥＺＨ２ダウンレギュレーター、例えばスタチン、特にシンバスタチンの治療上有効量を含む医薬組成物を投与することを含む、心筋緻密化障害（ＮＣＣ）に罹患している対象を治療する方法を提供する。

図１は、ヒトＬＶＮＣ心筋細胞の遺伝的および機能的特性を示す。図１Ａ：ＴＮＮＴ２（Ｒ１４１Ｗ）およびＭＹＰＮ（Ｓ１２９６Ｔ）におけるヘテロ接合型ミスセンス変異を有するＬＶＮＣ家族の患者のｈｉＰＳＣ（患者：ＬＶＮＣ＃１：ｉＦ＆ＬＶＮＣ＃２：ｉＨ）に由来するヒト心筋細胞は、健康な患者（ｉＭ）に由来するヒト心筋細胞と比較して、インビトロでの分化後７０日目に心筋細胞収縮の減少が観察される。図１Ｂ：細胞短縮速度は、健康なヒト心筋細胞（ｉＭ）では筋細胞の成熟中（３０日目から７０日目）に著しく増加するが、ＬＶＮＣ患者の心筋細胞（ｉＦａ＆ｉＨ）では徐々に減少している。図１Ｃ：ＬＶＮＣ患者の心筋細胞（ｉＦａ＆ｉＨ）は、インビトロでイソプレナリン（β−アドレナリン受容体アゴニスト）に対する陽性変力反応を失う。図１Ｄ：ミトコンドリア呼吸機能の低下は、健康群（ｉＭ）と比較してＬＶＮＣ心筋細胞（ｉＨ）で見られる。ＯＣＲは酸素消費率を示し、ＥＣＡＲは細胞外酸性化率を示す。ＯＣＲはミトコンドリアの呼吸率を測定する。ＥＣＡＲは解糖速度を測定する。ＦＣＣＰはカルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾンである。図１Ｅ：ＬＶＮＣ心筋細胞では、オミクス分析（ＲＮＡシーケンシングによるトランスクリプトーム（Ｔ）およびＬＣＭＳ／ＭＳによるプロテオーム（Ｐ）を含む）により、ＬＶＮＣ心筋細胞における特定のエピジェネティックレギュレーターと構造遺伝子（ＧＯＢＰ：クロマチン組織（Ｔ：クラスター［４］＆Ｐ：クラスター［１０］）およびＧＯＢＰ：アクチンフィラメントバンドル（Ｔ：クラスター［７］＆Ｐ：クラスター［２］）を含む）のアップレギュレーションに関連して、ミトコンドリア呼吸鎖および代謝過程（（１）ＧＯＢＰ（ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｃｅｓｓ、遺伝子オントロジー生物学的過程）：グルコース代謝過程（Ｔ：クラスター［３］＆Ｐ：クラスター［１］）、（２）ＧＯＣＣ（ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙＣｅｌｌｕｌａｒＣｏｍｐｏｎｅｎｔ）：アクチンフィラメントバンドル（Ｔ：クラスター［６］＆Ｐ：クラスター［６］）、（３）ＧＯＢＰ：筋肉の収縮（Ｔ：クラスター［８］＆Ｐ：クラスター［４］）を含む）の抑制と一致する堅牢な遺伝子／タンパク質パターンが明らかになる。図１Ｆ：２Ｄ濃縮分析では、ＬＶＮＣ心筋細胞の筋肉の収縮（上のパネル）とミトコンドリア呼吸鎖（下のパネル）に関与する機能遺伝子の異常な発現が見つかる。図中、Ｈは、健康対照であり、ｉＨは、ＬＶＮＣ＃２対照である。図２は、ヒトＬＶＮＣ心筋細胞のエピジェネティックな異常が心機能障害に関連していることを示す。図２Ａ：ＳＴＲＩＮＧ機能的なタンパク質相互作用ネットワークは、図１Ｅ〜１Ｆのオミクス分析から大幅に変更された分子によって構築される。ＳＭＹＤ１は、筋肉の遺伝子発現の調節に関連する。エピジェネティックレギュレーターＰＣＲ２（ＥＺＨ２／ＳＵＺ１２／ＥＰＣ１を含む）は、ミトコンドリア呼吸鎖と代謝過程の遺伝子発現の調節に関与する。図２Ｂ：リアルタイムＰＣＲの絶対定量化は、エピジェネティックレギュレーターの発現を検証するために実行される。１８Ｓは、内部ローディング対照として使用される。ＥＺＨ２発現の有意な増加は、ｉＦａ−およびｉＨ−ＬＶＮＣ心筋細胞で見られる。ＥＺＨ２は、メチルトランスフェラーゼとして機能するか、他のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を動員して、エピジェネティックな修飾を生成することができる。図２Ｃ：ゼブラリン（ｚｅｂ、ＤＮＭＴ阻害剤、５０μＭ）は、ＬＶＮＣ心筋細胞のＯＣＲおよびＥＣＡＲを改善することができる。ＧＳＫ５０３（ｇｓｋ、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ阻害剤、５μＭ）は、ＬＶＮＣ心筋細胞のＯＣＲまたはＥＣＡＲを大幅に改善しない。これらの結果から、ＬＶＮＣにおける異常なエピジェネティックな作用を媒介するのは、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼではなく、ＥＺＨ２で動員されたＤＮＭＴであることを示す。したがって、ＤＮＭＴの動員を減らすことによって心臓エピジェネティクスを正常化するためのユニークな治療戦略は、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性を直接阻害するのではなく、ＬＶＮＣ筋細胞におけるＥＺＨ２ダウンレギュレーターによるＥＺＨ２の異常なアップレギュレーションを阻害するはずである。ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、病状特異的作用の利点で、ＬＶＮＣ心筋細胞の心機能を回復させることができる。図中、ｉＨ，ｃｔｒｌは、治療なしのＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｚｅｂは、ゼブラリンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｇｓｋは、ＧＳＫ５０３で処理されたＬＶＮＣ心筋細胞である。図３は、シンバスタチンが、ＬＶＮＣ心筋細胞における異常なＥＺＨ２過剰発現を弱め、心臓機能を回復することができるＥＺＨ２ダウンレギュレーターの１つとして識別されることを示す。図３Ａ：ドラッグリポジショニングスクリーニングにより、シンバスタチンがＬＶＮＣ心筋細胞におけるＥＺＨ２発現を選択的に正常化できることがわかる。図３Ｂ：シンバスタチン（５μＭ）は、最小から最大のプロット（ボックス内の平均線とＳＥＭのエラーバーを含む）に示されているように、イソプレナリン（３回の投与：０．０３、０．１、１μＭ）によって誘発されたβ刺激に対する心臓収縮と陽性変力反応を有意に回復することができる。５μＭの同じ濃度で、シンバスタチンの有効性は、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチンなどの他のスタチンの有効性よりも優れている。心臓機能遺伝子発現の回復のために異常なヒストンメチル化を阻害する戦略に加えて、ヒストンのアセチル化状態を維持することによって遺伝子発現も回復できるかどうかをさらに調べる。ＳＡＨＡ（ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、５μＭ）はＬＶＮＣ心臓機能を改善できないことが実証されている。図３Ｃ：シンバスタチン（５μＭ）は、ＬＶＮＣ心筋細胞のミトコンドリア機能を著しく改善することができる。シンバスタチンは、心臓代謝機能の改善における低用量（５μＭ）での効果が高用量（１０μＭ）での効果よりも優れている。図３Ｄ：シンバスタチンは、ＣＹＢ５Ｒ２やＣＹＢＲＤ１のようなミトコンドリア呼吸鎖遺伝子の発現を回復させることができる。ゼブラリン（ｚｅｂ、１００μＭ）は、シンバスタチンと同様の効果を生み出すことができる。図３Ｅ：シンバスタチンは、用量依存的に心臓代謝遺伝子の発現を回復させることができる。図中、対照は、治療なしのＬＶＮＣ心筋細胞であり、シンバスタチンは、シンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ＳＡＨＡは、ＳＡＨＡで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、アトルバスタチンは、アトルバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、フルバスタチンは、フルバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ロバスタチンは、ロバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｃｔｒｌは、治療なしのＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｓ５は、５μＭシンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｓ１０は、１０μＭシンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｓは、シンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｚｅｂは、ゼブラリンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＭは、健康なヒト心筋細胞であり、ｉＨは、ＬＶＮＣ心筋細胞である。図４は、シンバスタチンがＬＶＮＣ心筋細胞の正常な細胞サイズ、心臓の代謝および筋肉タンパク質の発現を維持できることを示す。図４Ａ：シンバスタチン（５μＭ）は、ＬＶＮＣ心筋細胞の拡大を阻害することができる。ＳＡは、サルコメアアクチニンαであり、ＴＮＮＴ２は、トロポニンＴであり、ＤＡＰＩは、核対比染色である。図４Ｂ：シンバスタチンの有りまたは無しで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞のプロテオミクスの階層的クラスタリングプロットと主成分分析から、シンバスタチン治療群のタンパク質プロファイルは、健康群のタンパク質プロファイルに著しく近づいている。図４Ｃ：ＳＴＲＩＮＧ機能的タンパク質相互作用ネットワークは、健康／ｉＨ，ｃｔｒｌとｉＨ，ｓ／ｉＨ，ｃｔｒｌの両方とも高度に発現される６９種のタンパク質の交差点における機能的タンパク質の主要な回復を強調する。回復されたタンパク質は、筋肉の収縮、細胞構造、プロモーター活性、およびグルコース代謝に関与する。図４Ｄ：２人のＬＶＮＣ患者（ｉＦａ＆ｉＨ）間のＬＶＮＣ心筋細胞のタンパク質プロファイリングに対するシンバスタチンの同じ効果と、タンパク質の機能がさらに特徴づけられる。ｉＦ，ｓ／ｉＦ，ｃｔｒｌとｉＨ，ｓ／ｉＨ，ｃｔｒｌの両方で有意にアップレギュレートされる２７種のタンパク質がある。遺伝子オントロジーのＧＯ濃縮分析では、タンパク質機能の大部分は、代謝過程、細胞構成要素の構成、および生物調節の上位３つが含まれていることがわかる。図中、ｉＨ，ｃｔｒｌは、治療を受けていないｉＨ患者のＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＨ，ｓは、シンバスタチンで治療されたｉＨ患者からのＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＦａ，ｃｔｒｌは、治療を受けていないｉＦａ患者のＬＶＮＣ心筋細胞であり、ｉＦａ，ｓは、シンバスタチンで治療されたｉＦａ患者からのＬＶＮＣ心筋細胞である。図５は、シンバスタチンが、遺伝子標的ノックインＴｎｎｔ２（Ｒ１５４Ｗ）およびＭｙｐｎ（Ｓ１２９１Ｔ）の変異に関するヘテロ接合（Ｔｎｎｔ２^{Ｒ１５４Ｗ／＋}：：Ｍｙｐｎ^{Ｓ１２９１Ｔ／＋}）ＬＶＮＣマウスのインビボでの心臓代謝および心機能を有意に改善することを示す。図５Ａ：動的小動物^１８Ｆ−ＦＤＧＰＥＴスキャンを実施して、シンバスタチンの有りまたは無しで治療されたＴｎｎｔ２^{Ｒ１５４Ｗ／＋}：：Ｍｙｐｎ^{Ｓ１２９１Ｔ／＋}ＬＶＮＣマウスの左心室のグルコース代謝率（ＭＲＧｌｕ）を推定する。異なる年齢の１０、１２、１４週齢のＴｎｎｔ２^{Ｒ１５４Ｗ／＋}：：Ｍｙｐｎ^{Ｓ１２９１Ｔ／＋}ＬＶＮＣマウスに浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴモデル２００６）を移植して、シンバスタチン（３．５ｍｇ／ｋｇ／３．６μＬ／日、青い四角）またはＤＭＳＯ（３．６μＬ／日、赤い丸）を６週間連続投与する。^１８Ｆ−ＦＤＧＰＥＴスキャンの前に、マウスを１６〜２０時間絶食させる。心臓のグルコース代謝率は、空腹時血漿グルコースで補正されたＰａｔｌａｋプロットによって計算される。線形回帰分析を実行して、ＤＭＳＯベヒクル群では、Ｙ＝−１．６６７Ｘ＋３９．３１（Ｒ^２＝０．２５８５、非ゼロ勾配、Ｐ＝０．４９１６）の結果を取得し、シンバスタチン群では、Ｙ＝４．２０５Ｘ−５７．４３（Ｒ^２＝０．９９９８、非ゼロ勾配、Ｐ＝０．００９５）の結果を取得し、ベヒクル群とシンバスタチン群との間で、ＭＲＧｌｕ対年齢の勾配に有意差（Ｐ＝０．００３４）がある。図５Ｂ：ベヒクル（ＤＭＳＯ、３．６μＬ／日）またはシンバスタチン（３．５ｍｇ／ｋｇ／３．６μＬ／日）で治療されたＬＶＮＣマウスの左心室駆出率（ＬＶＥＦ％）は、タイムラインに示されているように、１〜８４日間または１〜１２６日間の期間において、薬物送達浸透圧ポンプの移植前日および移植後１２６日目に、心エコー検査（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓＶｅｖｏ２１００システム）によって測定される。線形回帰は、治療が効果的かどうかを判断するために実行される。ベヒクルＤＭＳＯ群において、傾きはゼロから有意的な偏差がない（Ｙ＝０．０１０１３＊Ｘ＋３２．０６、Ｐ＝０．７７６９、Ｒ^２＝０．０１７５７、ｎ＝４）。１２６日間の連続シンバスタチン治療群（Ｓ（ｄ１−１２６））では、勾配はゼロから大幅にずれている（Ｙ＝０．１０９８＊Ｘ＋２９．５５、Ｐ＝０．０２９７、Ｒ^２＝０．６４４５、ｎ＝４）。Ｓ（ｄ１−８４）群では、ＬＶＮＣマウスは最初の８４日間でシンバスタチンで治療し、その後、さらに４２日間で薬物治療を中止する（休薬期間）。Ｓ（ｄ１−８４）群の心臓機能変化の勾配は、ゼロから大きくずれていない（Ｙ＝０．０５０３１＊Ｘ＋３１．９５、Ｐ＝０．１３２６、Ｒ^２＝０．３３５２、ｎ＝４）。これは、ＬＶＮＣ心臓機能の良好な予後を維持するために、継続的な低用量シンバスタチン治療が必要であることを示す。図中、ベヒクルは、ＤＭＳＯで処理されたＬＶＮＣマウスであり、シンバスタチンは、シンバスタチンで治療されたＬＶＮＣマウスであり、対照は、ＤＭＳＯで処理されたＬＶＮＣマウスであり、ＤＭＳＯは、ＤＭＳＯで処理されたＬＶＮＣマウスである。図６は、シンバスタチン（１〜５μＭ）が、（図６Ａ）バース症候群（ＴＡＺ（ｃ．１５３Ｃ＞Ｇ、ＮＭ＿０００１１６．４）および（図６Ｂ）デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー（ＤＭＤ（ｃ．１０９９７＿１０９９９ｄｅｌＣＣＴ、ＮＭ＿００４００６．２））のような合併症を伴う他のＬＶＮＣ患者に由来するＬＶＮＣ心筋細胞のミトコンドリア機能も改善できることを示す。図中、対照は、治療なしのＬＶＮＣ心筋細胞であり、Ｓ１μＭは、１μＭシンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞であり、Ｓ５μＭは、５μＭシンバスタチンで処理されたＬＶＮＣ心筋細胞である。

発明の詳細な説明
左心室緻密化障害（ＬＶＮＣ）の病因は、多因子である。左心室緻密化障害（ＬＶＮＣ）の予後は、特に乳児期に発症した人では不良である。うっ血防止薬が失敗した人は、移植を検討する必要がある。満たされていない医療ニーズと移植のための小さな心臓の欠如のために、精密医療は、乳児期に発症する人々によって緊急に必要とされている。本発明は、安全な治療薬を特定するために、ＬＶＮＣ患者のｉＰＳＣ（ＬＶＮＣ−ｈｉＰＳＣ−ＣＭ）に由来するヒト心筋細胞において薬物の転用およびスクリーニングを実施する。さらに、同定された薬剤であるシンバスタチンの効果は、ＬＶＮＣ患者の遺伝子変異に基づく変異マウスにおいてインビボで確認している。このようなアプローチは、重度の心不全表現型を持つこれらのＬＶＮＣ患者に新しい治療アプローチを提供する。

本発明は、ＬＶＮＣ心筋細胞におけるＥＺＨ２の異常な過剰発現を発見する。また、本発明は、シンバスタチンを投与してＥＺＨ２発現をダウンレギュレートすることにより、ＬＶＮＣ心筋細胞の心臓機能を改善できることを実証する。

ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ−ＣＭ）に由来する心筋細胞と変異マウスの両方からの現在の研究のデータは、特に低用量範囲で、心臓の表現型に対するシンバスタチンの有益な効果を支持する強力な証拠を提供する。ＬＶＮＣ−ｈｉＰＳＣ−ＣＭは、分化後７０日目にインビトロで収縮性が低下するという心臓病の表現型を発現する。シンバスタチンは、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターとして機能し、３０日目から７０日目までの治療で、心臓代謝を改善すると共にＬＶＮＣ−ｈｉＰＳＣ−ＣＭのミトコンドリアＡＴＰ産生を増加させることに一貫した作用を発揮する。低用量のシンバスタチンは、ＬＶＮＣ−ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおいてミトコンドリア機能を効果的に改善し、筋細胞の形態を維持する。さらに、シンバスタチンは、ＬＶＮＣ心筋細胞の正常な細胞サイズ、心臓の代謝および筋肉遺伝子の発現を維持することができる。シンバスタチンの有益な効果は、心筋症の表現型を示すＴｎｎｔ２^{Ｒ１５４Ｗ／＋}：：Ｍｙｐｎ^{Ｓ１２９１Ｔ／＋}ＬＶＮＣマウスにおいてさらに確認される。ＬＶＮＣ患者では、１８Ｆ−フルオロ−２−デオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）動的ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）検査を使用して、より低い全体的な心筋グルコース取り込みが検出される。Ｔｎｎｔ２＜Ｒ１５４Ｗ／＋＞：：Ｍｙｐｎ＜Ｓ１２９１Ｔ／＋＞ＬＶＮＣマウスでは、ＰＥＴによって測定された全体的な心筋グルコース（^１８Ｆ−ＦＤＧ）取り込みの段階的な減少は、心臓収縮の段階的な悪化と一致する。低用量でのシンバスタチン治療は、心筋のグルコース取り込みを顕著に増加させ、心臓の拡張の悪化を防ぎ、ＬＶＮＣマウスの心機能を回復させる。

シンバスタチンは、バース症候群（ＢＳ）やデュシェンヌ/ベッカー筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のような合併症を伴う他のＬＶＮＣ患者に由来するＬＶＮＣ心筋細胞のミトコンドリア機能を改善することもできる。

本発明は、シンバスタチンが、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターとして機能できることにより、心臓代謝および収縮機能に関与する遺伝子の発現を回復するためのエピジェネティックな調節を通じて、ＬＶＮＣ患者の疾患の進行を改善し、良好な予後を維持することを実証する。この画期的な進歩は、ＬＶＮＣにおける精密医療の満たされていない医療ニーズを満たす。

本明細書で使用される「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」という用語は、本発明の要素および成分を説明するものである。この用語は、便宜上、および本発明の基本概念を提供するためにのみ使用される。さらに、説明は、１つまたは少なくとも１つを含むものとして理解されるべきであり、文脈によって明示的に示されない限り、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含む。請求項において「含む」という単語と組み合わせて使用される場合、「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」という用語は、１つまたは複数を意味する場合がある。

本明細書で使用される「または」という用語は、「および／または」を意味する場合がある。

本発明は、心筋緻密化障害（ＮＣＣ）に罹患している対象に、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量を含む医薬組成物を投与することを含む、ＮＣＣに罹患している対象を治療する方法を提供する。

心筋緻密化障害（ＮＣＣ）は、海綿状心筋症とも呼ばれ、子供と大人の両方に発症するまれな先天性心筋症である。これは、胚発生中の心筋発育の失敗に起因する。発育中、心筋の大部分は、織り交ぜられた心筋繊維のスポンジのような網目構造である。通常の発育が進むにつれて、これらの小柱構造（ｔｒａｂｅｃｕｌａｔｅｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）は、スポンジ状の網目構造から固体構造に変換される大幅な圧縮を受ける。この過程は、心室、特に左心室では特に顕著である。この圧縮過程に失敗した場合には、心筋緻密化障害が発生される。緻密化障害の結果は左心室で特に明白であるため、この状態は左心室緻密化障害とも呼ばれる。本発明の一実施形態では、ＮＣＣは、左心室緻密化障害（ＬＶＮＣ）である。なお、ＢＳまたはＤＭＤにはＬＶＮＣも付属している。したがって、一実施形態では、対象は、ＢＳまたはＤＭＤを伴うＬＶＮＣに罹患している。

本明細書で使用される場合、「左心室緻密化障害」または「ＬＶＮＣ」という用語は、心室、特に左心室が完全に緻密されない心筋緻密化障害（海綿状心筋症）を指す。ＬＶＮＣは、ＴＮＮＴ２、ＴＡＺ、ＤＭＤなどの特定の遺伝子の変異によって引き起こされる。

本発明の一実施形態では、ＮＣＣまたはＬＶＮＣの症状は、心不全、心室性不整脈、および全身性塞栓状態を含む。別の実施形態では、ＮＣＣまたはＬＶＮＣの症状は、拡張した心室、心室収縮性の障害、より大きな心筋細胞、βアドレナリン作動性応答の喪失、ミトコンドリア呼吸鎖遺伝子の異常な発現、および心臓代謝機能障害を含む。

本発明は、ＬＶＮＣ心筋細胞におけるＥＺＨ２の過剰発現を実証する。したがって、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、ＥＺＨ２の過剰発現を抑制して、ＮＣＣまたはＬＶＮＣを改善することができる。特に、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、ＮＣＣの病原性突然変異によって誘発されるＥＺＨ２の過剰発現を阻害することができ、その結果、エピジェネティックな変化を引き起こすＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）の動員を減少させる。したがって、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、ＮＣＣまたはＬＶＮＣにおける機能的な遺伝子発現を回復することにより、心臓代謝および疾患の進行を改善することができる。

一般的に、スタチンは、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの１つとして識別される。一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターはスタチンを含む。好ましい実施形態では、低用量のシンバスタチンは、ＥＨＺ２の過剰発現を選択的に阻害して、心臓代謝および心室機能を回復させることができる。

スタチンは、ＮＣＣまたはＬＶＮＣの症状を治療または改善することができる。一実施形態では、スタチンの治療上有効量は、心臓機能を改善することによってＮＣＣまたはＬＶＮＣを治療するのに十分である。好ましい実施形態では、心臓機能は、心臓代謝および心室機能を含む。

有用なスタチンの例には、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、ロスバスタチンおよびイタバスタチンが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、スタチンは、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、ロスバスタチンおよびイタバスタチンからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、スタチンはシンバスタチンである。

ＮＣＣまたはＬＶＮＣの症状は、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターを投与することで、ＥＺＨ２の過剰発現を修正して治療できる。よって、スタチン（例えば、シンバスタチン）は、ＥＺＨ２の発現をダウンレギュレートすることにより、ＮＣＣまたはＬＶＮＣ患者を治療することができる。一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量は、ＥＺＨ２の発現をダウンレギュレートすることにより、ＮＣＣまたはＬＶＮＣを治療するのに十分である。好ましい実施形態では、スタチンの治療上有効量は、ＥＺＨ２の発現をダウンレギュレートすることにより、ＮＣＣまたはＬＶＮＣを治療するのに十分である。より好ましい実施形態では、シンバスタチンの治療上有効量は、ＥＺＨ２の発現をダウンレギュレートすることにより、ＮＣＣまたはＬＶＮＣを治療するのに十分である。

一実施形態では、心臓代謝は、心臓の脂肪酸代謝、グルコース代謝、およびミトコンドリア呼吸鎖を含む。したがって、スタチンは、心臓代謝とミトコンドリア機能を改善する。なお、心臓代謝は、βアドレナリン作動性応答性を含む。したがって、スタチンは、βアドレナリン作動性応答性を回復することもできる。

βアドレナリン作動性応答性は、ミトコンドリアでのＡＴＰの生成に関与している。スタチンは、ミトコンドリア呼吸鎖遺伝子の発現を回復することにより、ＮＣＣに罹患している対象のミトコンドリア機能を改善することができる。一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチン）は、ミトコンドリア機能を改善する。好ましい実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチン）は、ミトコンドリアのＡＴＰ生成を増加させる。

また、ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチンまたはシンバスタチン）は、ＬＶＮＣ患者の異常な心室機能を改善または治療する。一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチン）は、心筋細胞の短縮速度を改善し、心筋細胞の正常な細胞サイズを維持し、筋肉タンパク質の発現を回復することによって、心室機能を改善する。好ましい実施形態では、筋肉タンパク質は、トロポミオシン、サルコメアアクチニンα、およびトロポニンＴを含む。したがって、ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチン）は、トロポミオシン、サルコメアアクチニンαおよびトロポニンＴの発現を回復することができる。

ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチンまたはシンバスタチン）は、心筋細胞の正常な細胞サイズを維持する機能を持つため、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターを投与することにより、ＮＣＣまたはＬＶＮＣ患者の拡張型心室の症状を改善することができる。

本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、対象が、疾患または障害、例えば、ＮＣＣおよびＬＶＮＣに関連する状態の進行または重症度を逆転、緩和、改善、阻害、減速または停止することである治療的な治療を指す。「治療する」という用語は、ＮＣＣまたはＬＶＮＣに関連する状態、疾患、または障害の少なくとも１つの悪影響または症状を減少または軽減することを含む。１つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少した場合、治療は一般に「効果的」である。あるいは、病気の進行が減少または停止した場合、治療は「効果的」である。すなわち、「治療」には、症状またはマーカーの改善だけでなく、治療がない場合に予想されるものと比較して、症状の停止、または少なくとも進行の減速または悪化も含まれる。有益なまたは望ましい臨床結果には、１つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、寛解（部分的または全体的）、介入の減少、入院期間の短縮、および／または検出可能か検出不可能かにかかわらず死亡率の低下が含まれるが、これらに限定されない。疾患の「治療」という用語は、疾患の症状または副作用（緩和治療を含む）からの救済を提供することも含む。この文脈での治療は、完全な「治療法」を含まない。

一実施形態では、対象は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。

一実施形態では、医薬組成物は、必要に応じて、薬学的に許容される担体のような担体を含むことができる。好ましい実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物および組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、医薬組成物の様々な適切な製剤が存在する。非経口投与に適した製剤は、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路のために製剤化することができる。担体には、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および所定のレシピエントの血液と等張する製剤を提供する溶質を含むことができる水性等張滅菌注射液が含まれ、水性および非水性滅菌懸濁液には、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、防腐剤、リポソーム、ミクロスフェアおよびエマルジョンが含まれる。「薬学的に許容される」という用語は、過度の毒性なしに哺乳動物に投与することができる化合物および組成物を指す。

ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチンまたはシンバスタチン）および薬学的に許容される担体は、当技術分野で知られているいくつかの異なる経路を介して対象に投与され得る。一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターおよび薬学的に許容される担体は、外部、静脈内、皮下、局所、経口、または筋肉または吸入によって投与される。医薬組成物は、消化器系または循環器系によって標的部位に送達される。

本明細書で使用される「治療上有効量」という用語は、特定の条件下で対象に発症する症状を予防、減少、停止もしくは逆転させることができるか、または対象が治療を受け始めたときに特定の条件下ですでに存在する症状を部分的にまたは完全に軽減することができる治療用量である。

一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。好ましい実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から５ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。より好ましい実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日から１ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。

別の実施形態では、スタチンの治療上有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。好ましい実施形態では、スタチンの治療上有効量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から５ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。より好ましい実施形態では、スタチンの治療上有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日から１ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。

シンバスタチンは、スタチンの中で最高の治療効果がある。低用量のシンバスタチンが効果的である。別の実施形態では、シンバスタチンの治療上有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。好ましい実施形態では、シンバスタチンの治療上有効量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から５ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。より好ましい実施形態では、シンバスタチンの治療上有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日から１ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。

一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、改善された心室機能または血漿ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの減少のいずれかにおいて良好な予後を維持するために、治療用量で毎日対象に継続的に投与される。好ましい実施形態では、スタチンは、治療用量で、少なくとも１年間、対象に毎日投与される。好ましい実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、低用量から滴定された治療用量で、少なくとも２４週間、対象に毎日投与される。別の実施形態において、スタチンは、低用量（０．１ｍｇ／ｋｇ／日）から開始して少なくとも４週間対象に毎日投与され、その用量漸増は、４週間ごとにモニターされる心室機能および血漿ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのパラメーターに基づく。

本発明は、心筋緻密化障害（ＮＣＣ）を治療するための薬物を調製するための組成物の使用を提供し、ここで、当該組成物は、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターを含む。

一実施形態では、ＮＣＣは、左心室心筋緻密化障害（ＬＶＮＣ）である。バース症候群（ＢＳ）またはデュシェンヌ／ベッカー筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もＬＶＮＣを伴う場合がある。

ＮＣＣまたはＬＶＮＣの原因には、病原性突然変異によって誘発されるＥＺＨ２の過剰発現が含まれる。したがって、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、ＥＺＨ２の過剰発現を抑制して、ＮＣＣまたはＬＶＮＣを改善することができる。スタチンは、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの１つとして識別される。一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターはスタチンを含む。

したがって、ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチン）は、ＮＣＣまたはＬＶＮＣの症状を治療することができる。一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、ＮＣＣまたはＬＶＮＣに罹患している対象の心臓機能を改善して、ＮＣＣまたはＬＶＮＣを治療する。好ましい実施形態では、スタチンは、ＮＣＣまたはＬＶＮＣに罹患している対象の心臓機能を改善して、ＮＣＣまたはＬＶＮＣを治療する。より好ましい実施形態では、心臓機能は、心臓代謝および心室機能を含む。

別の実施形態では、スタチンは、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、ロスバスタチンおよびイタバスタチンを含む。好ましい実施形態では、スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチンおよびシンバスタチンを含む。より好ましい実施形態では、スタチンはシンバスタチンである。

シンバスタチンは、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターとして機能する。したがって、シンバスタチンは、ＥＺＨ２の発現をダウンレギュレートすることにより、ＮＣＣまたはＬＶＮＣ患者を治療することができる。一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、ＥＺＨ２の発現をダウンレギュレートすることにより、ＮＣＣまたはＬＶＮＣを治療する。好ましい実施形態において、スタチンは、ＥＺＨ２の発現をダウンレギュレートすることにより、ＮＣＣまたはＬＶＮＣを治療する。より好ましい実施形態では、シンバスタチンは、ＥＺＨ２の発現をダウンレギュレートすることにより、ＮＣＣまたはＬＶＮＣを治療する。

一実施形態では、心臓代謝は、心臓の脂肪酸代謝、グルコース代謝、およびミトコンドリア呼吸鎖を含む。したがって、スタチンは、心臓の代謝とミトコンドリア機能を改善する。なお、心臓代謝は、βアドレナリン作動性応答性を含む。したがって、スタチンは、βアドレナリン作動性応答性を回復することもできる。

また、ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチン）は、ミトコンドリア呼吸鎖遺伝子の発現を回復することにより、ＮＣＣに罹患している対象のミトコンドリア機能を改善することができる。一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチン）は、ミトコンドリア機能を改善する。好ましい実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチン）は、ミトコンドリアのＡＴＰ生成を増加させる。

ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチンまたはシンバスタチン）は、ＮＣＣまたはＬＶＮＣに罹患している対象の異常な心室機能を改善または治療する。一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーター（例えば、スタチン）は、心筋細胞の短縮速度を改善し、心筋細胞の正常な細胞サイズを維持し、筋肉タンパク質の発現を回復することによって、心室機能を改善する。好ましい実施形態では、筋肉タンパク質は、トロポミオシン、サルコメアアクチニンα、およびトロポニンＴを含む。したがって、スタチンはトロポミオシン、サルコメアアクチニンαおよびトロポニンＴの量を増加させることができる。

一実施形態では、組成物は、医薬組成物である。好ましい実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。医薬組成物は、消化器系または循環器系によって標的部位に送達される。

低用量のシンバスタチンが効果的である。別の実施形態では、シンバスタチンの治療上有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。好ましい実施形態では、シンバスタチンの治療上有効量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から５ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。より好ましい実施形態では、シンバスタチンの治療上有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日から１ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にある。

一実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、改善された心室機能または血漿ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの減少のいずれかにおいて良好な予後を維持するために、治療用量で毎日対象に継続的に投与される。好ましい実施形態では、スタチンは、治療用量で、少なくとも１年間、対象に毎日投与される。好ましい実施形態では、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、低用量から滴定された治療用量で、少なくとも２４週間、対象に毎日投与される。別の実施形態において、スタチンは、低用量（０．１ｍｇ／ｋｇ／日）から開始して少なくとも４週間、対象に毎日投与され、その用量漸増は、４週間ごとにモニターされる心室機能および血漿ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのパラメーターに基づく。

以下の実施例は非限定的であり、本発明の様々な態様および特徴を単に代表するものである。

方法
ｈｉＰＳＣ研究
左心室心筋緻密化障害（ＬＶＮＣ）の患者と正常な健康な女性にそれぞれ由来するヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株は、２つのアプローチによって再プログラムされた。各患者の１つの株は、４つのＹａｍａｎａｋａ因子（Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４。ＮＴＵのＨｏｎｇ−ＮｅｒｎｇＨｏ博士により実施）を運ぶレンチウイルスによって皮膚細胞から再プログラムされ、もう１つの株は、４つのＹａｍａｎａｋａ因子を運ぶセンダイウイルス（スタンフォード大学のＪｏｓｅｐｈＣ．Ｗｕ博士により実施）によって末梢血単球（ＰＢＭＣ）から再プログラムされた。患者は、遺伝子検査、ｈｉＰＳＣへの再プログラミングおよび薬理学的研究のために患者の組織／血球を収集することに同意した。薬物効果は、同じ患者の２つの株に由来するヒト心筋細胞に同じ用量で同じ薬物をテストすることによって検証され、各株には少なくとも３つの独立した繰り返しがあった。細胞の短縮は、Ｉｏｎｏｐｔｉｘシステム（Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）で測定され、ミトコンドリア機能は、Ａｇｉｌｅｎｔｓｅａｈｏｒｓｅａｎａｌｙｚｅｒ（ＳｅａｈｏｒｓｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）で評価された。

ミトコンドリア機能の測定
Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイを７０日目に実施し、矢印で示された試薬を含むＸＦミトストレステストキットを順次追加する条件下で、ミトコンドリアＯＣＲ（酸素消費率）およびＥＣＡＲ（細胞外酸性化率）を測定した。データは、各ウェルの総細胞タンパク質で正規化された。ＯＣＲとＥＣＡＲの関係は、基礎（オリゴマイシン前）および最大呼吸容量（ＦＣＣＰ後）の条件下で測定された。

オミクス研究
プロテオミクス分析
シンバスタチンの有りまたは無しで処理されたｈｉＰＳＣ由来心筋細胞の総タンパク質は、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡバッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社、ＵＳＡ）によって抽出された。サンプルは、トリプシンによってさらに消化された。脱塩および乾燥後、ＬＴＱ−ＯｒｂｉｔｒａｐＶｅｌｏｓ質量分析計システムによってＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実行した。ペプチドおよびタンパク質グループＩＤは、ＭＡＳＣＯＴデータベース検索によって７ｐｐｍのプリカーサー質量精度と０．５ＤａのＭＳ／ＭＳ精度で取得された。大規模な質量分析の生データは、ラベルフリーの定量化方法でＵｎｉｐｒｏｔヒトデータベースに基づいてＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアによってさらに分析され、続いてＰｅｒｓｅｕｓソフトウェアを使用して統計分析が行われた。

トランスクリプトーム分析
シンバスタチンの有りまたは無しで処理されたｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞の全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社、ＵＳＡ）によって抽出された。全ＲＮＡは、Ｑｕｉｃｋ−ＲＮＡキット（ＺｙｍｏｌＲｅｓｅａｒｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）により、ＴＲＩｚｏｌ−クロロホルムホモジネートの上部水層からさらに精製された。ＴｒｕＳｅｑＳｔｒａｎｄｅｄｍＲＮＡシーケンスは、ＰｈａｌａｎｘＢｉｏｔｅｃｈによって実行された。簡単に説明すると、５００ｎｇの高品質な全ＲＮＡ（ＲＩＮ値＞８）のインプットからｐｏｌｙＡｍＲＮＡを精製、断片化し、第１鎖および第２鎖のｃＤＮＡを合成した。バーコード化されたリンカーをライゲーションして、インデックス付きライブラリを生成した。ライブラリは、ＱｕａｎｔｕｓＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）でＰｒｏｍｅｇａＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒｄｓＤＮＡシステムを使用して定量化された。ライブラリのサイズと純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ２２００ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ機器で高感度Ｄ１０００スクリーンテープを使用して分析した。ライブラリをプールし、ペアエンド１００ｂｐＲａｐｉｄＲｕｎフォーマットを使用してＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００シーケンサーで実行し、サンプルあたり合計４，０００万回のリードを生成した。シーケンシング後、低品質の塩基を除去するために、トリミングされた生のリードがＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃによるシーケンシングに使用された。生データのクレンジングにも、次の基準が適用された：（１）スライディングウィンドウ（４ベース幅）の平均品質が１５を下回ったときにカットオフすること、および（２）３５ｂｐより短い読み取りは破棄されること。リードがゲノムにアラインメントされた後、Ｃｕｆｆｑｕａｎｔを結果のアラインメントファイルで使用して、遺伝子および転写産物の発現プロファイルを計算した。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓパッケージの一部であるＣｕｆｆｄｉｆｆは、２つ以上の条件から発現プロファイルを取得してアセンブリをマージし、マッピングされた総ミリオン（ＦＰＫＭ）フラグメントあたりの転写産物のキロベースあたりのＲＮＡ−Ｓｅｑフラグメントの数を計算することによって、発現レベルを推定した。Ｃｕｆｆｄｉｆｆは、観察された変化の統計的有意性をテストし、転写時または転写後のレベルで差次的に調節された遺伝子を特定した。クロスオミクスデータは、プロテオームとトランスクリプトームのデータを１つのペルセウスマトリックスに結合することにより、Ｐｅｒｓｅｕｓソフトウェアによってさらに分析された。両方のオミクス列がソートされ、ランクに変換された。各注釈用語に対して２変量テストが実行された。遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析を実行して、分類のＧＯシステムに基づいて機能特性を備えた遺伝子のセットを解釈した。分子間の潜在的な相互作用は、ＳＴＲＩＮＧによって予測された。

絶対定量的リアルタイムＰＣＲ
シンバスタチンの有りまたは無しで処理された心筋細胞の遺伝子発現の違いは、ＩｌｌｕｍｉｎａＥｃｏリアルタイムＰＣＲシステムを用いた絶対定量法によって確認された。簡単に説明すると、抽出したｍＲＮＡの逆転写に続いて、テンプレートｃＤＮＡをＯｍｉＧｒｅｅｎバッファーで目的の遺伝子のプライマーと混合し、未知のサンプルの範囲をカバーする５つの１０倍段階希釈の標準でＰＣＲを実行した。各サンプルにおける１８ＳＲＮＡの発現も、内部対照として定量化された。

ＬＶＮＣマウスモデルと心臓機能イメージング
Ｃ５７ＢＬ／６ｊバックグラウンドにおけるＴｎｎｔ２（Ｒ１５４Ｗ）−およびＭｙｐｎ（Ｓ１２９１Ｔ）−ノックインマウスは、国立台湾大学ゲノム医学センターの遺伝子ノックアウトマウスコア研究所によって作成された。遺伝的にヘテロ接合のＬＶＮＣマウス（Ｔｎｎｔ２（Ｒ１５４Ｗ）^＋／−：：Ｍｙｐｎ（Ｓ１２９１Ｔ）^＋／−）は、Ｔｎｎｔ２（Ｒ１５４Ｗ）^＋／−とＭｙｐｎ（Ｓ１２９１Ｔ）^＋／−マウスの交配から得られた。遺伝子型を確認するために、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシングを行った。すべての動物の手順とプロトコルは、ＡＡＡＬＡＣ認定施設によって承認された。

ＬＶＮＣマウスの心臓運動機能は、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｖｅｖｏ２１００イメージングシステム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃ株式会社、トロント、カナダ）によるＭモードでの心エコー検査によって測定された。ＬＶＮＣマウスの心臓グルコース代謝率は、２％イソフルラン吸入による麻酔下で、動的小動物のポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）観察によって測定された。ＬＶＮＣマウス心臓における^１８Ｆ−ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース１８Ｆ）の取り込みは、動的小動物のポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）による心臓グルコース代謝率（ＭＲＧｌｕ）の分析のために測定され、心臓代謝の変化を調べた。

統計分析
テューキー検定による多重比較を伴う反復測定二元配置分散分析を使用して、ｉＦａおよびｉＨのＬＶＮＣ−ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおける５０日目と７０日目に、ＤＭＳＯ群とシンバスタチン群との間の細胞短縮速度の違いを区別した。線形回帰分析を実施して、ＬＶＮＣ−ｈｉＰＳＣ−ＣＭにおけるβアドレナリン作動性刺激に対する変力反応の違い、およびＤＭＳＯベヒクル群とシンバスタチン群との間のＬＶＮＣマウスにおけるグルコースのＬＶＥＦまたは心臓代謝率の変化を明らかにした。

結果
患者の特徴と遺伝情報
患者（ｉＨ）は、１週間の活動が不十分であったため、生後６か月で施設に入院した。初期評価では、灌流不良、肝臓腫大、心臓肥大、および著しく上昇したＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（＞３５０００ｐｇ／ｍＬ）が明らかになった。強心薬サポート下の心エコー図は、左心室（ＬＶ）の拡張（ＬＶ拡張末期径のＺスコア、４．７）と左心室収縮性の障害（ＬＶ駆出率、３０．３％）を示した。コンピューター断層撮影は、正常な冠状動脈、左心室収縮性が低くて緻密化がない拡張型左心室を示した。心筋炎調査は陰性であった。左心室緻密化障害を伴う拡張型心筋症と診断された。全身状態は徐々に改善したが、投与量の減少（ｌｏｓｅｄｏｓａｇｅ）の範囲でミルリノンを離脱することの困難が観察された。患者（ｉＨ）は入院４２日後に退院した。家族のスクリーニングにより、患者（ｉＨ）の父親（ｉＦａ）も拡張型ＬＶと低ＬＶ駆出率を持っていることが確認された。

最初のＬＶＮＣ家族の遺伝子検査では、患者（ｉＨ）と患者（ｉＨ）の父親（ｉＦａ）は、ＴＮＮＴ２（Ｒ１４１Ｗ）とＭＹＰＮ（Ｓ１２９６Ｔ）に不均一なミスセンス変異があることがわかった。ＴＡＺ（Ｙ５１＊）の相同変異は、ＢＳを伴う２番目のＬＶＮＣ家族で発見され、ＤＭＤ（Ｓ３６６６ｄｅｌ）のＤＭＤの異種変異は、ＤＭＤを伴う３番目のＬＶＮＣ家族で発見された。

その後のフォローアップ中に、患者（ｉＨ）は、ジゴキシン、フロセミド、カプトプリル、カルベジロール、アスピリンなどの投薬を受けた。発病から約２年後、患者の成長（ｉＨ）は遅く、体重は３パーセンタイルを下回りしたが、成長のマイルストーンは正常範囲内であった。心エコー検査による左心室駆出率は依然として低く、１７．５％から２４．５％の範囲にあった。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは９２０〜１２００ｐｇ／ｍｌであった。患者（ｉＨ）の父親（ｉＦａ）にもカルベジロール、ロサルタン、アスピリンを投与されたが、心臓の状態は変化しないままであった。

ＬＶＮＣ−ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞における薬物リポジショニング
ＬＶＮＣ患者（ｉＨ）および患者（ｉＨ）の父親（ｉＦａ）に由来するヒト心筋細胞による疾患モデリングを実施して、心機能障害の進行を再現した機能異常を特徴づけた。インビトロ分化後５０日目に、ＬＶＮＣ−ｈｉＰＳＣ−ＣＭは、筋細胞収縮の低下（図１Ａ〜図１Ｂ）、βアドレナリン作動性応答性の喪失（図１Ｃ）、心血管代謝機能障害（図１Ｄ）、および心臓収縮とミトコンドリア呼吸鎖の機能性分子における異常なオミクス（図１Ｅ〜図１Ｆ）を含む異常な心臓表現型を発症した。経路分析は、異常なエピジェネティックな調節が異常な新代謝および筋肉構造に関連している可能性があることを予測した（図２Ａ）。絶対定量的リアルタイムＰＣＲ検証により、ＬＶＮＣ心筋細胞（ｉＨ＆ｉＦａ）でＥＺＨ２の異常な過剰発現が見つかった（図２Ｂ）。直接ＥＺＨ２阻害剤（ｇｓｋ）は、心臓ミトコンドリア機能障害を変化させなかったが、ＤＮＭＴ阻害剤（ｚｅｂ）は、ＬＶＮＣ心臓ミトコンドリア機能を回復することができた（図２Ｃ）。ＥＺＨ２の過剰発現は、ＤＮＭＴの動員を増加させて、ＬＶＮＣ筋細胞のエピジェネティックな特徴を変化させ、その結果、機能的な遺伝子発現の障害を引き起こす可能性があることを示した。したがって、ＥＺＨ２発現のダウンレギュレーションは、病態特異的な作用様式でＬＶＮＣ心筋細胞の心機能を改善するための実行可能な治療戦略となると考えられた。このＬＶＮＣ−ｈｉＰＳＣ−ＣＭモデルでの薬物リポジショニングスクリーニングにより、シンバスタチンは、ＬＶＮＣ心筋細胞におけるＥＺＨ２発現を選択的にダウンレギュレートできるものとして特定された（図３Ａ）。３０日目から７０日目までのシンバスタチン治療後の心臓収縮およびβアドレナリン作動性反応の回復において、シンバスタチンの有益な効果は、他のもの（アトルバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチンを含む）よりも優れた（図３Ｂ）。これらのＬＶＮＣ−ｈｉＰＳＣ−ＣＭの心臓代謝機能の改善において、低用量のシンバスタチン治療（図３Ｃの５μＭ、ｉＨ、ｓ５）は、高用量の治療（図３Ｃの１０μＭ、ｉＨ、ｓ１０）よりも優れた効果を示した。シンバスタチン治療は、ミトコンドリア呼吸鎖分子（図３Ｄ）および心臓代謝（図３Ｅ）における遺伝子発現を有意に増加させることができた。さらに、ＬＶＮＣ心筋細胞の細胞サイズは、分化後７０日目に大きくなった（図４Ａ）。３０日目から７０日目までのシンバスタチン治療は、筋細胞サイズの変化を著しく弱めた（図４Ａ）。サルコメアアクチニンαまたはトロポニンＴのいずれかの密度も、シンバスタチンで処理された心筋細胞では著しく増加した。プロテオミクス分析により、シンバスタチンは、ｉＨ−およびｉＦａ−ＬＶＮＣ心筋細胞の両方で、筋肉の収縮および代謝過程の機能を備えたタンパク質の発現を有意に回復できることが実証された（図４Ｂ〜図４Ｄ）。

ＬＶＮＣマウスの心臓代謝の改善におけるシンバスタチンのインビボ効果
薬物投与（シンバスタチン：３．５ｍｇ／３．６μＬ／ｋｇ／日、ＤＭＳＯ：３．６μＬ／ｋｇ／日）は、ミニ浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴモデル２００６、Ｄｕｒｅｃｔ株式会社クパチーノ、ＣＡ、ＵＳＡ）をＬＶＮＣマウスの背中の皮下空間に移植して、それぞれ１０、１２、１４週齢から、６週間行われた。エンドポイントで、空腹時ＬＶＮＣマウスの心臓グルコース代謝率（ＭＲＧｌｕ）を測定した。ベヒクル処置ＬＶＮＣマウスの心臓グルコース取り込みは、高齢のＬＶＮＣマウスの心臓機能の悪化と並行して徐々に減少した（図５Ａ）。シンバスタチンは、ＬＶＮＣマウスの加齢後に発生した心臓のグルコース代謝率の低下を有意に逆転させ、これは、シンバスタチンがＬＶＮＣマウスの心臓のグルコース代謝を改善したことを示した。また、シンバスタチンは心臓収縮機能を有意に改善した（図５Ｂ）。さらに、ＬＶＮＣ心機能の良好な予後を維持するために、継続的な低用量シンバスタチン治療が必要であった。

また、シンバスタチンは、１〜５μＭの用量範囲でＢＳ（図６Ａ）またはＤＭＤ（図６Ｂ）のような他の合併症を伴うＬＶＮＣ患者に由来するＬＶＮＣ心筋細胞のミトコンドリア機能を有意に改善した。

本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない１つまたは複数の要素、制限がない状態で実施することができる。使用された用語および表現は、説明の用語として使用され、限定ではなく、そのような用語および表現の使用において、示されて説明された特徴またはその一部の同等物を除外する意図はないが、クレームされた発明の範囲内で様々な変更が可能であることを認識した。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示された概念の修正および変形は、当業者によって訴えられ得ることが理解されるべく、そのような修正および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると見なされる。

Claims

心筋緻密化障害に罹患している対象を治療するための方法であって、心筋緻密化障害に罹患している前記対象に、ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量を含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
前記心筋緻密化障害は、左心室緻密化障害を含む、請求項１に記載の方法。
前記ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量は、病原性突然変異で引き起こされるＥＺＨ２過剰発現を阻害することにより、心筋緻密化障害を治療するのに十分である、請求項１に記載の方法。
前記ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量は、心臓機能を改善することにより、心筋緻密化障害を治療するのに十分である、請求項１に記載の方法。
前記心臓機能は、心臓代謝および心室機能を含む、請求項４に記載の方法。
前記ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、少なくとも４週間、毎日対象に投与される、請求項１に記載の方法。
前記ＥＺＨ２ダウンレギュレーターは、スタチンを含む、請求項１に記載の方法。
前記スタチンはシンバスタチンである、請求項７に記載の方法。
前記対象はヒトである、請求項１に記載の方法。
前記ＥＺＨ２ダウンレギュレーターの治療上有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にある、請求項１に記載の方法。
前記シンバスタチンの治療上有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にある、請求項８に記載の方法。