JPWO2019131656A1 - ベンゾチアゾイミダゾリル化合物を含有する小胞体ストレス調節剤 - Google Patents

Abstract

一般式（１）【化１】［式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ同一又は異なっていて、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級シクロアルキル基、低級アルカノイル基、ハロゲン置換低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン置換低級アルコキシ基、シアノ基、架橋したメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、プロピレンジオキシ基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフォニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルアミド基、低級アルキルアミノアルキレンアミド基、アミノ基、アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、一般式（２）で表される官能基、または一般式（３）で表される官能基【化２】［式中、Ｒ３は、ジ低級アルキルアミノ基、モルホリノ基、ピペリジノ基、２−メチル−ピペリジノ基、２−オキソ−ピロリジニル基を表す。ｐは２〜６の整数を表す。］【化３】［式中、Ｒ４は、低級アルキル基を表す。］を表す。ｍ、ｎは０〜３の整数を表す。なお、低級なる語は、特に断りのない限り、炭素数1〜6を表し、好ましくは炭素数1〜4、より好ましくは1〜3の炭素数を表す。ハロゲン原子はフッ素原子、塩素原子、臭素原子を表す。］の化合物は、小胞体ストレスを、既知の化学シャペロンより強く抑制することができる。従って、小胞体ストレスに起因する種々の疾患の予防、改善、又は治療剤として好適に使用できる。

Description

本発明は、小胞体ストレス調節剤に関する。本発明の小胞体ストレス調節剤は、小胞体ストレス応答（ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＵＰＲ）を制御する機能を有する。更には、その制御機能に基づき、代謝異常に起因する疾患、脳神経疾患、癌、免疫疾患などに対する予防又は治療剤となるものである。

生体は、常に外界からの多種多様なストレスに曝されており、通常それらに対して内分泌系などの制御機構により恒常性を維持している。しかし、過剰なストレスは、時にメンタルヘルスの不調だけでなく、身体的なストレス反応を引き起こし、脳血管障害、心疾患、消化器疾患、更には免疫力の低下を引き起こすことが知られている。一方、細胞も、細胞レベルで内的及び外的ストレスに曝されている。例えば、ウイルス感染、栄養欠乏（アミノ酸、糖、脂質などの欠乏）、虚血、熱ショック、酸化ストレスなどが代表的なものである。

小胞体は、タンパク質の合成に関与する重要な細胞内小器官である。核で転写されたｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質は小胞体に取り込まれ、シャペロンの助けを借りて正常に折り畳まれ、小胞体から分泌される。しかし、不適切なアミノ酸を含む分子が関与すると、タンパク質は正常に折り畳まれない。正常に折り畳まれなかったタンパク質は、ＥＲＡＤ（ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）により処理されるが、処理能力を超えると、異常なタンパク質が増加して、小胞体（ＥＲ）ストレスが誘導される。

図1に示すように、ウイルス感染、栄養欠乏（アミノ酸、糖、脂質）、虚血、熱ショック、酸化ストレスなどによって、小胞体の環境が乱されることにより折り畳みが障害された異常なタンパク質が小胞体中に増加することがわかってきており、これを小胞体ストレスと呼んでいる。細胞は小胞体ストレスに曝された場合、小胞体ストレス応答（UPR）により、その環境変化に応じてその小胞体機能を制御してストレスに適応して健康な状態を維持することが分かって来た。しかしながら、小胞体ストレス応答が破綻すると、タンパク質が正しく折り畳まれないことから生命の維持に必要なタンパク質の機能を喪失して病気になることも明らかになった。

図2に示すように、小胞体ストレスマーカーの発現上昇を確認することなどで、小胞体ストレスあるいは小胞体ストレス応答（UPR）の破綻が様々な疾患の発症に関わることが明らかにされつつある（非特許文献５〜１２）。例えば、重篤な小胞体ストレスにより細胞機能の異常や細胞死が生じると、糖尿病、動脈硬化、神経変性疾患、自己免疫疾患、がんなどの病気になることがわかってきている。一方、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を増強することで、ストレス状態でも増殖能を獲得してがんを発症することもわかってきた。

図３に示すように、小胞体ストレス応答には、その活性化機序として大きく分けて３つのルートがあり、それぞれ、小胞体ストレス伝達タンパク質（受容体）であるＩｒｅｌ（Ｉｎｏｓｉｔｏｌｅ ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １）、ＡＴＦ６（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ６）、及びＰＥＲＫ（ＰＫＲ−ｌｉｋｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｋｉｎａｓｅ）の活性化によって、小胞体での折り畳み不全タンパク質の蓄積が感知され、その情報がサイトゾルや核に伝えられて、小胞体ストレス応答（UPR）が活性化される。
小胞体でのタンパク質折り畳み能を越える折り畳み不全タンパク質が生成されると、まずタンパク質の合成を止めること（翻訳抑制）により、小胞体の負荷を軽減する応答がおこる。これはPERKによって翻訳開始に必要なｅＩＦ２α（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２α ｓｕｂｕｎｉｔ）がリン酸化することで制御されている。
なお、ＰＥＲＫは転写制御因子ＡＴＦ４も標的にしており、ＡＴＦ４の翻訳を促進する。ＡＴＦ４はシス因子ＡＡＲＥに結合して一連の遺伝子の転写を誘導し、細胞を短期のストレスに適応させる。
次に、小胞体でのタンパク質折り畳み能を増加させるために、タンパク質の折り畳みを実行する分子シャペロンを誘導する。これはATF 6がATF6(N)に切断されて活性化することで、主として制御されている。ＡＴＦ６の標的遺伝子の１つがＸＢＰ１であり、これはＩｒｅ１の標的でもある。
さらに、小胞体に蓄積している折り畳み不全タンパク質を除去するために、折り畳み不全タンパク質を小胞体からサイトソルに引き出してユビキチンプロテアソーム系で分解する小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）が促進される。これはＩｒｅ１がＸＢＰ１（Ｘ-ｂｏｘ-ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）を選択的にスプライシングして活性型転写因子にすることで、主として制御されている。
このような適応応答によっても小胞体ストレスを解消できない障害を持つ細胞は、アポトーシス促進性転写因子ＣＨＯＰ（Ｃ／ＥＢＰ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を誘導することなどで、アポトーシスにより除去される。

最近では、小胞体ストレス応答及び統合的ストレス応答を標的にした創薬が注目されている（特許文献１〜３）。例えば、小胞体ストレスによる神経細胞死を回避させる化合物の探索から、低分子化合物のサルブリナル（Ｓａｌｕｂｒｉｎａｌ）が同定され、これはｅＩＦ２αの脱リン酸化を抑制し（ｅＩＦ２αのリン酸化を促進させ）、折り畳み不全タンパク質となるタンパク質の合成を抑制させることで、小胞体ストレスを軽減させている（非特許文献４）。
小胞体ストレスの緩和を念頭においた治療法としては、本来の分子シャペロン（タンパク質シャペロン）の機能を補完あるいは補助する低分子化合物の化学シャペロンが考えられている。これまでに、４ＰＢＡやその改良型であるＴＵＤＣＡにより２型糖尿病のモデルマウスでのインスリン抵抗性などの病態が改善したことが報告されている（非特許文献３）。４ＰＢＡやＴＵＤＣＡは多量に投与しなければ効果を認めなかったが、より低濃度で抗糖尿病効果のあるＡｚｏｒａｍｉｄｅも最近報告されている。
このように、小胞体ストレス応答や統合的ストレス応答を標的とした創薬研究が発展しているが、様々な疾患（代謝異常疾患、脳神経疾患、癌、免疫疾患など）に対する予防又は治療に使用可能な化合物を創出するために、どのような母核構造が必要であるのかは、ほとんど分かっていない。

再表２０１２−１０８３９４号公報 公表２０１４−５１２００８号公報 公表２０１６−５１７４４２号公報

Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．７（１２）：１０１３−３０（２００８） Ｏｚｃａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６，４５７−４６１（２００４） Ｏｚｃａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３，１１７３−１１４０（２００６） Ｒｅｉｊｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１４，９５０−９６０（２００８） Ｏｙａｄｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ７， ５２０−５３２（２００８）． Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｎｕｔｒ ３，３０７−３２１（２０１２）． Ｃｏｓｔａ−Ｍａｔｔｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３６，１１６６−１１７３（２００５）． Ｓｉｄｒａｕｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｉｆｅ ２，ｅ００４９８（２０１３）． Ｄｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１２５， ２５９２−２６０８（２０１５）． Ｍｕｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２２，６３３−６４２（２００５）． Ｏｙａｄｏｍａｒｉ ｅｔ ａｌ，ＦＡＥＢ Ｊ．３０，７９８−８１２（２０１６） 基礎老化研究３７（３）；９−１６，２０１３

本発明は、小胞体ストレスと統合的ストレスに由来する疾患の治療剤を開発するために、小胞体ストレスを調整できる新規な化合物を提供することを目的とする。

本発明者は、臓器特異的（肝臓、脂肪細胞、骨格筋）に生じる統合的ストレス、特に小胞体ストレスの影響を評価するため、小胞体ストレス応答シグナルを制御することが可能な遺伝子改変マウスを作製し、小胞体ストレス応答による生体機能制御について明らかしてきた。さらに本発明者は、小胞体ストレス応答のシグナルをより高感度かつ簡便に定量化できる細胞評価システム（図4）を新たに開発した。この本発明者が構築した細胞評価システムを用いた化合物ライブラリースクリーニングにより、小胞体ストレスを軽減できる化合物の同定を試みた。化学シャペロン活性を持つ化合物は、小胞体ストレス下で誘導される小胞体ストレス応答の活性化を抑制あるいは消失するので、上述の評価システムで見出すことができる。化学シャペロン活性がある化合物は、小胞体ストレスを緩和することで様々な疾患の予防や治療に役立つことが期待できる。特に糖尿病の発症に関してはインスリンやインスリン受容体に関する小胞体ストレスが注目されおり、インスリン分泌に関する小胞体ストレスから膵β細胞を保護できれば、糖尿病の発症が予防できることになる。

本発明者が構築したスクリーニングシステムは細胞ベースのスクリーニング方法であるために、細胞生存率低下やレポータータンパク質に作用して偽陽性となったヒット化合物があると考えられる。そこで、高濃度（１００μＭ）投与にて細胞障害性アッセイ、小胞体ストレス応答を検出するＥＧＦＰレポーターアッセイやルシフェラーゼレポーターアッセイを行い、偽陽性を除外することを行った。
見出された化合物の再アッセイを行った結果、次の一般式（１）のベンゾチアゾイミダゾリル化合物に、既知の化学シャペロンより強い小胞体ストレス軽減効果があることを見出した。

［式中、Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ同一又は異なっていて、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級シクロアルキル基、低級アルカノイル基、ハロゲン置換低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン置換低級アルコキシ基、シアノ基、架橋したメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、プロピレンジオキシ基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフォニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルアミド基、低級アルキルアミノアルキレンアミド基、アミノ基、アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、一般式（２）で表される官能基、または一般式（３）で表される官能基

［式中、Ｒ_３は、ジ低級アルキルアミノ基、モルホリノ基、ピペリジノ基、２−メチル−ピペリジノ基、２−オキソ−ピロリジニル基を表す。ｐは２〜６の整数を表す。］

［式中、Ｒ_４は、低級アルキル基を表す。］
を表す。ｍ、ｎは０〜３の整数を表す。］
本発明者は、以上の知見に基づいて本発明を完成した。

即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
〔１〕一般式（１）

［式中、Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ同一又は異なっていて、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級シクロアルキル基、低級アルカノイル基、ハロゲン置換低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン置換低級アルコキシ基、シアノ基、架橋したメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、プロピレンジオキシ基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフォニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、アミド基、低級アルキルアミド基、低級アルキルアミノアルキレンアミド基、アミノ基、アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、一般式（２）で表される官能基、または一般式（３）で表される官能基

［式中、Ｒ_３は、ジ低級アルキルアミノ基、モルホリノ基、ピペリジノ基、２−アルキル−ピペリジノ基、２−オキソ−ピロリジニル基を表す。ｐは２〜６の整数を表す。］

［式中、Ｒ_４は、低級アルキル基を表す。］
を表す。ｍ、ｎは０〜３の整数を表す。低級は炭素数１〜６を表す。ハロゲン原子はフッ素原子、塩素原子、臭素原子を表す。］
で表されるベンゾチアゾイミダゾリル化合物を有効成分とする、小胞体ストレス調節剤。
〔２〕上記Ｒ_１が水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン置換低級アルコキシ基、水酸基、又はアミド基であり、ｍが１又は２である、〔１〕に記載の小胞体ストレス調節剤。
〔３〕ｍが１であり、上記Ｒ_１がパラ位に置換しているか、又はｍが２であり、上記Ｒ_１がパラ位とメタ位に置換している〔１〕又は〔２〕に記載の小胞体ストレス調節剤。
〔４〕上記Ｒ_１のハロゲン原子がフッ素原子、又は塩素原子であり、低級アルキル基がメチル基、又はエチル基であり、低級アルコキシ基がメトキシ基、又はエトキシ基である、請求項〔２〕又は〔３〕に記載の小胞体ストレス調節剤。
〔５〕Ｒ_２が水素原子、低級アルキル基、低級アルキルスルフォニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、一般式（２）の置換基、又は一般式（３）の置換基であり、ｎが１である、〔１〕〜〔４〕の何れかに記載の小胞体ストレス調節剤。
〔６〕 上記Ｒ_２の低級アルキル基がメチル基であり、低級アルキルスルフォニル基がメチルスルフォニル基であり、低級アルコキシカルボニル基がメトキシカルボニル基、又はエトキシカルボニル基である、〔５〕に記載の小胞体ストレス調節剤。
〔７〕上記一般式（２）のＲ_３のジ低級アルキルアミノ基がジエチルアミノ基であり、２−アルキル−ピペリジノ基が２−メチル−ピペリジノ基であり、ｐが３である、〔５〕に記載の小胞体ストレス調節剤。
〔８〕上記一般式（３）のＲ_４の低級アルキル基がメチル基、又はエチル基である、〔５〕に記載の小胞体ストレス調節剤。
〔９〕上記ｎが１であり、Ｒ_２が７位の置換基である、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の小胞体ストレス調節剤。
〔１０〕上記ｎとｍが１であり、Ｒ_１がパラ位に置換した水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、ジフルオロメトキシ基、若しくはトリフルオロメトキシ基であるか、オルト位に置換したフッ素原子であるか、又はメタ位に置換したメトキシ基、若しくはエトキシ基であり、Ｒ_２が７位に置換した水素原子、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、メチルスルフォニル基、３−（ジエチルアミノ）−プロピルアミド基、３−ピペリジノ−プロピルアミド基、３−（２−メチル−ピペリジノ）−プロピルアミド基、３−モルホリノ−プロピルアミド基、若しくは４−エトキシカルボニルピペリジノカルボニル基であるか、
又は上記ｎが１、ｍが２であり、Ｒ_１がパラ位に置換した水酸基とメタ位に置換したアミド基であり、Ｒ_２が水素原子である〔１〕に記載の小胞体ストレス調節剤。
〔１１〕上記ｎとｍが１であり、Ｒ_１がパラ位に置換した水素原子、塩素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基、ジフルオロメトキシ基、若しくはトリフルオロメトキシ基、オルト位に置換したフッ素原子、又はメタ位に置換したメトキシ基、若しくはエトキシ基であり、Ｒ_２が７位に置換した水素原子、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、メチルスルフォニル基、３−（ジエチルアミノ）−プロピルアミド基、３−（２−メチル−ピペリジノ）−プロピルアミド基、若しくは３−モルホリノ−プロピルアミド基であるか、
又は上記ｎが１、ｍが２であり、Ｒ_１がパラ位に置換した水酸基とメタ位に置換したアミド基であり、Ｒ_２が水素原子である、〔１〕に記載の小胞体ストレス調節剤。
〔１２〕 一般式（５）

［式中、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、塩素原子、メトキシ基、エトキシ基、ジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、メチル基、またはエチル基を表し、Ｒ_２は、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、カルボキシル基、エステル基、アミド基、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基またはイソプロピルスルホニル基を表す。
上記エステル基は、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基またはイソプロピルオキシカルボニル基を表す。
上記アミド基は、３−Ｎ−モルホリノ−プロピルアミノカルボニル基、３−Ｎ−ピペリジノ−プロピルアミノカルボニル基、３−Ｎ−（２−メチル−ピペリジノ）−プロピルアミノカルボニル基、３−Ｎ−（２−ピロリドン）−プロピルアミノカルボニル基、３−（ジエチルアミノ）−プロピルアミノカルボニル基またはＮ―（４−エトキシカルボニルピペリジノ）−カルボニル基を表す。］
で表される〔１〕に記載のベンゾチアゾイミダゾリル化合物を有効成分とする、小胞体ストレス調節剤。
〔１３〕 Ｒ_２が、水素原子、メチルスルホニル基、水素原子、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、３−（ジエチルアミノ）−プロピルアミド基、３−（２−メチル−ピペリジノ）−プロピルアミド基、又は３−モルホリノ−プロピルアミド基である、〔１２〕に記載の小胞体ストレス調節剤。
〔１４〕 Ｒ_５が、水素原子、フッ素原子、塩素原子、メトキシ基、エトキシ基、水酸基、メチル基、エチル基、又はジフロロメトキシ基である、〔１２〕または〔１３〕に記載の小胞体ストレス調節剤。
〔１５〕 Ｒ_６が、メトキシ基、エトキシ基、又はアミノカルボニル基である、〔１２〕〜〔１４〕のいずれかに記載の小胞体ストレス調節剤。
〔１６〕 Ｒ_７がフッ素原子である、〔１２〕〜〔１５〕のいずれかに記載の小胞体ストレス調節剤。
〔１７〕上記小胞体ストレス調節剤が、ｅＩＦ２αのリン酸化の促進剤である、〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の小胞体ストレス調節剤。
〔１８〕ツニカマイシンの共存下で、小胞体ストレスによる細胞死を５０％抑制する化合物濃度（ＩＣ_５０）が２０μＭ以下、中でも１０μＭ以下、中でも５μＭ以下、中でも１μＭ以下である、〔１〕〜〔１７〕のいずれかに記載の小胞体ストレス調節剤。
〔１９〕〔１〕〜〔１８〕の小胞体ストレス調節剤を含有する、神経変性疾患又は生活習慣病（メタボリック症候群）の予防、改善、又は治療剤。
〔２０〕上記神経変性疾患がアルツハイマー病又はパーキンソン病である、〔１９〕に記載の予防、改善、又は治療剤。
〔２１〕上記生活習慣病が糖尿病である、〔１９〕に記載の予防、改善、又は治療剤。
〔２２〕〔１〕〜〔１８〕の小胞体ストレス調節剤を含有する、膵β細胞の細胞傷害の予防、改善、又は治療剤。

一般式（１）で表される化合物は、小胞体ストレス負荷により増大した小胞体ストレスマーカーであるＥＲＳＥ２、ＵＰＰＥ、ＡＡＲＥの活性を低下させ、小胞体ストレスを負荷しない場合と同程度にまで回復させた。その作用は、既存の化学シャペロンであるＡｚｏｒａｍｉｄｅ、４ＰＢＡ、ＴＵＤＣＡよりも強かった。一般式（１）で表される化合物の小胞体ストレス抑制効果は、ツニカマイシンの共存下で、小胞体ストレスによる細胞死を５０％抑制する化合物濃度（ＩＣ_５０）が２０μＭ以下であった。

また、一般式（１）で表される化合物は、小胞体ストレス負荷により増大した小胞体ストレスマーカーであるＧＡＤＤ３４、ＡＴＦ４、ＣＨＯＰの発現量を減少させ、小胞体ストレスを負荷しない場合と同程度にまで回復させ、その作用はＡｚｏｒａｍｉｄｅよりも強かった。
また、一般式（１）で表される化合物は、小胞体ストレス負荷により抑制された細胞増殖を効果的に回復させ、その作用はＡｚｏｒａｍｉｄｅよりも強かった。また、一般式（１）で表される化合物は、小胞体ストレス負荷により低下した細胞内ＡＴＰレベル（細胞生存率の指標）を小胞体ストレスを負荷しない場合と同程度にまで回復させた。また、一般式（１）で表される化合物は、小胞体ストレス負荷により増大したラクターゼ デヒドロゲナーゼ（細胞膜傷害の指標）を小胞体ストレスを負荷しない場合と同程度にまで低下させた。その作用はＡｚｏｒａｍｉｄｅよりも強かった。また、一般式（１）で表される化合物は、折り畳み異常のプリオン蛋白を発現することにより増殖が抑制された細胞の増殖を回復させた。
このように、一般式（１）で表される化合物は、小胞体ストレスから効果的に細胞を保護する。特に、神経変性疾患で見られる、折り畳み異常プリオン蛋白を発現する細胞を効果的に保護する。

前述した通り、小胞体ストレスは種々の疾患を引き起こす。例えば、パーキンソン病、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）といった神経変性疾患は、小胞体ストレスの結果、神経細胞内に構造異常のタンパク質が過剰に蓄積するという特徴がある。
また、膵臓β細胞の小胞体には、小胞体ストレスセンサーであるＰＥＲＫやＩｒｅ１が豊富に存在する。通常は、小胞体ストレス応答により小胞体の恒常性が維持され、インスリンが正常に分泌されるが、非常に強い小胞体ストレスが発生すると、β細胞はアポトーシスを引き起こし、正常にインスリンが分泌されず糖尿病を発症する。
強い小胞体ストレスは、この他にも、動脈硬化、ガン、免疫疾患などの多様な疾患を引き起こす（以上、非特許文献５〜１２）。

従って、一般式（１）で表される化合物は、膵β細胞の小胞体ストレスを軽減させるのに有効であり、膵β細胞傷害の予防、改善、又は治療剤として有効である。更に、糖尿病等の生活習慣病（メタボリックシンドロームが引き金となる場合が多い）の予防、改善、又は治療薬として使用できる。また、小胞体ストレスが関与することが知られているパーキンソン病等の神経変性疾患、癌、免疫疾患などの予防、改善、又は治療薬としても使用できる。

小胞体ストレスと小胞体ストレス応答(UPR)の原因と、その影響を表した図である。 小胞体ストレスにより発症する病気の概要を表した図である。 小胞体ストレスに応答して、どのような細胞内タンパク質が発現、活性化されるかを機序的に表した図である。 化学シャペロン活性を持つ化合物を探索するために本発明で開発された細胞評価システムの概要を表した図である。 本発明者が開発した細胞評価システムを用いたスクリーニングで見出した化合物Ｎｏ．１と先行する化学シャペロン物質との比較を表した図である。４ＰＢＡとＴＵＤＣＡは、小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシン（Ｔｍ）によるＥＵＡ ａｃｔｉｖｉｔｙ(小胞体ストレス応答活性化）を抑制できず、その改良型であるＡｚｏｒａｍｉｄｅでは40 μMで抑制効果を認める。一方で、化合物Ｎｏ．１は、より低い５ μＭでより強い抑制効果を認めることから、これまでにない高い化学シャペロン活性を持つことがわかる。 化合物Ｎｏ．１が、ツニカマイシンにより増大した小胞体ストレスマーカー（ＥＲＳＥ２、ＡＡＲＥ、ＵＰＲＥ）の活性を低下させ、ほぼ完全に回復したことを示す図である。 化合物No.1はＡｚｏｒａｍｉｄｅよりも高い化学シャペロン活性を持つことを表したＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇの図である。化合物No.1は、Ａｚｏｒａｍｉｄｅと比較して、より低い濃度で、小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシン（Ｔｍ）によって誘導される小胞体ストレスマーカータンパク質GADD34やATF4、さらにアポトーシス促進性転写因子ＣＨＯＰの誘導をより強く抑制した。 ２９３Ａ細胞株をツニカマイシンで処理し小胞体ストレスを与えた場合に、化合物Ｎｏ．１の有無により細胞増殖がどのように変化するかを評価した図である。 ツニカマイシン処理による小胞体ストレス応答の活性化による細胞成長又は細胞毒性に対して、化合物Ｎｏ．１の小胞体ストレス抑制効果を評価するため、細胞内ＡＴＰレベルの変化を評価した図である。 図９と同様に、細胞膜に損傷を受けた細胞から放出されるラクターゼ・デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)の活性を測定して、化合物Ｎｏ．１の小胞体ストレス抑制効果を評価した図である。 プリオン蛋白（ＰｒＰ）の変異体を過剰発現すると、小胞体ストレスを打が活性化し細胞増殖が抑制される。変異体ＰｒＰの過剰発現で生じた細胞増殖阻害に対する化合物Ｎｏ．１の小胞体ストレス抑制効果を評価した図である。 図１１と同様に、変異体ＰｒＰの過剰発現細胞内のＡＴＰレベルの変化を測定し、化合物Ｎｏ．１の小胞体ストレス抑制効果を評価した図である。

本発明の化合物である一般式（１）で表されるベンゾチアゾイミダゾリル化合物において、Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ同一又は異なっていて、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級シクロアルキル基、低級アルカノイル基、ハロゲン置換低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン置換低級アルコキシ基、シアノ基、架橋したメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、プロピレンジオキシ基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフォニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、アミノカルボキシル基、低級アルキルアミド基、低級アルキルアミノアルキレンアミド基、アミノ基、アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、一般式（２）で表される官能基、または一般式（３）で表される官能基を表す。

Ｒ_３は、ジ低級アルキルアミノ基、モルホリノ基、ピペリジノ基、又は２−オキソ−ピロリジニル基を表す。これらの置換基は、メチル基、エチル基等の低級アルキル基、低級アルコキシカルボニル基、フッ素原子や塩素原子で置換されていても良い。例えば、２−メチル−ピペリジノ基、２−エチル−ピペリジノ基等の２−低級アルキル−ピペリジノ基、４−メトキシカルボニル−ピペリジノ基、４−エトキシカルボニル−ピペリジノ基等の４−低級アルコキシカルボニル−ピペリジノ基が挙げられる。
好ましくは、例えばジエチルアミノ基、ジメチルアミノ基等のジ低級アルキルアミノ基、モルホリノ基、ピペリジノ基、２−メチル−ピペリジノ基等の２−アルキル−ピペリジノ基を挙げることができる。
ｐは２〜６の整数を表す。好ましくは、３〜４の整数、より好ましくは３が挙げられる。
一般式（２）の官能基の好ましい例として、３−（ジメチルアミノ）−プロピルアミド基、３−（ジエチルアミノ）−プロピルアミド基のような３−（ジ低級アルキルアミノ）−プロピルアミド基、３−ピペリジノ−プロピルアミド基、３−（２−メチル−ピペリジノ）−プロピルアミド基、３−（２−エチル−ピペリジノ）−プロピルアミド基のような３−（２−低級アルキル−ピペリジノ）−プロピルアミド基、３−モルホリノ−プロピルアミド基が挙げられる。

Ｒ_４は、低級アルキル基、好ましくはメチル基、エチル基を表す。
一般式（３）の官能基の好ましい例として、４−メトキシカルボニルピペリジノカルボニル基、４−エトキシカルボニルピペリジノカルボニル基のような４−低級アルコキシカルボニルピペリジノカルボニル基が挙げられる。

本発明において、低級なる語は、特に断りのない限り、炭素数1〜６を表し、好ましくは炭素数１〜４であり、より好ましくは1〜３の炭素数を表す。ハロゲン原子とはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子を表す。

ｍ，ｎは、０〜３の整数を表す。好ましくは、ｍ、ｎは独立に０又は１の整数を挙げることができる。ｎが１であり、ｍが２であることも好ましい。

Ｒ_１は、フェニル環の置換基であり、その置換位置にはオルト位、メタ位、パラ位の３つがある。ｍが２である場合はパラ位とメタ位の組み合わせが好ましい。
好ましいＲ_１としては、水素原子、例えばフッ素原子、塩素原子等のハロゲン原子、例えばメチル基、エチル基等の低級アルキル基、又は例えばメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基、又は例えばジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基等のハロゲン置換低級アルコキシ基を挙げることができる。

Ｒ_２は、ベンゾチアゾイミダゾリル骨格の６〜８位の置換基であり、好ましくは７位の置換基であることが挙げられる。好ましいＲ_２としては、水素原子、カルボキシル基、例えばメチル基等の低級アルキル基、例えばメチルスルフォニル基、エチルスルフォニル基、プロピルスルフォニル基、イソプロピルスルフォニル基等の低級アルキルスルフォニル基、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基等の低級アルコキシカルボニル基、一般式（２）で表される置換基、及び一般式（３）で表される置換基を挙げることができる。

本発明の式（１）の化合物として、以下の化合物表に示すものを例示することができる。中でも、小胞体ストレスを緩和する既知の化学シャペロン（Ａｚｏｒａｍｉｄｅ、４ＰＢＡ、及びＴＵＤＣＡ）より低濃度で小胞体ストレスを緩和する活性を有する化合物が好ましい。
化合物表
化合物Ｎｏ．１

化合物Ｎｏ．２

化合物Ｎｏ．３

化合物Ｎｏ．４

化合物Ｎｏ．５

化合物Ｎｏ．６

化合物Ｎｏ．７

化合物Ｎｏ．８

化合物Ｎｏ．９

化合物Ｎｏ．１０

化合物Ｎｏ．１１

化合物Ｎｏ．１２

化合物Ｎｏ．１３

化合物Ｎｏ．１４

化合物Ｎｏ．１５

化合物Ｎｏ．１６

化合物Ｎｏ．１７

なお、化合物Ｎｏ．１７は臭化水素酸塩であるが、本発明の小胞体ストレス調節剤の有効成分には下記化合物も含まれる。

化合物Ｎｏ．１８

化合物Ｎｏ．１９

化合物Ｎｏ．２０

化合物Ｎｏ．２１

化合物Ｎｏ．２２

化合物Ｎｏ．２３

化合物Ｎｏ．２４

化合物Ｎｏ．２５

また、本発明の式（１）の化合物として、以下の化合物（４）を例示することができる。

式（４）中のＲ_１、Ｒ_２は表１に示す官能基を表す。

なお、本発明の一般式（１）で表される化合物は、公知の方法に準じて製造することができる。例えば、その合成方法として次のａ）〜ｃ）を挙げることができる。
ａ）骨格ベンゾチアゾイミダゾール骨格の合成例
臭素共存下、アニリン誘導体をアンモニウムイソチオシアネートと反応し、アミノベンゾチアゾールを合成し、塩基（炭酸カリウム）存在下、クロロアセトフェノン誘導体と縮合閉環反応させ、2−フェニルベゾチアゾイミダゾール（１）を得る。
ｂ）アミド誘導体の合成例
エステルを加水分解しカルボン酸誘導体を合成し、相当するアミン誘導体とＤＣＣ（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）等の縮合剤を用い反応を行い、アミド誘導体（１−１）を得る。
ｃ）メチルスルフォニル誘導体の合成例
ブチルリチウムでアニオン生成後、ジメチルジスルフィドと反応し、メチルチオ基を導入し、ｍＣＰＢＡ（ｍ−ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）等の過酸で酸化し2−フェニルー7−メチルスルフォニルベンゾチアゾイミダゾール（１−２）を得る。

ａ）〜ｃ）の工程を下記に図示する。

本発明での「小胞体ストレス調節剤」とは、小胞体ストレスの原因となる折り畳み不全あるいは折り畳み異常タンパク質の蓄積を抑制あるいは改善するか又は小胞体ストレス応答を亢進または強化するように作用する物質又は組成物（特に、医薬組成物）のことをいう。従って、本発明の小胞体ストレス調節剤は、小胞体ストレスの緩和、抑制、又は改善剤と捉えることもできる。本発明の小胞体ストレス調節剤は、小胞体ストレスを抑制あるいは改善することで、小胞体ストレスが発症に関与すると考えられる神経変性疾患、生活習慣病、ガン、自己免疫疾患などの予防、改善、又は治療などに使用することが期待できる。
小胞体ストレスを抑制、改善するには、折り畳み不全あるいは折り畳み異常タンパク質の折り畳みを正常化させる働きが最も望ましい。しかし、それ以外にも、翻訳抑制により折り畳み不全あるいは折り畳み異常タンパク質の折り畳みの新たな生成を抑制する働きやタンパク質の折り畳みを担う分子を増加あるいは活性化させることでタンパク質の折り畳み効率を改善させる働きや、折り畳み不全あるいは折り畳み異常タンパク質が小胞体内に凝集して毒性を持たないように小胞体からの排出を促進したり、凝集を抑制したりする働きなどでも同様の効果を得ることができる。

本発明の小胞体ストレス調節剤の有効成分は、ツニカマイシンの共存下で、小胞体ストレスによる細胞死を５０％抑制する化合物濃度（ＩＣ_５０）が２０μＭ以下、中でも１０μＭ以下、中でも５μＭ以下、中でも１μＭ以下であることが望ましい。このＩＣ_５０値は、実施例３の方法で測定した値である。

また、本発明は、小胞体ストレス調節剤の製造のための一般式（１）の化合物の使用、小胞体ストレス調節方法における使用のための一般式（１）の化合物、小胞体ストレスの調節に有効な量の一般式（１）の化合物を、小胞体ストレスが原因となる疾患（生活習慣病（中でも、メタボリックシンドロームが引き金となる疾患、中でも糖尿病、動脈硬化、高脂血症、高血圧）、神経変性疾患、ガン、自己免疫疾患など）の患者、又は小胞体ストレスが負荷されているヒトに投与する小胞体ストレスの調節方法を提供する。

本発明の「生活習慣病（メタボリック症候群）の予防、改善、又は治療剤」とは、小胞体ストレスに起因するメタボリック症候群の症状の進展予防と治療のために使用される医薬組成物のことを言う。生活習慣病は、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等の疾患の総称として使用されるが、好ましくは糖尿病を挙げることができる。なお、糖尿病の結果として、膵β細胞への障害が顕著になり、最終的には膵β細胞の死滅が惹起される。その結果、インスリンの分泌が減少、途絶し、病状の悪化に拍車が掛かることになる。従って、糖尿病による膵β細胞への小胞体ストレス障害を改善し、治療する一つの手段として、膵β細胞におけるｅｌＦ２αのリン酸化を促進することが挙げられる。それ故、本発明化合物（１）は、マウス膵β細胞由来のＭＩＮ６細胞株においてレポーター活性（ＩＣ_５０）が２０μＭ以下、好ましくは５μＭ以下であることが挙げられる。

また、本発明は、生活習慣病（中でも、メタボリックシンドロームが引き金となる疾患、中でも糖尿病、動脈硬化、高脂血症、高血圧）の予防、改善、又は治療剤の製造のための一般式（１）の化合物の使用、生活習慣病の予防、改善、又は治療方法における使用のための一般式（１）の化合物、生活習慣病の予防、改善、又は治療に有効な量の一般式（１）の化合物を、生活習慣病の患者又は生活習慣病の兆候を示すヒトに投与する生活習慣病の予防、改善、又は治療方法を提供する。

本発明の「神経変性疾患の予防、改善、又は治療剤」とは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患の病状を予防、改善、又は治療する医薬組成物のことをいう。
また、本発明は、神経変性疾患の予防、改善、又は治療剤の製造のための一般式（１）の化合物の使用、神経変性疾患の予防、改善、又は治療方法における使用のための一般式（１）の化合物、神経変性疾患の予防、改善、又は治療に有効な量の一般式（１）の化合物を、神経変性疾患の患者又は神経変性疾患の兆候を示すヒトに投与する神経変性疾患の予防、改善、又は治療方法を提供する。

また、本発明は、ガン又は自己免疫疾患の予防、改善、又は治療剤、ガン又は自己免疫疾患の予防、改善、又は治療剤の製造のための一般式（１）の化合物の使用、ガン又は自己免疫疾患の予防、改善、又は治療方法における使用のための一般式（１）の化合物、ガン又は自己免疫疾患の予防、改善、又は治療に有効な量の一般式（１）の化合物を、ガン若しくは自己免疫疾患の患者、又はガン若しくは自己免疫疾患の兆候を示すヒトに投与する、ガン又は自己免疫疾患の予防、改善、又は治療方法を提供する。

これらの医薬組成物は、使用目的に応じて、経口製剤、非経口製剤（注射剤、栄養チューブによる経腸投与剤、坐剤、吸入剤、含嗽剤等）として用いることができ、それら製剤は、上記有効成分を通常の医薬製剤と同様に処方することにより製造できる。
そのような製剤の具体例としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、皮下注射、髄腔内注射などの注射剤、点滴静注剤等が挙げられ、それら製剤は通常用いられる医薬用担体を用いて調製される。
上記医薬用担体としては、医薬分野において常用され、かつ本発明の化合物と反応しない物質が用いられる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤の製造に用いられる医薬用担体の具体例としては、乳糖、トウモロコシデンプン、白糖、マンニトール、硫酸カルシウム、結晶セルロースのような賦形剤、カルメロースナトリウム、変性デンプン、カルメロースカルシウムのような崩壊剤、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンのような結合剤、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油のような滑沢剤が挙げられる。錠剤は、通常のコーティング剤を用い、周知の方法でコーティングしてもよい。

シロップ剤製造に用いられる担体の具体例としては、白糖、ブドウ糖、果糖のような甘味剤、アラビアゴム、トラガント、カルメロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、結晶セルロース、ビーガムのような懸濁化剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０のような分散剤が挙げられる。
注射剤は、通常、上記の有効成分を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤等を添加することができる。更に、該化合物を注射用蒸留水又は植物油に懸濁した懸濁性注射剤の形であってもよく、必要に応じて基剤、懸濁化剤、粘調剤等を添加することができる。

一般式（１）の化合物の投与量は、疾患又は症状の種類や重症度、剤型、投与経路などにより異なり、当業者が適宜定めることができるが、例えば、１日投与量として０．００００１ｍｇ以上、０．０００１ｍｇ以上、０．００１ｍｇ以上、０．０１ｍｇ以上、０．０１ｍｇ以上、０．１ｍｇ以上、１ｍｇ以上を挙げることができ、また、１日投与量として１００ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、１ｍｇ以下、０．１ｍｇ以下、０．０１ｍｇ以下、０．００１ｍｇ以下、０．０００１ｍｇ以下を挙げることができる。

以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。

（実施例１）小胞体ストレスレポーター細胞の樹立
図４に示すように、第三世代レンチウイルスベクターを元にし、ＡＴＦ６の標的であるＥＲ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＥＲＳＥ２）、ＸＢＰ１の標的であるＵｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＵＰＲＥ）およびＡＴＦ４の標的であるＡｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＡＲＥ）のタンデムリピートの下流でＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する配列（１０ｘＥＲＳＥ２−１０ｘＵＰＲＥ−５ｘＡＡＲＥ−ＥＧＦＰ）を含むベクターを作製し、２９３Ａ細胞に形質導入した。

ＥＲＳＥ２、ＵＰＲＥ、及びＡＡＲＥを、それぞれコードする塩基配列を以下に示す。
・ＥＲＳＥ２：
ＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＴＧＧＧＣＣＡＣＧＴＴＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣＣＴ（配列番号１）
・ＵＰＲＥ：
ＣＴＣＧＡＧＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＴＧＧＣＡＴＴＣ
（配列番号２）
・ＡＡＲＥ：
ＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＧＣ（配列番号３）

（実施例２）小胞体ストレスを緩和する化学シャペロンのレポーター細胞による評価
（１）材料・試薬
・ホスト細胞：実施例１の小胞体ストレスレポーター細胞（２９３Ａ形質転換細胞）
・ツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）：和光（Ｎｏ．２０８−０８２４３）
・化合物Ｎｏ．１：Ｂｕｔｔ Ｐａｒｋ（Ｎｏ．１５＼０２−８０）
・Ａｚｏｒａｍｉｄｅ：ＭｅｄＣｈｅｍ（Ｎｏ．ＨＹ−１８７０５）
・Ｓｏｄｉｕｍ ４−ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ（４ＰＢＡ）：ＬＫＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｏ．Ｐ２８１５）
・Ｔａｕｒｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ Ａｃｉｄ（ＴＵＤＣＡ）：東京化成（Ｎｏ．Ｔ１５６７）
（２）方法
（２−１）試薬溶液の調製
ａ）ツニカマイシン溶液の調製
ツニカマイシン５０ｍｇをＤＭＳＯ２５ｍＬに溶解し、２μｇ／μＬのツニカマイシン（Ｔｍ）溶液とした。さらに、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のＤＭＥＭ溶液で２０００倍希釈し、１ｎｇ／μＬのツニカマイシン（Ｔｍ）溶液とした。
ｂ）化合物Ｎｏ．１溶液の調製
化合物Ｎｏ．１ １０ｍｇをＤＭＳＯ１５ｍＬに溶解し、２ｍＭ溶液とした。
ｃ）Ａｚｏｒａｍｉｄｅ溶液の調製
Ａｚｏｒａｍｉｄｅ１０ｍｇをＤＭＳＯ８１０μＬに溶解し、４０ｍＭ溶液とした。
ｄ）４ＰＢＡ溶液の調製
４ＰＢＡ １００ｍｇを超純水５．４ｍＬに溶解し、１００ｍＭ溶液とした。
ｅ）ＴＵＤＣＡ溶液の調製
ＴＵＤＣＡ１０ｍｇを超純水２ｍＬに溶解し、１００ｍＭ溶液とした。

（２−２）レポーター活性の評価
上記の各化合物溶液を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のＤＭＥＭ溶液で適宜希釈し、３８４ｗｅｌｌのアッセイプレートに１０μＬ／ｗｅｌｌ加えた。さらに、上記の２９３Ａ形質転換細胞を含む培養液３０μＬと上記の１ｎｇ／μＬのＴｍ溶液１０μＬを混合し、３８４ｗｅｌｌのアッセイプレートに４０μＬ／ｗｅｌｌ加えて（１８×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、３７℃で一夜培養した。ツニカマイシンは、小胞体ストレスを誘導することが知られている化合物である。
マルチプレートリーダーＣｙｔａｔｉｏｎ３ （Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）で励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ｎｍの蛍光強度を測定した。

（２−３）小胞体ストレスマーカー活性の評価
ＡＴＦ６の標的であるＥＲ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＥＲＳＥ２）、ＸＢＰ１の標的であるＵｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＵＰＲＥ）およびＡＴＦ４の標的であるＡｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＡＲＥ）の下流でＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）をそれぞれ安定発現したＡＴＦ細胞株に、化合物Ｎｏ．１溶液などを１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のＤＭＥＭ溶液で適宜希釈し、３８４ｗｅｌｌのアッセイプレートに１０μＬ／ｗｅｌｌ加えた。さらに、上記の２９３Ａ形質転換細胞を含む培養液３０μＬと上記の１ｎｇ／μＬのＴｍ溶液１０μＬを混合し、３８４ｗｅｌｌのアッセイプレートに４０μＬ／ｗｅｌｌ加えて（１８×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、３７℃で一夜培養し、マルチプレートリーダーＣｙｔａｔｉｏｎ３ （Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）で励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ｎｍの蛍光強度を測定した。
（３）結果
蛍光強度の測定結果を図５に示す。図５中の各化合物濃度は終濃度である。図５に示されるように、化合物Ｎｏ．１は、ツニカマイシンにより誘導される小胞体ストレスをほぼ完全に阻害し、既知の小胞体ストレスを緩和する化学シャペロン（Ａｚｏｒａｍｉｄｅ，４ＰＢＡおよびＴＵＤＣＡ）よりも、低濃度で高い活性を示した。

また、ＥＲＳＥ２、ＵＰＲＥ、およびＡＡＲＥの活性の測定結果を図６に示す。図６に示されるように、化合物Ｎｏ．１は、ツニカマイシンによる誘導される小胞体ストレス応答の標的分子の活性をほぼ完全に阻害した。

図５、図６中、ＵＴ（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）は、小胞体ストレス誘導剤であるＴｍも、化合物Ｎｏ．１、Ａｚｏｒａｍｉｄｅ、４ＰＢＡ、またはＴＵＤＣＡも添加しなかったものである。また、Ｔｍ（ツニカマイシン）は、Ｔｍ溶液は上記の通り添加したが、化合物Ｎｏ．１、Ａｚｏｒａｍｉｄｅ、４ＰＢＡ、またはＴＵＤＣＡ１０μＬ添加しなかったものである。

（実施例３）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる小胞体ストレスマーカー発現確認および小胞体ストレス阻害率の測定
（１）方法
実施例２の小胞体ストレス評価方法に準じた操作を行い、レポーターの蛍光強度測定及びウェスタンブロッティングにより小胞体ストレスマーカーの発現量測定を行って、Ｔｍにより惹起される小胞体ストレスの評価化合物による阻害率（化学シャペロン活性）を確認した。
即ち、化合物表に記載の化合物Ｎｏ．１溶液と４ＰＢＡ、Ａｚｏｒａｍｉｄｅ、ＴＵＤＣＡ溶液をそれぞれ実施例２の「（２−１）試薬溶液の調製」の項目に記載したように調製した。
上記の２９３Ａ形質転換細胞を６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のＤＭＥＭ溶液で一夜培養した。

翌日、0.2 μｇ／ml Ｔｍに加えて、化合物Ｎｏ．１が１,２,４ μＭ、又はＡｚｏｒａｍｉｄｅが１０, ２０, ４０μＭを含む１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のＤＭＥＭ溶液に培地を交換し、３７℃で１６時間培養した。細胞をＰＢＳバッファーで洗浄後に、ＲＩＰＡバッファーで細胞を融解してタンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動法よりタンパク質をサイズごとに分離して、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによって小胞体ストレスマーカータンパク質を検出した。

（２）結果
ａ）レポーター活性の評価
マルチプレートリーダーＣｙｔａｔｉｏｎ３で、化合物表の化合物を添加した場合のＥＧＦＰの蛍光強度を測定した（単位 Ａ．Ｕ．）。蛍光強度測定から得られた小胞体ストレス阻害率を、表２に示す。このように、４ＰＢＡ、Ａｚｏｒａｍｉｄｅ、ＴＵＤＣＡでは、化学シャペロン活性を認めない低濃度において、化合物が強い活性を持つことが明らかになった。

小胞体ストレスの阻害率は、上記コントロール溶液、バックグランド評価溶液、化合物評価溶液でそれぞれ得られる蛍光強度を用いて次式で計算し算出した。

コントロール溶液は、Ｔｍ溶液は上記の通り添加したが、化合物表の化合物溶液を添加しなかったものである。バックグランド評価溶液は、Ｔｍ溶液も、化合物表の化合物溶液も添加しなかったものである。化合物評価用液は、Ｔｍ及び化合物表の化合物溶液を添加したものである。

また、図５〜６に示された化合物Ｎｏ．１と同様の小胞体ストレスの阻害率（化学シャペロン活性）を持つ化合物として、化合物表の化合物Ｎｏ．２〜Ｎｏ．８が挙げられた。これらの化合物は、既知の小胞体ストレスを緩和する化学シャペロン（Ａｚｏｒａｍｉｄｅ、４ＰＢＡおよびＴＵＤＣＡ）よりも、低濃度で高い活性を示すものが含まれていた。

ｂ）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる評価
図７に示されるように、Ｔｍ処理によって小胞体ストレスのマーカーであるＧＡＤＤ３４、ＡＴＦ４およびＣＨＯＰは増大したが、化合物Ｎｏ．１を添加すると、小胞体ストレスのマーカー（ＧＡＤＤ３４、ＡＴＦ４、およびＣＨＯＰ）は減少した。このことからも、化合物Ｎｏ．１〜Ｎｏ．８は小胞体ストレスを緩和又は抑制することが示された。

ｃ）細胞保護効果の評価
化合物評価溶液中の各被験化合物の終濃度を変化させて、生細胞数を計測し、ツニカマイシンによる細胞死を抑制する５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）を求めた。
その結果を以下の表３に示す。

（実施例４）小胞体ストレス条件下での化合物Ｎｏ．１の細胞保護効果
（１）方法
実施例２の小胞体ストレス評価方法に従い、小胞体ストレス存在下での評価サンプル（化合物Ｎｏ．１）の細胞保護作用を確認した。
即ち、上記の２９３Ａ形質転換細胞株を用いて、０．２μｇ／ｍＬのＴｍ（ツニカマイシン）で処理し、小胞体ストレスを与えた場合に、化合物Ｎｏ．１又はＡｚｏｒａｍｉｄｅ（ＡＺＯ）の有無により、細胞増殖がどのように変化するかを評価した（試験回数ｎ＝３）。なお、細胞毒性を与える化合物として、Ｔｍの他にカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ：ＣＰＴ）も使用して、細胞死のポジティブコントロールとした。細胞の増殖率は、ハイコンテンツ共焦点イメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｏｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳ）を用いて、実験開始後４時間間隔の明視野像を取得し、イメージ解析ソフトウェア Ｈａｒｍｏｎｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて明視野像から細胞密度を算出した。

（２）結果
図８に示されるように、Ｔｍ処理又はカンプトテシンで小胞体ストレスを与えた場合、ほとんど完全に細胞増殖が抑制された。一方、化合物Ｎｏ．１で処理すると、Ｔｍ処理で小胞体ストレスを与えた場合でも、用量依存的に細胞増殖が回復した。Ｔｍ未処理の細胞（ＵＴ細胞）の細胞増殖と比較すると、１μＭの化合物Ｎｏ．１濃度での処理により、４８時間後にはＵＴ細胞の約７０％の細胞増殖にまで回復した。更に化合物Ｎｏ．１の処理濃度を高めて、５又は１０μＭを添加すると、Ｔｍ処理で小胞体ストレスを与えた場合でも、細胞増殖はＴｍ未処理のＵＴ細胞と同程度に完全に回復した。
一方、４０μＭのＡｚｏｒａｍｉｄｅ（ＡＺＯ）を使用した場合には、細胞増殖はＵＴ細胞の約５８％に回復したに留まっている。
このように、化合物Ｎｏ．１の小胞体ストレスに対する強い細胞保護効果が明らかとなった。

（実施例５）化合物Ｎｏ．１の細胞保護効果の確認
（１）方法
細胞成長又は細胞毒性に対する化合物Ｎｏ．１の効果を確認するため、細胞内のＡＴＰレベル又は細胞膜に損傷を受けた細胞から放出されるラクターゼ・デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＬＤＨ)の活性を測定した。即ち、実施例４と同様にして、上記の２９３Ａ形質転換細胞株を、ＴｍとＮｏ．１化合物又はＡＺＯとで処理し、実験開始後４８時間後に細胞と培養液を分取し、それぞれＡＴＰアッセイ・キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−ｇｌｏ）とＬＤＨ活性測定キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ社、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ＬＤＨ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ）を用いて、キットのプロトコールに従って、マルチプレートリーダーＣｙｔａｔｉｏｎ３で測定した（実験回数ｎ＝４）。また、コントロールとして細胞毒性を与える化合物であるカンプトテシン（ＣＰＴ）でのみ処理した２９３Ａ形質転換細胞株についても、細胞内ＡＴＰレベルおよびＬＤＨ活性を測定した。

（２）結果
細胞エネルギーである細胞内ＡＴＰレベルを指標に、Ｔｍ未処理細胞（ＵＴ細胞）の生細胞数の百分率をＶｉａｂｉｌｉｔｙとして図９に示す。図９に示されるように、Ｔｍ処理により低下したＶｉａｂｉｌｉｔｙは、化合物Ｎｏ．１で処理すると、ＵＴ細胞と同程度にほぼ完全に回復した。これに対して、ＡＺＯは、Ｔｍ処理により低下した細胞内ＡＴＰレベルをＵＴ細胞の約７５％に回復させたに留まった。この結果は、実施例４の細胞増殖アッセイの結果と一致している。

また、細胞から放出されるラクターゼ・デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性をＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙとして図１０に示す。図１０に示されるように、Ｔｍ処理により増大したＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙは、化合物Ｎｏ．１により容量依存的に低下し、１０μＭの化合物Ｎｏ．１で処理した場合ＵＴ細胞と同程度に完全に低下した。これに対して、ＡＺＯは、Ｔｍ処理により増大したＬＤＨ活性をＵＴ細胞の約５０％にまで低下させたに留まった。この結果は、実施例４の細胞増殖アッセイの結果と一致している。
化合物Ｎｏ．１は、小胞体ストレス存在下の細胞成長阻害と細胞死を濃度依存的に抑制することが示された。

（実施例６）蛋白毒に対する化合物Ｎｏ．１の保護効果
（１）方法
小胞体の蛋白毒に対する化合物Ｎｏ．１の保護効果を評価するため、プリオン疾患モデルを使用した。プリオン病とは、正常プリオン蛋白と異なり難溶性で凝集しやすく，タンパク分解酵素に耐性で分解されにくい、折り畳み異常型の異常プリオン蛋白が蓄積されることで特徴付けられる神経変性疾患である。プリオン蛋白（ＰｒＰ蛋白）は小胞体で分泌蛋白として作られ、約１０％のＰｒＰに間違った折り畳みが起きる。これまでの知見によれば、小胞体の恒常性の揺らぎが、プリオン疾患の神経変性に寄与しているとされている。そこで、小胞体の蛋白毒として、小胞体ストレスを引き起こすＰｒＰ変異体を使用した。
ＰｒＰの発現レベルを観察するために、ＥＧＦＰを結合させた野生型ＰｒＰ（ＷＴ ＰｒＰ）又は折り畳み異常の変異ＰｒＰ（ｍｕｔ ＰｒＰ）を発現するプラスミドを、常法に従いｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ （ＰＥＩ）を用いて、２９３Ａ細胞株に遺伝子導入した。さらに、折り畳み異常の変異ＰｒＰ（ｍｕｔ ＰｒＰ）を発現する２９３Ａ細胞株には、ＰＥＩによる遺伝子導入と同時に5μＭの化合物Ｎｏ．１を培地に添加した。細胞の増殖率は、ハイコンテンツ共焦点イメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｏｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳ）を用いて、実験開始後４時間間隔の明視野像を取得し、イメージ解析ソフトウェアＨａｒｍｏｎｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて明視野像から細胞密度を算出した。

（２）結果
図１１に示されるように、変異体ＰｒＰを過剰発現すると細胞増殖が阻害された。一方、5μＭの化合物Ｎｏ．１を投与すると、変異体ＰｒＰの過剰発現で生じた細胞増殖阻害が回復した。この結果は、ハイコンテンツ共焦点イメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｏｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳ）を用いて評価された実施例４の細胞増殖アッセイの結果と一致している。
また、図１２に記載のように、変異体ＰｒＰの過剰発現細胞を化合物Ｎｏ．１で処理すると、変異体ＰｒＰの過剰発現で低下したＶｉａｂｉｌｉｔｙも回復し、変異体ＰｒＰによる細胞成長阻害を改善することが示された。
ミスフォールフォールド型のＰｒＰ蛋白は、種々の神経変性疾患を引き起こすことから、化合物Ｎｏ．１は、神経変性疾患の予防、改善、又は治療剤の有効成分として使用できることが明らかとなった。

以上の実施例４〜６の結果から、化合物Ｎｏ．１は、小胞体ストレス条件下で細胞を保護することが明らかとなった

本発明の一般式(１)のベンゾチアゾイミダゾリル化合物は、小胞体ストレスの調節剤として作用する。それ故、本発明の化合物は、小胞体ストレスに起因する神経変性疾患や生活習慣病、癌疾患等の各種の疾患の予防、改善、又は治療剤として使用できる。更に本発明の化合物は、新しい母核化合物を持った、これまでにない膵β細胞の小胞体ストレスの予防、改善、又は治療用の薬剤であり、生活習慣病を始めとする小胞体ストレスに起因する疾患の予防、改善、又は治療剤として利用できる。

Claims (19)

1. 一般式（１）
   

   

   ［式中、Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ同一又は異なっていて、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級シクロアルキル基、低級アルカノイル基、ハロゲン置換低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン置換低級アルコキシ基、シアノ基、架橋したメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、プロピレンジオキシ基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフォニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、アミド基、低級アルキルアミド基、低級アルキルアミノアルキレンアミド基、アミノ基、アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、一般式（２）で表される官能基、または一般式（３）で表される官能基
   

   

   ［式中、Ｒ_３は、ジ低級アルキルアミノ基、モルホリノ基、ピペリジノ基、２−アルキル−ピペリジノ基、２−オキソ−ピロリジニル基を表す。ｐは２〜６の整数を表す。］
   

   

   ［式中、Ｒ_４は、低級アルキル基を表す。］
   を表す。ｍ、ｎは０〜３の整数を表す。低級は炭素数１〜６を表す。ハロゲン原子はフッ素原子、塩素原子、臭素原子を表す。］
   で表されるベンゾチアゾイミダゾリル化合物を有効成分とする、小胞体ストレス調節剤。
2. 上記Ｒ_１が水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン置換低級アルコキシ基、水酸基、又はアミド基であり、ｍが１又は２である、請求項１に記載の小胞体ストレス調節剤。
3. ｍが１であり、上記Ｒ_１がパラ位に置換しているか、又はｍが２であり、上記Ｒ_１がパラ位とメタ位に置換している請求項１又は２に記載の小胞体ストレス調節剤。
4. 上記Ｒ_１のハロゲン原子がフッ素原子、又は塩素原子であり、低級アルキル基がメチル基、又はエチル基であり、低級アルコキシ基がメトキシ基、又はエトキシ基である、請求項２又は３に記載の小胞体ストレス調節剤。
5. Ｒ_２が水素原子、低級アルキル基、低級アルキルスルフォニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、一般式（２）の置換基、又は一般式（３）の置換基であり、ｎが１である、請求項１〜４の何れかに記載の小胞体ストレス調節剤。
6. 上記Ｒ_２の低級アルキル基がメチル基であり、低級アルキルスルフォニル基がメチルスルフォニル基であり、低級アルコキシカルボニル基がメトキシカルボニル基、又はエトキシカルボニル基である、請求項５に記載の小胞体ストレス調節剤。
7. 上記一般式（２）のＲ_３のジ低級アルキルアミノ基がジエチルアミノ基であり、２−アルキル−ピペリジノ基が２−メチル−ピペリジノ基であり、ｐが３である、請求項５に記載の小胞体ストレス調節剤。
8. 上記一般式（３）のＲ_４の低級アルキル基がメチル基、又はエチル基である、請求項５に記載の小胞体ストレス調節剤。
9. 上記ｎが１であり、Ｒ_２が７位の置換基である、請求項１〜８のいずれかに記載の小胞体ストレス調節剤。
10. 上記ｎとｍが１であり、Ｒ_１がパラ位に置換した水素原子、塩素原子、フッ素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、ジフルオロメトキシ基、若しくはトリフルオロメトキシ基であるか、オルト位に置換したフッ素原子であるか、又はメタ位に置換したメトキシ基、若しくはエトキシ基であり、Ｒ_２が７位に置換した水素原子、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、メチルスルフォニル基、カルボキシル基、３−（ジエチルアミノ）−プロピルアミド基、３−ピペリジノ−プロピルアミド基、３−（２−メチル−ピペリジノ）−プロピルアミド基、３−モルホリノ−プロピルアミド基、若しくは４−エトキシカルボニルピペリジノカルボニル基であるか、
    又は上記ｎが１、ｍが２であり、Ｒ_１がパラ位に置換した水酸基とメタ位に置換したアミド基であり、Ｒ_２が水素原子である請求項１に記載の小胞体ストレス調節剤。
11. 上記ｎとｍが１であり、Ｒ_１がパラ位に置換した水素原子、塩素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基、ジフルオロメトキシ基、若しくはトリフルオロメトキシ基、オルト位に置換したフッ素原子、又はメタ位に置換したメトキシ基、若しくはエトキシ基であり、Ｒ_２が７位に置換した水素原子、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、メチルスルフォニル基、３−（ジエチルアミノ）−プロピルアミド基、３−（２−メチル−ピペリジノ）−プロピルアミド基、若しくは３−モルホリノ−プロピルアミド基であるか、
    又は上記ｎが１、ｍが２であり、Ｒ_１がパラ位に置換した水酸基とメタ位に置換したアミド基であり、Ｒ_２が水素原子である、請求項１に記載の小胞体ストレス調節剤。
12. 一般式（５）
    

    

    ［式中、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７は、それぞれ独立して、水素原子、フッ素原子、塩素原子、メトキシ基、エトキシ基、ジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、メチル基、またはエチル基を表し、Ｒ_２は、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、カルボキシル基、エステル基、アミド基、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基またはイソプロピルスルホニル基を表す。
    上記エステル基は、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基またはイソプロピルオキシカルボニル基を表す。
    上記アミド基は、３−Ｎ−モルホリノ−プロピルアミノカルボニル基、３−Ｎ−ピペリジノ−プロピルアミノカルボニル基、３−Ｎ−（２−メチル−ピペリジノ）−プロピルアミノカルボニル基、３−Ｎ−（２−ピロリドン）−プロピルアミノカルボニル基、３−（ジエチルアミノ）−プロピルアミノカルボニル基またはＮ―（４−エトキシカルボニルピペリジノ）−カルボニル基を表す。］
    で表される請求項１に記載のベンゾチアゾイミダゾリル化合物を有効成分とする、小胞体ストレス調節剤。
13. Ｒ_２が、水素原子、メチルスルホニル基、水素原子、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、カルボキシル基、３−（ジエチルアミノ）−プロピルアミド基、３−（２−メチル−ピペリジノ）−プロピルアミド基、又は３−モルホリノ−プロピルアミド基である、請求項１２に記載の小胞体ストレス調節剤。
14. Ｒ_５が、水素原子、フッ素原子、塩素原子、メトキシ基、エトキシ基、水酸基、メチル基、エチル基、又はジフロロメトキシ基である、請求項１２または請求項１３に記載の小胞体ストレス調節剤。
15. Ｒ_６が、メトキシ基、エトキシ基、又はアミノカルボニル基である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の小胞体ストレス調節剤。
16. Ｒ_７がフッ素原子である、請求項１２〜１５のいずれかに記載の小胞体ストレス調節剤。
17. 上記小胞体ストレス調節剤が、ｅＩＦ２αのリン酸化の促進剤である、請求項１〜１６のいずれかに記載の小胞体ストレス調節剤。
18. ツニカマイシンの共存下で、小胞体ストレスによる細胞死を５０％抑制する化合物濃度（ＩＣ_５０）が５μＭ以下である、請求項１〜１７のいずれかに記載の小胞体ストレス調節剤。
19. 請求項１〜１８の小胞体ストレス調節剤を含有する、神経変性疾患又は生活習慣病（メタボリック症候群）の予防、改善、又は治療剤。

Images