JPWO2018034097A1 - 細胞の内包化方法および内包化細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
以下の工程:
有機溶剤に溶解させたアクリロイル化剤を含む溶液と、細胞懸濁液とを混合して、細胞膜の表面にアクリロイル基を導入するアクリロイル化工程;および
(A)アクリロイル化された細胞を含む細胞懸濁液と、(B)水溶性モノマー、架橋剤および重合開始剤を含む溶液とを混合して、細胞膜の表面のアクリロイル基を介して水溶性モノマーと架橋剤を重合させる重合工程
を含むことを特徴としている。
(アクリロイル化工程)
アクリロイル化工程では、有機溶剤に溶解させたアクリロイル化剤を含む溶液と、細胞懸濁液とを混合して、細胞膜の表面にアクリロイル基を導入する。アクリロイル基は、例えば以下の構造式で表される。
重合工程では、(A)アクリロイル化された細胞を含む細胞懸濁液と、(B)水溶性モノマー、架橋剤および重合開始剤を含む溶液とを混合して、細胞膜の表面のアクリロイル基を介して水溶性モノマーと架橋剤を重合させる。
<実施例1>HeLa細胞の内包化
ヒト子宮頸部がん細胞株であるHeLa細胞の細胞膜のアクリロイル化を行った(アクリロイル化工程)。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞であるMSC細胞の細胞膜のアクリロイル化を行った(アクリロイル化工程)。
また、未修飾のMSC細胞と内包化したMSC細胞の活性をWST-1アッセイ法によって定量的に分析した。細胞のリン酸緩衝液の懸濁液200 μL を2×104 cells/wellの密度で96穴プレートに播種した。次に、WST-1試薬 20 μLを各々のウェルに添加した。37℃で3時間インキュベーションを行った後、440 nm波長での吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。未修飾のMSC細胞の吸光度を100%の生存性とすると、内包化したMSC細胞の生存率は74.7±3.6%と高い細胞活性を示した。
ウシ膝間接軟骨細胞の細胞膜のアクリロイル化を行った(アクリロイル化工程)。
軟骨細胞膜のアクリロイル化を行うため、2 mgのN-アクリルオキシスクシンイミドを100 μLのジメチルスルホキシドに溶解させ、その後、4 mLのリン酸緩衝液(0.01 M、pH 7.4)と混合した。軟骨細胞を無血清培地に懸濁した懸濁液(1×106 cells/mL )1 mLを上記混合物に添加し、4〜8℃で振とうしながら2時間反応し、軟骨細胞の表面をアクリロイル化した。その後、アクリロイル化した軟骨細胞を4℃、1100 rpm、5分間の遠心分離によって回収、リン酸緩衝液で懸濁して再度4℃、1100 rpm、5分間の遠心分離によって回収した(これは余分の未反応のN-アクリルオキシスクシンイミドとジメチルスルホキシドを除去するための洗浄工程である)。その後、回収したアクリロイル化した軟骨細胞を無血清培地1 mLに再懸濁させた。
Claims (9)
- 単一細胞の細胞膜を高分子層で被覆して内包化する方法であって、
以下の工程:
有機溶剤に溶解させたアクリロイル化剤を含む溶液と、細胞懸濁液とを混合して、細胞膜の表面にアクリロイル基を導入するアクリロイル化工程;および
(A)アクリロイル化された細胞を含む細胞懸濁液と、(B)水溶性モノマー、架橋剤および重合開始剤を含む溶液とを混合して、細胞膜の表面のアクリロイル基を介して水溶性モノマーと架橋剤を重合させる重合工程
を含むことを特徴とする細胞の内包化方法。 - 前記アクリロイル化剤は、N-アクリルオキシスクシンイミドであることを特徴とする請求項1の細胞の内包化方法。
- 前記有機溶剤は、ジメチルスルホキシドであることを特徴とする請求項1または2の細胞の内包化方法。
- 前記架橋剤は、グリセロールジメタクリル酸塩、または、N′, N′-メチレンビスアクリルアミドであることを特徴とする請求項1から3のいずれかの細胞の内包化方法。
- 前記重合開始剤は、過硫酸アンモニウムとN, N, N′, N′-テトラメチルエチレンジアミンを含む混合液、または、過硫酸カリウムとN, N, N′, N′-テトラメチルエチレンジアミンとを含む混合液であることを特徴とする請求項1から4のいずれかの細胞の内包化方法。
- 細胞が、動物細胞であることを特徴とする請求項1から5のいずれかの細胞の内包化方法。
- 単一細胞の細胞膜のアミノ基に結合したアクリロイル基を介して、細胞膜の表面に、水溶性モノマーと架橋剤を含む架橋ネットワーク構造を有する高分子層が形成されていることを特徴とする内包化細胞。
- 前記架橋剤は、グリセロールジメタクリル酸塩、または、N′, N′-メチレンビスアクリルアミドであることを特徴とする請求項7の内包化細胞。
- 細胞が、動物細胞であることを特徴とする請求項7または8の内包化細胞。
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