JPWO2019009364A1 - 血小板の製造方法および製造装置、ならびに血小板の製造装置における運転条件の決定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 血小板産生培地中の巨核球細胞を培養する工程を含む血小板の製造方法であって、
前記培養する工程が、撹拌翼を用いて容器内の前記血小板産生培地を撹拌する工程を含み、
撹拌する工程が、以下:
(a)約0.0005m2/s2〜約0.02m2/s2の乱流エネルギー;
(b)約0.2Pa〜約6.0Paの剪断応力;及び
(c)約100μm〜約600μmのコルモゴロフスケール
から選択される1以上の指標を充足するように、前記撹拌翼を往復動させることを含む、血小板の製造方法。
[2] 血小板産生培地中の巨核球細胞を培養する工程を含む血小板の製造方法であって、
前記培養する工程が、鉛直に延びる軸線を中心として旋回可能な撹拌翼であって、撹拌翼の少なくとも一部を容器の底側領域内に配置した撹拌翼を用いて前記容器内の血小板産生培地を撹拌する工程を含み、
前記撹拌する工程が、前記培地中にて、複数の静止部材を前記撹拌翼の旋回に伴って前記培地に乱流を発生させるように前記底側領域内にて前記撹拌翼の周囲に配置した状態で、前記撹拌翼を旋回させることを含む、血小板の製造方法。
[3] 前記巨核球細胞を培養する工程の前に、巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、不死化巨核球細胞を得る工程を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4] 前記巨核球細胞を培養する工程で得られた血小板を回収する工程を含む、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の方法。
[5] 巨核球細胞を含む培地を収容する容器と、
前記容器内を往復動する撹拌翼と
を備える血小板の製造装置であって、
前記培地中にて以下:
(a)約0.0005m2/s2〜約0.02m2/s2の乱流エネルギー;
(b)約0.2Pa〜約6.0Paの剪断応力;及び
(c)約100μm〜約600μmのコルモゴロフスケール
から選択される1以上の指標を充足するように前記撹拌翼を往復動させることによって前記培地を撹拌した状態で、前記巨核球細胞から血小板を産生する血小板の製造装置。
[6] 巨核球細胞を含む血小板産生培地を収容する容器と、
前記培地に乱流を発生させるように前記培地を撹拌する撹拌機構と
を備え、
前記撹拌機構が、鉛直に延びる軸線を中心として旋回可能な撹拌翼であって、撹拌翼の少なくとも一部を前記容器の底側領域内に配置した撹拌翼と、前記撹拌翼の旋回に伴って前記乱流を発生させるように前記底側領域内にて前記撹拌翼の周囲に配置される複数の静止部材とを有し、
前記培地中にて前記撹拌翼を旋回させることによって前記培地を撹拌した状態で、前記巨核球細胞から血小板を産生する血小板の製造装置。
[7] 往復動可能又は旋回可能な撹拌翼を備えた血小板の製造装置における運転条件の決定方法であって、
前記製造装置における、乱流エネルギー、剪断応力及びコルモゴロフスケールから選択される1以上の指標と、血小板産生数との相関関係を算出する工程と、
前記血小板産生数が所定の範囲になる前記指標を与える運転条件を決定する工程と
を含む方法。
[8] 前記運転条件が、前記往復動可能な撹拌翼の往復動の平均速度を50mm/s〜500mm/sの範囲とすることを含む、[7]に記載の方法。
[9] 前記撹拌する工程において、MIF、NRDc、及びIGFBP2を含む血小板産生促進因子を外部から添加する工程を含む、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法。
[10] 前記外部から添加する血小板産生促進因子が、TSP-1、PAI-1、及びCCL5をさらに含む、[9]に記載の方法。
本発明は、一実施形態の第1態様によれば、血小板の製造方法に関し、より詳細には、血小板産生培地中の巨核球細胞を培養する工程を含む製造方法であって、前記培養する工程が、撹拌翼を用いて容器内の前記血小板産生培地を撹拌する工程を含み、前記撹拌する工程が、以下:
(a)約0.0005m2/s2〜約0.02m2/s2の乱流エネルギー;
(b)約0.2Pa〜約6.0Paの剪断応力;及び
(c)約100μm〜約600μmのコルモゴロフスケール
から選択される少なくとも1つの指標を充足するように、前記撹拌翼を往復動させることを含む製造方法に関する。また、本発明は、一実施形態の第1態様によれば、当該製造方法を実施するための血小板の製造装置に関する。
(a)約0.0005m2/s2〜約0.02m2/s2の乱流エネルギー;
(b)約0.2Pa〜約6.0Paの剪断応力;及び
(c)約100μm〜約600μmのコルモゴロフスケール
から選択される1以上の指標を充足するように、前記撹拌翼を往復動させることが好ましい。
例えば、かかるシール部材6は、密閉型のベアリングなどとすることができる。
遺伝子組換体は、市販されているものを用いることもできるし、公知の遺伝子情報に従って、当業者が適宜作製することもできる。例えば、MIF、IGFBP2、TSP-1、PAI-1、及びCCL5については、広く市販されており、市販されたタンパク質を使用することができる。NRDcは、単離精製が、J. Biol. Chem., 269, 2056, 1994に、遺伝子配列が、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6078, 1994に既に報告されている。したがって、これらの文献、あるいはその他の公知文献に開示された情報に基づいて当分野において既知の方法で作製することができる。添加する血小板産生促進因子の濃度は、特には限定されないが、例えば、NRDc、IGFBP2、TSP-1、PAI-1、及びCCL5については、約10〜500ng/mLとなるように添加することが好ましく、約50〜100ng/mLとなるように添加することがさらに好ましい。MIFについては、約1〜500ng/mLとなるように添加することが好ましく、約10〜100ng/mLとなるように添加することがさらに好ましい。しかしながら、これらの添加量は、当業者が適宜決定することができ、上記範囲に限定されるものではない。
本発明は、また別の実施形態によれば、血小板の製造装置における運転条件の決定方法に関する。特には、上述した実施形態の第1態様のように往復動可能な撹拌翼を備えた血小板の製造装置における運転条件の決定方法に関し、又は上述した実施形態の第2態様のように旋回可能な撹拌翼を備えた血小板の製造装置における運転条件の決定方法に関する。本実施形態に係る方法は、往復動可能又は旋回可能な撹拌翼を備えた血小板の製造装置における、乱流エネルギー、剪断応力及びコルモゴロフスケールから選択される1以上の指標と、血小板産生数との相関関係を算出する工程と、前記血小板産生数が所定の範囲になる前記指標を与える運転条件を決定する工程とを含む。
Nakamura et al, Cell Stem Cell. 2014 Apr 3; 14(4): 535-48.及び国際公開第2014/123242号に記載の方法により樹立した、iPS細胞(TKDN SeV2:センダイウィルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来iPS細胞、585A1、585B1、606A1、648B1および692D2:Okita K, et al, Stem Cells 31, 458-66, 2012に記載のエピソーマルベクターを用いて樹立されたヒト末梢血単核球由来iPS細胞)由来の造血幹細胞に、c-MYC、BMI1およびBCL-XLを同時に導入して製造した不死化巨核球前駆細胞株Cl-7を出発物質とし、Nakamura et alの12頁、Cell Cultureに記載の方法に基づいて細胞培養を行った。このときに用いたGene ON培地は、Takayama et al, Blood. 2008 Jun 1; 111(11): 5298-306に記載の、ESC differentiation mediumに、SCF、TPOを先に記載の濃度で、ドキシサイクリン(Doxycycline)を5μg/ml加えたものとした。以下の実験で用いる細胞は、この方法で調整した。
往復動非定常バイオリアクタおよび一方向回転式バイオリアクタにおける、撹拌速度と乱流エネルギーの関係を比較した。往復動非定常バイオリアクタは、佐竹化学機械工業社製VerMES VMF3000を用いた。回転式バイオリアクタは、底部に単一の撹拌翼が設けられ、撹拌翼が一方向にのみ回転し、往復動しないリアクタを用いた。往復動非定常バイオリアクタにおける撹拌速度とは、平均移動速度をいい、平均移動速度は上下移動時の撹拌翼が下死点から上死点(若しくはその逆)までの速度と定義される。一方、一方向回転式バイオリアクタにおける撹拌速度とは、撹拌翼の翼先端周速度:円周率π×回転数N(rps)×翼径(mm)をいうものとする。乱流エネルギーは、熱流体解析ソフトFLUENT(ANSYS社製)を用いて計算した。
次に、容量の異なる往復動非定常バイオリアクタVerMESを用いて、乱流エネルギー、及び剪断応力と、100mm/s基準の血小板産生数割合(%)の関係を調べた。また、コルモゴロフスケールと150mm/s基準の血小板産生数割合の関係を調べた。なお、100mm/s基準の血小板割合(%)とは、6日間の培養工程終了後の培地における血小板数(Platelets/mL)について、撹拌速度(平均移動速度)が100mm/sの場合の血小板数を100%としたときの、それぞれの条件における血小板数の割合(%)である。バイオリアクタとしては、0.3LのVerMESと、2.4LのVerMESを用いた。乱流エネルギーの値は上記と同様にして、熱流体解析ソフトFLUENT(ANSYS社製)を用いて計算した。また、剪断応力、コルモゴロフスケールについても、同ソフトを用いて計算した。結果を図7〜9に示す。これらの結果から、容量の異なるバイオリアクタVerMESを用いた場合であっても、所定の範囲の乱流エネルギーまたは剪断応力を発生させることにより、血小板の産生効率を保持できることが示唆された。
上記のとおり、異なる乱流の指標を与える培養条件で6日間培養した培地中のNRDcの分泌量をELISAにて定量した。結果を表1に示す。表中、Sample1は、乱流エネルギーが約0.00013m2/s2、剪断応力が約0.03Pa、コルモゴロフスケールが約948μmとなる撹拌条件にて、往復動非定常バイオリアクタを用いて培養したサンプル、Sample2は、乱流エネルギーが約0.002m2/s2、剪断応力が約0.64Pa、コルモゴロフスケールが約296μmとなる撹拌条件にて、往復動非定常バイオリアクタを用いて培養したサンプル、Sample3は、乱流エネルギーが約0.0047m2/s2、剪断応力が約1.42Pa、コルモゴロフスケールが約210μmとなる撹拌条件にて、往復動非定常バイオリアクタを用いて培養したサンプル、Sample4は、乱流エネルギーが約0.0174m2/s2、剪断応力が約4.25Pa、コルモゴロフスケールが約122μmとなる撹拌条件にて、往復動非定常バイオリアクタを用いて培養したサンプルである。表中の数値は、NRDc濃度(pg/mL)を示す。
Claims (10)
- 血小板産生培地中の巨核球細胞を培養する工程を含む血小板の製造方法であって、
前記培養する工程が、撹拌翼を用いて容器内の前記血小板産生培地を撹拌する工程を含み、
撹拌する工程が、以下:
(a)約0.0005m2/s2〜約0.02m2/s2の乱流エネルギー;
(b)約0.2Pa〜約6.0Paの剪断応力;及び
(c)約100μm〜約600μmのコルモゴロフスケール
から選択される1以上の指標を充足するように、前記撹拌翼を往復動させることを含む、血小板の製造方法。 - 血小板産生培地中の巨核球細胞を培養する工程を含む血小板の製造方法であって、
前記培養する工程が、鉛直に延びる軸線を中心として旋回可能な撹拌翼であって、撹拌翼の少なくとも一部を容器の底側領域内に配置した撹拌翼を用いて前記容器内の血小板産生培地を撹拌する工程を含み、
前記撹拌する工程が、前記培地中にて、複数の静止部材を前記撹拌翼の旋回に伴って前記培地に乱流を発生させるように前記底側領域内にて前記撹拌翼の周囲に配置した状態で、前記撹拌翼を旋回させることを含む、血小板の製造方法。 - 前記巨核球細胞を培養する工程の前に、巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させて、不死化巨核球細胞を得る工程を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記巨核球細胞を培養する工程で得られた血小板を回収する工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 巨核球細胞を含む培地を収容する容器と、
前記容器内を往復動する撹拌翼と
を備える血小板の製造装置であって、
前記培地中にて以下:
(a)約0.0005m2/s2〜約0.02m2/s2の乱流エネルギー;
(b)約0.2Pa〜約6.0Paの剪断応力;及び
(c)約100μm〜約600μmのコルモゴロフスケール
から選択される1以上の指標を充足するように前記撹拌翼を往復動させることによって前記培地を撹拌した状態で、前記巨核球細胞から血小板を産生する血小板の製造装置。 - 巨核球細胞を含む血小板産生培地を収容する容器と、
前記培地に乱流を発生させるように前記培地を撹拌する撹拌機構と
を備え、
前記撹拌機構が、鉛直に延びる軸線を中心として旋回可能な撹拌翼であって、撹拌翼の少なくとも一部を前記容器の底側領域内に配置した撹拌翼と、前記撹拌翼の旋回に伴って前記乱流を発生させるように前記底側領域内にて前記撹拌翼の周囲に配置される複数の静止部材とを有し、
前記培地中にて前記撹拌翼を旋回させることによって前記培地を撹拌した状態で、前記巨核球細胞から血小板を産生する血小板の製造装置。 - 往復動可能又は旋回可能な撹拌翼を備えた血小板の製造装置における運転条件の決定方法であって、
前記製造装置における、乱流エネルギー、剪断応力及びコルモゴロフスケールから選択される1以上の指標と、血小板産生数との相関関係を算出する工程と、
前記血小板産生数が所定の範囲になる前記指標を与える運転条件を決定する工程と
を含む方法。 - 前記運転条件が、前記往復動可能な撹拌翼の往復動の平均速度を50mm/s〜500mm/sの範囲とすることを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記撹拌する工程において、MIF、NRDc、及びIGFBP2を含む血小板産生促進因子を外部から添加する工程を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記外部から添加する血小板産生促進因子が、TSP-1、PAI-1、及びCCL5をさらに含む、請求項9に記載の方法。
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