JPWO2017213092A1 - トランスフェクション促進用ペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、従来のトランスフェクション促進用ペプチドと同等又はそれ以上の核酸導入効率でトランスフェクションを促進し、且つ汎用性の高いトランスフェクション促進用ペプチドの提供を課題とする。本発明は、「（ａ）細胞のトランスフェクション促進用ペプチド」「（ｂ）（ａ）に記載のペプチド及びカチオン性脂質を含むトランスフェクション薬剤を含む、細胞のトランスフェクション用キット」「（ｃ）（ａ）に記載のペプチド及びトランスフェクション薬剤の存在下、インビトロで細胞と核酸とを接触させる工程を包含する、細胞に核酸をトランスフェクションする方法」に関する。
Description
本発明は、トランスフェクション促進用ペプチド、当該ペプチドを含むトランスフェクション用キット、及び細胞に核酸をトランスフェクションする方法に関する。
細胞にプラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の核酸を導入する遺伝子導入実験（トランスフェクション）は、汎用的な実験手法として遺伝子組換えの分野において広く用いられている。具体的な方法としては、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が知られているが、専用機器を必要とせずに高い導入効率をもつリポフェクション法が最も広く用いられている。
リポフェクション法は、カチオニックな電荷を有する脂質（トランスフェクション薬剤）と核酸のもつマイナス荷電との電気的相互作用により脂質と核酸の複合体を形成し、細胞の持つ貪食作用や細胞膜融合等のエンドサイトーシスを利用して当該複合体を細胞内に導くことで、核酸を細胞内に導入する方法である。
リポフェクション法は、核酸や細胞等の種類により、核酸導入効率が低くなる場合がある。その為、リポフェクション法における核酸導入効率の向上を目的として、各種トランスフェクション促進用ペプチド（以下、エンハンサーペプチドと略記する場合がある）が開発されてきた（特許文献１、２）。
トランスフェクション促進用ペプチドとしては、例えば、スペルミン（Ｓｐ）に核移行シグナル（ＮＬＳ）をタンデムに結合させたペプチドＳｐ−ＮＬＳＮＬＳ（特許文献１）等が知られている。一般に、ＮＬＳはタンパク質を核膜孔から核内へ移行させる働きがある配列として知られており、トランスフェクション促進用ペプチドにおいても、導入した核酸を核内に運ぶ働きが、核酸導入効率の向上に寄与していると考えられている。
しかし、ｍＲＮＡを細胞にトランスフェクションする場合、ＮＬＳがｍＲＮＡを核内に運ぶため、Ｓｐ−ＮＬＳＮＬＳ等のＮＬＳを有するトランスフェクション促進用ペプチドを用いることはできなかった。その為、ｍＲＮＡ等導入する核酸の種類にかかわらずトランスフェクションを促進することができる、汎用性の高いトランスフェクション促進用ペプチドの開発が望まれている。
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、従来のトランスフェクション促進用ペプチドと同等又はそれ以上の核酸導入効率でトランスフェクションを促進し、且つ汎用性の高いトランスフェクション促進用ペプチドの提供を課題とする。
本発明者らは、上記した如き状況に鑑み鋭意研究した結果、ＮＬＳを有さない特定の配列からなるペプチド（本発明のエンハンサーペプチドと略記する場合がある）が、導入する核酸の種類にかかわらずトランスフェクションを促進することを見出した。
ＮＬＳを有していないにもかかわらず、導入した核酸を核内に運ぶ働きを有する従来のＮＬＳを有するトランスフェクション促進用ペプチドと同等又はそれ以上の導入効率で、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドがＤＮＡ等の核酸の細胞へのトランスフェクションを促進し得ることは意外なことであった。
ＮＬＳを有していないにもかかわらず、導入した核酸を核内に運ぶ働きを有する従来のＮＬＳを有するトランスフェクション促進用ペプチドと同等又はそれ以上の導入効率で、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドがＤＮＡ等の核酸の細胞へのトランスフェクションを促進し得ることは意外なことであった。
さらに、核移行シグナルを有する従来のトランスフェクション促進用ペプチドは、核酸を導入する細胞の種類によりトランスフェクションを促進しない（促進できない）場合があるが、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドは、核酸を導入する細胞の種類にかかわらずトランスフェクションを促進できることを見出した。
また、本発明者らは、トランスフェクション薬剤が細胞毒性を有しており、トランスフェクションを行った細胞の生存率を低下させていることを発見した。しかし、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを用いてトランスフェクションを行うと、細胞の生存率の低下を抑制できること、すなわち、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドがトランスフェクション薬剤の細胞毒性を抑制できることも見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の構成よりなる。
＜１＞下記一般式［１］又は［２］で示される、細胞のトランスフェクション促進用ペプチド。
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２ ［１］
Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２−（Ｘ１）ｎ ［２］
（式中、ｎ個のＸ１はそれぞれ独立してアルギニン又はリシンを表し、Ｘ２はグリシン又はアラニン、Ｘ３はチロシン又はアラニンをそれぞれ表し、ｎは８〜１７の整数を表す）
＜２＞前記ペプチドが、下記一般式［１’］、［１’’］、［２’］又は［２’’］で示されるものである、＜１＞に記載のペプチド。
（Ｘ１）ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ ［１’］
（Ｘ１）ｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ ［１’’］
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−（Ｘ１）ｎ ［２’］
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−（Ｘ１）ｎ ［２’’］
（式中、Ｘ１、ｎは上記に同じ）
＜３＞前記ペプチドが、一般式［１’］又は［２’］で示されるものである、＜２＞に記載のペプチド。
＜４＞前記一般式［１’］又は一般式［２’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ、（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍ、及び（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）ｍ（ｎは前記に同じ、ｍは４〜８の整数を表す）から選ばれるものである、＜３＞に記載のペプチド。
＜５＞前記一般式［１’］又は一般式［２’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ又は（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍ（ｎ及びｍは前記に同じ）である、＜４＞に記載のペプチド。
＜６＞ｎが９〜１６の整数、ｍが６である、＜４＞又は＜５＞に記載のペプチド。
＜７＞前記ペプチドが、一般式［１’’］又は［２’’］で示されるものである、＜２＞に記載のペプチド。
＜８＞前記一般式［１’’］又は一般式［２’’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ、（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍ、及び（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）ｍ（ｎ、ｍは前記に同じ）から選ばれるものである、＜７＞に記載のペプチド。
＜９＞前記一般式［１’’］又は一般式［２’’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ（ｎは前記に同じ）である、＜８＞に記載のペプチド。
＜１０＞ｎが９〜１６の整数、ｍが６である、＜８＞又は＜９＞に記載のペプチド。
＜１１＞＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載のペプチド及びカチオン性脂質を含むトランスフェクション薬剤を含む、細胞のトランスフェクション用キット（本発明のトランスフェクション用キット）。
＜１２＞前記トランスフェクション薬剤が、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミドを含むものである、＜１１＞に記載の細胞のトランスフェクション用キット。
＜１３＞＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載のペプチド及びトランスフェクション薬剤の存在下、インビトロで細胞と核酸とを接触させる工程を包含する、細胞に核酸をトランスフェクションする方法（本発明のトランスフェクション方法）。
＜１４＞前記トランスフェクション薬剤が、カチオン性脂質を含むものである、＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞前記トランスフェクション薬剤が、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミドを含むものである、＜１３＞に記載の方法。
＜１６＞前記核酸がＲＮＡである、＜１３＞〜＜１５＞に記載の方法。
＜１＞下記一般式［１］又は［２］で示される、細胞のトランスフェクション促進用ペプチド。
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２ ［１］
Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２−（Ｘ１）ｎ ［２］
（式中、ｎ個のＸ１はそれぞれ独立してアルギニン又はリシンを表し、Ｘ２はグリシン又はアラニン、Ｘ３はチロシン又はアラニンをそれぞれ表し、ｎは８〜１７の整数を表す）
＜２＞前記ペプチドが、下記一般式［１’］、［１’’］、［２’］又は［２’’］で示されるものである、＜１＞に記載のペプチド。
（Ｘ１）ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ ［１’］
（Ｘ１）ｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ ［１’’］
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−（Ｘ１）ｎ ［２’］
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−（Ｘ１）ｎ ［２’’］
（式中、Ｘ１、ｎは上記に同じ）
＜３＞前記ペプチドが、一般式［１’］又は［２’］で示されるものである、＜２＞に記載のペプチド。
＜４＞前記一般式［１’］又は一般式［２’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ、（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍ、及び（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）ｍ（ｎは前記に同じ、ｍは４〜８の整数を表す）から選ばれるものである、＜３＞に記載のペプチド。
＜５＞前記一般式［１’］又は一般式［２’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ又は（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍ（ｎ及びｍは前記に同じ）である、＜４＞に記載のペプチド。
＜６＞ｎが９〜１６の整数、ｍが６である、＜４＞又は＜５＞に記載のペプチド。
＜７＞前記ペプチドが、一般式［１’’］又は［２’’］で示されるものである、＜２＞に記載のペプチド。
＜８＞前記一般式［１’’］又は一般式［２’’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ、（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍ、及び（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）ｍ（ｎ、ｍは前記に同じ）から選ばれるものである、＜７＞に記載のペプチド。
＜９＞前記一般式［１’’］又は一般式［２’’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ（ｎは前記に同じ）である、＜８＞に記載のペプチド。
＜１０＞ｎが９〜１６の整数、ｍが６である、＜８＞又は＜９＞に記載のペプチド。
＜１１＞＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載のペプチド及びカチオン性脂質を含むトランスフェクション薬剤を含む、細胞のトランスフェクション用キット（本発明のトランスフェクション用キット）。
＜１２＞前記トランスフェクション薬剤が、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミドを含むものである、＜１１＞に記載の細胞のトランスフェクション用キット。
＜１３＞＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載のペプチド及びトランスフェクション薬剤の存在下、インビトロで細胞と核酸とを接触させる工程を包含する、細胞に核酸をトランスフェクションする方法（本発明のトランスフェクション方法）。
＜１４＞前記トランスフェクション薬剤が、カチオン性脂質を含むものである、＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞前記トランスフェクション薬剤が、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミドを含むものである、＜１３＞に記載の方法。
＜１６＞前記核酸がＲＮＡである、＜１３＞〜＜１５＞に記載の方法。
本発明によれば、導入する核酸の種類にかかわらず、トランスフェクションを促進することができる。さらに、本発明によれば、導入する細胞の種類にかかわらず、従来のトランスフェクション促進用ペプチドを用いた場合と同等又はそれ以上の核酸導入効率でトランスフェクションを促進することができる。すなわち、本発明は、非常に汎用性の高いトランスフェクション方法、及びトランスフェクション促進用ペプチドに関する。また、本発明のトランスフェクション法によれば、トランスフェクション薬剤の細胞毒性を抑制し、高い細胞生存率でトランスフェクションを行うこともできる。
本発明のトランスフェクション促進用ペプチド（以下、本発明のエンハンサーペプチドと略記する場合がある）は、下記一般式［１］又は［２］で示されるペプチドである。
本発明のトランスフェクション促進用ペプチドは、Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２で示されるコア配列と（Ｘ１）ｎで示される付加配列を有するポリペプチドである。
付加配列（Ｘ１）ｎは、コア配列Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２のＮ末端側又はＣ末端側の何れか一方に付加されている（結合している）。即ち、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドは、下記一般式［１］又は下記一般式［２］で示されるポリペプチドである。
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２ ［１］
Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２−（Ｘ１）ｎ ［２］
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びｎは上記に同じ）
付加配列（Ｘ１）ｎは、コア配列Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２のＮ末端側又はＣ末端側の何れか一方に付加されている（結合している）。即ち、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドは、下記一般式［１］又は下記一般式［２］で示されるポリペプチドである。
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２ ［１］
Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２−（Ｘ１）ｎ ［２］
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びｎは上記に同じ）
上記一般式［１］及び上記一般式［２］のＸ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２で示されるコア配列におけるＸ２は、グリシン又はアラニンを表し、コア配列中の４個のＸ２は同一でも異なっていてもよいが、同一であるのが好ましい。また、Ｘ３は、チロシン又はアラニンである。
従って、上記一般式［１］及び一般式［２］のＸ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２で示されるコア配列は、以下のように示すことができる。
従って、上記一般式［１］及び一般式［２］のＸ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２で示されるコア配列は、以下のように示すことができる。
Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２で示されるコア配列の好ましい具体例としては、例えば下表の１〜４の配列が挙げられる。中でも１及び４の配列が好ましく、１の配列が特に好ましい。
上記一般式［１］及び上記一般式［２］の（Ｘ１）ｎで示される付加配列におけるＸ１は、アルギニン又はリシンを表し、ｎ個のＸ１は同一でも異なっていてもよい。即ち、ｎ個のＸ１は、ｎ個のアルギニンのみから構成されるポリペプチド、ｎ個のリシンのみから構成されるポリペプチド、又は、アルギニンとリシンの２種類のペプチドから構成され当該ペプチドの総和がｎ個のポリペプチドを意味する。
（Ｘ１）ｎで示される付加配列は、より具体的には、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ、（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍ、（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）ｍ、［（Ａｒｇ）ｐ（Ｌｙｓ）ｑ］、［（Ｌｙｓ）ｑ（Ａｒｇ）ｐ］等が挙げられる（式中、ｎは８〜１７の整数を表し、ｍは４〜８の整数をそれぞれ表す。また、ｐは１〜１６の整数であり、ｑは１〜１６の整数であり、且つｐ＋ｑは８〜１７の整数を表す）。これらの中でも、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ、（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍ及び（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）ｍが好ましく、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ及び（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍがより好ましく、（Ａｒｇ）ｎ及び（Ｌｙｓ）ｎが特に好ましい。
上記一般式［１］及び上記一般式［２］におけるｎとしては、９〜１６の整数が好ましい。また、ｍは６が特に好ましい。また、ｐ＋ｑは９〜１６の整数が好ましく、中でもｐが８〜１０の整数、ｑが１〜６の整数が好ましい。
上記一般式［１］又は上記一般式［２］で示される本発明のトランスフェクション促進用ペプチドの好ましい具体例としては、例えば下記一般式［１’］、下記一般式［１’’］、下記一般式［２’］及び下記一般式［２’’］で示されるポリペプチドが挙げられ、下記一般式［１’］及び下記一般式［２’］で示されるものがより好ましく、下記一般式［１’］で示されるものが特に好ましい。
（Ｘ１）ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ ［１’］
（式中、Ｘ１、ｎは上記に同じ）
（式中、Ｘ１、ｎは上記に同じ）
（Ｘ１）ｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ ［１’’］
（式中、Ｘ１、ｎは上記に同じ）
（式中、Ｘ１、ｎは上記に同じ）
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−（Ｘ１）ｎ ［２’］
（式中、Ｘ１、ｎは上記に同じ）
（式中、Ｘ１、ｎは上記に同じ）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−（Ｘ１）ｎ ［２’’］
（式中、Ｘ１、ｎは上記に同じ）
（式中、Ｘ１、ｎは上記に同じ）
下記一般式［１’］としては、例えば、下記［１’−ａ］〜［１’−ｌ］のポリペプチドが挙げられ、［１’−ａ］〜［１’−ｈ］、［１’−ｊ］及び［１’−ｌ］が好ましく、［１’−ｃ］〜［１’−ｈ］及び［１’−ｌ］がより好ましく、［１’−ｅ］〜［１’−ｈ］及び［１’−ｌ］が特に好ましい。
上記一般式［２’］としては、例えば、下記［２’−ａ］〜［２’−ｈ］のポリペプチドが挙げられ、［２’−ａ］〜［２’−ｅ］、［２’−ｇ］及び［２’−ｈ］が好ましく、［２’−ｃ］〜［２’−ｅ］がより好ましく、［２’−ｅ］が特に好ましい。
上記一般式［１’’］としては、例えば、下記［１’’−ａ］〜［１’’−ｆ］のポリペプチドが挙げられ、［１’’−ａ］、［１’’−ｃ］及び［１’’−ｄ］が好ましく、［１’’−ｃ］及び［１’’−ｄ］がより好ましく、［１’’−ｄ］が特に好ましい。
上記一般式［２’’］としては、例えば、下記［２’’−ａ］〜［２’’−ｅ］のポリペプチドが挙げられ、［２’’−ａ］及び［２’’−ｃ］が好ましく、［２’’−ｃ］がより好ましい。
本発明のトランスフェクション促進用ペプチドとしては、上記具体例の中でも、例えば一般式［１’］、一般式［１’’］、一般式［２’］及び一般式［２’’］が好ましく、一般式［１’］及び一般式［２’］がより好ましく、［１’−ａ］〜［１’−ｈ］、［１’−ｊ］、［１’−ｌ］、［２’−ａ］〜［２’−ｅ］、［２’−ｇ］及び［２’−ｈ］が更に好ましく、［１’−ｃ］〜［１’−ｈ］、［１’−ｌ］及び［２’−ｃ］〜［２’−ｅ］が更により好ましく、［１’−ｅ］〜［１’−ｈ］、［１’−ｌ］及び［２’−ｅ］が特に好ましく、［１’−ｆ］が最も好ましい。
本発明のトランスフェクション促進用ペプチドは、自体公知のペプチド合成法に準じて合成すればよく、このような合成法としては、例えば特許３５６９９６６号に記載の方法が挙げられる。
本発明のトランスフェクション方法は、細胞に核酸をリポフェクション法によりトランスフェクションする際に、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを共存させて行う以外は、自体公知のリポフェクション法に於いて用いられるトランスフェクション薬剤等の各種試薬を用い、自体公知の操作に準じて行えばよい。
具体的には、例えば、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド及び本発明に係るトランスフェクション薬剤の存在下、インビトロで細胞と核酸とを接触させればよい。
本発明に係るトランスフェクション薬剤としては、通常この分野で用いられるトランスフェクション薬剤であれば何れでもよく、カチオン性脂質を含むものが挙げられ、カチオン性脂質と中性脂質を含むものが好ましい。
上記カチオン性脂質としては、１価カチオン性脂質でも多価カチオン性脂質でもよく、その具体例としては、例えばＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）等の１価カチオン性脂質、リポスペルミン、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ）トリフルオロ酢酸）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）−プロピルアミド）、ジおよびテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミン、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、ＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミド等の多価カチオン性脂質が挙げられ、多価カチオン性脂質が好ましく、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミドが特に好ましい。
上記中性脂質の具体例としては、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、コレステロール等が挙げられ、ＤＯＰＥが好ましい。
カチオン性脂質と中性脂質を含むものとしては、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ ｍＲＮＡ（和光純薬工業（株）製）等が挙げられ、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ ｍＲＮＡ（和光純薬工業（株）製）が好ましい。
本発明に係るトランスフェクション薬剤は、中でもＮ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミドとＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を含むＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔシリーズ（ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ ｍＲＮＡ（和光純薬工業（株）製）等）がより好ましい。
上記カチオン性脂質としては、１価カチオン性脂質でも多価カチオン性脂質でもよく、その具体例としては、例えばＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）等の１価カチオン性脂質、リポスペルミン、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ）トリフルオロ酢酸）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）−プロピルアミド）、ジおよびテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミン、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、ＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミド等の多価カチオン性脂質が挙げられ、多価カチオン性脂質が好ましく、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミドが特に好ましい。
上記中性脂質の具体例としては、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、コレステロール等が挙げられ、ＤＯＰＥが好ましい。
カチオン性脂質と中性脂質を含むものとしては、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ ｍＲＮＡ（和光純薬工業（株）製）等が挙げられ、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ ｍＲＮＡ（和光純薬工業（株）製）が好ましい。
本発明に係るトランスフェクション薬剤は、中でもＮ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミドとＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を含むＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔシリーズ（ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ Ａ（和光純薬工業（株）製）、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭ ｍＲＮＡ（和光純薬工業（株）製）等）がより好ましい。
本発明に係る細胞としては、通常、真核生物細胞が挙げられ、高等真核生物細胞が好ましく、ＨｅＬａ細胞、２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ａ５４９細胞、ＣＯＳ７細胞、ＭＣＦ７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＨｕＨ−７細胞、ＨＣＴ−１１６＃２Ｌｕｃ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、Ｕ２ＯＳ細胞等の接着細胞、Ｋ５６２細胞等の浮遊系細胞、幹細胞、マクロファージ、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７等の血球系細胞、ミクログリア（Ｈｏｒｔｅｇａ細胞）等のグリア細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、ＳＦ＋細胞、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞、ＢｍＮ４細胞等の昆虫細胞がより好ましく、接着細胞及び浮遊系細胞が特に好ましい。本発明に係る細胞は、プライマリー（初代培養）細胞であっても、継代した細胞であってもよい。
本発明に係る核酸としては、ゲノムＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｉｓＲＮＡ（免疫賦活性ＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等のＲＮＡが挙げられ、ｍＲＮＡが好ましい。本発明に係る核酸は、任意の生物に由来するもの、人工的にデザインしたもののいずれであってもよい。本発明に係る核酸の塩基数は、通常１０塩基〜３００００塩基、好ましくは５０塩基〜２００００塩基、より好ましくは１００塩基〜１００００塩基である。本発明に係る核酸を構成する塩基は、天然の塩基であっても、人工塩基であってもいずれであってもよく、天然の塩基が好ましい。本発明に係る核酸には、細胞中において治療用タンパク質や有用なタンパク質をコードして発現し得る核酸、細胞中において核酸の所望ではない発現を阻害する核酸、所望ではないタンパク質活性を阻害するか又は所望のタンパク質機能を活性化する核酸、反応を触媒する核酸（リボザイム）、及び診断アッセイにおいて機能する核酸（例えば、診断用核酸）が含まれる。
本発明に係る核酸の使用量は、特に限定されないが、例えば、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド及びトランスフェクション薬剤の存在下で細胞と核酸とを接触させる際の使用量、言い換えれば、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、本発明に係るトランスフェクション薬剤、細胞及び核酸を含む溶液中の使用量としては、通常０．０００１μｇ〜１００００ｍｇ、好ましくは０．００１μｇ〜５０００ｍｇであり、例えばプレートを用いる場合、ウェルの面積１ｃｍ２あたり、通常０．００５μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．００７５μｇ〜２５０μｇ、より好ましくは０．０１μｇ〜７５μｇ、特に好ましくは０．１μｇ〜１０μｇであり、例えばフラスコで用いる場合、培地１ｍＬあたり、通常０．００５μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．００７５μｇ〜２５０μｇ、より好ましくは０．０１μｇ〜７５μｇ、特に好ましくは０．１μｇ〜１０μｇである。
本発明のトランスフェクション促進用ペプチドの使用量は特に限定されないが、例えば、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、本発明に係るトランスフェクション薬剤、細胞及び核酸を含む溶液中の使用量としては、本発明に係る核酸１μｇ当たり、通常４μｇ〜２０μｇ、好ましくは５μｇ〜１５μｇ、より好ましくは８μｇ〜１２μｇ、特に好ましくは９μｇ〜１１μｇである。
本発明のトランスフェクション薬剤の使用量は、特に限定されないが、例えば、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、本発明に係るトランスフェクション薬剤、細胞及び核酸を含む溶液中の使用量としては、通常０．０４μｇ〜２４００００μｇ、好ましくは０．０６μｇ〜１２００００μｇであり、例えばプレートを用いる場合、ウェルの面積１ｃｍ２あたり、通常０．０５μｇ〜１０μｇ、好ましくは０．１μｇ〜７．５μｇ、より好ましくは０．２５μｇ〜３μｇであり、例えばフラスコを用いる場合、培地１ｍＬあたり、通常０．０５μｇ〜２４０００μｇ、好ましくは０．１μｇ〜１２０００μｇ、より好ましくは０．２５μｇ〜２４００μｇである。
本発明のトランスフェクション方法は、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド及び本発明に係るトランスフェクション薬剤の存在下、インビトロで細胞と核酸とを接触させればよく、特に限定されない。
このような方法としては、例えば、（工程１）核酸と本発明のトランスフェクション促進用ペプチドと本発明に係るトランスフェクション薬剤とを溶液中で混合してトランスフェクション溶液を調製し、（工程２）当該トランスフェクション溶液を、細胞を含む培地と混合して、細胞と核酸とを接触させてトランスフェクションを行う方法等が挙げられる。
このような方法としては、例えば、（工程１）核酸と本発明のトランスフェクション促進用ペプチドと本発明に係るトランスフェクション薬剤とを溶液中で混合してトランスフェクション溶液を調製し、（工程２）当該トランスフェクション溶液を、細胞を含む培地と混合して、細胞と核酸とを接触させてトランスフェクションを行う方法等が挙げられる。
工程１としては、例えば（工程１−ａ）核酸と本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを含有する溶液と、本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有する溶液とを混合させる方法、（工程１−ｂ）核酸と本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有する溶液と、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを含有する溶液とを混合させる方法、（工程１−ｃ）核酸を含有する溶液と、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドと本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有する溶液とを混合させる方法、（工程１−ｄ）核酸を含有する溶液と、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを含有する溶液と、本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有する溶液とを混合させる方法等が挙げられる。
工程１の核酸、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、及び／又は本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液（核酸と本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを含有させる溶液、本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液、核酸と本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを含有させる溶液、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドと本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液、核酸を含有させる溶液（溶媒）等）としては、例えば精製水、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＥ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）が挙げられ、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液が好ましく、ＴＥ緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液が特に好ましい。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常１ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは５〜３００ｍＭの範囲から適宜選択される。また、この溶液中には、核酸、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、本発明に係るトランスフェクション薬剤等に凝集等の悪影響を及ぼさない量であれば、例えば糖類、ＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていても良い。
要すれば、核酸と本発明のトランスフェクション促進用ペプチドと本発明に係るトランスフェクション薬剤とを溶液中で混合後、通常１５℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２８℃、より好ましくは２０℃〜２６℃で通常１分〜６０分、好ましくは３分〜４０分、より好ましくは５分〜２０分反応させる。
なお、工程１の核酸、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド及び／又は本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液（核酸と本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを含有させる溶液、本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液、核酸と本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを含有させる溶液、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドと本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液、核酸を含有させる溶液（溶媒）等）中に含有させる核酸の量、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドの量及び本発明に係るトランスフェクション薬剤の量は、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド及びトランスフェクション薬剤の存在下で細胞と核酸とを接触させる際の使用量、言い換えれば、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、トランスフェクション薬剤、細胞及び核酸を含む溶液中の使用量が前述した範囲となるように適宜選択して、核酸、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド及び／又は本発明に係るトランスフェション薬剤を含有させる溶液中に含有させればよい。
なお、工程１の核酸、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド及び／又は本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液（核酸と本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを含有させる溶液、本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液、核酸と本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを含有させる溶液、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドと本発明に係るトランスフェクション薬剤を含有させる溶液、核酸を含有させる溶液（溶媒）等）中に含有させる核酸の量、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドの量及び本発明に係るトランスフェクション薬剤の量は、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド及びトランスフェクション薬剤の存在下で細胞と核酸とを接触させる際の使用量、言い換えれば、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、トランスフェクション薬剤、細胞及び核酸を含む溶液中の使用量が前述した範囲となるように適宜選択して、核酸、本発明のトランスフェクション促進用ペプチド及び／又は本発明に係るトランスフェション薬剤を含有させる溶液中に含有させればよい。
工程１は、具体的には例えば以下の方法（上記工程１−ａ）により行えばよい。
［２４ウェルプレートの１ウェル（２ｃｍ２）を用いて本発明の方法（工程２）を行う場合］
まず、滅菌チューブに、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＥ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）４０μＬ、通常、０．０１μｇ〜１０００μｇ、好ましくは０．０１５μｇ〜５００μｇ、より好ましくは０．０２μｇ〜１５０μｇ、特に好ましくは０．２μｇ〜２０μｇの本発明に係る核酸、及び、通常０．０４μｇ〜２００００μｇ、好ましくは０．０７５μｇ〜７５００μｇ、より好ましくは０．１６μｇ〜１８００μｇ、特に好ましくは１μｇ〜２００μｇの本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを添加する。
次に、異なる滅菌チューブに、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＥ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）４０μＬ、及び通常０．１μｇ〜２０μｇ、好ましくは０．２μｇ〜１５μｇ、より好ましくは０．５μｇ〜６μｇの本発明に係るトランスフェクション薬剤を添加する。
次いで、上記の２本の滅菌チューブ中の溶液を混合して、要すれば通常１５℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２８℃、より好ましくは２０℃〜２６℃で通常１分〜６０分、好ましくは３分〜４０分、より好ましくは５分〜２０分反応させ、トランスフェクション溶液８０μＬを得る。
［２４ウェルプレートの１ウェル（２ｃｍ２）を用いて本発明の方法（工程２）を行う場合］
まず、滅菌チューブに、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＥ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）４０μＬ、通常、０．０１μｇ〜１０００μｇ、好ましくは０．０１５μｇ〜５００μｇ、より好ましくは０．０２μｇ〜１５０μｇ、特に好ましくは０．２μｇ〜２０μｇの本発明に係る核酸、及び、通常０．０４μｇ〜２００００μｇ、好ましくは０．０７５μｇ〜７５００μｇ、より好ましくは０．１６μｇ〜１８００μｇ、特に好ましくは１μｇ〜２００μｇの本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを添加する。
次に、異なる滅菌チューブに、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＥ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）４０μＬ、及び通常０．１μｇ〜２０μｇ、好ましくは０．２μｇ〜１５μｇ、より好ましくは０．５μｇ〜６μｇの本発明に係るトランスフェクション薬剤を添加する。
次いで、上記の２本の滅菌チューブ中の溶液を混合して、要すれば通常１５℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２８℃、より好ましくは２０℃〜２６℃で通常１分〜６０分、好ましくは３分〜４０分、より好ましくは５分〜２０分反応させ、トランスフェクション溶液８０μＬを得る。
［培地１ｍＬを含有するフラスコを用いて本発明の方法（工程２）を行う場合］
まず、滅菌チューブに、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＥ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）１００μＬ、通常０．００５μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．００７５μｇ〜２５０μｇ、より好ましくは０．０１μｇ〜７５μｇ、特に好ましくは０．１μｇ〜１０μｇの本発明に係る核酸、及び、通常０．０２μｇ〜１００００μｇ、好ましくは０．０３７５μｇ〜３７５０μｇ、より好ましくは０．０８μｇ〜９００μｇの本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを添加する。
次に、異なる滅菌チューブに、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＥ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）１００μＬ、及び、通常０．０５μｇ〜２４０００μｇ、好ましくは０．１μｇ〜１２０００μｇ、より好ましくは０．２５μｇ〜２４００μｇの本発明に係るトランスフェクション薬剤を添加する。
次いで、上記の２本の滅菌チューブ中の溶液を混合して、通常１５℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２８℃、より好ましくは２０℃〜２６℃で通常１分〜６０分、好ましくは３分〜４０分、より好ましくは５分〜２０分反応させ、トランスフェクション溶液２００μＬを得る。
まず、滅菌チューブに、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＥ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）１００μＬ、通常０．００５μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．００７５μｇ〜２５０μｇ、より好ましくは０．０１μｇ〜７５μｇ、特に好ましくは０．１μｇ〜１０μｇの本発明に係る核酸、及び、通常０．０２μｇ〜１００００μｇ、好ましくは０．０３７５μｇ〜３７５０μｇ、より好ましくは０．０８μｇ〜９００μｇの本発明のトランスフェクション促進用ペプチドを添加する。
次に、異なる滅菌チューブに、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＥ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）１００μＬ、及び、通常０．０５μｇ〜２４０００μｇ、好ましくは０．１μｇ〜１２０００μｇ、より好ましくは０．２５μｇ〜２４００μｇの本発明に係るトランスフェクション薬剤を添加する。
次いで、上記の２本の滅菌チューブ中の溶液を混合して、通常１５℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２８℃、より好ましくは２０℃〜２６℃で通常１分〜６０分、好ましくは３分〜４０分、より好ましくは５分〜２０分反応させ、トランスフェクション溶液２００μＬを得る。
工程２は、工程１により得られたトランスフェクション溶液を、細胞を含む培地と混合して、細胞と核酸とを接触させて細胞のトランスフェクションを行うことによりなされる。
本発明に係る細胞の数（細胞数）としては、通常この分野においてトランスフェクションを行う際に用いられる細胞数であればよく、特に限定されないが、例えば、工程１により得られたトランスフェクション溶液を、細胞を含む培地と混合する際の細胞数、言い換えれば、細胞と核酸とを接触させてトランスフェクションを行う際の細胞数としては、通常１×１０２細胞〜１×１０８細胞、好ましくは１×１０３細胞〜２×１０８細胞であり、プレートやフラスコ等の培地を含有させる容器に応じて適宜選択される。
例えばプレートを用いて工程２を行う場合、ウェルの面積１ｃｍ２あたり、本発明に係る細胞数は、通常０．１×１０５細胞〜５×１０５細胞、好ましくは０．２×１０５細胞〜３×１０５細胞、より好ましくは０．３×１０５細胞〜２×１０５細胞である。
例えばフラスコを用いて工程２を行う場合、本発明に係る細胞数は、培地１ｍＬあたり、通常０．１×１０５細胞〜通常３０×１０５細胞、好ましくは０．５×１０５細胞〜１５×１０５細胞、より好ましくは１×１０５細胞〜１０×１０５細胞である。
例えばプレートを用いて工程２を行う場合、ウェルの面積１ｃｍ２あたり、本発明に係る細胞数は、通常０．１×１０５細胞〜５×１０５細胞、好ましくは０．２×１０５細胞〜３×１０５細胞、より好ましくは０．３×１０５細胞〜２×１０５細胞である。
例えばフラスコを用いて工程２を行う場合、本発明に係る細胞数は、培地１ｍＬあたり、通常０．１×１０５細胞〜通常３０×１０５細胞、好ましくは０．５×１０５細胞〜１５×１０５細胞、より好ましくは１×１０５細胞〜１０×１０５細胞である。
工程２における培地は、通常この分野で用いられるものであれば特に限定されず、細胞毎に適切な培地を選択すればよい。工程２における培地は、トランスフェクションを阻害しないものであれば、例えば、ＦＢＳ等の血清、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｎ２サプリメント（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール等の血清代替物、脂質、アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含んでいてもよく、これらの選択可否はトランスフェクション薬剤に依存する。
また、工程２における培地の量は、通常この分野においてトランスフェクションを行う際に用いられる培地量であればよく、プレートやフラスコ等の培地を含有させる容器に応じて適宜選択される。
また、工程２における培地の量は、通常この分野においてトランスフェクションを行う際に用いられる培地量であればよく、プレートやフラスコ等の培地を含有させる容器に応じて適宜選択される。
例えばプレートを用いて工程２を行う場合、ウェルの面積１ｃｍ２あたり、培地の量は通常１００μＬ〜１０００μＬ、好ましくは１５０μＬ〜８００μＬ、より好ましくは２００μＬ〜６００μＬである。例えばフラスコを用いて工程２を行う場合、培地の量は通常１ｍＬ〜１０００Ｌ、好ましくは２０ｍＬ〜５００Ｌ、より好ましくは３０ｍＬ〜１００Ｌである。
工程２における、工程１により得られたトランスフェクション溶液の使用量は、通常この分野においてトランスフェクションを行う際に用いられるトランスフェクション溶液の量であればよく、通常０．００１ｍＬ〜１０００ｍＬ、好ましくは０．０１ｍＬ〜５００ｍＬ、より好ましくは０．０５ｍＬ〜１００ｍＬであり、プレートやフラスコ等の培地を含有させる容器に応じて適宜選択される。
例えばプレートを用いて工程２を行う場合、トランスフェクション溶液の量はウェルの面積１ｃｍ２あたり、通常１μＬ〜２００μＬ、好ましくは５μＬ〜１８０μＬ、より好ましくは１０μＬ〜１５０μＬである。
例えばフラスコを用いて工程２を行う場合、トランスフェクション溶液の量は、培地１ｍＬあたり、通常１０μＬ〜１０００μＬ、好ましくは５０μＬ〜６００μＬ、より好ましくは１００μＬ〜３００μＬである。
例えばプレートを用いて工程２を行う場合、トランスフェクション溶液の量はウェルの面積１ｃｍ２あたり、通常１μＬ〜２００μＬ、好ましくは５μＬ〜１８０μＬ、より好ましくは１０μＬ〜１５０μＬである。
例えばフラスコを用いて工程２を行う場合、トランスフェクション溶液の量は、培地１ｍＬあたり、通常１０μＬ〜１０００μＬ、好ましくは５０μＬ〜６００μＬ、より好ましくは１００μＬ〜３００μＬである。
工程２におけるトランスフェクションは、核酸が細胞内に導入されることによりなされる。具体的には、工程１により得られたトランスフェクション溶液を培地中の細胞に添加後、通常２５℃〜３９℃、好ましくは３５℃〜３８℃で通常１時間〜２日、好ましくは６時間〜１日培養する方法が挙げられる。
工程２は、具体的には例えば以下の方法により行えばよい。
［２４プレートの１ウェル（２ｃｍ２）を用いて工程２を行う場合］
通常０．２×１０５細胞〜１０×１０５細胞、好ましくは０．４×１０５細胞〜６×１０５細胞、より好ましくは０．６×１０５細胞〜４×１０５細胞を含有する、通常２００μＬ〜２０００μＬ、好ましくは３００μＬ〜１６００μＬ、より好ましくは４００μＬ〜１２００μＬの培地に、通常２μＬ〜４００μＬ、好ましくは１０μＬ〜３６０μＬ、より好ましくは２０μＬ〜３００μＬの工程１で調製したトランスフェクション溶液（通常０．０１μｇ〜１０００μｇ、好ましくは０．０１５μｇ〜５００μｇ、より好ましくは０．０２μｇ〜１５０μｇ、特に好ましくは０．２μｇ〜２０μｇの本発明に係る核酸、通常０．０４μｇ〜２００００μｇ、好ましくは０．０７５μｇ〜７５００μｇ、より好ましくは０．１６μｇ〜１８００μｇ、特に好ましくは１μｇ〜２００μｇの本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、及び、通常０．１μｇ〜２０μｇ、好ましくは０．２μｇ〜１５μｇ、より好ましくは０．５μｇ〜６μｇの本発明に係るトランスフェクション薬剤をｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液中に含有する溶液）を添加し、通常２５℃〜３９℃、好ましくは３５℃〜３８℃で通常１時間〜２日、好ましくは６時間〜１日培養することによりなされる。
［２４プレートの１ウェル（２ｃｍ２）を用いて工程２を行う場合］
通常０．２×１０５細胞〜１０×１０５細胞、好ましくは０．４×１０５細胞〜６×１０５細胞、より好ましくは０．６×１０５細胞〜４×１０５細胞を含有する、通常２００μＬ〜２０００μＬ、好ましくは３００μＬ〜１６００μＬ、より好ましくは４００μＬ〜１２００μＬの培地に、通常２μＬ〜４００μＬ、好ましくは１０μＬ〜３６０μＬ、より好ましくは２０μＬ〜３００μＬの工程１で調製したトランスフェクション溶液（通常０．０１μｇ〜１０００μｇ、好ましくは０．０１５μｇ〜５００μｇ、より好ましくは０．０２μｇ〜１５０μｇ、特に好ましくは０．２μｇ〜２０μｇの本発明に係る核酸、通常０．０４μｇ〜２００００μｇ、好ましくは０．０７５μｇ〜７５００μｇ、より好ましくは０．１６μｇ〜１８００μｇ、特に好ましくは１μｇ〜２００μｇの本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、及び、通常０．１μｇ〜２０μｇ、好ましくは０．２μｇ〜１５μｇ、より好ましくは０．５μｇ〜６μｇの本発明に係るトランスフェクション薬剤をｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液中に含有する溶液）を添加し、通常２５℃〜３９℃、好ましくは３５℃〜３８℃で通常１時間〜２日、好ましくは６時間〜１日培養することによりなされる。
［培地１ｍＬを含有するフラスコを用いて工程２を行う場合］
通常０．１×１０５細胞〜通常３０×１０５細胞、好ましくは０．５×１０５細胞〜１５×１０５細胞、より好ましくは１×１０５細胞〜１０×１０５細胞を含有する、通常１０μＬ〜１０００μＬ、好ましくは５０μＬ〜６００μＬ、より好ましくは１００μＬ〜３００μＬの工程１で調製したトランスフェクション溶液（通常０．００５μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．００７５μｇ〜２５０μｇ、より好ましくは０．０１μｇ〜７５μｇ、特に好ましくは０．１μｇ〜１０μｇの本発明に係る核酸、通常０．０２μｇ〜１００００μｇ、好ましくは０．０３７５μｇ〜３７５０μｇ、より好ましくは０．０８μｇ〜９００μｇの本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、及び、通常０．０５μｇ〜２４０００μｇ、好ましくは０．１μｇ〜１２０００μｇ、より好ましくは０．２５μｇ〜２４００μｇの本発明に係るトランスフェクション薬剤を、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液中に含有する溶液）を添加し、通常２５℃〜３９℃、好ましくは３５℃〜３８℃で通常１時間〜２日、好ましくは６時間〜１日することによりなされる。
通常０．１×１０５細胞〜通常３０×１０５細胞、好ましくは０．５×１０５細胞〜１５×１０５細胞、より好ましくは１×１０５細胞〜１０×１０５細胞を含有する、通常１０μＬ〜１０００μＬ、好ましくは５０μＬ〜６００μＬ、より好ましくは１００μＬ〜３００μＬの工程１で調製したトランスフェクション溶液（通常０．００５μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．００７５μｇ〜２５０μｇ、より好ましくは０．０１μｇ〜７５μｇ、特に好ましくは０．１μｇ〜１０μｇの本発明に係る核酸、通常０．０２μｇ〜１００００μｇ、好ましくは０．０３７５μｇ〜３７５０μｇ、より好ましくは０．０８μｇ〜９００μｇの本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、及び、通常０．０５μｇ〜２４０００μｇ、好ましくは０．１μｇ〜１２０００μｇ、より好ましくは０．２５μｇ〜２４００μｇの本発明に係るトランスフェクション薬剤を、ｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液中に含有する溶液）を添加し、通常２５℃〜３９℃、好ましくは３５℃〜３８℃で通常１時間〜２日、好ましくは６時間〜１日することによりなされる。
本発明のトランスフェクション用キットは、上記の如き本発明のトランスフェクション方法に用いられるもので、本発明のトランスフェクション促進用ペプチドと、本発明に係るトランスフェクション薬剤とを含んでなるものであり、夫々の構成要素の好ましい態様、具体例については上で述べたとおりである。
本発明のトランスフェクション用キットに含まれる本発明のトランスフェクション促進用ペプチドは、凍結乾燥した固体状態であっても、水やｐＨ５〜７に緩衝作用を有する緩衝液（例えばＴＥ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）に含有させた液体状態であってもいずれでもよい。液体状態の場合、その濃度は通常０．５ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである。
また、これらキットには、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類等）、賦活剤、共存物質の影響回避剤、その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したりしないものを有していてもよい。またこれら試薬類等の濃度範囲等も、各々の試薬類が有する効果を発揮するために通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いればよい。
さらにまた、本発明のキットには、本発明のトランスフェクション方法の説明書等を含ませておいても良い。当該「説明書」とは、当該方法における特徴・原理・操作手順、判定手順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取扱説明書、添付文書、あるいはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
以下に実施例、参考例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
以下の実施例及び比較例で用いた（エンハンサー）ペプチドの配列を以下に示す。
Ｃ２：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号２）
ＥＳＦＡ４：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（配列番号３）
Ｃ５：ＧＧＣＧＹＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号５）
Ｃ２＿ＡＡＣＡＡ：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＡＡＣＡＡＡ（配列番号６）
Ｋ１１：ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＧＣＧＹＧ（配列番号７）
Ｒ９：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号８）
Ｒ１６：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号９）
ＲＫ１２：ＲＫＲＫＲＫＲＫＲＫＲＫＧＧＣＧＹＧ（配列番号１０）
Ｃ４：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１１）
Ｃ２＿Ｃ１４Ａ：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＡＧＹＧ（配列番号１２）
Ｃ２＿Ａ６：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＡＡＡＡＡＡ（配列番号１３）
Ｒ３：ＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号１４）
Ｒ６：ＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号１５）
Ｒ１９：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号１６）
Ｒ２２：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号１７）
Ｒ３０：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号１８）
Ｈ１１：ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＣＧＹＧ（配列番号１９）
Ｃ２：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号２）
ＥＳＦＡ４：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（配列番号３）
Ｃ５：ＧＧＣＧＹＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号５）
Ｃ２＿ＡＡＣＡＡ：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＡＡＣＡＡＡ（配列番号６）
Ｋ１１：ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＧＣＧＹＧ（配列番号７）
Ｒ９：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号８）
Ｒ１６：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号９）
ＲＫ１２：ＲＫＲＫＲＫＲＫＲＫＲＫＧＧＣＧＹＧ（配列番号１０）
Ｃ４：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１１）
Ｃ２＿Ｃ１４Ａ：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＡＧＹＧ（配列番号１２）
Ｃ２＿Ａ６：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＡＡＡＡＡＡ（配列番号１３）
Ｒ３：ＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号１４）
Ｒ６：ＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号１５）
Ｒ１９：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号１６）
Ｒ２２：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号１７）
Ｒ３０：ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＧＣＧＹＧ（配列番号１８）
Ｈ１１：ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＣＧＹＧ（配列番号１９）
実施例１．エンハンサーペプチドＣ２のトランスフェクション促進効果の検証
以下の方法により、下記表１に記載の実験条件で、ＣＯＳ７細胞にＹＦＰ−Ｈ２Ｂ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、エンハンサーペプチドであるＣ２のトランスフェクション促進効果について確認した。
以下の方法により、下記表１に記載の実験条件で、ＣＯＳ７細胞にＹＦＰ−Ｈ２Ｂ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、エンハンサーペプチドであるＣ２のトランスフェクション促進効果について確認した。
（１）細胞の調製
ＣＯＳ７細胞をＤ−ＭＥＭ １０％ＦＢＳ培地（和光純薬工業（株）製）を用いて、１×１０５個以上の細胞が得られるまで培養し、培養細胞を得た。
ＣＯＳ７細胞をＤ−ＭＥＭ １０％ＦＢＳ培地（和光純薬工業（株）製）を用いて、１×１０５個以上の細胞が得られるまで培養し、培養細胞を得た。
（２）遺伝子導入
（ｉ）トランスフェクション溶液の調製
まず、配列番号１に記載のＹＦＰ−Ｈ２Ｂ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ（Ｉｎｃｅｌｌａ社製）を、０．５ｍｇ／ｍＬとなるようにＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）で懸濁し、プラスミドＤＮＡ溶液を調製した。
次いで、Ｃ２（（株）東レリサーチにて合成）を、トランスフェクション薬剤であるＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＡ Ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）に付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（以下、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと略記する場合がある）に５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、エンハンサーペプチド溶液を調製した。
（ｉ）トランスフェクション溶液の調製
まず、配列番号１に記載のＹＦＰ−Ｈ２Ｂ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ（Ｉｎｃｅｌｌａ社製）を、０．５ｍｇ／ｍＬとなるようにＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）で懸濁し、プラスミドＤＮＡ溶液を調製した。
次いで、Ｃ２（（株）東レリサーチにて合成）を、トランスフェクション薬剤であるＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＡ Ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）に付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（以下、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと略記する場合がある）に５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、エンハンサーペプチド溶液を調製した。
そして、滅菌したチューブを２本用意し、一本のチューブにＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを２３．５μＬ添加し、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＡ Ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）に付属のＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（以下、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔと略記する場合がある）を１．５μＬ（プラスミドＤＮＡ量１μｇあたりＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ３μＬ）添加した。
もう一本の滅菌済みチューブに、プラスミドＤＮＡ量が０．５μｇになるようプラスミドＤＮＡ溶液１μＬを添加し、更にエンハンサーペプチド溶液を１μＬ（プラスミドＤＮＡ量１μｇあたりエンハンサーペプチド溶液２μＬ）添加し、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加して、最終２５μＬになるように調製した。
次いで、上記の２本のチューブを混合して室温で１５分反応させ、トランスフェクション溶液を得た。
次いで、上記の２本のチューブを混合して室温で１５分反応させ、トランスフェクション溶液を得た。
（ｉｉ）細胞懸濁液の調製
（１）で得られた培養細胞を用いて、以下の通り細胞懸濁液を調製した。
培養容器から培地を除き、トリプシンＥＤＴＡ溶液［０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）］を培養容器に添加して細胞を培養容器から剥離し、懸濁液を得た。遠沈管に当該懸濁液を添加後、遠心分離処理を行い（１０００ｒｐｍ，５分）、細胞を沈降させた。上清を除いた後、細胞ペレットに適当量培地を加え、細胞懸濁液を得た。当該細胞懸濁液中の接着細胞の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定し、細胞懸濁液中の細胞の濃度を算出した。
（１）で得られた培養細胞を用いて、以下の通り細胞懸濁液を調製した。
培養容器から培地を除き、トリプシンＥＤＴＡ溶液［０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）］を培養容器に添加して細胞を培養容器から剥離し、懸濁液を得た。遠沈管に当該懸濁液を添加後、遠心分離処理を行い（１０００ｒｐｍ，５分）、細胞を沈降させた。上清を除いた後、細胞ペレットに適当量培地を加え、細胞懸濁液を得た。当該細胞懸濁液中の接着細胞の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定し、細胞懸濁液中の細胞の濃度を算出した。
（ｉｉｉ）トランスフェクション
まず、２４ウェルプレートの１つのウェルに以下のものをそれぞれ添加した。
・Ｄ−ＭＥＭ培地（和光純薬工業（株）製）４５０μＬ
・１×１０５個の細胞が存在する量の（ｉｉ）で調製した細胞懸濁液
次いで、（ｉ）で調製したトランスフェクション溶液を５０μＬ滴下し、ゆっくりと攪拌混合後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩細胞を培養した。
まず、２４ウェルプレートの１つのウェルに以下のものをそれぞれ添加した。
・Ｄ−ＭＥＭ培地（和光純薬工業（株）製）４５０μＬ
・１×１０５個の細胞が存在する量の（ｉｉ）で調製した細胞懸濁液
次いで、（ｉ）で調製したトランスフェクション溶液を５０μＬ滴下し、ゆっくりと攪拌混合後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩細胞を培養した。
（３）蛍光顕微鏡観察
（２）（ｉｉｉ）で一晩培養した細胞中のＹＦＰ−Ｈ２Ｂ（ＹＦＰ−ｈｕｍａｎ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ｂ）の蛍光強度（発現強度）を、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ ｏｂｓｅｖｅｒ Ｚ１、ＺＥＩＳＳ社製）により観察した。その結果を、図１のＳＦＡ Ｐｌｕｓ＋Ｃ２に示す。図中、ＹＦＰは導入したプラスミドＤＮＡの発現レベルをＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光により測定した結果を表し、ＤＩＣ（微分干渉顕微鏡像）は細胞の状態を表す。
（２）（ｉｉｉ）で一晩培養した細胞中のＹＦＰ−Ｈ２Ｂ（ＹＦＰ−ｈｕｍａｎ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ｂ）の蛍光強度（発現強度）を、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ ｏｂｓｅｖｅｒ Ｚ１、ＺＥＩＳＳ社製）により観察した。その結果を、図１のＳＦＡ Ｐｌｕｓ＋Ｃ２に示す。図中、ＹＦＰは導入したプラスミドＤＮＡの発現レベルをＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光により測定した結果を表し、ＤＩＣ（微分干渉顕微鏡像）は細胞の状態を表す。
（４）フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較
（３）で顕微鏡観察を行ったウェルから培地をアスピレーターで除いた。培地を除いたウェルにＰＢＳを適量添加し、再度アスピレーターでＰＢＳを除いて洗浄を行った。その後、トリプシンＥＤＴＡ溶液（０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有））１５０μＬを、洗浄後のウェルに添加した。トリプシンＥＤＴＡ溶液をアスピレーターで除き、ＣＯ２インキュベーターで５分間反応させた。反応後のウェルにｓｏｒｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１ｘＤ−ＰＢＳ（−）， １ｍＭ ＥＤＴＡ， １％ＢＳＡ）を３００μＬ添加し、ピペティングにより細胞を分散させ、ストレーナーサンプルチューブに細胞を回収してｓｏｒｔｉｎｇサンプルを得た。
フローサイトメーター（Ｇａｌｌｉｏｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて、ｓｏｒｔｉｎｇサンプル中のＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光強度（発現強度）を測定し、非トランスフェクション細胞の蛍光強度に対する相対蛍光強度を算出した。
その結果とエンハンサーペプチドを用いずにトランスフェクションして測定した結果（後述の比較例１−２）との比較を下記表５に示す。
（３）で顕微鏡観察を行ったウェルから培地をアスピレーターで除いた。培地を除いたウェルにＰＢＳを適量添加し、再度アスピレーターでＰＢＳを除いて洗浄を行った。その後、トリプシンＥＤＴＡ溶液（０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有））１５０μＬを、洗浄後のウェルに添加した。トリプシンＥＤＴＡ溶液をアスピレーターで除き、ＣＯ２インキュベーターで５分間反応させた。反応後のウェルにｓｏｒｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１ｘＤ−ＰＢＳ（−）， １ｍＭ ＥＤＴＡ， １％ＢＳＡ）を３００μＬ添加し、ピペティングにより細胞を分散させ、ストレーナーサンプルチューブに細胞を回収してｓｏｒｔｉｎｇサンプルを得た。
フローサイトメーター（Ｇａｌｌｉｏｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて、ｓｏｒｔｉｎｇサンプル中のＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光強度（発現強度）を測定し、非トランスフェクション細胞の蛍光強度に対する相対蛍光強度を算出した。
その結果とエンハンサーペプチドを用いずにトランスフェクションして測定した結果（後述の比較例１−２）との比較を下記表５に示す。
実施例２−１６．各種細胞におけるエンハンサーペプチドＣ２のトランスフェクション促進効果の検証
下記表２に記載の条件（細胞、プラスミドＤＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例１と同様の方法によりＹＦＰ−Ｈ２Ｂ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、蛍光顕微鏡観察及びフローサイトメーターを用いた蛍光強度比較により、エンハンサーペプチドＣ２のトランスフェクション促進効果を確認した。
浮遊細胞Ｋ５６２を用いた実施例７においては、「（２）遺伝子導入（ｉｉ）細胞懸濁液の調製」を、実施例１の方法に代えて以下のように行った。即ち、（１）で得た細胞培養液を遠沈管に移し、遠心分離処理（１０００ｒｐｍ，５分）を行い、上清を除いた細胞ペレットに適当量培地を添加して懸濁し、懸濁液中に含まれる浮遊系細胞の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定した。
また、浮遊細胞Ｋ５６２を用いた実施例７においては、「（４）フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較」におけるｓｏｒｔｉｎｇサンプルを、実施例１の方法に代えて以下のようにして得た。即ち、（２）遺伝子導入（ｉｉｉ）トランスフェクションで一晩培養した細胞が含まれる培養液を、ストレーナーチューブに添加してｓｏｒｔｉｎｇサンプルとした。
下記表２に記載の条件（細胞、プラスミドＤＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例１と同様の方法によりＹＦＰ−Ｈ２Ｂ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、蛍光顕微鏡観察及びフローサイトメーターを用いた蛍光強度比較により、エンハンサーペプチドＣ２のトランスフェクション促進効果を確認した。
浮遊細胞Ｋ５６２を用いた実施例７においては、「（２）遺伝子導入（ｉｉ）細胞懸濁液の調製」を、実施例１の方法に代えて以下のように行った。即ち、（１）で得た細胞培養液を遠沈管に移し、遠心分離処理（１０００ｒｐｍ，５分）を行い、上清を除いた細胞ペレットに適当量培地を添加して懸濁し、懸濁液中に含まれる浮遊系細胞の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定した。
また、浮遊細胞Ｋ５６２を用いた実施例７においては、「（４）フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較」におけるｓｏｒｔｉｎｇサンプルを、実施例１の方法に代えて以下のようにして得た。即ち、（２）遺伝子導入（ｉｉｉ）トランスフェクションで一晩培養した細胞が含まれる培養液を、ストレーナーチューブに添加してｓｏｒｔｉｎｇサンプルとした。
実施例２の顕微鏡観察の結果を図２のＳＦＡ Ｐｌｕｓ＋Ｃ２に、また、実施例３の顕微鏡観察の結果を図３のＳＦＡ Ｐｌｕｓ＋Ｃ２にそれぞれ示す。
また、フローサイトメーターを用いた蛍光強度測定の結果については、比較例２−２〜１６−２との比較を、下記表５及び表６に示す。図中、ＹＦＰは導入したプラスミドＤＮＡの発現レベルをＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光により測定した結果を表し、ＤＩＣ（微分干渉顕微鏡像）は細胞の状態を表す。
また、フローサイトメーターを用いた蛍光強度測定の結果については、比較例２−２〜１６−２との比較を、下記表５及び表６に示す。図中、ＹＦＰは導入したプラスミドＤＮＡの発現レベルをＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光により測定した結果を表し、ＤＩＣ（微分干渉顕微鏡像）は細胞の状態を表す。
比較例１−１〜比較例１６−１．各種細胞における従来のエンハンサーペプチドＥＳＦＡ４のトランスフェクション促進効果の検証
下記表３に記載の条件（細胞、プラスミドＤＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例１と同様の方法によりＹＦＰ−Ｈ２Ｂ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、蛍光顕微鏡観察及びフローサイトメーターを用いた蛍光強度比較により、従来のエンハンサーペプチドであるＥＳＦＡ４のトランスフェクション促進効果を確認した。
浮遊細胞Ｋ５６２を用いた比較例７−１においては、「（２）遺伝子導入（ｉｉ）細胞懸濁液の調製」を、実施例１の方法に代えて以下のように行った。即ち、（１）で得た細胞培養液を遠沈管に移し、遠心分離処理（１０００ｒｐｍ，５分）を行い、上清を除いた細胞ペレットに適当量培地を添加して懸濁し、懸濁液中に含まれる浮遊系細胞の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定した。
また、浮遊細胞Ｋ５６２を用いた比較例７−１においては、「（４）フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較」におけるｓｏｒｔｉｎｇサンプルを、実施例１の方法に代えて以下のようにして得た。即ち、（２）遺伝子導入（ｉｉｉ）トランスフェクションで一晩培養した細胞が含まれる培養液を、ストレーナーチューブに添加してｓｏｒｔｉｎｇサンプルとした。
下記表３に記載の条件（細胞、プラスミドＤＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例１と同様の方法によりＹＦＰ−Ｈ２Ｂ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、蛍光顕微鏡観察及びフローサイトメーターを用いた蛍光強度比較により、従来のエンハンサーペプチドであるＥＳＦＡ４のトランスフェクション促進効果を確認した。
浮遊細胞Ｋ５６２を用いた比較例７−１においては、「（２）遺伝子導入（ｉｉ）細胞懸濁液の調製」を、実施例１の方法に代えて以下のように行った。即ち、（１）で得た細胞培養液を遠沈管に移し、遠心分離処理（１０００ｒｐｍ，５分）を行い、上清を除いた細胞ペレットに適当量培地を添加して懸濁し、懸濁液中に含まれる浮遊系細胞の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定した。
また、浮遊細胞Ｋ５６２を用いた比較例７−１においては、「（４）フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較」におけるｓｏｒｔｉｎｇサンプルを、実施例１の方法に代えて以下のようにして得た。即ち、（２）遺伝子導入（ｉｉｉ）トランスフェクションで一晩培養した細胞が含まれる培養液を、ストレーナーチューブに添加してｓｏｒｔｉｎｇサンプルとした。
比較例１−１の顕微鏡観察の結果を図１のＳＦＡ Ｐｌｕｓ＋ＥＳＦＡ４に、比較例２−１の顕微鏡観察の結果を図２のＳＦＡ Ｐｌｕｓ＋ＥＳＦＡ４に、また、比較例３−１の顕微鏡観察の結果を図３のＳＦＡ Ｐｌｕｓ＋ＥＳＦＡ４にそれぞれ示す。
また、フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較の結果については、比較例１−２〜１６−２との比較を下記表５及び表６に示す。
また、フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較の結果については、比較例１−２〜１６−２との比較を下記表５及び表６に示す。
比較例１−２〜比較例１６−２．各種細胞に対するトランスフェクション
下記表４に記載の条件（細胞、プラスミドＤＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド）で、実施例１と同様の方法によりＹＦＰ−Ｈ２Ｂ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、蛍光顕微鏡観察及びフローサイトメーターを用いた蛍光強度比較を行った。
なお、浮遊細胞Ｋ５６２を用いた比較例７−２においては、「（２）遺伝子導入（ｉｉ）細胞懸濁液の調製」を、実施例１の方法に代えて以下のように行った。即ち、（１）で得た細胞培養液を遠沈管に移し、遠心分離処理（１０００ｒｐｍ，５分）を行い、上清を除いた細胞ペレットに適当量培地を添加して懸濁し、懸濁液中に含まれる浮遊系細胞の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定した。
また、 浮遊細胞Ｋ５６２を用いた比較例７−２においては、「（４）フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較」におけるｓｏｒｔｉｎｇサンプルを、実施例１の方法に代えて以下のようにして得た。即ち、（２）遺伝子導入（ｉｉｉ）トランスフェクションで一晩培養した細胞が含まれる培養液を、ストレーナーチューブに添加してｓｏｒｔｉｎｇサンプルとした。
下記表４に記載の条件（細胞、プラスミドＤＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド）で、実施例１と同様の方法によりＹＦＰ−Ｈ２Ｂ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、蛍光顕微鏡観察及びフローサイトメーターを用いた蛍光強度比較を行った。
なお、浮遊細胞Ｋ５６２を用いた比較例７−２においては、「（２）遺伝子導入（ｉｉ）細胞懸濁液の調製」を、実施例１の方法に代えて以下のように行った。即ち、（１）で得た細胞培養液を遠沈管に移し、遠心分離処理（１０００ｒｐｍ，５分）を行い、上清を除いた細胞ペレットに適当量培地を添加して懸濁し、懸濁液中に含まれる浮遊系細胞の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定した。
また、 浮遊細胞Ｋ５６２を用いた比較例７−２においては、「（４）フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較」におけるｓｏｒｔｉｎｇサンプルを、実施例１の方法に代えて以下のようにして得た。即ち、（２）遺伝子導入（ｉｉｉ）トランスフェクションで一晩培養した細胞が含まれる培養液を、ストレーナーチューブに添加してｓｏｒｔｉｎｇサンプルとした。
比較例１−２の顕微鏡観察の結果を図１のＳＦＡ Ｐｌｕｓに、比較例２−２の顕微鏡観察の結果を図２のＳＦＡ Ｐｌｕｓに、比較例３−２の顕微鏡観察の結果を図３のＳＦＡ Ｐｌｕｓに、それぞれ示す。
また、フローサイトメーターを用いた蛍光強度の結果と実施例１〜１６及び比較例１−１〜比較例１６−１の結果との比較を下記表５及び表６に示す。
表５及び表６中の記号は以下の通りである。
◎：「エンハンサーペプチドを用いなかった場合の蛍光強度」に対する「エンハンサーペプチドを用いた場合の蛍光強度」の比が２倍以上
○：「エンハンサーペプチドを用いなかった場合の蛍光強度」に対する「エンハンサーペプチドを用いた場合の蛍光強度」の比が１．５倍以上
△：「エンハンサーペプチドを用いなかった場合の蛍光強度」に対する「エンハンサーペプチドを用いた場合の蛍光強度」の比が１．１倍以上
×：「エンハンサーペプチドを用いなかった場合の蛍光強度」に対する「エンハンサーペプチドを用いた場合の蛍光強度」の比が１．１倍未満
また、フローサイトメーターを用いた蛍光強度の結果と実施例１〜１６及び比較例１−１〜比較例１６−１の結果との比較を下記表５及び表６に示す。
表５及び表６中の記号は以下の通りである。
◎：「エンハンサーペプチドを用いなかった場合の蛍光強度」に対する「エンハンサーペプチドを用いた場合の蛍光強度」の比が２倍以上
○：「エンハンサーペプチドを用いなかった場合の蛍光強度」に対する「エンハンサーペプチドを用いた場合の蛍光強度」の比が１．５倍以上
△：「エンハンサーペプチドを用いなかった場合の蛍光強度」に対する「エンハンサーペプチドを用いた場合の蛍光強度」の比が１．１倍以上
×：「エンハンサーペプチドを用いなかった場合の蛍光強度」に対する「エンハンサーペプチドを用いた場合の蛍光強度」の比が１．１倍未満
《実施例１−３、比較例１−１〜比較例３−１及び比較例１−２〜比較例３−２の蛍光顕微鏡観察の結果・考察》
ＣＯＳ７細胞に対するトランスフェクション（図１）及びＨＣＴ−１１６＃２Ｌｕｃ細胞に対するトランスフェクション（図３）では、従来のエンハンサーペプチドであるＥＳＦＡ４を用いた場合（比較例１−１、比較例３−１）とエンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例１−２、比較例３−２）とでＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光強度（発現強度）に有意な差はなく、ＥＳＦＡ４のトランスフェクション促進効果は観察されなかった。一方、Ｃ２を用いた場合（実施例１、実施例３）では、エンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例１−２、比較例３−２）に比べて強いＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光強度が観察されたことから、Ｃ２がトランスフェクション促進効果を有することが確認された。
ＨｕＨ−７細胞（図２）に対するトランスフェクションでは、Ｃ２を用いた場合（実施例２）は、ＥＳＦＡ４を用いた場合（比較例２−１）に比べて強いＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光強度が観察されたことから、Ｃ２はＥＳＦＡ４よりもＨｕＨ−７細胞に対するトランスフェクションにおけるトランスフェクション促進効果が高いことが判った。
ＣＯＳ７細胞に対するトランスフェクション（図１）及びＨＣＴ−１１６＃２Ｌｕｃ細胞に対するトランスフェクション（図３）では、従来のエンハンサーペプチドであるＥＳＦＡ４を用いた場合（比較例１−１、比較例３−１）とエンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例１−２、比較例３−２）とでＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光強度（発現強度）に有意な差はなく、ＥＳＦＡ４のトランスフェクション促進効果は観察されなかった。一方、Ｃ２を用いた場合（実施例１、実施例３）では、エンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例１−２、比較例３−２）に比べて強いＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光強度が観察されたことから、Ｃ２がトランスフェクション促進効果を有することが確認された。
ＨｕＨ−７細胞（図２）に対するトランスフェクションでは、Ｃ２を用いた場合（実施例２）は、ＥＳＦＡ４を用いた場合（比較例２−１）に比べて強いＹＦＰ−Ｈ２Ｂの蛍光強度が観察されたことから、Ｃ２はＥＳＦＡ４よりもＨｕＨ−７細胞に対するトランスフェクションにおけるトランスフェクション促進効果が高いことが判った。
《実施例１−１６及び比較例１−１〜比較例１６−１及び比較例１−２〜１６−２のフローサイトメーターを用いた蛍光強度比較の結果・考察》
上記表５及び表６から明らかなとおり、使用した１６種の細胞株全てにおいて、Ｃ２をエンハンサーペプチドとして用いた場合は、ＥＳＦＡ４をエンハンサーペプチドとして用いた場合と同等又はそれ以上の蛍光強度が測定された。この結果から、Ｃ２はＥＳＦＡ４と同等又はそれ以上のトランスフェクション促進効果を有することが判った。
特に、ＣＯＳ７細胞、ＨＣＴ−１１６＃２Ｌｕｃ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｌ細胞に対するトランスフェクションおいては、ＥＳＦＡ４を用いた場合（比較例１−１、比較例３−１、比較例７−１、比較例１３−１）とエンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例１−２、比較例３−２、比較例７−２、比較例１３−２）とで蛍光強度に有意な差はなく、ＥＳＦＡ４はトランスフェクション促進効果を示さなかった。他方、Ｃ２を用いた場合（実施例１、実施例３、実施例７、実施例１３）では、エンハンサーペプチドを用いなかった場合に比べて強い蛍光強度が測定されことから、Ｃ２のトランスフェクション促進効果が確認された。これらの結果から、ＥＳＦＡ４がトランスフェクション促進効果を示さない細胞に対しても、Ｃ２はトランスフェクション促進効果を示しており、Ｃ２はトランスフェクションを行う細胞の種類を問わない汎用性の広いエンハンサーペプチドであることが判った。
一般に、核移行シグナルを有するペプチドは、細胞質に導入されてプラスミド遺伝子を核内に運ぶことでトランスフェクション促進効果を発揮することが知られている。この知見を考慮すると、核移行シグナルを持たないＣ２は、核移行シグナルを有するＥＳＦＡ４よりもトランスフェクション促進効果が劣ると予測されたが、意外にもＣ２はＥＳＦＡ４と同等又はそれ以上のトランスフェクション促進効果を示すことが判った。
上記表５及び表６から明らかなとおり、使用した１６種の細胞株全てにおいて、Ｃ２をエンハンサーペプチドとして用いた場合は、ＥＳＦＡ４をエンハンサーペプチドとして用いた場合と同等又はそれ以上の蛍光強度が測定された。この結果から、Ｃ２はＥＳＦＡ４と同等又はそれ以上のトランスフェクション促進効果を有することが判った。
特に、ＣＯＳ７細胞、ＨＣＴ−１１６＃２Ｌｕｃ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｌ細胞に対するトランスフェクションおいては、ＥＳＦＡ４を用いた場合（比較例１−１、比較例３−１、比較例７−１、比較例１３−１）とエンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例１−２、比較例３−２、比較例７−２、比較例１３−２）とで蛍光強度に有意な差はなく、ＥＳＦＡ４はトランスフェクション促進効果を示さなかった。他方、Ｃ２を用いた場合（実施例１、実施例３、実施例７、実施例１３）では、エンハンサーペプチドを用いなかった場合に比べて強い蛍光強度が測定されことから、Ｃ２のトランスフェクション促進効果が確認された。これらの結果から、ＥＳＦＡ４がトランスフェクション促進効果を示さない細胞に対しても、Ｃ２はトランスフェクション促進効果を示しており、Ｃ２はトランスフェクションを行う細胞の種類を問わない汎用性の広いエンハンサーペプチドであることが判った。
一般に、核移行シグナルを有するペプチドは、細胞質に導入されてプラスミド遺伝子を核内に運ぶことでトランスフェクション促進効果を発揮することが知られている。この知見を考慮すると、核移行シグナルを持たないＣ２は、核移行シグナルを有するＥＳＦＡ４よりもトランスフェクション促進効果が劣ると予測されたが、意外にもＣ２はＥＳＦＡ４と同等又はそれ以上のトランスフェクション促進効果を示すことが判った。
実施例１７．比較例１７．ｍＲＮＡのトランスフェクションにおけるエンハンサーペプチドＣ２のトランスフェクション促進効果の検証
下記表７に記載の条件（細胞、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例１と同様の方法により、プラスミドＤＮＡの代わりにｍＲＮＡをトランスフェクションし、蛍光顕微鏡観察及びフローサイトメーターを用いたＥＧＦＰの蛍光強度比較により、エンハンサーペプチドＣ２のトランスフェクション促進効果を確認した。
導入するｍＲＮＡは、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（＃Ｌ−６３０１、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。
実施例１７及び比較例１７におけるトランスフェクション薬剤（ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ）の添加量は、０．８μＬ（ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ量１μｇあたりＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ４μＬ）とした。
下記表７に記載の条件（細胞、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例１と同様の方法により、プラスミドＤＮＡの代わりにｍＲＮＡをトランスフェクションし、蛍光顕微鏡観察及びフローサイトメーターを用いたＥＧＦＰの蛍光強度比較により、エンハンサーペプチドＣ２のトランスフェクション促進効果を確認した。
導入するｍＲＮＡは、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（＃Ｌ−６３０１、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。
実施例１７及び比較例１７におけるトランスフェクション薬剤（ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ）の添加量は、０．８μＬ（ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ量１μｇあたりＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ４μＬ）とした。
（１）蛍光顕微鏡観察の結果及び考察
蛍光顕微鏡観察で得られた結果について、図４に示す。図４中、ＳＦＡ Ｐｌｕｓは比較例１７の結果、ＳＦＡ Ｐｌｕｓ＋Ｃ２は実施例１７の結果である。図中、ＧＦＰは導入したＥＧＦＰ ｍＲＮＡの発現レベルをＥＧＦＰの蛍光により測定した結果を表し、ＤＩＣ（微分干渉顕微鏡像）は細胞の状態を表す。
Ｃ２を用いた場合（実施例１７）、エンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例１７）に比べて強い蛍光強度が観察されており、Ｃ２はｍＲＮＡのトランスフェクションにおいてもトランスフェクション促進効果を有することが判った。
（２）フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較の結果及び考察
フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較について、図５に示す。図５中、ＳＦＡ Ｐｌｕｓは比較例１７の結果、ＳＦＡ Ｐｌｕｓ＋Ｃ２は実施例１７の結果である。図中、相対蛍光強度は、非トランスフェクション細胞の蛍光強度を１００とした場合のトランスフェクションした細胞における導入ｍＲＮＡの相対蛍光強度を示す。
Ｃ２を用いた場合（実施例１７）、エンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例１７）に比べて強い蛍光強度が観察されており、Ｃ２はｍＲＮＡのトランスフェクションにおいてもトランスフェクション促進効果を有することが判った。
以上のことから、Ｃ２はＤＮＡだけでなくＲＮＡのトランスフェクションにおいてもトランスフェクション促進効果を有することが明らかとなり、導入する核酸の種類を問わない汎用性の高いエンハンスペプチドであることが判った。
蛍光顕微鏡観察で得られた結果について、図４に示す。図４中、ＳＦＡ Ｐｌｕｓは比較例１７の結果、ＳＦＡ Ｐｌｕｓ＋Ｃ２は実施例１７の結果である。図中、ＧＦＰは導入したＥＧＦＰ ｍＲＮＡの発現レベルをＥＧＦＰの蛍光により測定した結果を表し、ＤＩＣ（微分干渉顕微鏡像）は細胞の状態を表す。
Ｃ２を用いた場合（実施例１７）、エンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例１７）に比べて強い蛍光強度が観察されており、Ｃ２はｍＲＮＡのトランスフェクションにおいてもトランスフェクション促進効果を有することが判った。
（２）フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較の結果及び考察
フローサイトメーターを用いた蛍光強度比較について、図５に示す。図５中、ＳＦＡ Ｐｌｕｓは比較例１７の結果、ＳＦＡ Ｐｌｕｓ＋Ｃ２は実施例１７の結果である。図中、相対蛍光強度は、非トランスフェクション細胞の蛍光強度を１００とした場合のトランスフェクションした細胞における導入ｍＲＮＡの相対蛍光強度を示す。
Ｃ２を用いた場合（実施例１７）、エンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例１７）に比べて強い蛍光強度が観察されており、Ｃ２はｍＲＮＡのトランスフェクションにおいてもトランスフェクション促進効果を有することが判った。
以上のことから、Ｃ２はＤＮＡだけでなくＲＮＡのトランスフェクションにおいてもトランスフェクション促進効果を有することが明らかとなり、導入する核酸の種類を問わない汎用性の高いエンハンスペプチドであることが判った。
実施例１８．各種ペプチドのアミノ酸配列の違いによるトランスフェクション促進効果への影響についての検証
以下の方法により、下記表８に記載の実験条件で、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、各種ペプチドのアミノ酸配列の違いによるトランスフェクション促進効果への影響を確認した。
以下の方法により、下記表８に記載の実験条件で、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、各種ペプチドのアミノ酸配列の違いによるトランスフェクション促進効果への影響を確認した。
（１）細胞の調製
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬工業（株）製）を用いて、１×１０５個以上の細胞数が得られるまで培養し、培養細胞を得た。
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬工業（株）製）を用いて、１×１０５個以上の細胞数が得られるまで培養し、培養細胞を得た。
（２）遺伝子導入
（ｉ）トランスフェクション溶液の調製
まず、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するｐＧＬ３ ｃｏｎｔｒｏｌ ｖｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｍｅｇａ社製、配列番号４）を、０．５ｍｇ／ｍＬとなるようにＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）で懸濁し、プラスミドＤＮＡ溶液を調製した。
次いで、Ｃ２（（株）東レリサーチにて合成）を、トランスフェクション薬剤であるＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＡ Ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）に付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（以下、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと略記する場合がある）に５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、エンハンサーペプチド溶液を調製した。
そして、滅菌したチューブを２本用意し、一本のチューブにＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを４．７μＬ添加し、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＡ Ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）に付属のＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔを０．３μＬ（プラスミドＤＮＡ量１μｇあたりＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ３μＬ）添加した。
もう一本の滅菌済みチューブに、プラスミドＤＮＡ量が０．１μｇになるようプラスミドＤＮＡ溶液１μＬを添加し、更にエンハンサーペプチド溶液を０．２μＬ（プラスミドＤＮＡ量１μｇあたりエンハンサーペプチド溶液２μＬ）添加し、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加えて全量５μＬになるように調製した。
次いで、上記の２本のチューブを混合して、室温で１５分反応させトランスフェクション溶液を得た。
（ｉ）トランスフェクション溶液の調製
まず、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するｐＧＬ３ ｃｏｎｔｒｏｌ ｖｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｍｅｇａ社製、配列番号４）を、０．５ｍｇ／ｍＬとなるようにＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）で懸濁し、プラスミドＤＮＡ溶液を調製した。
次いで、Ｃ２（（株）東レリサーチにて合成）を、トランスフェクション薬剤であるＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＡ Ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）に付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（以下、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと略記する場合がある）に５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、エンハンサーペプチド溶液を調製した。
そして、滅菌したチューブを２本用意し、一本のチューブにＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを４．７μＬ添加し、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＡ Ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）に付属のＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔを０．３μＬ（プラスミドＤＮＡ量１μｇあたりＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ３μＬ）添加した。
もう一本の滅菌済みチューブに、プラスミドＤＮＡ量が０．１μｇになるようプラスミドＤＮＡ溶液１μＬを添加し、更にエンハンサーペプチド溶液を０．２μＬ（プラスミドＤＮＡ量１μｇあたりエンハンサーペプチド溶液２μＬ）添加し、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加えて全量５μＬになるように調製した。
次いで、上記の２本のチューブを混合して、室温で１５分反応させトランスフェクション溶液を得た。
（ｉｉ）細胞懸濁液の調製
（１）で得られた培養細胞を用いて、以下の通り細胞懸濁液を調製した。
培養容器から培地を除いたのち、トリプシンＥＤＴＡ溶液［０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有））を培養容器に添加して細胞を培養容器から剥離し、懸濁液を得た。遠沈管に当該懸濁液を添加後、遠心分離処理を行い（１０００ｒｐｍ，５分）、細胞を沈降させた。上清を除いた後、細胞ペレットに適当量培地を加えて細胞懸濁液を得た。当該細胞懸濁液中の細胞の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定し、細胞懸濁液中の細胞の濃度を算出した。
（１）で得られた培養細胞を用いて、以下の通り細胞懸濁液を調製した。
培養容器から培地を除いたのち、トリプシンＥＤＴＡ溶液［０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有））を培養容器に添加して細胞を培養容器から剥離し、懸濁液を得た。遠沈管に当該懸濁液を添加後、遠心分離処理を行い（１０００ｒｐｍ，５分）、細胞を沈降させた。上清を除いた後、細胞ペレットに適当量培地を加えて細胞懸濁液を得た。当該細胞懸濁液中の細胞の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定し、細胞懸濁液中の細胞の濃度を算出した。
（ｉｉｉ）トランスフェクション
まず、９６ウェルプレートの１つのウェルに、以下のものをそれぞれ添加した。
・Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬工業（株）製）９０μＬ
・１．５×１０５個の細胞が存在する量の（ｉｉ）で調製した細胞懸濁液
次いで、（ｉ）で調製したトランスフェクション溶液を１０μＬ滴下し、ゆっくりと攪拌混合後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩細胞を培養した。
まず、９６ウェルプレートの１つのウェルに、以下のものをそれぞれ添加した。
・Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬工業（株）製）９０μＬ
・１．５×１０５個の細胞が存在する量の（ｉｉ）で調製した細胞懸濁液
次いで、（ｉ）で調製したトランスフェクション溶液を１０μＬ滴下し、ゆっくりと攪拌混合後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩細胞を培養した。
（３）ルシフェラーゼアッセイ
上記（２）で一晩培養した細胞について、導入したプラスミドの発現レベルをホタルルシフェラーゼ遺伝子の発光強度（発現強度）により、以下の方法で測定した。
まず、ＣＯ２インキュベーターから９６ウェルプレートを取り出し、室温に戻した。次いで、ウェルにＯＮＥ−ＧｌｏＴＭ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｇｅｍａ）を１００μＬ添加し、プレートミキサーで撹拌しながら５分間室温で反応させた。その後、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いて発光強度の測定を行った。
上記（２）で一晩培養した細胞について、導入したプラスミドの発現レベルをホタルルシフェラーゼ遺伝子の発光強度（発現強度）により、以下の方法で測定した。
まず、ＣＯ２インキュベーターから９６ウェルプレートを取り出し、室温に戻した。次いで、ウェルにＯＮＥ−ＧｌｏＴＭ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｇｅｍａ）を１００μＬ添加し、プレートミキサーで撹拌しながら５分間室温で反応させた。その後、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いて発光強度の測定を行った。
（４）結果
ルシフェラーゼアッセイで得られた結果を、図６に示す。図６中、横軸は各種ペプチドの種類、縦軸は発光強度をそれぞれ表す。
ルシフェラーゼアッセイで得られた結果を、図６に示す。図６中、横軸は各種ペプチドの種類、縦軸は発光強度をそれぞれ表す。
実施例１９−２４．各種ペプチドのアミノ酸配列の違いによるトランスフェクション促進効果への影響についての検証
下記表９に記載の条件（細胞、プラスミドＤＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例１８と同様の方法により、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、ルシフェラーゼアッセイにより、各種ペプチドのアミノ酸配列の違いによるトランスフェクション促進効果への影響を確認した。各ペプチドは、全て（株）東レリサーチにて合成した。
下記表９に記載の条件（細胞、プラスミドＤＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例１８と同様の方法により、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、ルシフェラーゼアッセイにより、各種ペプチドのアミノ酸配列の違いによるトランスフェクション促進効果への影響を確認した。各ペプチドは、全て（株）東レリサーチにて合成した。
比較例１８−２８．各種ペプチドのアミノ酸配列の違いによるトランスフェクション促進効果への影響についての検証
下記表１０に記載の条件（細胞、プラスミドＤＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例１８と同様の方法により、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、ルシフェラーゼアッセイにより、各種ペプチドのアミノ酸配列の違いによるトランスフェクション促進効果への影響を確認した。各ペプチドは、全て（株）東レリサーチにて合成した。
下記表１０に記載の条件（細胞、プラスミドＤＮＡ量、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例１８と同様の方法により、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、ルシフェラーゼアッセイにより、各種ペプチドのアミノ酸配列の違いによるトランスフェクション促進効果への影響を確認した。各ペプチドは、全て（株）東レリサーチにて合成した。
実施例１８〜２４及び比較例１８〜２８の結果及び考察を以下に纏めて示す。
《実施例１８〜２４及び比較例１８〜２８のルシフェラーゼアッセイの結果及び考察》
ルシフェラーゼアッセイの結果、Ｃ４、Ｃ２＿Ｃ１４Ａ、Ｃ２＿Ａ６、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ１９、Ｒ２２、Ｒ３０又はＨ１１をトランスフェクション時に用いた場合（比較例２０〜２８）の発光強度は、ペプチドを用いなかった場合（比較例１８）の発光強度と同等かそれ以下であった。
他方、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ２＿ＡＡＣＡＡＡ、Ｋ１１、Ｒ９、Ｒ１６、又はＲＫ１２をトランスフェクション時に用いた場合（実施例１８〜２４）の発光強度は、ペプチドを用いなかった場合（比較例１８）の発光強度に比べて２倍以上強かった。また、これらのペプチドは、従来のエンハンサーペプチドであるＥＳＦＡ４を用いた場合（比較例１９）よりも強い発光を示し、ＥＳＦＡ４よりも優れたトランスフェクション促進効果を示すことが判った。
中でも、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ２＿ＡＡＣＡＡＡ、Ｒ１６又はＲＫ１２をトランスフェクション時に用いた場合（実施例１８〜２０、２３及び２４）の発光強度は、ペプチドを用いなかった場合（比較例１８）の発光強度に比べて５倍以上の強い発光を示しており、これらのペプチドはエンハンサーペプチドとして特に有用であることが判った。
ルシフェラーゼアッセイの結果、Ｃ４、Ｃ２＿Ｃ１４Ａ、Ｃ２＿Ａ６、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ１９、Ｒ２２、Ｒ３０又はＨ１１をトランスフェクション時に用いた場合（比較例２０〜２８）の発光強度は、ペプチドを用いなかった場合（比較例１８）の発光強度と同等かそれ以下であった。
他方、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ２＿ＡＡＣＡＡＡ、Ｋ１１、Ｒ９、Ｒ１６、又はＲＫ１２をトランスフェクション時に用いた場合（実施例１８〜２４）の発光強度は、ペプチドを用いなかった場合（比較例１８）の発光強度に比べて２倍以上強かった。また、これらのペプチドは、従来のエンハンサーペプチドであるＥＳＦＡ４を用いた場合（比較例１９）よりも強い発光を示し、ＥＳＦＡ４よりも優れたトランスフェクション促進効果を示すことが判った。
中でも、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ２＿ＡＡＣＡＡＡ、Ｒ１６又はＲＫ１２をトランスフェクション時に用いた場合（実施例１８〜２０、２３及び２４）の発光強度は、ペプチドを用いなかった場合（比較例１８）の発光強度に比べて５倍以上の強い発光を示しており、これらのペプチドはエンハンサーペプチドとして特に有用であることが判った。
Ｃ２（実施例１８）及びＣ５（実施例１９）はいずれもトランスフェクション促進効果を示しており、エンハンサーペプチドにおけるポリアルギニン又はポリリシンからなる付加配列は、コア配列のＮ末端側、Ｃ末端側のいずれに結合していても、トランスフェクション促進効果を有することが判った。
付加配列がポリアルギニンからなるＣ２（実施例１８）等や付加配列がポリリシンからなるＫ１１（実施例２１）、アルギニンとリシンを交互に１２個配置させたＲＫ１２（実施例２４）はトランスフェクション促進効果を示した。他方、アルギニンやリシンと同様にカチオニックなアミノ酸であるヒスチジンが１１個結合したヒスチジンＨ１１（比較例２８）はトランスフェクション促進効果を示さなかった。
これらの結果から、付加配列はカチオニックなアミノ酸の中でも、アルギニン又は／及びリシンからなるアミノ酸配列であることが必要であると判った。
付加配列がポリアルギニンからなるＣ２（実施例１８）等や付加配列がポリリシンからなるＫ１１（実施例２１）、アルギニンとリシンを交互に１２個配置させたＲＫ１２（実施例２４）はトランスフェクション促進効果を示した。他方、アルギニンやリシンと同様にカチオニックなアミノ酸であるヒスチジンが１１個結合したヒスチジンＨ１１（比較例２８）はトランスフェクション促進効果を示さなかった。
これらの結果から、付加配列はカチオニックなアミノ酸の中でも、アルギニン又は／及びリシンからなるアミノ酸配列であることが必要であると判った。
さらに、付加配列が９個のアルギニンからなるＲ９（実施例２２）、付加配列として１１個のリシンからなるＫ１１（実施例２１）、付加配列が１６個のアルギニンからなるＲ１６（実施例２３）等もトランスフェクション促進効果を示した。一方、付加配列が６個のアルギニンからなるＲ６（比較例２４）等の付加配列が６個以下のアルギニン又はリシンからなるペプチドや、付加配列が１９個のアルギニンからなるＲ１９（比較例２５）等の付加配列が１９個以上のアルギニン又はリシンからなるペプチドは、トランスフェクション促進効果を示さなかった。これらの結果から、アルギニン又は／及びリシンからなる付加配列のアミノ酸数は、９個以上１６個以下でトランスフェクション促進効果を示すことが判った。
なお、ポリアルギニンのみからなるＣ４（比較例２０）はトランスフェクション促進効果を示しておらず、コア配列がペプチドのトランスフェクション促進効果に重要な配列であることが明らかとなった。特に、コア配列の３番目のＣｙｓ残基をＡｌａに置換したＣ２＿Ｃ１４Ａ（比較例２１）、Ｃ２＿Ａ６（比較例２２）はトランスフェクション促進効果を示さず、一方、コア配列の３番目のＣｙｓ残基以外をＡｌａに置換したＣ２＿ＡＡＣＡＡＡＡ（実施例２０）がトランスフェクション促進効果を示した。これらの結果から、コア配列の３番目のＣｙｓ残基が特にトランスフェクション促進効果に寄与していることが明らかとなった。
実施例２５．各種エンハンサーペプチドのトランスフェクション薬剤の細胞毒性抑制効果についての検証
以下の方法により、下記表１１に記載の実験条件の下、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、各種ペプチドのアミノ酸配列の違いによるトランスフェクション促進効果への影響を確認した。
なお、本実施例においては、導入遺伝子の発現による細胞毒性の効果を排除するため、プラスミドＤＮＡは用いずに下記（２）の遺伝子導入の操作を行った。
以下の方法により、下記表１１に記載の実験条件の下、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、各種ペプチドのアミノ酸配列の違いによるトランスフェクション促進効果への影響を確認した。
なお、本実施例においては、導入遺伝子の発現による細胞毒性の効果を排除するため、プラスミドＤＮＡは用いずに下記（２）の遺伝子導入の操作を行った。
（１）細胞の調製
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ’ｓＦ−１２ １０％ＦＢＳ培地（和光純薬工業（株）製）を用いて、１．５×１０５個以上の細胞が得られるまで培養し、培養細胞を得た。
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ’ｓＦ−１２ １０％ＦＢＳ培地（和光純薬工業（株）製）を用いて、１．５×１０５個以上の細胞が得られるまで培養し、培養細胞を得た。
（２）遺伝子導入
（ｉ）トランスフェクション溶液の調製
まず、Ｃ２（（株）東レリサーチにて合成）を、トランスフェクション薬剤であるＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＡ Ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）に付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（以下、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと略記する場合がある）に５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、エンハンサーペプチド溶液を調製した。
次いで、滅菌したチューブを２本用意し、一本のチューブにＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＡ Ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）に付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを２３．５μＬ添加し、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔを１．５μＬ添加した。
もう一本の滅菌済みチューブに、エンハンサーペプチド溶液を１μＬ添加し、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加して最終２５μＬになるように調製した。
次いで、上記の２本のチューブを混合して、室温で１５分反応させトランスフェクション溶液を得た。
（ｉ）トランスフェクション溶液の調製
まず、Ｃ２（（株）東レリサーチにて合成）を、トランスフェクション薬剤であるＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＡ Ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）に付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（以下、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと略記する場合がある）に５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、エンハンサーペプチド溶液を調製した。
次いで、滅菌したチューブを２本用意し、一本のチューブにＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＴＭＡ Ｐｌｕｓ（和光純薬工業（株）製）に付属のＤｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを２３．５μＬ添加し、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔを１．５μＬ添加した。
もう一本の滅菌済みチューブに、エンハンサーペプチド溶液を１μＬ添加し、Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加して最終２５μＬになるように調製した。
次いで、上記の２本のチューブを混合して、室温で１５分反応させトランスフェクション溶液を得た。
（ｉｉ）細胞懸濁液の調製
（１）で得られた培養細胞を用いて、細胞懸濁液を調製した。培養容器から培地を除いたのち、トリプシンＥＤＴＡ溶液（０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有））を培養容器に添加して細胞を培養容器から剥離し、懸濁液を得た。遠沈管に当該懸濁液を添加後、遠心分離処理を行い（１０００ｒｐｍ， ５分）、細胞を沈降させた。上清を除いた後、細胞ペレットに適当量培地を加え、細胞懸濁液を得た。当該細胞懸濁液中の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定し、細胞懸濁液中の浮遊系細胞の濃度を算出した。
（１）で得られた培養細胞を用いて、細胞懸濁液を調製した。培養容器から培地を除いたのち、トリプシンＥＤＴＡ溶液（０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有））を培養容器に添加して細胞を培養容器から剥離し、懸濁液を得た。遠沈管に当該懸濁液を添加後、遠心分離処理を行い（１０００ｒｐｍ， ５分）、細胞を沈降させた。上清を除いた後、細胞ペレットに適当量培地を加え、細胞懸濁液を得た。当該細胞懸濁液中の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定し、細胞懸濁液中の浮遊系細胞の濃度を算出した。
（ｉｉｉ）トランスフェクション
まず、２４ウェルプレートの１つのウェルに以下のものをそれぞれ添加した。
・Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬工業（株）製）４５０μＬ
・１．５×１０５細胞が存在する量の（ｉｉ）で調製した細胞懸濁液
次いで、ウェルに（ｉ）で調製したトランスフェクション溶液を５０μＬ滴下し、ゆっくりと攪拌混合後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで細胞を一晩培養した。
まず、２４ウェルプレートの１つのウェルに以下のものをそれぞれ添加した。
・Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬工業（株）製）４５０μＬ
・１．５×１０５細胞が存在する量の（ｉｉ）で調製した細胞懸濁液
次いで、ウェルに（ｉ）で調製したトランスフェクション溶液を５０μＬ滴下し、ゆっくりと攪拌混合後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで細胞を一晩培養した。
（３）細胞生存率測定
上記（２）で一晩培養した細胞について、培養容器から培地を除いたのち、トリプシンＥＤＴＡ溶液［０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有））を培養容器に添加して細胞を培養容器から剥離し懸濁液を得た。遠沈管に当該懸濁液を添加後、遠心分離処理を行い（１０００ｒｐｍ，５分）、細胞を沈降させた。上清を除いた後、細胞ペレットに適当量培地を加え、細胞懸濁液を得た。当該細胞懸濁液中の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定し、細胞懸濁液中の接着細胞の濃度を算出した。
算出された細胞数とトランスフェクションを行っていない細胞の細胞数とを比較し、生細胞数の割合を算出した。
上記（２）で一晩培養した細胞について、培養容器から培地を除いたのち、トリプシンＥＤＴＡ溶液［０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン−１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有））を培養容器に添加して細胞を培養容器から剥離し懸濁液を得た。遠沈管に当該懸濁液を添加後、遠心分離処理を行い（１０００ｒｐｍ，５分）、細胞を沈降させた。上清を除いた後、細胞ペレットに適当量培地を加え、細胞懸濁液を得た。当該細胞懸濁液中の細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により測定し、細胞懸濁液中の接着細胞の濃度を算出した。
算出された細胞数とトランスフェクションを行っていない細胞の細胞数とを比較し、生細胞数の割合を算出した。
（４）結果
細胞生存率測定の結果を図７に示す。本実施例の考察は、実施例２６〜３１及び比較例２９と併せて、比較例２９に示す。図中、横軸はエンハンサーペプチドに関する条件、縦軸は生細胞の割合（％）を示す。
細胞生存率測定の結果を図７に示す。本実施例の考察は、実施例２６〜３１及び比較例２９と併せて、比較例２９に示す。図中、横軸はエンハンサーペプチドに関する条件、縦軸は生細胞の割合（％）を示す。
実施例２６−３１．比較例２９．各種エンハンサーペプチドのトランスフェクション薬剤による細胞毒性抑制効果についての検証
下記表１２に記載の条件（細胞、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例２５と同様の方法により、トランスフェクション薬剤の細胞毒性に対するエンハンサーペプチドの抑制効果を確認した。
エンハンサーペプチドは、実施例１８−２４の結果トランスフェクション促進効果を有することが明らかとなったものを用いた。これらのエンハンサーペプチドは、全て（株）東レリサーチで合成した。
下記表１２に記載の条件（細胞、播種細胞数、培地、エンハンサーペプチド、エンハンサーペプチドの量）で、実施例２５と同様の方法により、トランスフェクション薬剤の細胞毒性に対するエンハンサーペプチドの抑制効果を確認した。
エンハンサーペプチドは、実施例１８−２４の結果トランスフェクション促進効果を有することが明らかとなったものを用いた。これらのエンハンサーペプチドは、全て（株）東レリサーチで合成した。
（４）結果
細胞生存率測定の結果を図７に示す。図中、横軸はエンハンサーペプチドに関する条件、縦軸は生細胞の割合（％）を示す。実施例２５〜３１及び比較例２９の結果及び考察を以下に纏めて示す。
細胞生存率測定の結果を図７に示す。図中、横軸はエンハンサーペプチドに関する条件、縦軸は生細胞の割合（％）を示す。実施例２５〜３１及び比較例２９の結果及び考察を以下に纏めて示す。
《実施例２５〜３１及び比較例２９の結果及び考察》
エンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例２９）の細胞生存率は、約５０％であった。他方、本発明のエンハンサーペプチドを用いた場合（実施例２５〜３１）はいずれも、細胞生存率は約７０％から約９０％の生存率であった。
これらの結果から、本発明のエンハンサーペプチドはいずれもトランスフェクション薬剤の細胞毒性に対する抑制効果を有することが判った。とりわけ、Ｃ２を用いた場合の細胞生存率は約９０％であり、トランスフェクション薬剤の細胞毒性に対する抑制効果が特に高く、Ｃ２は細胞毒性抑制効果の点からも特に有用なエンハンサーペプチドであることが判った。
エンハンサーペプチドを用いなかった場合（比較例２９）の細胞生存率は、約５０％であった。他方、本発明のエンハンサーペプチドを用いた場合（実施例２５〜３１）はいずれも、細胞生存率は約７０％から約９０％の生存率であった。
これらの結果から、本発明のエンハンサーペプチドはいずれもトランスフェクション薬剤の細胞毒性に対する抑制効果を有することが判った。とりわけ、Ｃ２を用いた場合の細胞生存率は約９０％であり、トランスフェクション薬剤の細胞毒性に対する抑制効果が特に高く、Ｃ２は細胞毒性抑制効果の点からも特に有用なエンハンサーペプチドであることが判った。
本発明のトランスフェクション促進用ペプチド、本発明のトランスフェクション用キット、及び本発明のトランスフェクション方法は、細胞や核酸の種類にかかわらず、従来のトランスフェクション促進用ペプチドと同等又はそれ以上の核酸導入効率でトランスフェクションを促進することができることから、導入遺伝子の機能解析やタンパク質発現生産等のトランスフェクションを行う分野において有用である。
また、本発明のトランスフェクション法によれば、トランスフェクション薬剤の細胞毒性を抑制し、高い細胞生存率でトランスフェクションを行うことができることから、導入遺伝子の機能解析やタンパク質発現生産等のトランスフェクションを行う分野において有用である。
また、本発明のトランスフェクション法によれば、トランスフェクション薬剤の細胞毒性を抑制し、高い細胞生存率でトランスフェクションを行うことができることから、導入遺伝子の機能解析やタンパク質発現生産等のトランスフェクションを行う分野において有用である。
Claims (16)
- 下記一般式［１］又は［２］で示される、細胞のトランスフェクション促進用ペプチド。
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２ ［１］
Ｘ２−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ２−（Ｘ１）ｎ ［２］
（式中、ｎ個のＸ１はそれぞれ独立してアルギニン又はリシンを表し、Ｘ２はグリシン又はアラニン、Ｘ３はチロシン又はアラニンをそれぞれ表し、ｎは８〜１７の整数を表す） - 前記ペプチドが、下記一般式［１’］、［１’’］、［２’］又は［２’’］で示されるものである、請求項１に記載のペプチド。
（Ｘ１）ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ ［１’］
（Ｘ１）ｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ ［１’’］
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−（Ｘ１）ｎ ［２’］
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−（Ｘ１）ｎ ［２’’］
（式中、Ｘ１、ｎは上記に同じ） - 前記ペプチドが、一般式［１’］又は［２’］で示されるものである、請求項２に記載のペプチド。
- 前記一般式［１’］又は一般式［２’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ、（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍ、及び（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）ｍ（ｎは前記に同じ、ｍは４〜８の整数を表す）から選ばれるものである、請求項３に記載のペプチド。
- 前記一般式［１’］又は一般式［２’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ又は（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍ（ｎ及びｍは前記に同じ）である、請求項４に記載のペプチド。
- ｎが９〜１６の整数、ｍが６である、請求項４又は５に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、一般式［１’’］又は［２’’］で示されるものである、請求項２に記載のペプチド。
- 前記一般式［１’’］又は一般式［２’’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ、（Ｌｙｓ）ｎ、（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ｍ、及び（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）ｍ（ｎ、ｍは前記に同じ）から選ばれるものである、請求項７に記載のペプチド。
- 前記一般式［１’’］又は一般式［２’’］中の（Ｘ１）ｎが、（Ａｒｇ）ｎ（ｎは前記に同じ）である、請求項８に記載のペプチド。
- ｎが９〜１６の整数、ｍが６である、請求項８又は９に記載のペプチド。
- 請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチド及びカチオン性脂質を含むトランスフェクション薬剤を含む、細胞のトランスフェクション用キット。
- 前記トランスフェクション薬剤が、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミドを含むものである、請求項１１に記載の細胞のトランスフェクション用キット。
- 請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチド及びトランスフェクション薬剤の存在下、インビトロで細胞と核酸とを接触させる工程を包含する、細胞に核酸をトランスフェクションする方法。
- 前記トランスフェクション薬剤が、カチオン性脂質を含むものである、請求項１３に記載の方法。
- 前記トランスフェクション薬剤が、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−４，５−ビス（ウンデシルチオ）ペンタンアミドを含むものである、請求項１３に記載の方法。
- 前記核酸がＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
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|---|---|
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| JP2001517939A (ja) * | 1997-03-14 | 2001-10-09 | ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド | ペプチドによって増強されるトランスフェクション |
| US20130149374A1 (en) * | 2010-05-14 | 2013-06-13 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Asymmetric Liposomes for the Highly Efficient Encapsulation of Nucleic Acids and Hydrophilic Anionic Compounds, and Method for Preparing Same |
| JP2013539360A (ja) * | 2010-07-30 | 2013-10-24 | キュアヴァック ゲーエムベーハー | トランスフェクションおよび免疫刺激のためのジスルフィド架橋されたカチオン性成分との核酸の複合体形成 |
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-
2017
- 2017-06-05 WO PCT/JP2017/020837 patent/WO2017213092A1/ja active Application Filing
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| J OF CONTROLLED RELEASE, 2012, VOL.158, PP.433-442, JPN6017023606, ISSN: 0004523330 * |
| MOL PHARMACEUTICS, 2014, VOL.11, PP.683-696, JPN6017023607, ISSN: 0004523331 * |
| 村上孝, "SCREENFECT Aによる遺伝子導入の特徴", 和光純薬時報, 2014, VOL.82, NO.3, PP.7-9, JPN6017032057, ISSN: 0004523332 * |
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|---|---|
| WO2017213092A1 (ja) | 2017-12-14 |
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