JPWO2018117011A1 - インビトロでのIgM型メモリーB細胞分化培養系を用いた臓器移植後抗体関連型拒絶反応の早期診断法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]臓器移植後の患者において抗体関連型拒絶反応(ABMR)の有無をインビトロで検出する方法であって、患者からの末梢血試料を、活性化T細胞からの液性因子および/または炎症性サイトカインの存在下で培養し、培養上清中のIgM型抗ドナーHLA抗体(Donor Specific HLA Antibody;以下、「DSA」という)を検出することを含み、その際、IgM型DSAの検出がABMR発症を早期診断するための指標となる前記方法。
[2]前記活性化T細胞からの液性因子および/または炎症性サイトカインの存在下での培養を、健常人単核球培養上清を添加することにより行う、上記[1]に記載の方法。
[3]臓器移植が腎移植である、上記[1]または[2]に記載の方法。
[4]患者からの末梢血試料の培養をB細胞に適した培養条件下で行う、上記[1]から[3]のいずれかに記載の方法。
[5]臓器移植後の患者において抗体関連型拒絶反応(ABMR)の有無をインビトロで検出するためのキットであって、患者からの末梢血試料を、活性化T細胞からの液性因子および/または炎症性サイトカインの存在下で培養する手段、及び、培養上清中のIgM型DSAを検出する手段を含み、IgM型DSAの検出がABMRの存在の指標となる前記キット。
[6]前記患者からの末梢血試料を、活性化T細胞からの液性因子および/または炎症性サイトカインの存在下での培養する手段が、健常人単核球培養上清を含む、上記[5]に記載のキット。
[7]臓器移植が腎移植である、上記[5]または[6]に記載のキット。
[8]前記患者からの末梢血試料を培養する手段が、前記患者からの末梢血試料をB細胞に適した培養条件下で培養する手段である、上記[5]から[7]のいずれかに記載のキット。
(1)腎移植後の患者から移植直後、さらに定期的(1〜3ヶ月)に末梢血を8-16ml採取し、インビトロにおいて培養を行う。培養上清を解析し、IgM型DSA(特にDSAs, C1q binding)が検出された症例においてDSA特異的IgMメモリーB細胞のアポトーシスを促進する免疫抑制剤(cellcept)さらにクラススイッチを抑制する免疫抑制剤(CNI)の増量を行う。
(2)腎移植後、3週目の症例から末梢血(8〜16ml)を採取し、インビトロにおいて培養を行う。培養上清を解析し、IgM型DSA(特にDSAs, C1q binding)が検出されるかどうか確認する。検出された症例においてはcellcept, CNIの投与量を維持する。未検出例においては、cellceptの減量とCNIの早期中止を目標とする。再検査は1ヶ月後に行い、それを元に今後の治療方針を決定する。
(3)腎移植前例において移植前に末梢血を8-16ml採取し、インビトロにおいて培養を行う。培養上清を解析し、IgM型DSA(特にDSAs, C1q binding)が検出された症例においては移植時に再度ドナー抗原に感作されることにより、DSA特異的IgMメモリーB細胞が植後早期にDSA特異的IgGメモリーB細胞へとクラススイッチし、ABMR発症の原因になることが予測される。よってDSA特異的IgMメモリーB細胞のアポトーシスを促進する免疫抑制剤(cellcept)さらにクラススイッチを抑制する免疫抑制剤(CNI)を移植前より、内服を開始するなどして、移植後、早期のABMR発症を予防する。
腎移植後のHLA抗原感作症例、腎移植レシピエントから末梢血8mlを採取した。末梢血からFicoll-Hypaque density gradient(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)を用いて単核球を分離し、培養した。培地はIscove's modified Dulbecco's medium(Sigma-Aldrich)に10% fetal calf serum(FCS; Thermo Scientific HyClone, NYSE, TMO)、50μg/ml human transferrin-selenium and human insulin(Gibco Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)とサイトカインとして50ng/ml IL-21(Miltenyi Biotech)、2.5μg/ml phosphorothioate CpG-ODN 2006(Invivogen)、2.5μg/ml phytohemagglutinin (PHA) (Sigma)、15ng/ml phorbol 12-myristate-13 acetate (PMA)を添加したものであった。さらに末梢血単核球を24-well平底(5×105 cells/well)にて7日間培養した。
腎移植後のHLA抗原感作症例から末梢血8mlを採取し、単核球に分離し、さらにMACS separation (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)を用いてCD19陽性B細胞を分離した。基本培地は単核球と同条件を用い、サイトカインは50 ng/ml IL-21、2.5μg/ml phosphorothioate CpG-ODN 2006、50ng/ml histidine-tagged soluble recombinant human CD40L (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)を添加したものであった。さらに健常人単核球培養上清として、輸血歴のない健康な男性10人から採取した末梢血単核球(CD19陽性B細胞を除いたもの)を24-well平底(1×106 cells/well)にて36時間培養し、培養上清を回収した。培地はRPMI1640に10%fetal calf serum (FCS; Thermo Scientific HyClone, NYSE, TMO)と2.5μg/ml phytohemagglutinin (PHA)(Sigma)、10ng/ml phorbol 12-myristate-13 acetate (PMA)を添加したものであった。健常人単核球培養上清を末梢血B細胞培養条件に5%添加し、24-well平底(1×105 cells/well)にて7日間培養した。
培養上清中にFlowPRAR Class I & II Screening Test (One Lamda)を用いてIgG型もしくはIgM型抗体、Class IあるいはClass II HLA抗体が産生されているかをスクリーニングした。さらに、陽性例においてはLuminex technologyを用いてHLA抗体のプロファイルの解析、抗ドナーHLA抗体の有無などを詳細に解析した。
HLA抗原感作症例からの患者検体を用いて、確立したインビトロ培養系により産生された抗体と血清中の抗体を比較検討した。また、培養上清中のドナーHLA抗体の解析結果と実際の臨床経過、および腎生検の病理組織結果とを比較検討した。
De novo DSA陽性でABMR(-)、移植腎機能が安定した症例群(Group I)と、腎生検によりABMRと診断されているもしくはABMRにより移植腎が廃絶された症例(Group II)との2群に分類し、さらにコントロール群として移植後、血清中からのHLA抗体非産生症例群(Group III)に分類した。これらの症例から回収した末梢血単核球の培養上清をFlow PRAにてIgG型とIgM型それぞれにおいて解析を行った。
Flow PRA screening法にて末梢血単核球培養上清からIgM型HLA抗体が検出された症例においてLABScreenを施行し、結果、de novo DSA陽性、腎機能安定症例においてはIgM型DSAも検出された(図2A)。一方で移植腎拒絶群においてはDSAはIgG型、IgM型として検出された。また培養上清中からのIgG型DSAのMFI値は血清中と比較し、高値であり、IgG型DSAの移植腎への吸着が疑われた(図2B)。
末梢血単核球培養上清からIgM型HLA抗体が検出された症例において、さらに末梢血をCD19陽性B細胞まで分離した。B細胞の培養条件に健常人単核球培養上清を添加した群と非添加群に分けて培養上清をFlow PRA screening法にて解析し、結果を比較検討した。
培養上清中からIgM型HLA抗体のみが検出された10症例において抗原刺激の代わりにAffini Pure F(ab)2 Fragment Goat anti-Human IgM(Jackson Immuno Research)を5μg/mlを培養条件に添加し、7日間培養した。培養上清を回収し、FLOW PRA screening法にて解析した。
健常人から採取した、末梢血単核球(5×105 cells/well)を24-well flat-bottom plates にて培養した。サイトカインは基本培養条件としてIL-21 (50ng/ml)、CpG-ODN (2.5μg/ml)、phorbol myristate acetate (PMA)(2.5μg/ml)、phytohemagglutinin / leucoagglutinin (PHA-L)(15μg/ml)を添加した。さらにIgM BCRを介した抗原抗体反応の賦活化をin vitroで再現するためにAffini Pure F(ab)2 Fragment Goat anti-Human IgM (5.2μg/ml)を添加した条件下においても7日間培養した。その後、培養上清を回収し、ELISAにてIgG/IgM EBV抗体濃度を測定した。基本培養条件下とAffini Pure F(ab) 2 Fragment Goat anti-Human IgM添加条件下における、培養上清中のIgG/IgM EBV抗体濃度を比較検討した。
健常人から採取した末梢血を遠心分離し、血清を分離した。その血清中のIgG/IgM EBV抗体濃度をELISAにて測定し、比較検討を行った。
健常人から採取した、末梢血単核球(5×105 cells/well)を24-well flat-bottom plates にて培養した。サイトカインは基本培養条件としてIL-21(50ng/ml)、CpG-ODN (2.5μg/ml)、phorbol myristate acetate (PMA)(2.5μg/ml)、phytohemagglutinin / leucoagglutinin (PHA-L)(15μg/ml)を添加し、7日間培養した。またPMA, PHA-L非添加条件にても同様に7日間培養を行った。その後、培養上清を回収し、ELISAにてIgG/IgM抗体濃度を測定した。基本培養条件下とPMA, PHA-L非添加条件下における、培養上清中のIgG/IgM抗体濃度を比較検討した。
腎移植症例から採取した、末梢血単核球(5×105 cells/well)を24-well flat-bottom plates にて培養した。サイトカインは基本培養条件としてIL-21 (50ng/ml)、CpG-ODN (2.5μg/ml)、phorbol myristate acetate (PMA)(2.5μg/ml)、phytohemagglutinin / leucoagglutinin (PHA-L)(15μg/ml)を添加し、7日間培養した。その後、培養上清を回収し、5倍に濃縮後、Flow PRA screening法にて解析し、陽性症例においてはさらにsingle antigen beads法にてHLA抗体の特異性、DSAの有無などの評価を行った。
図9において、移植直後に培養上清中からIgM DSAが検出され、その後、8日後に血清からIgG DSAが検出され、9日後にはABMRと診断された。図10において、移植後8日目に採取したPBMC培養上清からIgM DSAが検出され、移植後28日目の血清からIgG DSAが検出された。図11において、移植後67日目に採取したPBMC培養上清からIgM DSAが検出され、移植後133日目の血清からIgG DSAが検出された。
移植前に末梢血単核球を採取し、培養上清からIgG DSAが検出された症例(1次移植にて移植臓器が拒絶)およびIgM DSAが検出された症例において、移植後にも末梢血単核球を採取し、培養上清中のIgG/IgM DSA推移を検討した。
2次移植前に採取した,末梢血単核球(5×105 cells/well)を24-well flat-bottom platesにて培養した。サイトカインは基本培養条件としてIL-21 (50ng/ml)、CpG-ODN (2.5μg/ml)、phorbol myristate acetate (PMA)(2.5μg/ml)、phytohemagglutinin/leucoagglutinin (PHA-L)(15μg/ml)を添加し、7日間培養した。その結果、培養上清中から1次ドナー抗原に対するIgGあるいはIgM抗体が検出された症例において、移植後も末梢血単核球を採取し、同様に培養を行った。また培養上清を解析し、移植前と比べて1次ドナー抗原に対するIgGあるいはIgM抗体の検出量などを比較検討した。移植時にはサイモグロブリン(T細胞除去)、プレドニン、セルセプト、タクロリムスのstandard immunosuppressive agentsの内服を開始した。
Claims (8)
- 臓器移植後の患者において抗体関連型拒絶反応(antibody mediated rejection; 以下、「ABMR」という)の有無をインビトロで検出する方法であって、患者からの末梢血試料を、活性化T細胞からの液性因子および/または炎症性サイトカインの存在下で培養し、培養上清中のIgM型抗ドナーHLA抗体(Donor Specific HLA Antibody;以下、「DSA」という)を検出することを含み、その際、IgM型DSAの検出がABMR発症の早期診断の指標となる前記方法。
- 前記活性化T細胞からの液性因子および/または炎症性サイトカインの存在下での培養を、健常人単核球培養上清を添加することにより行う、請求項1に記載の方法。
- 臓器移植が腎移植である、請求項1または2に記載の方法。
- 患者からの末梢血試料の培養をB細胞に適した培養条件下で行う、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 臓器移植後の患者において抗体関連型拒絶反応(antibody mediated rejection; 以下、「ABMR」という)の有無をインビトロで検出するためのキットであって、患者からの末梢血試料を、活性化T細胞からの液性因子および/または炎症性サイトカインの存在下で培養する手段、及び、培養上清中のIgM型DSAを検出する手段を含み、IgM型DSAの検出がABMRの存在の指標となる前記キット。
- 前記患者からの末梢血試料を、活性化T細胞からの液性因子および/または炎症性サイトカインの存在下での培養する手段が、健常人単核球培養上清を含む、請求項5に記載のキット。
- 臓器移植が腎移植である、請求項5または6に記載のキット。
- 前記患者からの末梢血試料を培養する手段が、前記患者からの末梢血試料をB細胞に適した培養条件下で培養する手段である、請求項5から7のいずれかに記載のキット。
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