JPWO2018135598A1 - 新規蛍光標識方法 - Google Patents
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Abstract
Description
GFPは27kDaの比較的小さい分子量のタンパク質であり蛍光を発する際に外部基質を必要とせず細胞内での対象タンパク質の簡便な蛍光標識に適しているため様々な蛍光標識のアプリケーションが試みられてきた。解析対象のタンパク質とGFPの融合タンパク質を細胞に発現させてその局在や動態を解析することで、転写因子や細胞骨格、受容体などの種々の分子の機能の解明が進んできた(非特許文献2、3)。
加えて、ほぼ同時期にDNA修復酵素のO6−アルキルグアニン−DNAアルキルトランスフェラーゼの改変によってSNAPタグタンパク質も開発されてきた(非特許文献5)。
のタンパク質に親和性を示す小分子リガンドが標的タンパク質に結合することで、リガンドに共有結合しているトシル基とタンパク質の活性中心付近のアミノ酸残基が反応し、リガンドが切り離されプローブ部分のみが標的タンパク質にラベル化される。
しかしながら、未だ実用的に使用できるような蛍光ON/OFFの制御技術は開発されていない。
単一分子位置決定顕微鏡法では、蛍光明滅させるためシアニン色素によるチオール及び光依存性フォトスイッチングを用いるが(非特許文献12)、この際に、還元剤としてチオール化合物を用いる必要がある。このチオール化合物は細胞毒性により生細胞への適用が困難であったため、細胞毒性のある還元剤等を使用せずに蛍光明滅ができる超解像イメージング技術が望まれているが、実用的な技術開発は未だに実現していない。
また、本発明は、当該蛍光標識法に好適に使用することができる抗体及び蛍光プローブを提供することも目的とする。
また、本発明は、当該蛍光標識法を用いた超解像イメージング技術を提供することも目的とする。
[1]細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と抗DNP(ジニトロフェニル化合物)抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式(I)で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び 前記融合タンパク質と下記式(I)で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、
タンパク質を蛍光標識する方法。
(前記式(I)中、
Sは、蛍光性基であり、
Lは、リンカーであり、
Raは、一価の置換基であり、
mは、0〜2の整数であり、
nは、0〜2の整数であり、
mが2の場合は、nは0であり、
mが1の場合は、nは1又は0であり、
mが0の場合は、nは2であり、
nが2の場合は、Raの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。)
[2]Raの一価の置換基が、ハロゲン原子、炭素数1〜10のアルキル基、炭素数1〜10のアルコキシ基、シアノ基、エステル基、アミド基、アルキルスルホニル基、少なくとも1以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数1〜10のアルキル基、及び少なくとも1以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数1〜10のアルコキシ基からなる群から選択される、[1]に記載の方法。
[3]細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と抗DNP(ジニトロフェニル化合物)抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式(Ia)で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び
前記融合タンパク質と下記式(Ia)で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、
タンパク質を蛍光標識する方法。
(前記式(Ia)中、
Sは、蛍光性基であり、
Lは、リンカーであり、
m1は、1又は2である。)
[4]前記融合タンパク質における前記抗DNP抗体は、
配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR1、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR2及び配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR3を含む軽鎖、並びに
配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR1、配列番号5に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR2及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR3を含む重鎖
からなる抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントである、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の方法。
配列番号1:QEISGY
配列番号2:AAS
配列番号3:VQYASYPYT
配列番号4:GFTFSNYWMNW
配列番号5:IRLKSNNYAT
配列番号6:TGYYYDSRYGY
[5]前記抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントが一本鎖Fv(scFv)である、[4]に記載の方法。
[6]前記抗DNP抗体は、配列番号7のアミノ酸を90%以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号1〜6で示されるアミノ酸配列を含む、[4]又は[5]に記載の方法。
配列番号7:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
[7]前記アミノ酸配列が配列番号7である、[6]に記載の方法。
[8]前記融合タンパク質における前記抗DNP抗体は、配列番号7のアミノ酸を90%以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号1〜6で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号1〜6のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも1つの置換:
(a)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(b)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の方法。
[9]前記融合タンパク質における前記抗DNP抗体は、配列番号7のアミノ酸において以下の置換:
(1)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(2)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の方法。
[10]前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、[1]〜[9]のいずれか1項に記載の方法。
[11]前記リンカーが、T−Yで表され、Yは蛍光性基であるSと結合する結合基を表し、Tは架橋基を表す、[1]〜[10]のいずれか1項に記載の方法。
[12]前記結合基が、アミド基、アルキルアミド基、カルボニルアミノ基、エステル基、アルキルエステル基又はアルキルエーテル基から選択される、[11]に記載の方法。
[13]Sが、以下の式(II)で表される、[1]〜[12]のいずれか1項に記載の方法。
R1は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる一価の置換基を示し;
R2は、水素原子、一価の置換基又は結合を示し;
R3及びR4は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し;
R5及びR6は、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基、アリール基又は結合を示し、但し、Xが酸素原子の場合は存在しない;
R7及びR8は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し;
Xは、酸素原子又は珪素原子を示し;
*は、ベンゼン環上の任意の位置における式(I)のLとの結合箇所を表す。)
[14]Sが、以下の式(III)で表される、[1]〜[12]のいずれか1項に記載の方法。
(式中、R1〜R8、Xは、式(II)で定義した通りであり;
R9及びR10は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数1〜6個のアルキル基を示し、
R9及びR10は一緒になってR9及びR10が結合している窒素原子を含む4〜7員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
R9又はR10は、或いは、R9及びR10の両方は、夫々、R3又はR7と一緒になって、R9又はR10が結合している窒素原子を含む5〜7員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される1〜3個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数1〜6個のアルキル、炭素数2〜6個のアルケニル、又は炭素数2〜6個のアルキニル、炭素数6〜10個のアラルキル基、炭素数6〜10個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく;
R11及びR12は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数1〜6個のアルキル基を示し、
R11及びR12は一緒になってR11及びR12が結合している窒素原子を含む4〜7員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
R11又はR12は、或いは、R11及びR12の両方は、夫々、R4又はR8と一緒になって、R11又はR12が結合している窒素原子を含む5〜7員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される1〜3個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数1〜6個のアルキル、炭素数2〜6個のアルケニル、又は炭素数2〜6個のアルキニル、炭素数6〜10個のアラルキル基、炭素数6〜10個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく;
*は、ベンゼン環上の任意の位置における式(I)のLとの結合箇所を表す。)
[15]配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR1、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR2及び配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR3を含む軽鎖、並びに
配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR1、配列番号5に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR2及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR3を含む重鎖
からなる抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。
配列番号1:QEISGY
配列番号2:AAS
配列番号3:VQYASYPYT
配列番号4:GFTFSNYWMNW
配列番号5:IRLKSNNYAT
配列番号6:TGYYYDSRYGY
[16]前記抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントが一本鎖Fv(scFv)である、[15]に記載の抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。
[17]配列番号7のアミノ酸を90%以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号1〜6で示されるアミノ酸配列を含む、[15]又は[16]に記載の抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。
配列番号7:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
[18]前記アミノ酸配列が配列番号7である、[17]に記載の抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。
[19]配列番号7のアミノ酸を90%以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号1〜6で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号1〜6のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも1つの置換:
(a)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(b)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。
[20]配列番号7のアミノ酸において以下の置換:
(1)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(2)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。
[21][15]〜[18]のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸。
[22]配列番号8に示される塩基配列からなる、[21]に記載の核酸。
配列番号8:
ATGGCGGACTACAAAGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCTTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGTCAAGTCAGGAAATTAGTGGTTACTTAGGCTGGCTTCAGCAGAAACCAGATGGAAGTATTAAACGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCAAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTATTGTGTACAATATGCTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATGAAACGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGATTCAGCTTCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGACTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCGGTTATTACTACGATAGTAGGTACGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCG
[23][20]又は[21]に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸。
[24][21]〜[23]のいずれか1項に記載の核酸を含むプラスミド又はベクター。
[25]前記式(I)で表される化合物又はその塩を含む、[1]〜[10]のいずれか1項に記載の方法に用いる蛍光プローブ。
(前記式(I)中、
Sは、蛍光性基であり、
Lは、リンカーであり、
mは、1又は2の整数である。)
[26]in vivoイメージングに用いられる、[25]に記載の蛍光プローブ。
[27]以下の式で表される化合物又はその塩。
[28]標識対象タンパク質と抗DNP(ジニトロフェニル化合物)抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式(I)で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び
前記融合タンパク質と下記式(I)で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、
超解像イメージング法。
(前記式(I)中、
Sは、蛍光性基であり、
Lは、リンカーであり、
Raは、一価の置換基であり、
mは、0〜2の整数であり、
nは、0〜2の整数であり、
mが2の場合は、nは0であり、
mが1の場合は、nは1又は0であり、
mが0の場合は、nは2であり、
nが2の場合は、Raの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。)
[29]単一分子位置決定顕微鏡法を用いる、[28]に記載の超解像イメージング法。
[30]前記融合タンパク質における前記抗DNP抗体は、配列番号7のアミノ酸を90%以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号1〜6で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号1〜6のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも1つの置換:
(a)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(b)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、[28]又は[29]に記載の超解像イメージング法。
[31]前記融合タンパク質における前記抗DNP抗体は、配列番号7のアミノ酸において以下の置換:
(1)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(2)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、[28]〜[30]のいずれか1項に記載の超解像イメージング法。
[32]以下の式(I)で表される化合物又はその塩を含む、[28]〜[31]のいずれか1項に記載の超解像イメージング法に用いられる蛍光プローブ。
式(I)中、Sは、蛍光性基であり、Lは、リンカーであり、Raは、一価の置換基である。mは、0〜2の整数であり、nは、0〜2の整数であり、mが2の場合は、nは0であり、mが1の場合は、nは1又は0であり、mが0の場合は、nは2であり、nが2の場合は、Raの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。
[33]Raの一価の置換基が、ハロゲン原子、炭素数1〜10のアルキル基、炭素数1〜10のアルコキシ基、シアノ基、エステル基、アミド基、アルキルスルホニル基、少なくとも1以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数1〜10のアルキル基、及び少なくとも1以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数1〜10のアルコキシ基からなる群から選択される、[31]に記載の蛍光プローブ。
[34]以下の式(Ib)で表される化合物又はその塩を含む、[32]又は[33]に記載の超解像イメージング法に用いられる蛍光プローブ。
式(Ib)中、Sは、蛍光性基であり、Lは、リンカーであり、Rb及びRcは、以下の組合せから選択される。
(Rb、Rc):(NO2、p−NO2)、(NO2、p−Br)、(NO2、p−SO2Me)、(NO2、p−Cl)、(NO2、m−CN)、(NO2、p−CN)、(NO2、p−COOMe)、(CF3、p−CF3)、(NO2、p−CONHMe)、(NO2、m−COOMe)、(NO2、H)
(ここで、p−及びm−は、夫々、Rcがベンゼン環上でLに対してパラ位及びメタ位にあることを表す。)
を、提供するものである。
本発明の分子タグ技術を用いることで、優れた細胞内タンパク質の蛍光標識方法を提供することができ、本発明の蛍光標識法により、生細胞において蛍光分子の局在を極めて低いバックグラウンド蛍光の下で高いコントラストで蛍光観察することが可能となった。更に、本発明の蛍光標識法によって、生細胞内中で標識した機能分子を対象としてライブセルイメージングや超解像イメージングである構造化照明顕微鏡法(SIM:Structured Illumination Microscopy)が可能となる。
本発明の分子タグ技術をライブセルイメージングや超解像イメージングに応用することで、分子動態の追跡やナノスケールの空間解像度での微細構造の解析を実現し細胞機能の基盤となる分子メカニズムの解明に寄与することが期待される。
また、本発明により、蛍光OFFである蛍光プローブ(QODEプローブと、抗消光団抗体と結合することで消光現象が解除され蛍光がONとなった分子タグ(De−QODEタグ)との結合解離キネティックスを制御することにより、実用性の高い超解像イメージングを実現することができる。
式(I)中、Sは、蛍光性基であり、Lは、リンカーであり、Raは、一価の置換基である。mは、0〜2の整数であり、nは、0〜2の整数であり、mが2の場合は、nは0であり、mが1の場合は、nは1又は0であり、mが0の場合は、nは2であり、nが2の場合は、Raの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。
式(Ia)中、Sは、蛍光性基であり、Lは、リンカーであり、m1は、1又は2である。
本発明の抗DNP抗体は、好ましくは、一本鎖Fv(scFv)である。また、本発明の抗DNP抗体は、好ましくは、分子量が30kDa程度の抗体である。
通常の抗体は、重鎖と軽鎖がジスルフィド結合で繋がった分子量が60kDa程度の分子である。全長の抗体は細胞内が還元的環境であるため正常なフォールディングに必要な複数のジスルフィド結合の形成に適しておらず、正常なフォールディング状態を保って細胞内で発現させることが困難である。これに対して、本発明の抗体は、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域のみを短いアミノ酸リンカーで繋いだ構造を有しているため、細胞内で発現させることが比較的容易である。
配列番号1:QEISGY
配列番号2:AAS
配列番号3:VQYASYPYT
配列番号4:GFTFSNYWMNW
配列番号5:IRLKSNNYAT
配列番号6:TGYYYDSRYGY
抗DNP抗体はこれまでに免疫学領域の研究において広く用いられておりハプテン(不完全抗原)として知られている。しかしながら抗DNP抗体による消光能の制御を介した色素化合物の蛍光性を制御するためには、抗DNP抗体を細胞内に安定に発現させる必要がある。そのために抗、本発明の方法で用いる抗DNP抗体では抗体を小型化して一本鎖抗体(scFv)化することで細胞内への発現効率の向上が可能である。
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
一方、本発明の蛍光標識の方法においては、マウス等に由来するscFvの抗体以外にもラマなどのラクダ科の動物が産生する重鎖抗体(VHH)を使用することもできる。VHHは重鎖のみで構成され、分子量が約15kDaであり単一ドメイン抗体であるため、他のタンパク質やペプチドと融合する事や細胞内で発現させることが容易である。また、CDR3領域が他のIgG抗体より長いため抗原と高いアフィニティーを持ちやすく、変性しても天然の構造へ巻き戻りやすい性質を備えているためタグとして非常に有用である。
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、抗DNP抗体をコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド又はベクターを調製することができる。
融合タンパク質は、標準的な技術(化学結合体化を含む)を使用して一般的に調製され得る。簡潔には、ポリペプチド成分をコードするDNA配列は、別個にアセンブリされ得、そして、適切な発現ベクターとして連結され得る。1つのポリペプチド成分をコードするDNA配列の3’末端は、ペプチドリンカーを用いてかまたはそれを用いずに、第2のポリペプチド成分をコードするDNA配列の5’末端に連結され、その結果、その配列のリーディングフレームの、フェーズ(相)は一致する。このことによって、成分ペプチドの両方の生物学的活性を保持する単一の融合ペプチドへと翻訳されることが可能となる。
また、十分な距離で第1のポリペプチドと第2のポリペプチドを隔てるために、リンカー配列が使用され得、ポリペプチドの各々が、その高次構造にフォールドし、また、互いの機能を阻害しないことが期待できる。このようなリンカーは、ペプチド、ポリペプチド、アルキル鎖または他の従来型スペーサー分子であり得る。
また、式(I)において、mは、0〜2の整数であり、nは、0〜2の整数であり、mが2の場合は、nは0であり、mが1の場合は、nは1又は0であり、mが0の場合は、nは2であり、nが2の場合は、Raの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。
Raの一価の置換基としてのアルキル基としては、好ましくはメチル基である。
アルコキシ基としては、好ましくはメトキシ基である。
エステル基としては、好ましくはメチルエステル基である。
アミド基としては、好ましくはメチルアミド基である。
アルキルスルホニル基としては、好ましくはメチルスルホニル基である。
少なくとも1以上の水素原子がフッ素原子で置換されているアルキル基としては、好ましくは三フッ化メチル基である。
少なくとも1以上の水素原子がフッ素原子で置換されているアルコキシ基としては、好ましくは三フッ化メトキシ基である。
mが2の場合は、nは0であり、即ち、式(I)の化合物は、ベンゼン環に2つのニトロ基が結合した構造を有する。
mが1の場合は、nは1又は0である。ここで、nが1の場合は、式(I)の化合物は、ベンゼン環に1つのニトロ基と1つのRaが結合した構造を有し、nが0の場合は、式(I)の化合物は、ベンゼン環に1つのニトロ基が結合した構造を有する。
mが0の場合は、nは2であり、即ち、式(I)の化合物は、ベンゼン環に2つのRaが結合した構造を有する。
式(Ia)中、Sは、蛍光性基であり、Lは、リンカーであり、m1は、1又は2である。
また、Tの架橋基には、T1−(W)−T2の式で表されるものも含まれる。ここで、T1及びT2として、各々上記で例示した架橋基を用いることができる。Wは、存在する場合は、T1とT2を連結する基であり、例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、アミノアルキル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、アルキルアミド基などが挙げられる。
このような架橋基の例として、トリエチレングリコール基と、ジエチレングルコール基をアミド基、アルキルアミド基等を介して結合させたものが挙げられるがこれらに限定されない。更に、T1−(W)−T2の式で表される架橋基は、その片方または両方の端部に、Y、式(I)又は(Ia)の化合物のベンゼン環と結合することができる官能基(例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、アミノアルキル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、アルキルアミド基など)を有してもよい。
R1が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数1〜6個のアルキル基、炭素数1〜6個のアルケニル基、炭素数1〜6個のアルキニル基、炭素数1〜6個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基は更に任意の置換基を1個又は2個以上有していてもよい。例えば、R1が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよく、例えばR1が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
本発明の1つの好ましい態様においては、R1はいずれも水素原子である。
本発明の1つの好ましい態様においては、R2は、炭素数1〜6個のアルキル基(好ましくは、メチル基)、カルボキシル基,メトキシ基,ハイドロキシメチル基又は結合(即ち、L(即ち、リンカー)がR2の位置に導入される)である。
R3又はR4がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよく、例えばR3又はR4が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、R3及びR4がともに水素原子である場合、又はR3及びR4がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
Xが珪素原子の場合は、R5及びR6は、それぞれ独立に、炭素数1〜3個のアルキル基であることが好ましく、R5及びR6がともにメチル基であることがより好ましい。R5及びR6が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよく、例えばR5又はR6が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。R5又はR6がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は1個又は2個以上の環構成ヘテロ原子(例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など)を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には1個又は2個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが1個又は2個以上存在していてもよい。
また、R9及びR10は一緒になってR9及びR10が結合している窒素原子を含む4〜7員のヘテロシクリルを形成していてもよい。
また、R9又はR10は、或いは、R9及びR10の両方は、夫々、R3又はR7と一緒になって、R9又はR10が結合している窒素原子を含む5〜7員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される1〜3個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数1〜6個のアルキル、炭素数2〜6個のアルケニル、又は炭素数2〜6個のアルキニル、炭素数6〜10個のアラルキル基、炭素数6〜10個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。この場合、ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、1又は2以上の置換基を有することができる。
R11及びR12は一緒になってR11及びR12が結合している窒素原子を含む4〜7員のヘテロシクリルを形成していてもよい。
また、R11又はR12は、或いは、R11及びR12の両方は、夫々、R4又はR8
と一緒になって、R11又はR12が結合している窒素原子を含む5〜7員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される1〜3個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数1〜6個のアルキル、炭素数2〜6個のアルケニル、又は炭素数2〜6個のアルキニル、炭素数6〜10個のアラルキル基、炭素数6〜10個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。この場合、ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、1又は2以上の置換基を有することができる。
本発明の蛍光標識の方法においては、融合タンパク質と式(I)で表される化合物又はその塩とを反応させる工程は、融合タンパク質を発現する細胞内や生体内で行ってもよく、単離した融合タンパク質を用いてin vitroで行ってもよい。標識をin vitroで行う場合、例えば、緩衝液中(pH7.4)で25℃の温度で行ってもよい。
配列番号1:QEISGY
配列番号2:AAS
配列番号3:VQYASYPYT
配列番号4:GFTFSNYWMNW
配列番号5:IRLKSNNYAT
配列番号6:TGYYYDSRYGY
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
(a)配列番号7におけるN末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(b)配列番号7におけるN末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントである(以下「抗DNP抗体4又はその抗原結合性フラグメント4」とも言う)。
より具体的には、VL−CDR1、VL−CDR2、VL−CDR3、VH−CDR1、VH−CDR2又はVH−CDR3のアミノ酸配列において、N末端からの番号が33位のグルタミン酸(VL−CDR1のE33に対応)、37位のチロシン(VL−CDR1のY37に対応)、94位のバリン(VL−CDR3のV94に対応)、95位のグルタミン(VL−CDR3のQ95に対応)、159位のグリシン(VH−CDR1のG159に対応)、160位のフェニルアラニン(VH−CDR1のF160に対応)、162位のフェニルアラニン(VH−CDR1のF162に対応)、164位のアスパラギン(VH−CDR1のN164に対応)、233位のグリシン(VH−CDR3のG233に対応)、235位のチロシン(VH−CDR3のY235に対応)、236位のチロシン(VH−CDR3のY236に対応)、237位のアスパラギン酸((VH−CDR3のD237に対応)、239位のアルギニン(VH−CDR3のR239に対応)、240位のチロシン又は242位のチロシン(VH−CDR3のY240又はY242に対応)のいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(2)N末端からの番号が96位のチロシン(VL−CDR3のY96に対応)又は234位のチロシン(VH−CDR3のY234)のいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸を有し、配列番号7のアミノ酸を90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上の相同で有するアミノ酸配列からなる、抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
(1)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(2)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントである(以下「抗DNP抗体5又はその抗原結合性フラグメント5」とも言う)。
配列番号9:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQAISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号10:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGAYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号11:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCAQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号12:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVAYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号13:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQFASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号14:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASAFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号15:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGATFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号16:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTASNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号17:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSAYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号18:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTAYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号19:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGFYYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号20:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYAYDSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号21:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYADSRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号22:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYASRYGYWGQGTTVTVSS
配列番号23:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSAYGYWGQGTTVTVSS
配列番号24:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRAGYWGQGTTVTVSS
配列番号25:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGAWGQGTTVTVSS
配列番号8:
ATGGCGGACTACAAAGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCTTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGTCAAGTCAGGAAATTAGTGGTTACTTAGGCTGGCTTCAGCAGAAACCAGATGGAAGTATTAAACGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCAAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTATTGTGTACAATATGCTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATGAAACGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGATTCAGCTTCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGACTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCGGTTATTACTACGATAGTAGGTACGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCG
式(I)中、Sは、蛍光性基であり、Lは、リンカーであり、Raは、一価の置換基である。mは、0〜2の整数であり、nは、0〜2の整数であり、mが2の場合は、nは0であり、mが1の場合は、nは1又は0であり、mが0の場合は、nは2であり、nが2の場合は、Raの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。
式(Ia)中、Sは、蛍光性基であり、Lは、リンカーであり、m1は、1又は2である。
式(I)中、S、L、Ra、m、nについては、上記で説明した通りである。
単一分子位置決定顕微鏡法を用いる超解像イメージング法は、例えば、前記の非特許文献13(M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang, Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods 3, 793-795 (2006))や非特許文献14(M. Heilemann, S. van de Linde, M. Schuettpelz, R. Kasper, B. Seefeldt, A. Mukherjee, P. Tinnefeld, M. Sauer, Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl 47, 6172-6176 (2008))の記載に基づいて行うことができる。
(a)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(b)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
抗DNP抗体として、上記のアミノ酸配列からなる抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントを用いることにより、QODEプローブと、抗消光団抗体と結合することで消光現象が解除され蛍光がONとなった分子タグ(De−QODEタグ)との結合解離キネティックス(koff)を増大させることができ、実用性の高い超解像イメージングを実現することができる。
(1)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(2)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
式(I)中、Sは、蛍光性基であり、Lは、リンカーであり、Raは、一価の置換基である。mは、0〜2の整数であり、nは、0〜2の整数であり、mが2の場合は、nは0であり、mが1の場合は、nは1又は0であり、mが0の場合は、nは2であり、nが2の場合は、Raの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。
式(Ib)中、Sは、蛍光性基であり、Lは、リンカーであり、Rb及びRcは、以下の組合せから選択される。
(Rb、Rc):(NO2、p−NO2)、(NO2、p−Br)、(NO2、p−SO2Me)、(NO2、p−Cl)、(NO2、m−CN)、(NO2、p−CN)、(NO2、p−COOMe)、(CF3、p−CF3)、(NO2、p−CONHMe)、(NO2、m−COOMe)、(NO2、H)
(ここで、p−及びm−は、夫々、Rcがベンゼン環上でLに対してパラ位及びメタ位にあることを表す。)
また、Tの架橋基には、T1−(W)−T2の式で表されるものも含まれる。ここで、T1及びT2として、各々上記で例示した架橋基を用いることができる。Wは、存在する場合は、T1とT2を連結する基であり、例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、アミノアルキル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、アルキルアミド基などが挙げられる。
このような架橋基の例として、トリエチレングリコール基と、ジエチレングルコール基をアミド基、アルキルアミド基等を介して結合させたものが挙げられるがこれらに限定されない。更に、T1−(W)−T2の式で表される架橋基は、その片方または両方の端部に、Y、式(Ib)の化合物のベンゼン環と結合することができる官能基(例えば、アミノ基、アルキルアミノ基、アミノアルキル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、アルキルアミド基など)を有してもよい。
本発明の蛍光標識方法用キットは、好適には超解像法イメージング法に用いることができる。
[抗ジニトロフェノールモノクローナル抗体の取得]
抗原としてNHS−ジニトロフェノールをKLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)に標識した複合体を用いた。NHS−ジニトロフェノールとKLHを室温で2時間反応させた後に未反応のNHS−DNPをNAP5カラム(GE)を用いて除去した。ジニトロフェノールのKLHコンジュゲートとFreundの完全アジュバントを混合することでエマルジョンを調製し、5匹のBalb/Cマウス(9週齢雌)の尾根部に0.1mlずつ免疫した。免疫後19日後にマウスからリンパ節を摘出、破砕することでB細胞を取得し、1,000μlのラボバンカー(十慈フィールド)に懸濁した後に500μlずつ2本のクライオチューブに分注して−80℃で保存した。
回収したリンパ節細胞とミエローマ細胞(SP2、RIKEN BRC)をGenomONE−CF(石原産業)を用いて細胞融合させた。細胞融合後の細胞懸濁液は10%のBM Condimed H1(ロシュ)と10%の血清を含む44mlのHAT培地(和光純薬)で希釈し、4枚の96ウェルプレート(コーニング)に播種後、5%二酸化炭素、37℃で培養した。細胞培養後7日後に各ウェルの培養上清30μlを用いて抗体価を評価した。ハイブリドーマの細胞上清が高い抗体価とSRB−DNPの蛍光強度増加を示したウェルの細胞を選別し、限界希釈法による単一クローン化を2回行い、ハイブリドーマ株を樹立した。
スクリーニングではジニトロフェノールとBSAのコンジュゲートを抗原として用いた。10μg/mlのBSA−DNPコンジュゲート液をELISAプレート(Nunc)に100μlずつ加え、37℃で2時間吸着させた。抗原吸着後に抗原液をPBSによる洗浄で除去し、ハイブリドーマ培養上清を30μl加え、37℃で2時間放置した。200μlのPBSで3回洗浄した後に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体と37℃で30分反応させた。200μlのPBSで3回洗浄した後にTMB発色キット(ナカライテスク)を50μl加え発色反応を行った。発色後に1M硫酸を50μl加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(TECAN)で590nmをリファレンスとして450nmの吸光度を測定した。
106個の抗DNPモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを回収し、RNeasy(Qiagen)を用いてトータルRNAを取得した。得られたトータルRNAを鋳型にしてPrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)(TAKARA)を用いてcDNA合成を行った。得られたcDNAを鋳型にして縮重プライマー(S. D. R.Kontermann, Antibody Engineering. Springer 1, (2010))を用いたPCRを行い、各抗DNPモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖領域をコードするcDNA断片を増幅した。得られたcDNA断片はFastGene Gel/PCR Extraction Kit(日本ジェネティクス)を用いて精製した後にオーバーラップPCRによって軽鎖と重鎖を結合させたcDNA断片を取得した。得られたcDNA断片の両端に付加した制限酵素SfiIサイトを介してpAK400ベクター(A. Krebber et al., Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of immunological methods 201, 35-55 (1997).)にサブクローニングした。scFvをコードするcDNA配列の解析を行った。
pAK400−scFvをHindIII消化し、続いてKlenow fragment(TAKARA)で平滑化した。さらにNcoI消化して得られたscFvのcDNA断片をNcoI/EcoRV消化したpMalc5Eにサブクローニングした(pMalc5E−scFv)。
抗DNP scFvはマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として発現及び精製を行った。精製対象のscFv配列を挿入したpMalc5Eベクター(pMalc5E−scFv)で大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、100μg/mlのアンピシリンを含んだLB培地プレート上で一晩培養した。単一コロニーをピックアップし、100μg/mlのアンピシリンを含んだ5mlの液体LB培地で一晩培養した培養液1mlを、100μg/mlのアンピシリンを含んだ100mlのLB培地に継代した。600nmの光学密度が0.8になるまで37℃、200rpmで振蕩培養し、15℃で30分振蕩培養した後に終濃度0.5mMとなるようにIPTGを加え、引き続き一晩振蕩培養した。培養後に大腸菌を回収し、ソニケーターを用いて破砕した。大腸菌破砕液を遠心(3,000g)することで上清を回収し、His tag アフィニティービーズTALON(タカラバイオ)で精製し、250μlの精製タンパク質を得た。溶出液をPBSに交換し、収量をブラッドフォード法により定量したのちに以降の計測に供した。
細胞質発現コンストラクトの作製
抗DNP scFvと赤色蛍光タンパク質TagRFPとの融合タンパク質を動物細胞で発現させるためにベクター構築をした。フォワードプライマーにBglIIサイトを、リバースプライマーにEcoRIサイトをそれぞれ付加してpMalc5E−scFvを鋳型にしてPCRを行った。PCR産物をBglIIとEcoRIで消化した後にpTagRFP−C(Evrogen)のBglII/EcoRIサイトにサブクローニングした(pTagRFP−scFv)。また、pTagRFP−scFv をNheI/BspEI消化し、TagRFPのcDNA配列を切り出した後に、フォワードプライマーにNheIサイトを、リバースプライマーにEcoRIサイトをそれぞれ付加してPCRで増幅したECFPのcDNA断片をNheI/BspEI消化し、NheI/BspEI消化によりTagRFPのcDNA配列を除去したpTagRFP−scFvにサブクローニングした(pECFP−scFv)。
フォワードプライマーにBspEIサイトを、リバースプライマーにEcoRIサイトを付加してpTagRFP−5D4を鋳型にしてPCRを行った。取得したcDNA断片をBspEI/EcoRI消化し、pcDNATagRFP−M13(251−450aa)−CAAX(東京大学 有吉哲郎氏より供与)をBspEI/EcoRI消化してM13(251−450aa)コード領域を除去したベクターにサブクローニングした(pTagRFP−5D4−CAAX)。pTagRFP−5D4−CAAXをNheI/BspEI消化し、TagRFPコード領域を除去し、pECFP−5D4からNheI/BspEI消化により切り出したECFP−5D4コード領域をサブクローニングした(pECFP−5D4−CAAX)。
フォワードプライマーにSmaIサイトを、リバースプライマーにSalIサイトをそれぞれ付加してpECFP−5D4−CAAXを鋳型にしたPCRによって増幅しSmaI/SalI消化したcDNA断片を、あらかじめNheIサイトとEcoRIサイトを除去してSmaI/SalI消化をしたpCMV−SPORTにサブクローニングした(pCMV−SPORT6−ECFP−5D4)。pCMV−SPORT6−ECFP−5D4のEcoRI/NotIサイトにGGGSリンカーと核移行シグナル(DPKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKV)をコードするDNA配列をオリゴDNAをアニールして挿入した(pCMV−SPORT6−ECFP−5D4−NLS)。
pCMV−SPORT6−ECFP−5D4のSmaI/NheIサイトにER局在化シグナル(GWSCIILFLVATATGAHS)とGGGASアミノ酸リンカーをコードするDNA配列をオリゴDNAをアニールすることで作製して挿入した。加えて、EcoRI/NotIサイトにGGGSリンカーと小胞体局在化シグナル(SEKDEL)をコードするDNA配列をオリゴDNAをアニールして作製して挿入した(pCMV−SPORT6−ECFP−5D4−ER)。
β−Tubulin−Haloの発現コンストラクト(TBB−Halo)(S.-n. Uno et al., A spontaneously blinking fluorophore based on intramolecular spirocyclization for live-cell super-resolution imaging. Nat Chem 6, 681-689 (2014))をSalI/NotI消化し、HaloTagコード領域を除去した後に、PCRによってSalI/NotIサイトを付加した5D4コード領域をSalI/NotI消化して得たDNA断片をサブクローニングした。得られたプラスミドを環状PCRによってTBB−5D4のチューブリンコード領域の直後と5D4コード領域の直前それぞれにGGGSが2回続くリンカーをコードする配列を付加した。PCR産物を精製し、T4 PNK (東洋紡)でリン酸化した後に、Ligation kit ver2 (TAKARA)を用いてセルフライゲーションを行った。ライゲーション産物で大腸菌HB101を形質転換し、100μg/mlのアンピシリンを含んだLB培地プレート上で一晩培養した。大腸菌の単一コロニーから増殖させた大腸菌よりプラスミドを取得した(pTBB−GGGS4−5D4)。
p5D4−actinからNheI/BspEI消化によって5D4のcDNA領域を、pmGFP−actin(生理学研究所村越研究室より供与)(H. Murakoshi, H. Wang, R. Yasuda, Local, persistent activation of Rho GTPases during plasticity of single dendritic spines. Nature 472, 100-104 (2011).)からBspEI/BamHI消化によってactinのcDNA領域をそれぞれ取得し、pcDNA3.1(+)(Invitrogen)のNheI/BamHIサイトにサブクローニングした(p5D4−actin)。p5D4−actinをBspEI/BglII消化し、アミノ酸GGGSGGGSGGGSGGGSをコードするリンカーDNAをオリゴDNAのアニールによって形成してライゲーションした(p5D4−GGGS4−actin)。
LifeactペプチドをコードするcDNA配列(J. Riedl et al., Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods 5, 605-607 (2008))となるように2本のオリゴDNAをそれぞれT4PNKで37℃、1時間処理してリン酸化した後に、2本のリン酸化オリゴDNAを混合し95℃で5分間処理したのちに室温まで放冷することで2本鎖のリンカーを形成させた。pECFP−5D4をNheI消化しBAP処理による脱リン酸化を行ったベクターにリンカーをサブクローニングした(pLifeact−5D4)。
フォワードプライマーにEcoRVサイトを、リバースプライマーにXbaIサイトをそれぞれ付加してpGFP−STIM1(Y. Wang et al., STIM protein coupling in the activation of Orai channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 7391-7396 (2009).)を鋳型にしたPCRによって増幅したcDNA断片をEcoRV/XbaI消化し、EcoRV/XbaI消化したpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にサブクローニングした(p5D4−STIM1)
有機合成・化合物同定に用いた方法
すべての化学試薬および溶媒は、Aldrich、ナカライテスク、東京化成工業、和光純薬工業、Thermo Scientific、もしくは、関東化学から入手し、さらなる精製は行わずに使用した。
HPLC精製は、ポンプ(PU−2080)およびUV検出器(MD−2010)を備え付けたHPLCシステム(日本分光)を利用し、また、逆相カラムとしてInertsil ODS−3(5μm、φ10mm or φ14mm x 250mm)(GLサイエンス)を用いた。このとき、サンプルはPTFEフィルター(0.45μm)(Millipore)により濾過した上で、A液(H2O with 0.1%TFA):B液(CH3CN with 0.1%TFA)が95:5から20分掛けて5:95になる線形勾配条件下で精製を行った。また、取得したフラクションに飽和食塩水を加えた後にジクロロメタンもしくは酢酸エチルによる抽出、硫酸ナトリウムによる乾燥、濃縮を行うことにより目的物を取得した。
1H NMRおよび13C NMRスペクトルは、AVANCE III 400 spectrometer(Bruker)を用いて室温にて測定した。すべての化学シフト(δ)はppmを単位として記載し、内部標準としてテトラメチルシラン(0ppm)もしくは残留溶媒(CDCl3,7.26ppm for 1H, 77.16ppm for 13C;CD3OD,3.31ppm for 1H,49.00ppm for 13C;Acetone−d6,2.05ppm for 1H,29.84ppm for 13C;CD3CN,1.94ppm for 1H,1.32ppm for 13C;DMSO−d6,2.50ppm for 1H,39.52ppm for 13C)を用いた。また、ピークの多重度は以下のように短縮して記載した:s=singlet,d=doublet,t=triplet,q=quartet,m=multiplet,dd=double doublet,brs=broad singlet。ESI−TOF(electron spray ionization−time−of−flight) 質量分析はmicroTOF II−TM mass spectrometer(Bruker)を用いて行った。
DCM:dichloromethane
DIEPA:N,N−diisopropylethylamine
DMAP:N,N−dimethyl−4−aminopyridine
DMF:N,N−dimethylformamide
DMSO:dimethyl sulfoxide
DSC:N,N’−Disuccinimidyl carbonate
HATU:2−(1H−7−azabenzotriazol−1−yl)−1,1,3,3−tetramethyluronium hexafluorophosphate methanaminium
HRMS:high resolution mass spectrometry
TEA:triethylamine
TFA:trifluoroacetic acid
TSTU:O−(N−Succinimidyl)−N,N,N‘,N’−tetramethyluronium Tetrafluoroborate
1,2−ビス(2−アミノエトキシ)エタン(7.92g、53.4mmol)およびDIPEA(9.30mL、53.4mmol)が溶解した4mLのDMF溶液に、1−フルオロ−2,4−ジニトロベンゼン(995mg、5.34mmol)が溶解した16mLのDMF溶液を0oCでゆっくりと滴下した。反応混合物を室温で終夜撹拌した後、濃縮した。残渣にDCMを加え、1M炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、硫酸ナトリウムで脱水、濾過、濃縮を行った。粗生成物はシリカゲルクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチルの後にメタノール)により精製し、DNP−amine(1.20g、3.82mmol)を黄色オイルとして取得した(収率72%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.88 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 7.14 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 3.82 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.72-3.63 (m, 6H), 3.53 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.7, 136.9, 131.3, 130.9, 124.5, 116.0, 73.6, 71.5, 71.3, 69.7, 44.0, 42.1.
DNP−amine(40.0mg、0.127mmol)が溶解した0.5mLのアセトニトリル溶液に無水酢酸(12.0μL、0.127mmol)を滴下した。反応混合物を室温で終夜撹拌した後、濃縮した。粗生成物はシリカゲルクロマトグラフィー(溶出溶媒:3%メタノール/酢酸エチル)により精製し、DNP(42.5mg、0.119mmol)を黄色オイルとして取得した(収率94%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.11 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.88 (br s, 1H), 8.27 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.27 (br s, 1H), 3.86 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.74-3.57 (m, 8H), 3.47 (q, 2H, J = 5.2 Hz), 2.00 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.4, 148.4, 136.1, 130.4, 124.3, 114.2, 70.7, 70.2, 68.2, 43.2, 39.4, 23.3. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 357.14102; found, 357.14158 (Δ0.56 mmu).
DNP−amineの合成と同様のスキームで、2−フルオロニトロベンゼンを原料としてoNP−amine(43.7mg、0.162mmol)を橙色オイルとして取得した(収率70%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.12-8.10 (m, 2H), 7.50-7.46 (m, 1H), 7.03-7.01 (m, 1H), 6.69-6.64 (m, 1H), 3.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.68-3.66 (m, 4H), 3.53-3.50 (m, 4H), 2.77 (br s, 2H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 146.7, 137.4, 133.1, 127.5, 116.4, 115.4, 73.6, 71.5, 71.4, 70.1, 43.5, 42.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 270.14483; found, 270.14584 (Δ1.01 mmu).
DNPの合成と同様のスキームで、oNP−amineを原料としてoNP(48.7mg、0.156mmol)を橙色オイルとして取得した(収率84%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.18 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 8.07-8.04 (m, 2H), 7.85 (br s, 1H), 7.55-7.51 (m, 1H), 7.07-7.05 (m, 1H), 6.71-6.66 (m, 1H), 3.68 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.60-3.48 (m, 6H), 3.40 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.18 (q, 2H, J = 5.6 Hz), 1.79 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 169.3, 145.2, 136.6, 131.0, 126.2, 115.4, 114.6, 69.7, 69.6, 69.2, 68.4, 42.1, 38.6, 22.5. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 312.15540; found, 312.15452 (Δ-0.88 mmu).
DNP−amineの合成と同様のスキームで、4−フルオロニトロベンゼンを原料としてpNP−amine(47.0mg、0.174mmol)を黄色固体として取得した(収率73%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.04-8.01 (m, 2H), 6.66-6.64 (m, 2H), 3.72-3.69 (m, 8H), 3.41 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.11 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 156.0, 138.1, 127.3, 111.9, 71.4, 71.3, 70.4, 67.9, 43.8, 40.6. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 270.14538; found, 270.14517 (Δ-0.21 mmu).
DNPの合成と同様のスキームで、pNP−amineを原料としてpNP(46.8mg、0.150mmol)を黄色オイルとして取得した(収率81%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.93 (m, 2H), 7.87 (br s, 1H), 7.31 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 6.67 (m, 2H), 3.59-3.51 (m, 6H), 3.40-3.31 (m, 4H), 3.17 (q, 2H, J = 5.6 Hz), 1.79 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 169.3, 154.6, 135.7, 126.2, 110.9 (br s), 69.7, 69.6, 69.2, 68.7, 42.4, 38.6, 22.6. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 312.15540; found, 312.15644 (Δ1.04 mmu).
DNP−amineの合成と同様のスキームで、2,2’−オキシビス(エチルアミン)を原料としてDNP2−amine(254mg、0.939mmol)を黄色固体として取得した(収率78%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.95 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.24 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 3.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.67 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.57 (t, 5.2 Hz, 2H), 2.82 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.8, 137.0, 131.5, 130.9, 124.9, 116.0, 73.6, 69.7, 44.0, 42.2. HRMS (ESI-) calcd for [M-H]-, 269.08914; found, 269.09115 (Δ 2.01 mmu).
DNP−amineの合成と同様のスキームで、1,11−ジアミノ−3,6,9−トリオキサウンデカンを原料としてDNP4−amine(197mg、0.549mmol)を黄色オイルとして取得した(収率83%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.96 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.24 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 9.6Hz), 3.81 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.69-3.60 (m, 10H), 3.51 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.8, 137.0, 131.5, 131.0, 124.6, 116.1, 73.4, 71.6, 71.58, 71.3, 69.9, 44.1, 42.
1. HRMS (ESI-) calcd for [M-H]-, 357.14157; found, 357.14466 (Δ 3.09 mmu).
ジスクシニミジルスベレート(120mg、0.032mmol)およびDIPEA(11μL、0.064mmol)が溶解した0.5mLのDMF溶液に、32μLの1M DNP−amine(10mg、0.032mmol相当)のDMF溶液を0oCで滴下した後、反応混合物を室温で2時間撹拌した。粗生成物はHPLCで精製を行い、DNP−NHS(7.9mg、0.014mmol)を黄色固体として取得した(収率44%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.15 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.88 (br s, 1H), 8.29 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.34 (br s, 1H), 3.84 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.73-3.66 (m, 4H), 3.51-3.47 (m, 4H), 2.84 (br s, 4H), 2.60 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 2.24 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 1.78-1.62 (m, 4H), 1.43-1.33 (m, 4H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.2, 169.4, 168.7, 148.4, 136.4, 130.6, 124.5, 114.1, 70.8, 70.3, 70.2, 68.3, 43.2, 39.6, 36.3, 31.0, 28.6, 28.4, 25.7, 25.5, 24.5.
HRMS (ESI+) calcd. for [M+Na]+, 590.20688; found, 590.20688 (Δ 0.01 mmu).
6DCF−DNP(2−(2,7−ジクロロ−6−ヒドロキシ−3−オキソ−3H−キサンテン−9−イル)−4−((2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)安息香酸)の合成
3’,6’−ジアセチル−2’,7’−ジクロロ−6−カルボニルフルオレセインピリジニウム塩(Woodroofe, C. C., Masalha, R., Barnes, K. R., Frederickson, C. J. & Lippard, S. J. Membrane-permeable and-impermeable sensors of the Zinpyr family and their application to imaging of hippocampal zinc in vivo. Chem. Biol. 11, 1659-1666 (2004).)(26mg、0.050mmol)、DNP−amine(19mg、0.059mmol)、HATU(23mg、0.059mmol)およびDIPEA(43μL、0.25mmol)を3mLのアセトニトリルに溶解した反応混合物を遮光下室温で30分間撹拌した。反応混合物を濃縮した後、粗生成物はシリカゲルクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル/ヘキサン=3/1の後に10%メタノール/DCM)により精製し、中間体(24mg、0.029mmol)を取得した。取得した中間体をTHF/水(3mL/1mL)に溶解し、そこに170μLの1M NaOH水溶液を加え、反応溶液を遮光下室温で30分間撹拌した。反応溶液に水を加え、酢酸エチルで洗浄した後に、水層に300μLの1M塩酸を加え、酢酸エチルで抽出を行った。取得した有機層は、硫酸ナトリウムで脱水した後、濾過、濃縮を行った。粗生成物はHPLCで精製を行い、6DCF−DNP(15mg、0.020mmol)を黄色固体として取得した(2反応の収率40%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.82 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 8.79 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.73 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.21 (dd, 1H, J = 9.6, 2.4 Hz), 8.14 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.06 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.91 (s, 2H), 6.73 (s, 2H), 3.63-3.48 (m, 12H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 167.7, 164.7, 155.3, 151.8, 150.0, 148.3, 140.9, 134.9, 129.8, 129.6, 128.4, 127.9, 125.3, 123.5, 122.2, 116.4, 115.5, 110.0, 103.6, 81.7, 69.7, 69.5, 68.7, 68.2, 42.6. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 741.09970; found, 741.10088 (Δ1.18 mmu).
6DCF−oNP(2−(2,7−ジクロロ−6−ヒドロキシ−3−オキソ−3H−キサンテン−9−イル)−4−((2−(2−(2−((2−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)安息香酸)の合成
6DCF−DNPの合成と同様のスキームで、oNP−amineを原料として6DCF−oNP(12mg、0.017mmol)を黄色固体として取得した(2反応の収率33%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 11.12 (s, 2H), 8.74 (t, 1H, J = 4.8 Hz), 8.14-8.02 (m, 4H), 7.69 (s, 1H), 7.53-7.49 (m, 1H), 7.02 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.91 (s, 2H), 6.74 (s, 2H), 6.69-6.65 (m, 1H), 3.62-3.43 (m, 12H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 696.11463; found, 696.11539 (Δ0.76 mmu).
6DCF−pNP(2−(2,7−ジクロロ−6−ヒドロキシ−3−オキソ−3H−キサンテン−9−イル)−4−((2−(2−(2−((4−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)安息香酸)の合成
6DCF−DNPの合成と同様のスキームで、pNP−amineを原料として6DCF−pNP(7.7mg、0.011mmol)を黄色固体として取得した(2反応の収率29%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.16 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 8.14 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 8.10-7.95 (m, 2H), 7.65 (s, 1H), 6.82 (s, 2H), 6.66 (s, 1H), 6.55 (d, 2H, J = 9.6 Hz), 3.61-3.52 (m, 10H), 3.26-3.24 (m, 2H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 696.11463; found, 696.11560 (Δ0.97 mmu).
6DCF−DNP2(2−(2,7−ジクロロ−6−ヒドロキシ−3−オキソ−3H−キサンテン−9−イル)−4−((2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エチル)カルバモイル)安息香酸)の合成
6DCF−DNPの合成と同様のスキームで、DNP2−amineを原料として6DCF−DNP2 (4.7mg、0.0067mmol)を橙色固体として取得した(2反応の収率8.9%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.94 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.82 (br s, 1H), 8.25-8.19 (m, 2H), 8.07-8.05 (m, 2H), 7.80 (br s, 1H), 7.27 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.00 (s, 2H), 6.86 (s, 2H), 3.81 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71 (q, 2H, J = 5.2 Hz), 3.67 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.56 (q, 2H, J = 5.6 Hz). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 697.07349; found, 697.07700 (Δ 3.51 mmu).
6DCF−DNP4(2−(2,7−ジクロロ−6−ヒドロキシ−3−オキソ−3H−キサンテン−9−イル)−4−((2−(2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)安息香酸)の合成
6DCF−DNPの合成と同様のスキームで、DNP4−amineを原料として6DCF−DNP4 (3.0mg、0.0038mmol)を橙色固体として取得した(2反応の収率5.0%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.96 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.83 (br s,1H), 8.29-8.25 (m, 1H), 8.22 (dd, 1H, J = 1.2, 8.0 Hz), 8.07 (dd, 1H, J = 0.8, 8.0 Hz), 7.97 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 7.80 (br s, 1H), 7.26 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.00 (s, 2H), 6.86 (s, 2H), 3.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.69 (q, 2H, J = 5.2 Hz), 3.59-3.46 (m, 12H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 785.12592; found,785.12616(Δ 0.24 mmu).
DCF−DNP(2−(2,7−ジクロロ−6−ヒドロキシ−3−オキソ−3H−キサンテン−9−イル)−N−(2−((2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)アミノ)−2−オキソエチル)−N−メチルベンズアミド)の合成
2’,7’−ジクロロフルオレセイン(51mg、0.13mmol)、tert−ブチルサルコシネート塩酸塩(28mg、0.15mmol)、HATU(58mg、0.15mmol)およびDIPEA(111μl、0.64mmol)を1mlのDMFに溶解させ、反応混合物を遮光下室温で1日撹拌した。粗生成物はHPLCで精製を行い、tert−ブチルエステル中間体を取得した。この中間体およびトリエチルシラン(56μl)を溶解した5mlのDCMに1mlのTFAを滴下した後、反応混合物を遮光下室温で終夜撹拌した。粗生成物はHPLCで精製を行い、カルボン酸を有する中間体を橙色固体として取得した。取得した中間体、化合物1(46mg、0.15mmol)、HATU(56mg、0.15mmol)およびDIPEA(106μl、0.61mmol)を1mlのDMFに溶解した反応混合物を遮光下室温で2時間撹拌した。粗生成物はHPLCで精製を行い、DCF−DNP(29mg、0.038mmol)を橙色固体として取得した(3反応の収率30%)。
HRMS (ESI-) calcd. for [M-H]-, 766.13244; found, 766.13345 (Δ1.01 mmu).
R110−DNP(6−アミノ−9−(2−((2−((2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)アミノ)−2−オキソエチル)(メチル)カルバモイル)フェニル)−3H−キサンテン−3−イミニウム)の合成
Rhodamine 110 chlorideを原料にして、DCF−DNPの合成と同様のスキームで、R110−DNP(4.8mg、0.0065mmol)を橙色固体として取得した(3反応の収率15%)。
HRMS (ESI+) calcd. for [M-Cl]+, 698.25690; found, 698.25345 (Δ-3.45 mmu).
5OG−DNP(2−(2,7−ジフルオロ−6−ヒドロキシ−3−オキソ−3H−キサンテン−9−イル)−5−((2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)安息香酸)の合成
5−カルボキシ−2’,7’−ジフルオロフルオレセイン(W.-C. Sun, K. R. Gee, D. H. Klaubert, R. P. Haugland, Synthesis of Fluorinated Fluoresceins. The Journal of Organic Chemistry 62, 6469-6475 (1997))を原料にして、DCF−DNPの合成と同様のスキームで、5OG−DNP(2.9mg、0.0041mmol)を橙色固体として取得した(収率34%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.86-8.82 (m, 3H), 8.44 (m, 1H), 8.25-8.20 (m, 2H), 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 6.90 (s, 2H), 6.73 (s, 2H), 3.71 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.61-3.45 (m, 10H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 167.7, 164.7, 155.3, 153.6, 150.1, 148.4, 136.5, 134.9, 129.9, 129.7, 128.7, 128.4, 127.9, 126.4, 124.1, 123.9, 123.6, 116.4, 115.6, 110.0, 103.7, 69.8, 69.6, 68.8, 68.3, 48.6, 42.7. HRMS (ESI-) calcd. for [M-H]-, 707.14425; found, 707.14452 (Δ0.27 mmu).
6SiR−DNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
SiR−カルボキシル(G. Lukinavicius et al., A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins. Nat Chem 5, 132-139 (2013))(5.9mg、0.012mmol)、DSC(13mg、0.050mmol)、TEA(10μl、0.075mmol)およびDMAP(0.2mg、0.001mmol)を1mlのDMFに溶解した反応混合物を遮光下室温で終夜撹拌した。粗生成物はHPLCで精製を行い、中間体を青色固体として取得した。この中間体および化合物1(DNP−amine)(3.9mg、0.012mmol)、DIPEA(5.3μl)を0.5mLのDMFに溶解した反応混合物を遮光下室温で1時間撹拌した。粗生成物はHPLCで精製を行い、6SiR−DNP(3.3mg、0.0043mmol)を緑色固体として取得した(2反応の収率34%)。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.92 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.79 (br s, 1H), 8.23 (dd, J = 2.8, 9.6 Hz, 1H), 8.10-8.08 (m, 1H), 7.97-7.95 (m, 2H), 7.77 (m, 1H), 7.15 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.64 (dd, J = 2.8, 8.8 Hz, 2H), 3.75 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 170.0, 166.2, 156.0, 150.5, 149.5, 141.2, 138.3, 137.4, 136.6, 132.4, 130.7, 129.3, 129.0, 128.9, 126.2, 124.4, 124.0, 117.6, 116.0, 114.5, 71.1, 70.9, 70.1, 69.3, 43.8, 40.6, 40.3, 0.4, -1.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 769.30118; found, 769.30220 (Δ1.02 mmu).
5DCF−DNP(2−(2,7−ジクロロ−6−ヒドロキシ−3−オキソ−3H−キサンテン−9−イル)−5−((2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)安息香酸)の合成
6DCF−DNPの合成と同様のスキームで、3’,6’−ジアセチル−2’,7’−ジクロロ−5−カルボキシフルオレセイン(Woodroofe, C. C., Masalha, R., Barnes, K. R., Frederickson, C. J. & Lippard, S. J. Membrane-permeable and-impermeable sensors of the Zinpyr family and their application to imaging of hippocampal zinc in vivo. Chem. Biol. 11, 1659-1666 (2004).)を原料として5DCF−DNP(17mg、0.023mmol)を黄色固体として取得した(2反応の収率24%)。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.96 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.87 (br s, 1H), 8.44-8.43 (m, 1H), 8.32-8.30 (m, 1H), 8.26-8.23 (m, 1H), 8.12-8.09 (m, 1H), 7.46-7.44 (m, 1H), 7.27-7.24 (m, 1H), 6.98 (s, 2H), 6.84 (s, 2H), 3.89-3.86 (m, 2H), 3.73-3.68 (m, 8H), 3.66-3.62 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 167.8, 164.7, 155.3, 153.6, 150.1, 148.4, 136.5, 134.9, 129.9, 129.7, 128.7, 128.4, 127.9, 126.4, 124.1, 123.9, 123.6, 116.4, 115.6, 110.0, 103.7, 69.8, 69.6, 68.8, 68.3, 48.6, 42.7. HRMS (ESI+) calcd for [M+H]+, 741.10025; found, 741.09788 (Δ-2.37 mmu).
6OG−DNP,diAc(6−((2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)−2’,7’−ジフルオロ−3−オキソ−3H−スピロ[イソベンゾフラン−1,9’−キサンテン]−3’,6’−ジイル ジアセテート)の合成
6−カルボキシ−2’,7’−ジフルオロフルオレセイン二酢酸ピリジニウム塩(Sun, W. C., Gee, K. R., Klaubert, D. H. & Haugland, R. P. Synthesis of fluorinated fluoresceins. J. Org. Chem. 62, 6469-6475 (1997).)(31mg、0.063mmol)、DNP−amine(24mg、0.075mmol)、HATU(29mg、0.075mmol)およびDIPEA(55μL、0.31mmol)を3mLのアセトニトリルに溶解した反応混合物を遮光下室温で1時間撹拌した。反応混合物を濃縮した後、粗生成物はシリカゲルクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル/ヘキサン=3/1)により精製し、6OG−DNP,diAc(28mg、0.035mmol)を黄色固体として取得した(収率59%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.82 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 8.80 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.72 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.22 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 8.18 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.10 (d, 1H, J = 8.0 Hz) , 7.81 (s, 1H), 7.51 (d, 2H, 4JHF = 6.4 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.02 (d, 2H, 3JHF = 10.4 Hz), 3.63-3.47 (m, 12H), 2.34 (s, 6H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 793.17993; found, 793.17871 (Δ-1.22 mmu).
6OG−DNP,diAc(28mg、0.035mmol)をTHF/水(2mL/1mL)に溶解し、そこに320μLの1M NaOH水溶液を加え、反応溶液を遮光下室温で30分間撹拌した。反応溶液に水を加え、酢酸エチルで洗浄した後に、水層に400μLの1M塩酸を加え、酢酸エチルで抽出を行った。取得した有機層は、硫酸ナトリウムで脱水した後、濾過、濃縮を行った。粗生成物はHPLCで精製を行い、6OG−DNP(17mg、0.024mmol)を黄色固体として取得した(収率68%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.88 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.21 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 8.10-8.09 (m, 2H), 7.71 (m, 1H), 7.08 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.66-6.63 (m, 4H), 3.70 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.66-3.63 (m, 6H), 3.57 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.51 (t, 2H, J = 5.2 Hz). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 708.15153; found, 708.15223 (Δ0.70 mmu).
6JF549−DNP(2−(3−(アゼチジン−1−イウム−1−イリデン)−6−(アゼチジン−1−イル)−3H−キサンテン−9−イル)−4−((2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
6SiR−DNPの合成と同様のスキームで、6−カルボキシ−JF549(Grimm, J. B. et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat. Methods 12, 244-250 (2015).)を原料にして6JF549−DNP(12mg、0.016mmol)を紫色固体として取得した(収率30%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.82 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.32 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.20-8.16 (m, 2H), 7.78 (s, 1H), 7.10 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 7.00 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.53 (dd, 2H, J = 9.2, 1.6 Hz), 6.40 (d, 2H, J = 1.6 Hz), 4.26 (t, 8H, J = 7.6 Hz), 3.70-3.59 (m, 10H), 3.48 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.55 (quint, 4H, J = 7.6 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 168.0, 167.2, 160.0, 158.6, 157.9, 149.7, 139.5, 137.0, 135.5, 134.8, 132.8, 132.2, 131.2, 131.0, 130.1, 124.6, 116.1, 114.7, 113.5, 95.1, 71.5, 71.2, 70.5, 69.7, 52.8, 44.0, 41.2, 30.7, 16.8. HRMS (ESI+) calcd for [M+H]+, 751.27277; found, 751.27408 (Δ1.31mmu).
6JF646,NHSの合成
6−カルボキシ−JF646(Grimm, J. B. et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat. Methods 12, 244-250 (2015).)(7.7mg、0.015mmol)、DSC(16mg、0.062mmol)、TEA(13μL、0.093mmol)およびDMAP(0.2mg、0.002mmol)を1mLのDMFに溶解した反応混合物を遮光下室温で3時間撹拌した。
粗生成物はHPLCで精製を行い、6JF646,NHS(5.6mg、0.0094mmol)を青色固体として取得した(収率61%)。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.35 (dd, 1H, J = 1.2, 8.0 Hz), 8.18 (dd, 1H, J = 0.8, 8.0 Hz), 7.92-7.91 (m, 1H), 6.82-6.80 (m, 4H), 6.36 (dd, 2H, J = 2.8, 8.8 Hz), 3.90 (t, 8H, J = 7.2 Hz), 2.95 (s, 4H), 2.35 (quint, 4H, J = 7.2 Hz), 0.63 (s, 3H), 0.53 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 170.3, 169.4, 162.0, 156.5, 152.2, 137.0, 132.1 (including two peaks), 131.4, 131.3, 128.9, 128.0, 127.5, 126.6, 116.5, 113.6, 52.7, 26.4, 17.3, 0.1, -0.9. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 594.20549 found, 594.20799 (Δ2.50 mmu).
6JF646,NHS(5.0mg、0.0084mmol)、DNP−amine(5.3mg、0.017mmol)およびDIPEA(7.3μL、0.042mmol)を0.5mLのDMFに溶解した反応混合物を遮光下室温で6時間撹拌した。粗生成物はHPLCで精製を行い、6JF646−DNP(5.5mg、0.0069mmol)を緑色固体として取得した(収率82%)。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.92 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.59 (br s, 1H), 8.24 (dd, 1H, J = 2.8, 9.6 Hz), 8.10-8.07 (m, 1H), 7.96-7.94 (m, 2H), 7.77 (br s, 1H), 7.15 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.77 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 6.73 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.30 (dd, 2H, J = 2.4, 8.8 Hz), 3.87 (t, 8H, J = 7.2 Hz), 3.75 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.53 (m, 10H), 2.34 (quint, 4H, J = 7.2 Hz), 0.64 (s, 3H), 0.51 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 169.9, 166.2, 155.8, 152.1, 149.6, 149.4, 141.2, 137.3, 136.6, 133.1, 131.1, 130.7, 129.3, 128.9, 126.3, 124.4, 124.1, 116.4, 116.0, 113.3, 71.1, 70.9, 70.1, 69.3, 52.8, 43.8, 43.7, 40.6, 40.5, 17.4, 0.3, -1.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 793.30118; found, 793.30155 (Δ0.37 mmu).
6SiR600−DNP(2−(7−アミノ−3−イミノ−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
6−カルボキシ−SiR600(13mg、0.022mmol)、TSTU(7.9mg、0.026mmol)およびDIPEA(100μL、0.57mmol)を1mLのDMFに溶解した反応混合物を遮光下室温で15分間撹拌した。1M DNP−amineのアセトニトリル溶液(84μL)を滴下し、遮光下室温でさらに30分間撹拌した。粗生成物はHPLCで精製を行い、中間体を緑色固体として取得した。中間体(14mg、0.016mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(2.4mg、0.0021mmol)および1,3−ジメチルバルビツール酸(12mg、0.076mmol)を5mLの脱酸素DCMに溶解した反応混合物をアルゴン雰囲気下室温で終夜撹拌した。反応混合物は濃縮した後、HPLCで精製を行い、6SiR600−DNP(3.7mg、0.0052mmol)を緑色固体として取得した(2反応の収率24%)。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6 + TFA): δ 8.89 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 8.25 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 8.16 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.10 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 8.04 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.00 (br s, 1H), 7.58 (dd, 2H, J = 8.8, 2.4 Hz), 7.44 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.25 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 3.80 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.69-6.60 (m, 8H), 3.51 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 0.82 (s, 3H), 0.70 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 713.23858; found, 713.24096 (Δ2.38mmu).
6SiR700−DNP(4−((2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)−2−(1,9,11,11−テトラメチル−2,3,7,8,9,11−ヘキサヒドロシリノ[3,2−f:5,6−f’]ジインドール−1−イウム−5−イル)ベンゾエート)の合成
6−カルボキシ−SiR700(Lukinavicius, G. et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. J. Am. Chem. Soc. 138, 9365-9368 (2016).)(8.3mg、0.016mmol)、TSTU(5.6mg、0.019mmol)およびDIPEA(71μL、0.40mmol)を1mLのDMFに溶解した反応混合物を遮光下室温で15分間撹拌した。1M DNP−amineのアセトニトリル溶液(59μL)を滴下し、遮光下室温でさらに30分間撹拌した。粗生成物はHPLCで精製を行い、6SiR700−DNP(8.6mg、0.011mmol)を緑色固体として取得した(収率70%)。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.91 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.83 (br s, 1H), 8.28-8.24 (m, 1H), 8.05 (s, 2H), 7.95 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 7.68 (s, 1H), 7.18 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.97 (br s, 2H), 6.66 (s, 2H), 3.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.64-3.60 (m, 8H), 3.54-3.45 (m, 6H), 2.95 (s, 6H), 2.85-2.77 (m, 4H), 0.65 (s, 3H), 0.51 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 166.0, 165.9, 159.5, 156.0, 149.5, 149.4, 136.5, 133.9, 131.0, 130.8, 128.3, 124.4, 118.0, 116.2, 116.0, 115.2, 113.5, 71.1, 70.9, 70.1, 69.3, 55.5, 43.8, 43.7, 40.6, 40.5, 34.6, 27.9, -0.4, -1.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 793.30118; found, 793.29938 (Δ-1.80 mmu).
1mM SRB−DNP/DMSO溶液をPBS(pH7.4)で希釈して5μM SRB−DNP/PBSを調製し、96ウェルプレート(BD 353219 Imaging Plate)の各ウェルに10μlずつ分注した。SRB−DNPは、Sunbulらの報告したSR−DN1と同一で合成法も同様である(M. Sunbul, A. Jaschke, Contact-mediated quenching for RNA imaging in bacteria with a fluorophore-binding aptamer. Angewandte Chemie (International ed. in English) 52, 13401-13404 (2013).)。ハイブリドーマクローン培養液もしくは陰性対照としてハイブリドーマ培養培地を90μl加え、Mixmate(Eppendorf)を用いて1,000rpmで30秒撹拌した後、マイクロプレートリーダー SH−9000(CORONA ELECTRIC Co.,Ltd.)で蛍光測定を行った。測定波長条件は、Ex/Em=570nm/600nm。このスクリーニングで大きな蛍光変化率を示した上位27ウェルのハイブリドーマの培養上清については、さらに4種類の蛍光団−DNP(SRB−DNP、5OG−DNP、R110−DNP、DCF−DNP)に対する蛍光の増強効果を調べた。
ここで複数種類の蛍光団−DNPに対して大きな蛍光増加効果が見られた4ウェル(1E10、1H4、3B12、4C12)のハイブリドーマについては限界希釈法によるクローン化を行った。
HEK293T細胞とHeLa細胞は10%ウシ胎仔血清(FBS、SIGMA)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Wako)中で二酸化炭素濃度5%、37℃中で培養した。
HeLa細胞への遺伝子導入はリポフェクションを用いた。24ウェルディッシュで培養中のHeLa細胞に対して0.5μgのplasmidを加えたOpti−MEM I(GIBCO)25μlを、2μlのLipofectamine 2000(Invitrogen)と25μlのOpti−MEM Iの混合溶液に加えて室温で5分インキュベートした。これを90〜100%コンフルエントのHEK293T細胞とHeLa細胞の培地500μlに加え、二酸化炭素濃度5%、37℃で培養した。トランスフェクションから5〜8時間後に細胞濃度を1/10に希釈してガラスディッシュに撒きなおした。トランスフェクションから24時間経過した後に各種イメージング実験に供した。
細胞の観察はキセノンアークランプを備えた倒立顕微鏡(IX−71、Olympus)を用いて行われた。撮影はEM−CCDカメラ(iXon EM+, Andor)を用いて取得した。6SiR−DNPの蛍光画像を取得する際は608−648nmの励起光フィルター、660 nmのダイクロイックミラーと672−712nmの吸収フィルターから構成されるCy5−4040Cフィルターセット(Semrock)を用いた。
CFPの蛍光画像を取得する際は424−438nmの励起光フィルター、450nmのダイクロイックミラーと460−510nmの吸収フィルターから構成されるU−MCFPHQフィルターセット(Olympus)を用いた。図3のスクリーニングでは対物レンズ(10x NA 0.3、20x NA 0.75:Olympus)を用い、図5、8、9、10の観察では油浸対物レンズ(100x NA 1.4:Olympus)を用いた。
細胞の観察は、HeLa細胞の培地を吸いHBS緩衝液(25mM Hepes、125mM NaCl、2.5mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、25mM D−glucose、pH7.4)で洗浄した後、濃度100nMもしくは10nMの6SiR−DNPを含むHBS緩衝液中で行った。6SiR−DNPを加えてから5分後に撮影を開始した。画像解析にはImageJ(NIH)を用いた。
Hela細胞にpTBB−GGGS4−5D4をトランスフェクションし、5〜8時間後にトリプシン処理によって剥がした後に、コラーゲンとポリ−L−リジンでコートしたカバーガラス上に1/10の密度となるように再播種し、さらに18〜25時間、37℃、4%、CO2存在下で培養し、SIMイメージングに供した。構造化照明画像はSIMシステム(Nikon)を用いて取得した。励起として640nm半導体レーザーを用いて、対物レンズ(100x SR Apo TIRF、NA 1.49:Nikon)、s−CMOSカメラ(ORCA Flash 4、Hamamatsu)を用いて2秒のフレームレートで蛍光像を取得した。取得した蛍光像はNIS−Elementsソフトウェア(Nikon)を用いて解析した。
[実施例1]
抗DNP scFvの取得
マウスを用いて抗DNPモノクローナル抗体を作製した(実験方法参照)。抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングにおいてはハイブリドーマ培養上清に対してELISA法による抗体価の評価を行った(図3A)。その結果、多くの抗DNP抗体が産生されたことが確認できた。加えて、蛍光消光の解除の効率が良いsvFvを取得するためにハイブリドーマ培養上清による蛍光団−DNP(SRB−DNP)の蛍光増加率についても評価を行った(図3B)。
ここまでのスクリーニングで大きな蛍光変化率を示した上位27ウェルのハイブリドーマの培養上清の4種類の蛍光団−DNPに対する蛍光の増強効果を調べ、複数種類の蛍光団−DNPに対して大きな蛍光増加効果が見られた4ウェル(1E10、1H4、3B12、4C12)のハイブリドーマのクローン化を行った(図3C)。ここでは蛍光団−DNPとしてSRB−DNP、5OG−DNP、R110−DNP、DCF−DNPの4種類を用いた。
得られた4クローンの各ハイブリドーマからRNAを抽出し、逆転写反応によりモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域のcDNA断片を得た。オーバーラップPCR法によりリンカー配列を介して軽鎖及び重鎖の可変領域のcDNA断片を繋ぎ、それぞれ1E10、3B12のウェルに由来するサブクローン(4E10、5D4)のみからscFvコンストラクトを構築できた。4E10、5D4のリコンビナントタンパク質を大腸菌発現系で発現・精製し、蛍光団−DNP(DCF−DNP)に対する蛍光強度変化への効果を調べたところ5D4のみが蛍光強度の増加(10倍程度)を示した。シーケンシングにより5D4をコードするcDNA配列の核酸配列を同定し(配列番号8)、その結果から決定したアミノ酸配列をIMGTデータベース(http://www.imgt.org/)を用いて解析し、CDR領域を特定した(図4)
培養細胞での抗DNP scFvの発現テスト
scFvで蛍光団−DNPの蛍光増加効果が見られた5D4クローンを蛍光タンパク質TagRFPとの融合タンパク質としてHEK293T細胞に発現させてscFvの細胞内での発現の様子や蛍光団−DNPによる細胞質の蛍光標識の可否を評価した。蛍光団−DNPとして6OGdiAc−DNPを終濃度1μMとなるように細胞に負荷して室温で10分間放置した後にHBSで細胞外の6OGdiAc−DNPを洗浄した。引き続き37℃で10分間放置した後に、蛍光顕微鏡で観察したところTagRFP陽性のHEK293T細胞の細胞質にのみ緑色蛍光が確認された(図5)。得られた5D4クローンが抗DNP scFvとして機能する状態で細胞内に発現可能であることが確認できたため、5D4クローンを以降の開発工程に供した。
蛍光団−DNPの蛍光性変化特性の解析
上記で作製した蛍光団−DNPのうち、近赤外領域の蛍光を示し、細胞へのアプリケーションにおいて自家蛍光の影響の大幅な軽減が期待できる6SiR−DNPの吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを5D4有無の条件下で計測した。6SiR−DNPは5D4存在時に、653nmに吸収極大を持ち、668nmに蛍光の極大を示した(図6A、B)。この蛍光特性は細胞での蛍光イメージングで広く用いられているCy5色素と類似している。5D4存在下では、5D4非存在下と比べて6SiR−DNPの蛍光強度が98倍に増加した(図6B)6SiR−DNPの5D4との結合している状態での蛍光量子収率を測定したところ、過剰量の5D4存在下での蛍光量子収率は0.57であった。この蛍光量子収率の値は大きく、細胞の標識実験においても汎用性の高い蛍光色素であるCy5(量子収率=0.2〜0.4)、Cy5.5(量子収率=0.24)と同等かそれ以上である(Q. Zheng et al., Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chem Soc Rev 43, 1044-1056 (2014).)。また、その他の蛍光団−DNPを評価したところ、5D4の存在下で同様に大きな蛍光強度の増大を示した(図7)。図7では、短波長側から、6OG−DNP、6DCF−DNP、6JF549−DNP、6SiR600−DNP、6SiR−DNP、6SiR700−DNPについて5D4有無の条件下での蛍光スペクトルを示している。
培養細胞内の任意の部位への発現させた5D4の蛍光標識
5D4を細胞内の任意の部位に発現させた際に6SiR−DNPで標識され、蛍光顕微鏡で蛍光像が観察できるかどうかを調べた。ECFPのみを発現させて6SiR−DNPを細胞に負荷した際(図8A)、及び5D4を付加したECFPを細胞に発現させるが6SiR−DNPを細胞に負荷しない際は6SiR−DNPによる蛍光シグナルは観察されなかった(図8B)。5D4をECFPとの融合タンパク質としてHela細胞に発現させた際には、TagRFPとの融合タンパク質として発現させた際(図5)と同様に細胞質全体に渡る6SiR−DNPの蛍光シグナルが観察された(図8C)。5D4をECFP及び核、細胞膜、小胞体への局在化ペプチドを付加してそれぞれを融合タンパク質として発現させた後に、細胞へ終濃度0.1μMの6SiR−DNPを負荷したところ、いずれの細胞においても狙った細胞内部位で蛍光標識された蛍光像が取得できた(図8D、E、F)。
以上の結果は5D4が細胞内で任意の部位で安定に発現してかつDNPとの結合能を失っておらず、5D4とDNPが結合したときのみ蛍光団−DNPが蛍光性となることを示す。以上より、蛍光団−DNPの洗浄せずに、細胞外液に未反応の6SiR−DNPが存在しても細胞内オルガネラの構造を高いコントラストで蛍光イメージングできることが示された。
任意のタンパク質との融合タンパク質として発現させた5D4の標識
細胞内に5D4との融合タンパク質として発現させたタンパク質を蛍光団−色素によって標識できるかどうかを調べた。
β−チューブリンタンパク質を観察対象として5D4との融合タンパク質の発現コンストラクトをHela細胞に遺伝子導入した。細胞外液に6SiR−DNPが存在する条件で蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察したところ、チューブリンに特徴的な繊維状の構造が観察された(図9A)。また、細胞内のb−アクチンを観察対象とすることを試みた。β−アクチンと5D4の融合タンパク質をHeLa細胞に発現させて細胞を観察したところ、β−アクチンに特徴的な繊維状の構造が観察された(図9B)。さらに細胞内に内在するF−アクチンを可視化するため、F−アクチンに特異的に結合するペプチド配列(Lifeact配列)を5D4のN末端に付加した発現コンストラクトをHela細胞に遺伝子導入した。β−アクチンと5D4の融合タンパク質を細胞に発現させた際と同様な特徴的な繊維状の構造が観察された(図9C)。
以上のタンパク質の標識実験の結果は5D4を細胞内の観察対象分子との融合タンパク質として細胞に発現及び蛍光標識できる分子タグとして用いることが可能であることを示す。
ライブセル超解像イメージング
近年の超解像顕微鏡技術の発展により、細胞内オルガネラの微細構造や機能分子の時空間動態についてナノメートルの解像度で高精細に解析する試みが進んでいる。そこで、超解像イメージングの一つである構造化照明顕微鏡法(SIM)でのライブセル超解像イメージングへの適用可能性を検証した。Hela細胞に5D4とチューブリンの融合タンパク質を発現させ、通常の蛍光顕微鏡とSIM法による観察結果を比較したところ、通常の蛍光像では空間的に分離が不可能であった構造が、複数の繊維状の構造によって構成されている様子が観察できた(図11A、B)。またSIM法によるタイムラプス撮影を行ったところ、150秒程度までチューブリンの構造が安定して観察できた(図11C)。また30秒の時間解像度でチューブリンの微細構造の変化を検出することが出来た(図11D)。以上より、本研究で開発した分子タグ技術を用いた細胞内分子の標識によりSIM法でのチューブリンのナノスケールの微細構造のライブセルイメージングに成功し、タイムラプス撮影に適用可能であり、連続的かつ高精細な細胞内分子の動態解析に利用できることが示された。
1分子位置決定法による超解像イメージング
本発明の分子タグ(De−QODEタグ)を分子位置決定法による超解像イメージングに適用するに当たり、De−QODEタグ−プローブの結合解離キネティックスを制御することにより蛍光明滅を実現することを検討した。
図12に、6DCF−DNPと5D4との結合解離キネティックの模式図を示すが、この場合、蛍光OFFとなる解離定数(koff)は1.4×10−2(/s)である。De−QODEタグ−プローブの解離定数(koff)を増大させるため、De−QODEタグ及びプローブの両方について分子改変の検討を行った。
MBP−scFvタンパク質のコード領域内へのアミノ酸変異導入は目的のアミノ酸変異に対応するように改変したコドンを含むフォワードプライマーとリバースプライマーと耐熱性ポリメラーゼKOD Plus(TOYOBO)を用いてpMalc5E−5D4を鋳型とした環状PCR法により導入した。得られた直鎖PCR産物をLigation kit ver2(TAKARA)を用いて環状化してMBP−scFv変異体の発現コンストラクトを得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 9.89 (br s, 1H), 9.83 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 9.02 (dd, 1H, J = 9.2, 2.0 Hz), 8.44 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 5.10 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 5.00-4.88 (m, 6H), 4.76 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 4.06 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100MHz, CD3OD): δ 196.1, 186.2, 180.6, 166.7, 166.0, 164.3, 145.9, 122.0, 118.8, 118.6, 117.0, 91.3, 90.2. HRMS (ESI) calcd for [M+Na]+, 317.12203 ; found, 317.12552 (Δ3.49 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.21 (d, 1H, J = 2.4 Hz ), 7.55 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.99 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 3.77 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.70-3.68 (m, 2H), 3.66-3.63 (m, 2H), 3.52 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.26 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 145.7, 139.9, 133.3, 129.4, 117.5, 107.0, 73.6, 71.5, 71.4, 70.0, 43.6, 42.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 348.05535; found, 348.05503 (Δ0.32 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.03 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 6.59 (dd, 1H, J = 9.2, 2.0 Hz), 3.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.70-3.64 (m, 4H), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.47 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 147.1, 143.6, 131.7, 129.1, 116.6, 114.7, 73.5, 71.5, 71.3, 70.0, 43.7, 42.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 304.10586; found, 304.10603 (Δ0.17 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.45 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.12 (dd, 1H, J = 9.2, 2.8 Hz), 6.89 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.75-3.73 (m, 5H), 3.67-3.61 (m, 4H), 3.50 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.44 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 150.9, 142.4, 131.9, 128.0, 116.7, 107.7, 73.6, 71.5, 71.3, 70.2, 56.2, 43.7, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 300.15540; found, 300.15689 (Δ1.49 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.36 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 7.67 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71-3.64 (m, 4H), 3.59 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 148.3, 132.9 (q, J = 3.2 Hz), 132.0, 125.8 (q, J = 4.3 Hz), 125.3 (q, J = 268.3 Hz), 117.8 (q, J = 33.7 Hz), 116.6, 73.6, 71.6, 71.4, 69.9, 43.7, 42.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 338.13222; found, 338.13308 (Δ0.86 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.63 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.93 (dd, 1H, J = 9.2, 2.0 Hz), 7.01 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.86 (s, 1H), 3.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71-3.69 (m, 2H), 3.66-3.64 (m, 2H), 3.56 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 167.0, 148.9, 136.9, 132.3, 129.9, 117.8, 115.3, 73.6, 71.5, 71.4, 69.8, 52.6, 43.7, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 328.15031; found, 328.15102 (Δ0.71 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.99 (dd, 1H, J = 2.8, 0.8 Hz), 7.43 (ddd, 1H, J = 9.2, 2.8, 0.8 Hz), 7.11 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71-3.64 (m, 4H), 3.56-3.52 (m, 4H), 2.79 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 145.7, 135.2 (q, JC-F = 571.9 Hz), 131.1, 122.0 (JC-F = 254.0 Hz), 120.0, 117.0, 73.6, 71.5, 71.3, 70.0, 43.8, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 354.12713; found, 354.12835 (Δ1.22 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.57 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.87 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.80 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71-3.63 (m, 4H), 3.61 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.13 (s, 3H), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.0, 134.6, 131.9, 128.5, 127.7, 116.7, 73.5, 71.5, 71.3, 69.8, 44.6, 43.8, 42.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 348.12238 ; found, 348.12210 (Δ-0.28 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.84 (d, 1H, J = 0.8 Hz), 7.29-7.26 (m, 1H), 6.87 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.75 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.69-3.63 (m, 4H), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.46 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 144.9, 138.8, 132.6, 126.6, 126.1, 115.3, 73.6, 71.5, 71.3, 70.1, 43.6, 42.2, 20.0. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 284.16048; found, 284.16183 (Δ1.35 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.22 (dd, 1H, J = 8.8, 0.4 Hz), 7.28 (d, 1H, J = 0.4 Hz), 6.85 (dd, 1H, J = 8.8, 2.0 Hz), 3.80 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.72-3.64 (m, 4H), 3.56 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 146.3, 137.8 (q, JC-F= 32.2 Hz), 134.6, 128.8, 124.7 (q, JC-F = 271.1 Hz), 112.9 (q, JC-F = 4.1 Hz), 111.9 (q, JC-F = 3.3 Hz), 73.6, 71.6, 71.3, 70.2, 43.7, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 338.13222; found, 338.13335 (Δ1.13 mmu).
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.29 (br s, 1H), 8.22 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.57 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 6.98 (dd, 1H, J = 8.8, 1.6 Hz), 3.82 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.68-3.60 (m, 8H), 3.33-3.29 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, (CD3)2CO): δ 145.9, 134.4, 128.4, 120.4, 119.6, 118.2, 117.6, 72.3, 71.2, 71.1, 69.7, 52.0, 43.6. HRMS (ESI+) calcd. for [M+Na]+, 317.12203; found, 317.12050 (Δ1.53 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.03 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.27 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.23 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 3.86 (s, 3H), 3.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.70 - 3.63 (m, 4H), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.48 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100MHz CD3OD): δ 167.6, 149.2, 129.8, 127.3, 106.2, 96.3, 73.6, 71.5, 71.3, 70.1, 56.3, 43.6, 42.2. HRMS (ESI) calcd for [M+Na]+, 322.13734; found, 322.13714 (Δ0.20 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.98 (d. 1H, J = 9.2 Hz), 7.37 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.01 (dd, 1H, J = 8.8, 1.6 Hz), 3.88 (s, 3H), 3.76 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.71 (m, 4H), 3.51 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.44 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 166.7, 145.8, 137.3, 134.7, 127.7, 116.7, 115.9, 73.6, 71.5, 71.3, 69.9, 53.2, 43.5, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 328.15031; found, 328.15150 (Δ1.19 mmu).
1H NMR (400 MHz CD3OD): δ 8.23 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 6.85 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 3.68-3.64 (m, 6H), 3.52 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.15 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 2.80 (t, 2H, J = 5.2 Hz).
HRMS (ESI) calcd for [M+Na]+, 337.11186; found, 337.11280 (Δ 0.94 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.65-7.63 (m, 2H), 6.97 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 3.73 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.68-3.62 (m, 4H), 3.51 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.45 (t, 2H J = 5.2 Hz), 2.78 (t, 2H, J = 5.2 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.7, 131.4-131.3 (m), 129.9-121.8 (m), 125.0 (m), 118.2 (q, JC-F = 33.4 Hz), 113.6 (q, JC-F = 30.2 Hz), 113.2, 73.6, 71.5, 71.4, 70.0, 43.8, 42.2. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 361.13452; found, 361.13546 (Δ0.94 mmu).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.71 (br s, 1H), 8.50 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.62 (dd, 1H, J = 9.2, 2.0 Hz), 6.94 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.22 (br s, 1H), 3.83 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.73-3.70 (m, 2H), 3.67-3.65 (m, 2H), 3.59-3.54 (m, 2H), 3.49-3.45 (m, 2H), 1.99 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.4, 147.2, 137.8, 132.3, 131.5, 118.0, 115.0, 98.3, 70.7, 70.2, 70.2, 68.3, 42.9, 39.4, 23.3. HRMS (ESI+) calcd. for [M+Na]+, 359.13259; found, 359.13431 (Δ1.49 mmu).
1H NMR (400MHz DMSO-d6): δ 8.36 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 8.0, 0.4 Hz), 7.943 - 7.938 (m, 1H), 7.20(d, 2H, J = 2.8 Hz), 6.75 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 2.99 (s, 12H), 2.95 (s, 4H), 0.68 (s, 3H), 0.58 (s, 3H). 13C NMR (100MHz DMSO-d6): δ 170.3, 169.4, 162.0, 156.4, 150.4, 141.5, 137.3, 132.1, 132.0, 131.4, 131.3, 129.2, 127.5, 126.6, 118.1, 115.2, 40.5, 26.3, 0.1, -0.9. HRMS (ESI+) calcd for C31H32N3O6Si [M+H]+, 570.20549 ; found, 570.20454 (Δ-0.95 mmu).
6SiR−pCNoNP(4−((2−(2−(2−((4−シアノ−2−ニトロベンジル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)−2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルアミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−yl)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz (CD3)2CO): δ 8.60 (br s, 1H), 8.43 (d, 1H, J = 2.0Hz), 8.09 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 7.98 - 7.96 (m, 2H), 7.77 (d, 1H, J = 0.8 Hz), 7.71 (ddd, 1H, J = 8.8, 2.0, 0.8 Hz), 7.13-7.11 (m, 3H), 6.75 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.65 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.73 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.61-3.60 (m, 6H), 5.54-3.49 (m, 4H), 2.97 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 749.31135 ; found, 749.31045 (Δ-0.90 mmu)
6SiR−oNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((2−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.19 (br s, 1H), 8.10-8.05 (m, 2H), 7.98 (br s, 1H), 7.96-7.94 (dd, 1H, J =8.0, 0.4 Hz), 7.76 (d, 1H, J = 0.4 Hz), 7.51-7.49 (m, 1H), 7.09 (d, 2H, J =2.8 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 6.74 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.70-6.65 (m, 1H), 6.63 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.72 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.60 (m, 6H), 3.55-3.53 (m, 2H), 3.45-3.41 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.68 (s, 3H), 0.55 (s, 3H) . HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 724.31610; found, 724.31450 (Δ-1.60mmu).
6SiR−oDNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルアミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((2,6−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.52 (br s, 1H), 8.22 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 8.07 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 7.96-7.94 (m, 2H), 7.75 (d, 1H, J = 0.8 Hz), 7.09 (d, 2H, J= 2.8 Hz), 6.89 (t, 1H, J =8.0 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 9.2, 2.8 Hz), 3.65 (t, 2H, J = 2.8 Hz), 3.60-3.58 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.09-3.05 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 769.30118; found, 769.30113 (Δ-0.05 mmu).
6SiR−linker(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミニオ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−メトキシエトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.11 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.02 (br s, 1H), 7.99 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.75 (s, 1H), 7.11 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.65 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.59-3.51 (m, 6H), 3.43-3.41 (m, 2H), 3.20 (s, 3H), 2.97 (s, 12H), 0.68 (s, 3H), 0.56 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 574.27317; found, 574.27444 (Δ1.27 mmu).
6SiR−mCNoNP(4−((2−(2−(2−((5−シアノ−2−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)−2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.25 (br s, 1H), 8.19 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.08 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.96-7.94 (m, 2H), 7.75 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.10 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.76 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.75 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.61-3.60 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 4H), 2.96 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 749.31135; found, 749.31022 (Δ-1.13 mmu).
6SiR−pCF3oNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((2−ニトロ−4−(トリフルオロメチル)フェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.50 (br s, 1H), 8.36 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 8.08 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 7.98 (br s, 1H), 7.95 (dd, 1H, J = 8.0, 0.4 Hz), 7.76 (s, 1H), 7.73 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.17 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.74 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.64-3.60 (m, 6H), 3.59-3.48 (m, 4H), 2.95 (s, 12H), 0.68 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 792.303349; found, 792.30515 (Δ1.66 mmu).
6SiR−pCOOMeoNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((4−(メトキシカルボニル)−2−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.69 (d, 1H, J = 2.4 Hz ), 8.56 (br s, 1H), 8.11 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.01-7.96 (m, 3H), 7.82 (br s, 2H), 7.42 (br s, 2H), 7.07 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.91-6.86 (m, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.75 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.63-3.60 (m, 6H), 3.54-3.52 (m, 4H), 3.01 (s, 12H), 0.72 (s, 3H), 0.58 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 782.32158; found, 782.32129 (Δ-0.29 mmu).
6SiR−pBroNP(4−((2−(2−(2−((4−ブロモ−2−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルボニル)−2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]silin−10−yl)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.22 (br s, 1H), 8.16 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.10 (dd, 1H, J =8.0, 1.2 Hz), 7.98-7.96 (m, 2H), 7.78 (s, 1H), 7.57 (dd, 1H, J =9.2, 2.4 Hz), 7.20 (br s, 2H), 6.98 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.79 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.73-6.71 (m, 2H), 3.71 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.59 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.45-3.41 (m, 2H), 2.98 (s, 12H), 0.70 (s, 3H), 0.56 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 802.22661; found, 802.22786 (Δ 1.25 mmu).
6SiR−pCOONHMeoNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((4−(メチルカルバモイル)−2−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.63 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 8.41 (br s, 1H), 8.09 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.00-7.99 (m, 2H), 7.95 (d, 1H, J =7.6 Hz), 7.76 (m, 2H), 7.09 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 7.04 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.74 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.63 (dd, 2H, J = 9.2, 2.4 Hz), 3.72 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 3.61-3.59 (m, 6H), 3.55-3.47 (m, 4H), 2.95 (s, 12H), 2.87 (d, 3H, J = 4.4 Hz), 0.68 (s, 3H), 0.55 (s, 3H).
HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 781.33757; found, 781.33757 (Δ 0.00 mmu).
6SiR−mCOOMeoNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((5−(メトキシカルボニル)−2−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.15-8.13 (m, 2H), 8.00 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 7.90-7.88 (m, 2H), 7.71-7.70 (m, 1H), 7.50 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 7.20 (dd, 1H, J = 8.8, 1.6 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 6.78 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.65 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.92 (s, 3H), 3.72 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.60 (m, 6H), 3.54-3.49 (m, 2H), 3.39-3.35 (m, 2H), 2.95 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.54 (s, 3H)
. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 782.32158; found, 782.32292 (Δ1.34 mmu).
6SiR−mCF3oNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((2−ニトロ−5−(トリフルオロメチル)フェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.31 (br s, 1H), 8.25 (dd, 1H, J = 8.8, 0.4 Hz), 8.07 (dd, 1H, J =8.0, 1.6 Hz), 7.95-7.93 (m, 2H), 7.75-7.74 (m, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.09 (d, 2H, J = 3.2 Hz), 6.94 (dd, 1H, J = 8.8, 1.6 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 9.2, 3.2 Hz), 3.75 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.59 (m, 6H), 3.57-3.52 (m, 4H), 2.95 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 792.30349; found, 795.30297 (Δ-0.52 mmu).
6SiR−pSO2MeoNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((4−(メチルスルホニル)−2−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.63 (br s, 1H), 8.58 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.08 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 7.97-7.95 (m, 2H), 7.91 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 0.4 Hz), 7.21-7.18 (m, 3H), 6.81-6.73 (m, 4H), 3.76 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.63-3.60 (m, 6H), 3.56-3.51 (m, 4H), 3.10 (s, 3H), 2.98 (s, 12H), 0.70 (s, 3H), 0.56 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 824.27560; found, 824.27660 (Δ1.00 mmu).
6SiR−pCloNP(4−((2−(2−(2−((4−クロロ−2−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)−2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.25 (br s, 1H), 8.07-8.05 (m, 2H), 7.95-7.93 (m, 2H), 7.743-7.738 (m, 1H), 7.09 (d, 2H, J = 3.2 Hz), 7.05 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 6.76 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.68-6.62 (m, 3H), 3.72 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.63-3.60 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.44-3.40 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.70 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 758.27713; found, 758.28038 (Δ3.25 mmu).
6SiR−LC−oNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((1−((2−ニトロフェニル)アミノ)−10−オキソ−3,6,13,16,19−ペンタオキサ−9−アザヘニコサン−21−イル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.22 (br s, 1H), 8.15-8.09 (m, 3H), 8.00-7.97 (dd, 1H, J = 8.0, 0.8 Hz), 7.80-7.79 (m, 1H), 7.53-7.49 (m, 1H), 7.10 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 7.07-7.04 (m, 2H), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.71-6.67 (m, 1H), 6.65 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.77 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.65-3.43 (m, 22H), 3.31-3.27 (m, 2H), 2.97 (s, 12H), 2.29 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 949.41380; found, 949.41383 (Δ0.00 mmu)
6SiR−LC−pCF3oNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((1−((2−ニトロ−4−(トリフルオロメチル)フェニル)アミノ)−10−オキソ−3,6,13,16,19−ペンタオキサ−9−アザヘニコサン−21−イル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.55 (br s, 1H), 8.39 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 8.15-8.11 (m, 2H), 7.98 (dd, 1H, J = 8.0, 0.8 Hz), 7.80-7.79 (m, 1H), 7.56 (dd, 1H, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.28 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.11-7.08 (m, 3H), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.65 (dd, 2H, J = 9.2, 2.8 Hz), 3.80 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.66-3.42 (m, 22H), 3.31-3.27 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 2.29 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 1017.40119; found, 1017.39989 (Δ-1.30 mmu).
6SiR−LC−pCOOMeoNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((1−((4−(メトキシカルボニル)−2−ニトロフェニル)アミノ)−10−オキソ−3,6,13,16,19−ペンタオキサ−9−アザヘニコサン−21−イル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.75 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.60 (br s, 1H), 8.15-8.03 (m, 2H), 8.03-8.01 (m, 1H), 7.99-7.97 (dd, 1H, J = 7.6,0.8 Hz), 7.798-7.795 (m, 1H), 7.15 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.07 (br s, 1H), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.65 (dd, 2H, J = 9.2, 2.8 Hz), 3.86 (s, 3H), 3.80 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.65-3.42 (m, 22H), 3.32-3.27 (m, 2H), 2.97 (s, 12H), 2.28 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 1007.41928; found, 1007.41634 (Δ-2.94mmu)
6SiR−pMeoNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((4−メチル−2−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.09-8.07 (m, 2H), 7.95-7.93 (m, 2H), 7.87 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 3.34 (dd, 1H, J= 8.8, 1.6 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 6.89 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.74 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.63 (dd, 1H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.72 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.60 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 2H), 2.95 (s, 12H), 0.68 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 738.33175; found, 738.33238 (Δ0.63 mmu).
6SiR−pMeOoNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((4−メトキシ−2−ニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.09-8.07 (m, 2H), 7.96-7.93 (m, 2H), 7.76 (s, 1H), 7.53 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 7.20 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 7.01-6.96 (m, 1H), 6.74 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.63 (dd, 2H, J = 9.2, 3.2 Hz), 3.79 (s, 3H), 3.70 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.61 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.43-3.39 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.68 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 754.32667; found, 754.32777 (Δ1.10 mmu).
6SiR−DCF3P(4−((2−(2−(2−((2,4−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)−2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.10 (d, 1H, J = 8.0 Hz). 8.00-7.94 (m, 2H), 7.76 (s, 1H), 7.70-7.68 (m, 2H), 7.10 (d, 2H, 2.8 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.75 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.68 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.61-3.59 (m, 6H), 3.55-3.52 (m, 2H), 3.42-3.38 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.68 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 815.30579; found, 815.30687 (Δ1.08 mmu).
6SiR−pCF3OoNP(2−(7−(ジメチルアミノ)−3−(ジメチルイミノ)−5,5−ジメチル−3,5−ジヒドロジベンゾ[b,e]シリン−10−イル)−4−((2−(2−(2−((2−ニトロ−4−(トリフルオロメトキシ)フェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.26 (br s, 1H), 8.87 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.05 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.96-7.94 (m, 2H), 7.76 (s, 1H), 7.50 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 7.12-7.09 (m, 3H), 6.75 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.64 (dd, 2H, J = 8.8, 2.8 Hz), 3.73 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.63-3.60 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 2H), 3.48-3.44 (m, 2H), 2.96 (s, 12H), 0.69 (s, 3H), 0.55 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 808.29840; found, 808.29775 (Δ-0.65 mmu).
6SiR720−NHS(2−(1,2,2,4,8,10,10,11,13,13−デカメチル−2,10,11,13−テトラヒドロシリノ[3,2−g:5,6−g’]ジキノリン−1−イウム−6−イル)−4−(((2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)カルボニル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.41 (dd, 1H, J = 8.0, 1.2 Hz), 8.34 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.03 (d, 1H, J = 1.2 Hz ), 7.14 (s, 2H), 6.64 (s, 2H), 5.472-5.470 (m, 2H), 3.14 (s, 6H), 2.95 (s, 4H), 1.63 (s, 3H), 1.62 (s, 3H), 1.42 (s, 6H), 1.40 (s, 6H), 0.66 (s, 3H), 0.58 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 702.29939; found, 702.30020 (Δ0.81 mmu).
6SiR720−DNP(2−(1,2,2,4,8,10,10,11,13,13−デカメチル−2,10,11,13−テトラヒドロシリノ[3,2−g:5,6−g’]ジキノリン−1−イウム−6−イル)−4−((2−(2−(2−((2,4−ジニトロフェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.91 (d, 1H, J = 2.8 Hz ), 8.79 (br s, 1H), 8.23 (dd, 1H, J = 9.6, 2.8 Hz), 8.11 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.01 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.95 (br t, 1H, J = 5.2 Hz), 7.82 (s, 1H),7.14 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.88 (s, 2H), 6.55 (s, 2H), 5.34 (s, 2H), 3.76 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 3.62-3.51 (m, 10H), 2.93 (s, 6H), 1.61 (s, 6H), 1.32 (s, 6H), 1.29 (s, 6H), 0.68 (s, 3H), 0.54 (s, 3H) 13C NMR (100 MHz, (CD3)2CO): δ 169.9, 166.2, 149.5, 145.8, 141.0, 136.6, 132.03, 131.98, 131.1, 130.7, 129.6, 129.0, 127.7, 126.6, 124.44, 124.40, 124.3, 123.3, 116.0, 115.8, 71.2, 70.9, 70.2, 69.3, 57.7, 43.9, 40.7, 31.3, 28.4, 27.8, 18.1, 0.24, -1.1. HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 901.39508; found, 901. 39525 (Δ0.17 mmu).
6SiR720−pCF3oNP(2−(1,2,2,4,8,10,10,11,13,13−デカメチル−2,10,11,13−テトラヒドロシリノ[3,2−g:5,6−g’]ジキノリン−1−イウム−6−イル)−4−((2−(2−(2−((2−ニトロ−4−(トリフルオロメチル)フェニル)アミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)ベンゾエート)の合成
1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO): δ 8.49 (br s, 1H), 8.36-6.35 (m, 1H), 8.10 (dd, 1H, J = 8.0, 1.6 Hz), 8.01 (dd, 1H, J = 8.0, 0.4 Hz ), 7.97 (br t, 1H, J = 5.6 Hz), 7.81 (dd, 1H, J = 1.2, 0.8 Hz), 7.72 (dd, 1H, J = 9.2, 2.0 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.89 (s, 2H), 6.56 (s, 2H), 5.35-5.34 (m, 2H), 3.74(t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.63-3.59 (m, 6H), 3.55-3.51 (m, 4H), 2.94 (s, 6H), 1.614 (s, 3H), 1.611 (s, 3H), 1.31 (s, 6H), 1.30 (s, 6H), 0.67 (s, 3H), 0.54 (s, 3H). HRMS (ESI+) calcd. for [M+H]+, 924.39739; found, 924.39648 (Δ-0.91 mmu).
ストップトフロー装置(Bio−logic)内の流路をリン酸緩衝液(pH7.4)(PBS)に1%w/vゼラチンを溶かした前処理液で満たし、室温で30分間以上放置することでブロッキングを行った後、MilliQ水で流路を十分に洗浄した。装置を用いて、100nM以下のMBP−5D4もしくはその変異体と1μMのプローブを溶解したPBSと、競合物質となる100μMのDNPを溶解したPBSを1:1で混合し、蛍光変化を測定した。このとき、励起/蛍光波長は、DCFのプローブは510nm/529−556nm、SiRのプローブは650nm/672−712nmを用い、計測は25−27℃の条件で行った。時間tに対して観測した蛍光強度I(t)を式(1)でフィットすることにより、解離速度定数koffを算出した(図13及び表1)。
このとき、cn(n=1−3)は定数である。
さらに、合成実施例16〜35で得た6SiR−DNPの誘導体について5D4もしくは5D4(Y96F)との解離速度を評価した結果を表1に示す。表1に示されるように、5D4(Y96F)・6SiR−pCNoNPの組合せでは解離速度が14s−1と最大であった。
5D4(Y96F)のER発現コンストラクトはpECFP−5D4を鋳型として2種類のプライマー(Y96F_FとVLCDR3)を用いた環状PCR法により導入した。
得られた直鎖PCR産物をLigation kit ver2(TAKARA)を用いて環状化してMBP−5D4(Y96F)の発現コンストラクトpECFP−5D4(Y96F)を得た。
小胞体局在化シグナル配列を付加したECFP−5D4(Y96F)の発現プラスミド(pECFP−5D4(Y96F)−ER)をLipofectamin 2000を用いて96ウェルプレート上で培養したHeLa細胞に導入した。プラスミド導入後20時間後にトリプシン・EDTA処理し細胞をはがした後にコラーゲン/ポリ―L―リジンでコートしたカバーガラスに再播種した。再播種後20時間後に細胞をHBSで洗浄し、10nMの6SiR−DNPを負荷し、超解像イメージングに供した。640nmの半導体レーザーを用いて標本を励起し、1分子の蛍光明滅像を背面照射型冷却EM−CCDカメラ(アンドールテクノロジー、iXon)で16ミリ秒の露光で連続的に取得した。各画像内の1分子蛍光の輝点の重心位置を決定して超解像イメージを再構成した。通常の蛍光顕微鏡のイメージと比較して、超解像イメージでは小胞体の構造が高い空間解像度で可視化された(図14)。
In vivoイメージング
自家蛍光低減飼料D10001(RESEARCH DIETS Inc.)で5日飼育した7週齢の雌のヌードマウスBALB/c−nu/nu(日本SLC)に、EGFP−5D4もしくはEGFPを安定発現するSKOV3細胞をそれぞれ左右の大腿の付け根に200万細胞ずつ皮下投与した。自家蛍光低減飼料を用いてさらに5日間飼育した後、in vivoイメージング実験に供した。マウスをイソフルランで麻酔した後、100μLのPBSに溶解した10μMの6SiR700−pCF3oNPを静脈内に投与し、蛍光イメージャーPearl Trilogy(LI−COR,Inc.)を用いて観察を行った。励起/蛍光波長は685nm/720nmを用いた。プローブを投与して5分後には、EGFP−5D4を発現するSKOV3細胞が特異的に可視化された(図15)。この結果は、開発したタグ・プローブ手法により近赤外蛍光を用いた目的の細胞のin vivo標識が可能であることを明確に示している。
タグ・プローブの結合解離平衡に基づく長期安定な蛍光イメージング
ECFP−5D4を発現するHeLa細胞を10nMの6SiR−pCOONHMeoNPを含むHBSに室温で1時間浸し、そのままプローブが細胞外液に10nM存在する条件で蛍光イメージングを行った。細胞全体に強力な励起光を照射したところ、光褪色の後に蛍光シグナルが回復する現象が見られた(図16)。この現象は、タグとプローブの結合解離の平衡を基に一定の蛍光強度が観察された結果であり、安定した蛍光観察が可能であることを示している。従来、光褪色が深刻な問題となる超解像イメージング等の蛍光観察において、開発したタグ・プローブ手法は光褪色に制限されずに蛍光シグナルを半永
久的に得ることを可能にする画期的な特性を有している。
Claims (34)
- 細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と抗DNP(ジニトロフェニル化合物)抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式(I)で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び
前記融合タンパク質と下記式(I)で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、
タンパク質を蛍光標識する方法。
(前記式(I)中、
Sは、蛍光性基であり、
Lは、リンカーであり、
Raは、一価の置換基であり、
mは、0〜2の整数であり、
nは、0〜2の整数であり、
mが2の場合は、nは0であり、
mが1の場合は、nは1又は0であり、
mが0の場合は、nは2であり、
nが2の場合は、Raの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。) - Raの一価の置換基が、ハロゲン原子、炭素数1〜10のアルキル基、炭素数1〜10のアルコキシ基、シアノ基、エステル基、アミド基、アルキルスルホニル基、少なくとも1以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数1〜10のアルキル基、及び少なくとも1以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数1〜10のアルコキシ基からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記融合タンパク質における前記抗DNP抗体は、
配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR1、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR2及び配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR3を含む軽鎖、並びに
配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR1、配列番号5に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR2及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR3を含む重鎖
からなる抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
配列番号1:QEISGY
配列番号2:AAS
配列番号3:VQYASYPYT
配列番号4:GFTFSNYWMNW
配列番号5:IRLKSNNYAT
配列番号6:TGYYYDSRYGY - 前記抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントが一本鎖Fv(scFv)である、請求項4に記載の方法。
- 前記抗DNP抗体は、配列番号7のアミノ酸を90%以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号1〜6で示されるアミノ酸配列を含む、請求項4又は5に記載の方法。
配列番号7:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS - 前記アミノ酸配列が配列番号7である、請求項6に記載の方法。
- 前記融合タンパク質における前記抗DNP抗体は、配列番号7のアミノ酸を90%以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号1〜6で示されるアミノ酸配列を含み、
かつ、配列番号1〜6のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも1つの置換:
(a)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(b)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記融合タンパク質における前記抗DNP抗体は、配列番号7のアミノ酸において以下の置換:
(1)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(2)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リンカーが、T−Yで表され、Yは蛍光性基であるSと結合する結合基を表し、Tは架橋基を表す、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合基が、アミド基、アルキルアミド基、エステル基、アルキルエステル基、カルボニルアミノ基又はアルキルエーテル基から選択される、請求項11に記載の方法。
- Sが、以下の式(II)で表される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
R1は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する1ないし4個の同一又は異なる一価の置換基を示し;
R2は、水素原子、一価の置換基又は結合を示し;
R3及びR4は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し;
R5及びR6は、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基、アリール基又は結合を示し、但し、Xが酸素原子の場合は存在しない;
R7及びR8は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し;
Xは、酸素原子又は珪素原子を示し;
*は、ベンゼン環上の任意の位置における式(I)のLとの結合箇所を表す。) - Sが、以下の式(III)で表される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
(式中、R1〜R8、Xは、式(II)で定義した通りであり;
R9及びR10は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数1〜6個のアルキル基を示し、
R9及びR10は一緒になってR9及びR10が結合している窒素原子を含む4〜7員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
R9又はR10は、或いは、R9及びR10の両方は、夫々、R3又はR7と一緒になって、R9又はR10が結合している窒素原子を含む5〜7員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される1〜3個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数1〜6個のアルキル、炭素数2〜6個のアルケニル、又は炭素数2〜6個のアルキニル、炭素数6〜10個のアラルキル基、炭素数6〜10個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく;
R11及びR12は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数1〜6個のアルキル基を示し、
R11及びR12は一緒になってR11及びR12が結合している窒素原子を含む4〜7員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
R11又はR12は、或いは、R11及びR12の両方は、夫々、R4又はR8と一緒になって、R11又はR12が結合している窒素原子を含む5〜7員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される1〜3個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数1〜6個のアルキル、炭素数2〜6個のアルケニル、又は炭素数2〜6個のアルキニル、炭素数6〜10個のアラルキル基、炭素数6〜10個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく;
*は、ベンゼン環上の任意の位置における式(I)のLとの結合箇所を表す。) - 配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR1、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR2及び配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるVL−CDR3を含む軽鎖、並びに
配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR1、配列番号5に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR2及び配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるVH−CDR3を含む重鎖
からなる抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。
配列番号1:QEISGY
配列番号2:AAS
配列番号3:VQYASYPYT
配列番号4:GFTFSNYWMNW
配列番号5:IRLKSNNYAT
配列番号6:TGYYYDSRYGY - 前記抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメントが一本鎖Fv(scFv)である、請求項15に記載の抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 配列番号7のアミノ酸を90%以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号1〜6で示されるアミノ酸配列を含む、請求項15又は16に記載の抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。
配列番号7:
MADYKDIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRSSQEISGYLGWLQQKPDGSIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCVQYASYPYTFGGGTKLEMKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIQLQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLDWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGYYYDSRYGYWGQGTTVTVSS - 前記アミノ酸配列が配列番号7である、請求項17に記載の抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 配列番号7のアミノ酸を90%以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号1〜6で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号1〜6のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも1つの置換:
(a)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(b)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。 - 配列番号7のアミノ酸において以下の置換:
(1)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(2)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、抗DNP抗体又はその抗原結合性フラグメント。 - 請求項15〜18のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸。
- 配列番号8に示される塩基配列からなる、請求項21に記載の核酸。
配列番号8:
ATGGCGGACTACAAAGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCTTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGTCAAGTCAGGAAATTAGTGGTTACTTAGGCTGGCTTCAGCAGAAACCAGATGGAAGTATTAAACGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCAAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTATTGTGTACAATATGCTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATGAAACGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGATTCAGCTTCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGACTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCGGTTATTACTACGATAGTAGGTACGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCG - 請求項20又は21に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸。
- 請求項21〜23のいずれか1項に記載の核酸を含むプラスミド又はベクター。
- in vivoイメージングに用いられる、請求項25に記載の蛍光プローブ。
- 標識対象タンパク質と抗DNP(ジニトロフェニル化合物)抗体の融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式(I)で表される化合物又はその塩を前記細胞と接触させること、及び
前記融合タンパク質と下記式(I)で表される化合物又はその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含む、
超解像イメージング法。
(前記式(I)中、
Sは、蛍光性基であり、
Lは、リンカーであり、
Raは、一価の置換基であり、
mは、0〜2の整数であり、
nは、0〜2の整数であり、
mが2の場合は、nは0であり、
mが1の場合は、nは1又は0であり、
mが0の場合は、nは2であり、
nが2の場合は、Raの一価の置換基は同じであっても異なっていてもよい。) - 単一分子位置決定顕微鏡法を用いる、請求項28に記載の超解像イメージング法。
- 前記融合タンパク質における前記抗DNP抗体は、配列番号7のアミノ酸を90%以上の相同で有するアミノ酸配列からなり、配列番号1〜6で示されるアミノ酸配列を含み、
かつ、配列番号1〜6のいずれかで表されるアミノ酸配列において以下の少なくとも1つの置換:
(a)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(b)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、請求項28又は29に記載の超解像イメージング法。 - 前記融合タンパク質における前記抗DNP抗体は、配列番号7のアミノ酸において以下の置換:
(1)N末端からの番号が33位のグルタミン酸、37位のチロシン、94位のバリン、95位のグルタミン、159位のグリシン、160位のフェニルアラニン、162位のフェニルアラニン、164位のアスパラギン、233位のグリシン、235位のチロシン、236位のチロシン、237位のアスパラギン酸、239位のアルギニン、240位のチロシン又は242位のチロシンのいずれか1のアミノ酸がアラニンにより置換;あるいは
(2)N末端からの番号が96位のチロシン又は234位のチロシンのいずれか1つのアミノ酸がフェニルアラニンにより置換;
されたアミノ酸配列からなる、請求項28〜30のいずれか1項に記載の超解像イメージング法。 - Raの一価の置換基が、ハロゲン原子、炭素数1〜10のアルキル基、炭素数1〜10のアルコキシ基、シアノ基、エステル基、アミド基、アルキルスルホニル基、少なくとも1以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数1〜10のアルキル基、及び少なくとも1以上の水素原子がフッ素原子で置換されている炭素数1〜10のアルコキシ基からなる群から選択される、請求項31に記載の蛍光プローブ。
- 以下の式(Ib)で表される化合物又はその塩を含む、請求項32又は33に記載の超解像イメージング法に用いられる蛍光プローブ。
式(Ib)中、Sは、蛍光性基であり、Lは、リンカーであり、Rb及びRcは、以下の組合せから選択される。
(Rb、Rc):(NO2、p−NO2)、(NO2、p−Br)、(NO2、p−SO2Me)、(NO2、p−Cl)、(NO2、m−CN)、(NO2、p−CN)、(NO2、p−COOMe)、(CF3、p−CF3)、(NO2、p−CONHMe)、(NO2、m−COOMe)、(NO2、H)
(ここで、p−及びm−は、夫々、Rcがベンゼン環上でLに対してパラ位及びメタ位にあることを表す。)
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