JPWO2017179232A1 - Hpvワクチン関連神経免疫異常症候群モデル動物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ヒトパピローマウイルス 6型L1タンパク質ウイルス様粒子:20μg
ヒトパピローマウイルス11型L1タンパク質ウイルス様粒子:40μg
ヒトパピローマウイルス16型L1タンパク質ウイルス様粒子:40μg
ヒトパピローマウイルス18型L1タンパク質ウイルス様粒子:20μg
L1タンパク質ウイルス様粒子(VLP)はDNAを持っていないためウイルス感染性がない。ガーダシル(登録商標)は,これらのVLPをアジュバントであるアルミニウムヒドロキシホスフェイト硫酸塩に吸着させ,緩衝剤及び安定剤と混合して,製剤化したものである。
11週齢メスマウスに,HPVワクチンであるガーダシル(登録商標)もしくはPBS50μlを皮下もしくは筋肉に投与した。2および24時間後,百日咳毒素(Ptx)(Hook Loboratories)334 ngもしくはPBS100μlを腹腔に投与し,血液脳関門を破壊した。ガーダシル(登録商標)は2週間おき,Ptxは6週間後に繰り返し投与し,臨床症状の観察を行った。3ヶ月後,麻酔下においてPBSおよび10%ホルマリン溶液で灌流し組織を採取した。
採取したマウスの脳を10%ホルマリンで固定後,定法によりパラフィン切片および凍結切片を作製し,ヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)およびクリューバー・バレラ染色(KB染色)を行った。
脳のパラフィン切片をin situ Apoptosis Detection Kit (Takara Bio)を用いてアポト−シス陽性細胞を検出した。対比染色として ヘマトキシリンで核を染色し,顕微鏡にて観察を行った。
脳のパラフィン切片を 0.1Mクエン酸バッファーで賦活化した後,10%BSA/PBS(−)で 1.5時間室温でブロッキングした。3%BSA/PBS(−)で希釈した1次抗体で1.5時間,2次抗体で30分反応し,ヒストファインDAB基質キット(ニチレイ)で発色した。マイヤーのヘマトキシリンで核の対比染色を行い,脱水,透徹,封入後,顕微鏡にて観察を行った。
1次抗体は,CD31 (abcam ab28304),NG2 (Millipore MAB5384),GFAP (abcam ab7620)であった。
2次抗体は,ヒストファイン シンプルステインMAX−PO (M),MAX−PO (R)であった。
九週齢の雌C57BL / 6マウスを,三共ラボ(日本)から購入し,ワクチン接種に使用した。マウスは東京医科大学の動物施設において標準的な条件下で維持し,食物および水を自由に与えた。全ての動物実験は,東京医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された(承認番号:S-27050及びS-28039)。または研究機関,科学界,および動物実験のための国のガイドラインに従って行った。
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)および百日咳毒素(Ptx)のための抗原は,フックラボラトリーズから購入し,HPVワクチン,及びガーダシルは,MSD K.K.から購入した。以下の抗体を,本研究において使用した。すなわち,メルクミリポア社(ドイツ)からの抗NG2抗体,アブカム(ケンブリッジ,UK)からの抗GFAPおよびCD31,及びセロテック(キドリントン,英国)からの抗体である。
11週齢の雌C57BL / 6マウスの群に,ガーダシルまたはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を100μl筋肉内に5回投与した。Ptxは,腹腔内に2および24時間後に投与した。ガーダシルワクチン又はPtxをそれぞれ,2週間または4週間間隔で投与した。対照として,製造業者の説明書(フック・ラボラトリーズ,USA)に従ってミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質35-55(MOG35-55)を用いてEAEを誘導した。
マウスを麻酔し,PBSおよびPBS中の10%ホルムアルデヒドで灌流した。脳を,その後除去し,10%ホルムアルデヒドで固定し,パラフィン包埋した。5マイクロメートルの断片を得て,脱パラフィン処理した。一般的な形態学的分析のために,ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)とクリューバー - バレラ(KB)染色を使用した。免疫組織化学的検証のために,クエン酸緩衝液中で加熱部によって抗原回復を行い,3%過酸化水素で切片をインキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。切片を,PBS中の10%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックし,一次抗体と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)とコンジュゲート二次抗体とのインキュベーション後,結合した抗体を,3,3ジアミノベンジジンを用いて検出した。染色した切片をヘマトキシリンで対比染色し,そして全ての画像をナノズーマー(浜松ホトニクス,日本)を用いて得た。
マウス脳をPBS中の10%ホルムアルデヒド中で固定し,パラフィン包埋した。断片を5μmに切断し,標準的な手順を使用して脱パラフィンした。TUNELアッセイは,インサイチュウでのアポトーシス検出キット(タカラバイオ株式会社,日本)を用いて行った。染色された切片をヘマトキシリンで対比染色した。
HPVワクチンの神経生理学的な効果を評価するため,39匹のメスマウスにガーダシル又はコントロール群としてPBSを投与した(図7A)。次に血液脳関門の調節を通した脳神経系へのアクセス作用を促進する為,Ptxを,ワクチン接種に続いて投与した(Kugler, S. et al. Pertussis toxin transiently affects barrier integrity, organelle organization and transmigration of monocytes in a human brain microvascular endothelial cell barrier model. Cellular microbiology 9, 619-632, doi:10.1111/j.1462-5822.2006.00813.x (2007).)。自己免疫性脳脊髄炎のコントロールとして,MOG35−55を用いた(Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nature reviews. Immunology 7, 904-912, doi:10.1038/nri2190 (2007).)。PBS又はPtxを投与したものに効果は現れず(グループ1,2),またPtxの作用でBBBを破損したものは効果が無かった。EAEグループのPtx投与を受けたマウス(グループ6)は,2週間以内に尾部麻痺,3週間後に後肢の運動麻痺が起こるなどといった多様な神経症状が現れた。トキシン投与を受けていないEAEグループ(グループ5)のマウスは,以前報告されたように軽度の神経症状を明らかにした(Hofstetter, H. H., Shive, C. L. & Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 169, 117-125 (2002).)。3度目のワクチン注射後(1度目の投与から4週間),グループ4のガーダシルとPtx投与を受けた16匹のマウスのうち3匹は,尾部の緊張が低下し,脱力運動が著しく減少した(図7-B)。症状の重症度はばらつくが,およそ60%のマウス(9/16)について,本実験全体にわたり尾部降下など類似した神経症状が現れた。Ptxは投与せず連続的にガーダシルを投与したグループ(グループ3)の10匹中2匹は,併用投与したグループに比べて尾部降下の穏やかな減少を示した。全体として,これらの結果はHPVワクチンが神経変性を誘発することを示唆する。
組織の解析は,ワクチン投与に伴う神経学的効果のさらなる研究として行われた。全体的に,そのグループは脳のサイズや重さに差異を示さなかった。連続した脳の解剖は,1度目のワクチン投与から12週間後の脳のHEおよびKB染色を経て行われた。HE染色法は,ガーダシル及びPtxを投与されたマウスの第三脳室の罹患を明らかにする(図8A上)。一方でEAEを投与されたマウスは,尾部及び後肢における重度の運動麻痺を示し,脳室の制限は現れなかった。同様に,Ptxのみの投与は脳室の狭窄を惹き起こさなかった。脳の背側の部分は全てのマウスで同様であり,それゆえ投与グループに影響されずに現れた。また小脳の形態学的な差異も検出されなかった。さらにネズミの前脳でも,KB染色した切片において差異は現れず(図8A下),ガーダシルは脱髄を含まないことを示している。染色によって,賦形剤またはガーダシル及びPtxを投与した連続的なネズミの前脳切片は,第三脳室の前脳の前方から後方まで広範囲にわたって著しく狭窄したことを明らかにした(図8−B)。全体として,私たちの解析は,PHVワクチンの接種は脳内の脳室の大きさ及び圧力に影響を与え得ることを示している。HPVワクチンの運動機能における効果と組織間作用の関係を確証する為に,第三脳室周囲の病理学的な差異を,ガーダシル及びPtxを投与したマウス間で比較した。ワクチンを投与したグループでは,第三脳室は尾部降下を示した全てのマウスにおいて狭窄していた。加えて第三脳室は,尾部により重度の緊張欠陥があるネズミにおいて,狭窄していたことをさらに示した(図8D)。HE染色したガーダシル及びPtxを投与したネズミの前脳の切片において,脳室周囲の視床下部の神経核は,コントロール群のマウスに比べると染色が少なかった(図8B,D)。KB染色もまた神経核及びニッスル小体の減少を明らかにした(図8C,D)。これらの結果は,第三脳室の閉鎖はHPVワクチン接種に伴い,また前脳の腹側において細胞数を減少させることを示す。
細胞数の減少に基づいて,前脳の腹側領域におけるHPVワクチン接種とアポトーシスとの間の関連性を評価することとした。これを行うために,我々は,前脳の切片のTUNELアッセイを行った。対象とPtx処理動物の切片から,限られた数の標識されたpf細胞を発見し,これからPtxが単独ではアポトーシスを誘導しないことを確認した。
次に,我々は,どのタイプの細胞が,アポトーシスによって影響を受けたかについて検討した。アポトーシス細胞は,血管の周囲に観察されたので,我々は,血管内皮細胞,周皮細胞およびアストロサイトのマーカーを使用して各部位を標識した。CD31発現細胞は,血管に結合したアポトーシス細胞と一致し(図10),一方でNG2−やGFAPを発現する細胞は染色されなかった。この結果は,HPVワクチンが,血管内皮細胞のアポトーシスを誘導することを示す。
Claims (5)
- 対象に,不活化したヒトパピローマウイルスと,百日咳毒素とを投与する工程を含む、HPVワクチン関連神経免疫異常症候群(HANS)モデル動物の製造方法。
- 請求項1に記載の方法であって,
前記対象が,マウスである,方法。 - 請求項2に記載の方法であって,
前記不活化したヒトパピローマウイルスが,遺伝子組換えヒトパピローマウイルス(HPV)6,11,16及び18型L1タンパク質ウイルス様粒子を含む,
方法。 - 請求項2に記載の方法であって,
前記不活化したヒトパピローマウイルスが,ヒトパピローマウイルスワクチンである,
方法。 - 請求項2に記載の方法であって,
前記不活化したヒトパピローマウイルスが,ガーダシル(登録商標)及びサーバリックス(登録商標)のいずれか又は両方である,
方法。
Applications Claiming Priority (3)
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JP2016082542 | 2016-04-16 | ||
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2016
- 2016-11-02 JP JP2018511877A patent/JP6807921B2/ja active Active
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