CN112512519A - 治疗致密化不全心肌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种通过向患有致密化不全心肌症(NCC)的个体施用具有治疗有效量的EZH2负调节剂的医药组合物来治疗患有致密化不全心肌症的个体的方法，该EZH2负调节剂包含他汀类药物。

Description

治疗致密化不全心肌症的方法
技术领域
本发明涉及治疗患有致密化不全心肌症(non-compaction cardiomyopathy，NCC)的个体的方法，其包括向个体施用包含治疗有效量的EZH2负调节剂的医药组合物。特别地，EZH2负调节剂能够抑制由NCC中的致病突变诱导的EZH2过度表达，因而减少过多的DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)被召集移入，导致表观遗传改变(epigeneticalteration)。因此，EZH2负调节剂可以通过恢复NCC中的功能基因表达来提升心脏代谢和改善疾病进展，例如左心室致密化不全心肌症(left ventricular non-compactioncardiomyopathy，LVNC)。
背景技术
左心室致密化不全心肌症(LVNC)，其特征在于具有异常小梁化(trabeculation)的海绵状左心室(LV)心肌，特别是在左心室尖端，是一种独特的心肌症。根据一项人口研究，新诊断病例的平均年发病率为每10万名10岁以下儿童有0.11人，并且在出生后的第一年中最高(每10万名婴儿有0.83人)。诊断后10年内，只有48％的人没有死亡或移植；通常在婴儿早期表现出主要扩张表型症状的儿童的长期预后更差。LVNC可以是单独先天性心脏病病症，或同时发生在如杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)或巴氏综合征(Barth syndrome)等先天性心脏病、神经肌肉疾病或遗传综合征的病患。LVNC发病机制的相关基因突变包括MIB1、TBX20、2个钙调控基因TAZ和LMNA、NUMB/NUMBL、线粒体基因组突变(远端22q11·2)和肌节编码基因(MYH7、ACTC1、TNNT2、MYBPC3、TPM1、LDB3和TNNI3)。心脏代谢功能不良也被描述为LVNC的病理生理学的一部分。
用于LVNC心脏衰竭的现有疗法包括抗充血药物(利尿剂、ACE抑制剂、AT1受体阻断剂和β阻断剂)和抗血小板治疗以预防血栓栓塞。对于药物控制失败的人，将考虑进行心脏移植手术。尽管在一些患者中最初改善了LV功能，但在中位间隔期6.3年时仍会发生晚期恶化。为了改善这些患者的不良预后，精准医学可有效地提供另一种发现新疗法的策略。
发明内容
本发明提供了治疗患有致密化不全心肌症(NCC)的个体的方法，其包括向患有NCC的个体施用包含治疗有效量的EZH2负调节剂例如他汀类药物特别是辛伐他汀(simvastatin)的医药组合物。
附图说明
图1显示人类LVNC心肌细胞的遗传和功能性特征。(图1A)与源自健康患者iM的人类心肌细胞相比，从LVNC家族带有TNNT2(R141W)和MYPN(S1296T)杂合错义突变(heterozygous missense mutation)患者(患者：LVNC#1:iF以及LVNC#2:iH)hiPSC细胞所衍生的人类心肌细胞，在体外分化后第70天观察到心肌细胞收缩下降。(图1B)在肌细胞成熟期间(第30天至第70天)，健康人类心肌细胞(iM)的细胞缩短速度显著增加，但在LVNC患者的心肌细胞(iFa和iH)中逐渐减少。(图1C)LVNC患者的心肌细胞(iFa和iH)在体外失去对异丙肾上腺素(isoprenaline)(一种β肾上腺素受体激动剂)的正性收缩反应。(图1D)与健康组(iM)相比，在LVNC心肌细胞(iH)中发现线粒体呼吸功能降低。OCR表示耗氧率，ECAR表示细胞外酸化率。OCR测量线粒体呼吸率。ECAR测量糖酵解速率(glycolysis)。FCCP：氰基羰基4-(三氟甲氧基)苯腙(carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)。(图1E)LVNC心肌细胞的组学分析(omics analysis)(包括通过RNA定序的转录组(T)和通过LC-MS/MS的蛋白质组(P))描述了与线粒体呼吸链和代谢过程的抑制一致的有力基因/蛋白型态(包括(1)GOBP(基因本体生物作用(Gene Ontology Biological Process))：葡萄糖代谢作用(T：组[3]和P：组[1])，(2)GOCC(基因本体细胞组分)：肌动蛋白丝束(T：组[6]和P：组[6])，(3)GOBP：肌肉收缩(T：组[8]和P：组[4])，与某些表观遗传调节因子和结构基因的上调相关联(包括GOBP：染色质组织(T：组[4]和P：组[10])和GOBP：肌动蛋白丝束(T：组[7]和P：组[2])。(图1F)LVNC心肌细胞中有关肌肉收缩(上图)和线粒体呼吸链(下图)的功能基因的异常表达的2D富集分析结果。H：健康对照；iH：LVNC#2对照。
图2显示人类LVNC心肌细胞中的表观遗传异常与心脏功能不良有关。(图2A)STRING功能性蛋白质相互作用网络，其由图1E到图1F的组学分析中显著改变的分子构建。SMYD1与肌肉基因表达的调节有关。表观遗传调节因子PCR2(包括EZH2/SUZ12/EPC1)参与调节线粒体呼吸链和代谢过程的基因表达。(图2B)为验证表观遗传调节因子的表达而进行的即时PCR的绝对定量，以18S作为内部对照组。发现iFa和iH-LVNC心肌细胞中EZH2的表达显著增加。EZH2可以作为甲基转移酶或可以召集其他DNA甲基转移酶(DNMT)以产生表观遗传修饰。(图2C)显示了扎布拉林(zebularine(zeb)，DNMT抑制剂，50μM)可以增进LVNC心肌细胞的ECAR和OCR，而GSK503(gsk，EZH2甲基转移酶抑制剂，5μM)并没有显著提高LVNC心肌细胞的OCR或ECAR。这些结果表明介导LVNC中的异常表观遗传作用并非是EZH2甲基转移酶，而是EZH2召集的DNMT。因此，使心脏表观遗传学正常化的独特治疗策略应该是通过EZH2负调节剂抑制LVNC心肌细胞中EZH2的异常上调，以减少DNMT的召集，而不是直接抑制EZH2甲基转移酶活性。EZH2负调节剂可以恢复LVNC心肌细胞的心脏功能，具有疾病状态特异性(disease-state-specific)作用。iH，ctrl：未经治疗的LVNC心肌细胞；iH，zeb：经扎布拉林治疗的LVNC心肌细胞；iH，gsk：经GSK503治疗的LVNC心肌细胞。
图3显示辛伐他汀经鉴别为EZH2负调节剂之一，可以减弱异常EZH2过度表达并恢复LVNC心肌细胞的心脏功能。(图3A)老药新用活性筛选发现辛伐他汀可以选择性地使LVNC心肌细胞中的EZH2表达正常化。(图3B)辛伐他汀(5μM)可以显著恢复心脏收缩及其对异丙肾上腺素(在0.03μM、0.1μM和1μM三种剂量下)所诱导的β刺激的增强收缩反应，如最小至最大值图(min-to-max plot)所示，方框中为平均线，误差线为SEM。在5μM相同作用浓度下，辛伐他汀的效力优于其他汀类药物，例如洛伐他汀(lovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)和氟伐他汀(fluvastatin)。除了抑制组蛋白异常甲基化以恢复心脏功能基因表达的策略之外，还进一步检查维持组蛋白乙酰化状态是否也能恢复基因表达。已证实SAHA(组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，5μM)不能改善LVNC心脏功能。(图3C)辛伐他汀(5μM)可显著改善LVNC心肌细胞的线粒体功能。辛伐他汀在低剂量(5μM)下改善心脏代谢功能的效果优于高剂量(10μM)。(图3D)辛伐他汀可以恢复线粒体呼吸链基因的表达，如CYB5R2和CYBRD1。扎布拉林(zeb，100μM)可以产生类似辛伐他汀的效果。(图3E)辛伐他汀可以剂量依赖性地恢复心脏代谢基因的表达。对照：未经治疗的LVNC心肌细胞；辛伐他汀：以辛伐他汀治疗的LVNC心肌细胞；SAHA：用SAHA治疗的LVNC心肌细胞；阿托伐他汀：用阿托伐他汀治疗的LVNC心肌细胞；氟伐他汀：用氟伐他汀治疗的LVNC心肌细胞；洛伐他汀：用洛伐他汀治疗的LVNC心肌细胞；iH，ctrl：未经治疗的LVNC心肌细胞；iH，s5：以5μM辛伐他汀治疗的LVNC心肌细胞；iH，s10：以10μM辛伐他汀治疗的LVNC心肌细胞；iH，s：以辛伐他汀治疗的LVNC心肌细胞；iH，zeb：以扎布拉林治疗的LVNC心肌细胞；iM：健康人的心肌细胞；iH：LVNC心肌细胞。
图4显示辛伐他汀可以维持LVNC心肌细胞的正常细胞大小，以及心脏代谢蛋白质和肌肉蛋白质的表达。(图4A)辛伐他汀(5μM)可以抑制LVNC心肌细胞的增大。SA：肌节辅肌动蛋白α；TNNT2：肌钙蛋白T；DAPI：核复染。(图4B)以辛伐他汀治疗或不以辛伐他汀治疗的LVNC心肌细胞中蛋白质组学的阶层式分群图(hierarchical clustering plot)和主成分分析结果(principal component analysis)，描述辛伐他汀治疗组中的蛋白质型态(protein profile)显著接近健康组中的蛋白质型态。(图4C)STRING功能性蛋白质的相互作用网络，突显出在健康/iH，ctrl和iH，s/iH，ctrl中皆高度表达的69种蛋白质的交叉节点的功能性蛋白质有大量恢复，该恢复的蛋白质功能与肌肉收缩、细胞结构、启动子活性和葡萄糖代谢有关。(图4D)辛伐他汀对两名LVNC患者(iFa和iH)之间LVNC心肌细胞的蛋白质型态的相同作用，并且进一步描述了蛋白质功能的特性。有27种蛋白质在iF，s/iF，ctrl和iH，s/iH，ctrl中均显著上调。基因本体(GO)富集分析发现，大部分蛋白质功能包括代谢作用、细胞成分组织和生物调节的前三位。iH，ctrl：来自未经治疗的iH患者的LVNC心肌细胞；iH，s：来自以辛伐他汀治疗的iH患者的LVNC心肌细胞；iFa，ctrl：来自未经治疗的iFa患者的LVNC心肌细胞；iFa，s：来自以辛伐他汀治疗的iFa患者的LVNC心肌细胞。
图5显示辛伐他汀显著改善杂合(Tnnt2R154W/+::MypnS1291T/+)LVNC小鼠体内的心脏代谢和心脏功能，该小鼠用于Tnnt2(R154W)和Mypn(S1291T)目标基因敲入(knock-in)的突变。(图5A)以辛伐他汀治疗或不以辛伐他汀治疗Tnnt2R154W/+::MypnS1291T/+的LVNC小鼠进行动态小动物18F-FDG PET扫描以估计葡萄糖左心室代谢率(MRGlu)的结果。在10、12和14周不同年龄的Tnnt2R154W/+::MypnS1291T/+LVNC小鼠植入渗透泵(ALZET Model 2006)以施用辛伐他汀(3.5mg/kg/3.6μL/天，方块)或对照组DMSO(3.6μL/天，圆圈)连续6周。在18F-FDG PET扫描前将小鼠禁食16至20小时，以空腹血浆葡萄糖校正的Patlak图计算心脏葡萄糖代谢率。进行线性回归分析以获得DMSO载体组中的结果，Y＝-1.667X+39.31(R2＝0.2585，非零斜率，P＝0.4916)，以及在辛伐他汀组中的结果为Y＝4.205X-57.43(R2＝0.9998，非零斜率，P＝0.0095)，在载体和辛伐他汀组之间的MRGlu相对于年龄的斜率存在显著差异(P＝0.0034)。(图5B)在植入药物递送渗透泵之前和之后第126天，以时间线显示以载体(DMSO，3.6μL/天)或辛伐他汀(3.5mg/kg/3.6μL/天)处理的LVNC小鼠于1至84天或1至126天的期间以心脏超声波(VisualSonics Vevo 2100系统)测量的左心室射出率(LVEF％)。进行线性回归以决定治疗是否有效。在载体DMSO组中，斜率与零的偏差没有显著性(Y＝0.01013X+32.06，P＝0.7769，R2＝0.01757，n＝4)。在连续126天辛伐他汀治疗组中(S(d1-126)，斜率显著偏离零(Y＝0.1098X+29.55，P＝0.0297，R2＝0.6445，n＝4)。在S(d1-84)组中，LVNC小鼠在最初的84天期间以辛伐他汀治疗，然后另外42天停止药物治疗。S(d1-84)组的心功能变化斜率与零无明显偏差(Y＝0.05031X+31.95，P＝0.1326，R2＝0.3352，n＝4)，显示需要连续低剂量的辛伐他汀治疗以维持LVNC心脏功能的良好预后。载体：以DMSO处理的LVNC小鼠；辛伐他汀：以辛伐他汀处理的LVNC小鼠；对照：以DMSO处理的LVNC小鼠；DMSO：以DMSO处理的LVNC小鼠。
图6显示辛伐他汀(1μM至5μM)也可以改善来自其他LVNC患者的LVNC心肌细胞的线粒体功能，该等患者具有如(图6A)巴氏综合征(Barth syndrome)(TAZ(c.153C>G,NM_000116.4))或(图6B)杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)(DMD(c.10997_10999delCCT，NM_004006.2))等疾症同时并发LVNC心肌病变。
具体实施方式
左心室致密化不全心肌症(LVNC)的致病机转是多因素的。左心室致密化不全心肌症(LVNC)的预后很差，特别是在婴儿期发病的患者。对于抗充血药物治疗失败的人需要考虑移植。由于未满足的医疗需求和缺乏适当大小可供移植的心脏，在婴儿期严重心衰竭的病人迫切需要精准治疗药物。本发明在源自LVNC患者的iPSC(LVNC-hiPSC-CMs)的人类心肌细胞中进行老药新用活性筛选，以鉴别出有效且安全的治疗药物。此外，在带有和LVNC患者相同突变基因的转基因小鼠进行活体实验证实辛伐他汀具有能改善活体心脏功能的作用。此类方法为严重心脏衰竭表型的LVNC患者提供了新的治疗方法。
本发明发现了LVNC心肌细胞中EZH2的异常过度表达。此外，本发明证明，施以辛伐他汀以下调EZH2表达可以改善LVNC心肌细胞的心脏功能。
本研究数据中，来自LVNC病人的人类诱导多能干细胞所分化的心肌细胞(LVNC-hiPSC-CMs)和突变小鼠的心肌细胞提供了支持辛伐他汀(尤其是在低剂量范围内)对心脏表型的有益作用的有力证据。LVNC-hiPSC-CMs分化后第70天体外收缩性降低表现出心脏疾病表型。以辛伐他汀于第30天至第70天持续治疗，发挥EZH2负调节剂作用，改善心脏代谢，并增加LVNC-hiPSC-CMs中线粒体功能。在LVNC-hiPSC-CMs中，低剂量辛伐他汀有效改善线粒体功能并保留心肌细胞形态。此外，辛伐他汀可以维持LVNC心肌细胞的正常细胞大小以及心脏代谢和肌肉基因的表达。辛伐他汀的有益效果进一步在表现出心肌病表型的Tnnt2R154W/+::MypnS1291T/+LVNC小鼠中证实。在LVNC患者中，通过使用18F-氟-2-脱氧葡萄糖(18F-FDG)动态正电子发射断层扫描(PET)检测到较低的整体(global)心肌葡萄糖摄取。在Tnnt2R154W/+::MypnS1291T/+LVNC小鼠中，通过PET测量的整体心肌葡萄糖(18F-FDG)摄取的逐渐减少与心脏收缩的逐渐恶化相匹配。低剂量的辛伐他汀治疗增加显著的心肌葡萄糖摄取，防止心脏恶化的扩张，并恢复LVNC小鼠的心脏功能。
辛伐他汀也可以改善来自其他LVNC患者的LVNC心肌细胞的线粒体功能，该等患者可能同时具有如巴氏综合征(BS)或杜氏肌营养不良(DMD)等并发症。
本发明证明辛伐他汀可以作用为EZH2负调节剂，以通过表观遗传调节恢复参与心脏代谢和收缩功能的基因的表达，来改善LVNC患者的疾病进展并维持良好的预后。这项突破满足了LVNC精准医疗未被满足的医疗需求。
如本文所用的术语“一种(a)或“一种(an)”描述本公开的要素和成分。该术语仅用于方便性并提供本发明的基本概念。此外，该描述应被理解为包括一种或至少一种，并且除非上下文另外明确指出，否则单数术语包括多个，并且复数术语包括单数。当与权利要求书中的“包括”一词一起使用时，术语“一种(a)”或“一种(an)”可以表示一种或多于一种。
本文使用的术语“或”可以表示“和/或”。
本公开内容提供了治疗患有致密化不全心肌症(NCC)的个体的方法，其包括向患有NCC的个体施用包含治疗有效量的EZH2负调节剂的医药组合物。
致密化不全心肌症(NCC)，也称为海绵状心肌病，是一种罕见的先天性心肌病，其影响儿童和成人。它是由胚胎发育过程中心肌发育失常引起的。在发育过程中，大多数心脏肌肉是心肌纤维交织而成的海绵状网状结构。随着正常发育的进展，这些小梁的(trabeculated)结构经历了显著的致密化，将它们从海绵状网状结构转变为实心结构。该过程在心室中尤其明显，特别是在左心室中。当致密化过程失常时即会发生致密化不全心肌症。由于致密化不全若发生在左心室中则特别明显，该病症亦称为左心室致密化不全。在本发明的具体实施例中，NCC是左心室致密化不全心肌症(LVNC)。此外，BS或DMD亦伴随有LVNC。因此，在本发明的一个具体实施例中，该个体患有伴随BS或DMD的LVNC。
如本文所用，术语“左心室致密化不全心肌症”或“LVNC”是指致密化不全心肌症(海绵状心肌病)，其中，心室(特别是左心室)未完全致密化。LVNC由某些基因的突变引起，例如TNNT2、TAZ和DMD。
在本发明的具体实施例中，NCC或LVNC的症状包括心脏衰竭、室性心律失常和全身性栓塞病症。在本发明的另一个具体实施例中，NCC或LVNC的症状包括扩张的心室、心室收缩性受损、较大的心肌细胞、β肾上腺素反应性(β-adrenergic responsiveness)丧失、线粒体呼吸链基因的异常表达和心脏代谢功能障碍。
本发明证明了在LVNC心肌细胞中EZH2的过度表达。因此，EZH2负调节剂能够抑制EZH2过度表达以改善NCC或LVNC。特别地，EZH2负调节剂能够抑制NCC中致病突变所诱导的EZH2过度表达，进而减少过多DNA甲基转移酶(DNMT)聚集引起表观遗传的病态改变。因此，EZH2负调节剂可以通过恢复NCC或LVNC中的功能基因表达来改善心脏代谢和疾病进展。
通常，他汀类药物经鉴别为EZH2负调节剂之一。在具体实施例中，EZH2负调节剂包含他汀类药物。在一个较佳具体实施例中，低剂量的辛伐他汀可以选择性地抑制EHZ2的过度表达以恢复心脏代谢和心室功能。
他汀类药物可以治疗或改善NCC或LVNC的症状。在一个具体实施例中，治疗有效量的他汀类药物通过改善心脏功能足以治疗NCC或LVNC。在一个较佳具体实施例中，心脏功能包括心脏代谢和心室功能。
有用的他汀类药物的实例包括，但不限于洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、美伐他汀(mevastatin)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)和伊伐他汀(itavastatin)。在一个较佳具体实施例中，他汀类药物选自洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、罗苏伐他汀和伊伐他汀所成的组。在一个较佳具体实施例中，他汀类药物是辛伐他汀。
可以通过施用EZH2负调节剂来校正EZH2的过度表达，以治疗NCC或LVNC的症状。因此，他汀类药物(例如辛伐他汀)可以通过下调EZH2的表达来治疗NCC或LVNC患者。在一个较佳具体实施例中，治疗有效量的EZH2负调节剂足以通过下调EZH2的表达来治疗NCC或LVNC。在一个较佳具体实施例中，治疗有效量的他汀类药物足以通过下调EZH2的表达来治疗NCC或LVNC。在另一个具体实施例中，治疗有效量的辛伐他汀足以通过下调EZH2的表达来治疗NCC或LVNC。
在一个具体实施例中，心脏代谢包括心脏氧化磷酸化代谢、葡萄糖代谢和线粒体呼吸链。因此，他汀类药物可改善心脏代谢和线粒体功能。此外，心脏代谢包括β肾上腺素反应性。是以，他汀类药物也可以恢复β肾上腺素反应性。
β肾上腺素反应性与线粒体中ATP的产生有关。他汀类药物可通过恢复线粒体呼吸链基因的表达来改善患有NCC的个体的线粒体功能。在一个具体实施例中，EZH2负调节剂(例如他汀类药物)改善了线粒体功能。在一个较佳具体实施例中，EZH2负调节剂(例如他汀类药物)增加了线粒体ATP的产生。
此外，EZH2负调节剂(例如他汀类药物或辛伐他汀)改善或治疗LVNC患者的异常心室功能。在一个具体实施例中，EZH2负调节剂(例如他汀类药物)通过改善心肌细胞的收缩速度、维持心肌细胞的正常细胞大小和恢复肌肉蛋白的表达来改善心室功能。在一个较佳具体实施例中，肌肉蛋白包括原肌球蛋白(tropomyosin)、肌节辅肌动蛋白α和肌钙蛋白T。因此，EZH2负调节剂(例如他汀类药物)可以恢复原肌球蛋白、肌节辅肌动蛋白α和肌钙蛋白T的表达。
通过施用EZH2负调节剂(例如他汀类药物或辛伐他汀)可以改善NCC或LVNC患者中扩张心室的症状，因为EZH2负调节剂具有维持心肌细胞正常细胞大小的功能。
如本文所用，术语“治疗”是指治疗性治疗，其中个体将会逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与例如NCC和LVNC的疾病或病症相关病症的进展或严重性。术语“治疗”包括减少或减轻与NCC或LVNC相关的病况、疾病或病症的至少一种不良作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括相较于没有治疗所预期的状况，症状进展或恶化的停止或至少减缓。有益或期望的临床结果包括但不限于，减轻一种或多种症状、减轻疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、缓解(无论是部分还是全部)、减少干预、缩短住院时间和/或降低死亡率，无论是可检测的还是不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括缓解疾病的症状或副作用(包括缓和治疗)。在这种情况下的治疗可能不包括或包含完整的“治愈”。
在一个具体实施例中，个体是动物、较佳为哺乳动物、更佳为人。
在一个具体实施例中，医药组合物可任选地包含载体，例如药学上可接受的载体。在一个较佳具体实施例中，医药组合物还包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体部分地由所施用的特定组合物以及用于施用组合物的特定方法决定。因此，有多种合适的医药组合物剂型。适合肠胃外给药的剂型可以配制成例如用于静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径。载体包括水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂、脂质体、微球和乳液的水性和非水性无菌悬浮液。术语“药学上可接受的”是指可以施用于哺乳动物而没有过度毒性的化合物和组合物。
EZH2负调节剂(例如，他汀类药物或辛伐他汀)和药学上可接受的载体可以通过本领域已知的许多不同途径施用于个体。在一个具体实施例中，EZH2负调节剂和药学上可接受的载体通过外部、静脉内、皮下、局部、口服或通过肌肉或吸入给药。医药组合物将通过消化系统或循环系统递送至目标部位。
本文使用的术语“治疗有效量”是一个治疗剂量，其可以预防、减少、停止或逆转在特定条件下在个体中发展的症状，或者在个体开始接受治疗时，在特定条件下部分或完全缓解已经存在的症状。
在一个具体实施例中，治疗有效量的EZH2负调节剂的范围为0.01mg/kg/天至10mg/kg/天。在一个较佳具体实施例中，治疗有效量的EZH2负调节剂的范围为0.05mg/kg/天至5mg/kg/天。在一个更佳具体实施例中，治疗有效量的EZH2负调节剂的范围为0.1mg/kg/天至1mg/kg/天。
在另一个具体实施例中，治疗有效量的他汀类药物的范围为0.01mg/kg/天至10mg/kg/天。在一个较佳具体实施例中，治疗有效量的他汀类药物的范围为0.05mg/kg/天至5mg/kg/天。在一个更佳具体实施例中，治疗有效量的他汀类药物的范围为0.1mg/kg/天至1mg/kg/天。
辛伐他汀在他汀类药物中具有最佳治疗功效。在一个具体实施例中，低剂量的辛伐他汀是有效的。在另一个具体实施例中，治疗有效量的辛伐他汀的范围为0.01mg/kg/天至10mg/kg/天。在一个较佳具体实施例中，治疗有效量的辛伐他汀的范围为0.05mg/kg/天至5mg/kg/天。在一个更佳具体实施例中，治疗有效量的辛伐他汀的范围为0.1mg/kg/天至1mg/kg/天。
在一个具体实施例中，以治疗剂量将EZH2负调节剂连续每日施用于个体，以在心室功能改善或血浆NT-proBNP降低维持良好的预后。在一个较佳具体实施例中，他汀类药物每天以治疗剂量给予个体至少一年。在一个较佳具体实施例中，EZH2负调节剂每天施用至个体至少24周时间，其中治疗剂量从低剂量滴定。在另一个具体实施例中，他汀类药物从低剂量(0.1mg/kg/天)开始每天施用至个体至少4周时间，且剂量滴定是基于心室功能和血浆NT-proBNP的参数每4周监测一次。
本发明提供一种组合物在制备用于治疗致密化不全心肌症(NCC)的药物的用途，其中，该组合物包含EZH2负调节剂。
在一个具体实施例中，NCC是左心室致密化不全心肌症(LVNC)。巴氏综合征(BS)或杜氏和贝克氏肌营养不良(DMD)亦可伴随LVNC。
NCC或LVNC的致因包含由致病突变诱导的EZH2过度表达。因此，EZH2负调节剂可抑制EZH2过度表达并改善NCC或LVNC。他汀类药物经鉴别为EZH2负调节剂之一。在一个具体实施例中，EZH2负调节剂包含他汀类药物。
因此，EZH2负调节剂(例如，他汀类药物)可以治疗NCC或LVNC的症状。在一个具体实施例中，EZH2负调节剂改善患有NCC或LVNC的个体的心脏功能以治疗NCC或LVNC。在一个较佳具体实施例中，他汀类药物改善患有NCC或LVNC的个体的心脏功能以治疗NCC或LVNC。在一个更佳具体实施例中，心脏功能包括心脏代谢和心室功能。
在另一个具体实施例中，他汀类药物包含洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、罗苏伐他汀和伊伐他汀。在一个较佳具体实施例中，他汀类药物包含阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀及辛伐他汀。在一个更佳具体实施例中，他汀类药物包含辛伐他汀。
辛伐他汀作用为EZH2负调节剂。因此，辛伐他汀可通过下调EZH2的表达来治疗NCC或LVNC患者。在一个具体实施例中，EZH2负调节剂通过下调EZH2的表达来治疗NCC或LVNC。在一个较佳具体实施例中，他汀类药物通过下调EZH2的表达来治疗NCC或LVNC。在一个更佳具体实施例中，辛伐他汀通过下调EZH2的表达来治疗NCC或LVNC。
在一个具体实施例中，心脏代谢包括心脏脂肪酸代谢、葡萄糖代谢和线粒体呼吸链。因此，他汀类药物可改善心脏代谢和线粒体功能。此外，心脏代谢包括β肾上腺素反应性。因此，他汀类药物也可以恢复β肾上腺素反应性。
此外，EZH2负调节剂(例如他汀类药物)可通过恢复线粒体呼吸链基因的表达来改善患有NCC的个体的线粒体功能。在一个具体实施例中，EZH2负调节剂(例如他汀类药物)改善线粒体的功能。在一个较佳具体实施例中，EZH2负调节剂(例如他汀类药物)增加线粒体ATP的产生。
EZH2负调节剂(例如，他汀类药物或辛伐他汀)可以改善或治疗患有NCC或LVNC的个体的异常心室功能。在一个具体实施例中，EZH2负调节剂(例如他汀类药物)通过改善心肌细胞的缩短速度、维持心肌细胞的正常细胞大小和恢复肌肉蛋白的表达来改善心室功能。在一个较佳具体实施例中，肌肉蛋白质包括原肌球蛋白、肌节辅肌动蛋白α和肌钙蛋白T。因此，他汀类药物可以增加原肌球蛋白、肌节辅肌动蛋白α和肌钙蛋白T的量。
在一个具体实施例中，组合物是一种医药组合物。在一个较佳具体实施例中，该医药组合物还包含医药上可接受的载体。该医药组合物将通过消化系统或循环系统传送至目标部位。
在一个具体实施例中，治疗有效量的EZH2负调节剂的范围为0.01mg/kg/天至10mg/kg/天。在一个较佳具体实施例中，治疗有效量的EZH2负调节剂的范围为0.05mg/kg/天至5mg/kg/天。在一个更佳具体实施例中，治疗有效量的EZH2负调节剂的范围为0.1mg/kg/天至1mg/kg/天。
在另一个具体实施例中，治疗有效量的他汀类药物的范围为0.01mg/kg/天至10mg/kg/天。在一个较佳具体实施例中，治疗有效量的他汀类药物的范围为0.05mg/kg/天至5mg/kg/天。在一个更佳具体实施例中，治疗有效量的他汀类药物的范围为0.1mg/kg/天至1mg/kg/天。
低剂量的辛伐他汀是有效的。在另一个具体实施例中，治疗有效量的辛伐他汀的范围为0.01mg/kg/天至10mg/kg/天。在一个较佳具体实施例中，治疗有效量的辛伐他汀的范围为0.05mg/kg/天至5mg/kg/天。在一个更佳具体实施例中，治疗有效量的辛伐他汀的范围为0.1mg/kg/天至1mg/kg/天。
在一个具体实施例中，以治疗剂量将EZH2负调节剂连续每天施用至个体，以在心室功能改善或血浆NT-proBNP降低维持良好的预后。在一个较佳具体实施例中，以治疗剂量将他汀类药物每天施用至个体至少一年。在一个较佳具体实施例中，每天向个体施用EZH2负调节剂至少24周时间，其中治疗剂量从低剂量滴定。在一个具体实施例中，从低剂量(例如，0.1mg/kg/天)他汀类药物开始，每天向个体施用至少4周，并且基于心室功能和血浆NT-proBNP，每4周监测一次参数滴定剂量。
实施例
以下实施例是非限制性的，并且仅代表本发明的各个方面和特征。
方法
hiPSC研究
分别将源自患有左心室致密化不全心肌症(LVNC)的患者和正常健康女性的人类诱导多能干细胞系(hiPSC)通过两种方法重新编程(reprogrammed)；每个患者的其中一个细胞系以皮肤细胞由携带四种Yamanaka因子(Klf4、Myc、Sox2、Oct4；由NTU的Hong-NerngHo博士进行)的慢病毒(lentivirus)重新编程，另一个细胞系以周边血单核细胞(PBMC)由携带四个Yamanaka因子的仙台病毒(由斯坦福大学的Joseph C.Wu博士进行)重新编程。患者同意收集患者的组织/血细胞进行遗传检查，重新编程为hiPSC，以及进行药理学研究。通过在来自相同患者的两个人类心肌细胞系中以相同剂量测试相同药物来验证药物效果，每个细胞系中独立重复至少三次。通过Ionoptix系统(Westwood，MA，USA)测量细胞收缩参数，并通过Agilent Seahorse Analyzer(Seahorse Bioscience，MA，USA)评估线粒体功能。
线粒体功能的测量
在第70天进行Seahorse测定，在依序添加XF Mito压力测试试剂盒中以箭头指示的试剂的条件下测量线粒体OCR(耗氧率)和ECAR(细胞外酸化率)。以每孔中的总细胞蛋白质来标准化数据。在基础(寡霉素之前)和最大呼吸能力(FCCP之后)的条件下测量OCR与ECAR的关系。
组学研究
蛋白质组学分析
以含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)的RIPA缓冲液萃取以辛伐他汀处理或不以辛伐他汀处理由hiPSC衍生的心肌细胞的总蛋白质，进一步用胰蛋白酶分解样本。脱盐和干燥后，通过LTQ-Orbitrap Velos质谱仪系统进行LC-MS/MS分析。搜索MASCOT数据库以取得肽和蛋白质组ID，前体质量准确度为7ppm，MS/MS准确度为0.5Da。基于Uniprot人类数据库，使用无标记量化方法以MaxQuant软件进一步分析大质谱原始数据，然后使用Perseus软件进行统计分析。
转录组分析
以TRIzol试剂(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)萃取以辛伐他汀处理或不以辛伐他汀处理由hiPSC衍生的心肌细胞的总RNA。通过Quick-RNA试剂盒(Zymol Research，CA，USA)从TRIzol-氯仿匀浆的上层水层进一步纯化总RNA。以PhalanxBiotech进行TruSeq Stranded mRNA定序。简而言之，来自500ng高质量总RNA(RIN值>8)的polyA mRNA经纯化、片段化，并合成第一和第二链cDNA。连接条码连接子以产生索引库，并使用Quantus Fluorometer(Promega，Madison，WI)上的Promega QuantiFluor dsDNA系统定量该索引库。使用Agilent 2200TapeStation仪器上的High Sensitivity D1000 ScreenTape分析索引库的大小和纯度。合并索引库并使用配对的末端100bp Rapid Run型式在Illumina HiSeq 2500定序仪上执行，以产生每个样本4千万个总读数。定序后，以Trimmomatic在定序中修剪原始读数以去除低质量的碱基。以下标准也适用于原始数据清理：(1)当滑动窗(4碱基宽)的平均质量降至15以下时切除；以及(2)丢弃短于35bp的读数。在将读数与基因组比对后，将Cuffquant用于得到的比对资料以计算基因和转录物的表达形态(profile)。Cuffdiff是Cufflinks套装软件的一部分，通过计算每百万(FPKM)比对片段中每千个碱基转录物的RNA-Seq片段数量，从两个或多个条件中获取表达形态和合并的组装体(assemblies)来估计表达量。Cuffdiff测试了观察到的变化的统计学显著性，并鉴别在转录时或转录后经差异性调节的基因。Perseus软件通过结合蛋白质组和转录组的数据成为一个Perseus矩阵，进一步分析跨组学数据。两个组学栏(column)都被排序并转换为列(rank)。对每个注释术语进行了双变量测试。进行基因本体论(GO)富集分析，以基于GO的分类系统解释具有功能表征的基因组别。通过STRING预测分子之间的潜在相互作用。
绝对定量实时PCR
用Illumina Eco实时PCR系统通过绝对定量方法证实以辛伐他汀处理或不以辛伐他汀处理的心肌细胞的基因表达的差异。简而言之，经萃取出的mRNA进行逆转录后，将模板cDNA与感兴趣基因的引物在OmiGreen缓冲液中混合，与5个10倍连续稀释(serialdilution)的标准品进行PCR，以覆盖未知样本范围，并且定量每个样本中18S RNA的表达量作为内部对照。
LVNC小鼠模型和心脏功能成像
以C57BL/6j为背景敲入Tnnt2(R154W)和Mypn(S1291T)的小鼠由中国台湾大学基因组医学中心的基因敲除小鼠核心实验室产生。遗传杂合的LVNC小鼠(Tnnt2R154W/+::MypnS1291T/+)自交叉繁衍Tnnt2R154W/+和MypnS1291T/+小鼠而得。进行PCR和DNA定序以确认基因型。所有动物程序和实验方法均经AAALAC认可的设施批准。
在以吸入2％异氟醚麻醉的小鼠，通过VisualSonic Vevo 2100成像系统(VisualSonic Inc.，Toronto，Canada)以M模式心脏超声波图测量LVNC小鼠的心脏运动功能。通过动态小动物正电子发射断层扫描(PET)来测量LVNC小鼠的心脏葡萄糖代谢率及小鼠心脏中的18F-FDG(氟脱氧葡萄糖18F)摄取，以分析心脏葡萄糖代谢率(MRGlu)，进而检查心脏代谢的变化。
统计分析
使用双向ANOVA搭配杜凯(Tukey)检定进行多重比较，以区分iFa和iH的LVNC-hiPSC-CMs中第50天和第70天在DMSO和辛伐他汀组之间的细胞缩短速度的差异。进行线性回归分析，以阐明LVNC-hiPSC-CMs中对β肾上腺素刺激的收缩性反应的差异，以及LVNC小鼠中，DMSO载体和辛伐他汀组之间的LVEF或心脏代谢葡萄糖速率的变化。
结果
患者特征和遗传信息
由于活动力不良达一周，患者(iH)在6个月大时入院。初步评估显示灌注不良、肝肿大和心脏肥大，NT-proBNP显著升高(>35000pg/mL)。在使用强心剂支持下的心脏超声波图显示左心室扩张(LV)(LV末端舒张直径的Z评分，4.7)伴随LV收缩力受损(LV射出分率，30.3％)。电脑断层扫描显示冠状动脉正常、LV扩张、左心室收缩力差、以及致密化不全。心肌炎调查结果为阴性。诊断为LV致密化不全扩张型心肌病。病况大致逐渐改善，但观察到在丢失剂量(lose dosage)范围内戒除米力农(milrinone)有困难。患者(iH)入院后42天出院。家庭筛查发现患者(iH)的父亲(iFa)也有扩张的LV和低LV射出分率。
第一个LVNC家族的遗传检查发现患者(iH)和患者(iH)的父亲(iFa)在TNNT2(R141W)和MYPN(S1296T)中具有杂合错义突变。在具有BS的第二LVNC家族中发现TAZ(Y51*)的纯合突变，并且在具有DMD的第三LVNC家族中发现DMD(S3666del)与DMD的杂合突变。
在随后的追踪期间，患者(iH)接受药物治疗，包括地高辛(digoxin)、呋塞米(furosemide)、卡托普利(captopril)、卡维地洛(carvedilol)和阿司匹林(aspirin)。在疾病发作后约2年，患者(iH)的生长缓慢且体重低于第三百分位数，但发育状态在正常范围内。心脏超声波图的LV射出分率仍然很差，在17.5％和24.5％之间。NT-proBNP在920pg/ml和1200pg/ml之间。患者(iH)的父亲(iFa)也接受了卡维地洛、氯沙坦和阿司匹林，其心脏状态保持稳定。
LVNC-hiPSC所衍生心肌细胞中的药物再利用
以来自该LVNC患者(iH)和其父亲(iFa)的人类心肌细胞进行诱导为多能干细胞，作为疾病建模(disease modeling)，以表征重现心脏功能障碍进展的功能异常。在体外分化后第50天，LVNC-hiPSC-CM发展成异常的心脏表型，包括肌细胞收缩减少(图1A和1B)、β肾上腺素反应性丧失(图1C)、心脏代谢功能不良(图1D)、以及心脏收缩和线粒体呼吸链的功能分子中的异常组学(图1E和1F)。途径分析预测异常的表观遗传调节可能与异常代谢过程和肌肉结构有关(图2A)。绝对定量实时PCR验证发现LVNC心肌细胞(iH和iFa)中EZH2的异常过度表达(图2B)。EZH2直接抑制剂(gsk)未改变心脏线粒体功能不良，但DNMT抑制剂(zeb)能够恢复LVNC心脏线粒体功能(图2C)。这表明EZH2的过度表达可能会增加DNMT的召集，从而改变LVNC心肌细胞的表观遗传特征，最后导致功能基因表达的扰乱。因此，EZH2表达的下调应该是一种以疾病状态特异性作用方式改善LVNC心肌细胞中心脏功能的可行治疗策略。在该LVNC-hiPSC-CM模型上的药物再利用筛选鉴别出辛伐他汀能够选择性下调LVNC心肌细胞中EZH2的表达(图3A)。从辛伐他汀治疗后第30天到第70天，辛伐他汀在恢复心脏收缩和β肾上腺素反应的有益作用优于其他(例如阿托伐他汀、洛伐他汀和氟伐他汀)(图3B)。在LVNC-hiPSC-CMs中，低剂量的辛伐他汀治疗(图3C中的5μM，iH，s5)确实比高剂量(10μM，iH，图3C中的s10)的治疗在改善心脏代谢功能方面具有更好的效果。辛伐他汀治疗能够显著增加线粒体呼吸链分子(图3D)和心脏代谢(图3E)的基因表达。此外，LVNC心肌细胞的细胞大小在分化后第70天变大(图4A)。从第30天到第70天的辛伐他汀治疗显著减弱了肌细胞大小的变化(图4A)。在辛伐他汀处理的心肌细胞中，肌节辅肌动蛋白α或肌钙蛋白T的密度也显著增加。蛋白质组学分析表明辛伐他汀在iH-LVNC和iFa-LVNC心肌细胞中皆可显著恢复具有肌肉收缩和代谢过程功能的蛋白质的表达(图4B至4D)。
辛伐他汀改善LVNC小鼠心脏代谢中的体内作用
植入微型渗透泵(ALZET Model 2006，Durect Corp.Cupertino，CA，美国)进行小鼠背上的皮下药物施用(辛伐他汀：3.5mg/3.6μL/kg/天；DMSO：3.6μL/kg/天)，分别从10周、12周、14周龄开始，为期6周。在终点时，测量空腹LVNC小鼠的心脏葡萄糖代谢率(MRGlu)。经载体处理的LVNC小鼠的心脏葡萄糖摄取，随着老年LVNC小鼠中心脏功能的恶化而逐渐降低(图5A)。辛伐他汀显著逆转了LVNC小鼠衰老后心脏葡萄糖代谢率的恶化，证明辛伐他汀改善了LVNC小鼠的心脏葡萄糖代谢。辛伐他汀还显著改善心脏收缩功能(图5B)。此外，需要持续的低剂量辛伐他汀治疗以维持LVNC心脏功能的良好预后。
辛伐他汀还显著改善来自LVNC患者的LVNC心肌细胞的线粒体功能，该LVNC心肌细胞具有其他并发症，例如BS(图6A)或DMD(图6B)，剂量范围为1μM至5μM。
在缺少任何本文未具体公开的要素和限制的情况下，本文中说明性描述的公开内容可适当地实施。使用的术语和表达是用作描述性的术语而非限制性的，并且无意在使用这些术语和表达来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但已认知在所要求保护的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过实施例和可视需要选择的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文所公开的概念进行修改和变化，并且此等修改和变化被认为是在由本发明所附的权利要求书所限定的范围内。

Claims (11)

1.一种治疗患有致密化不全心肌症的受试者的方法，所述方法包括向所述患有致密化不全心肌症的受试者施用包含治疗有效量的EZH2负调节剂的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述致密化不全心肌症包含左心室致密化不全心肌症。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EZH2负调节剂的治疗有效量足以通过抑制由致病突变导致的EZH2过度表达而治疗所述致密化不全心肌症。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EZH2负调节剂的治疗有效量足以通过改善心脏功能而治疗所述致密化不全心肌症。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述心脏功能包括心脏代谢和心室功能。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EZH2负调节剂每天施用至所述受试者为期至少四周。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EZH2负调节剂包含他汀类药物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述他汀类药物是辛伐他汀。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受试者是人。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述EZH2负调节剂的治疗有效量在0.01mg/kg/天至10mg/kg/天范围内。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述辛伐他汀的治疗有效量在0.01mg/kg/天至10mg/kg/天范围内。
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