JPWO2016163560A1 - Digital holographic microscope - Google Patents
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Abstract
蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡が結合され、蛍光像と位相像を同時に３次元計測できるディジタルホログラフィック顕微鏡を提供する。第１のレーザ光５を用いて試料ステージ４を通過する物体光と通過しない参照光とを重ね合せた干渉光による位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系と、第２のレーザ光６を用いて蛍光励起光による蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系と、撮像手段３と、偏光依存性を有する２焦点フルネルレンズ（ＳＰＦＬ）２を備える。物体光と蛍光信号光とが同軸に重畳するように各々の光学系が配置され、重畳した光軸上に２重焦点レンズ２が配置される。撮像手段３が位相３次元像と蛍光３次元像をホログラムとして同時に取得する。位相３次元像と蛍光３次元像を分離してそれぞれの干渉強度分布から物体光と蛍光信号光を再構成する。A fluorescence holographic microscope and a phase image detection digital holographic microscope are combined to provide a digital holographic microscope capable of simultaneously measuring a fluorescence image and a phase image in three dimensions. A first holographic optical system that obtains a phase three-dimensional image by interference light obtained by superimposing the object light passing through the sample stage 4 and the reference light not passing by using the first laser light 5; and a second laser A second holographic optical system that obtains a fluorescence three-dimensional image by fluorescence excitation light using the light 6, an imaging unit 3, and a bifocal Fullel lens (SPFL) 2 having polarization dependency are provided. The respective optical systems are arranged so that the object light and the fluorescent signal light are coaxially superimposed, and the bifocal lens 2 is disposed on the superimposed optical axis. The imaging means 3 acquires a phase three-dimensional image and a fluorescence three-dimensional image simultaneously as a hologram. The phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image are separated, and the object light and the fluorescence signal light are reconstructed from the respective interference intensity distributions.
Description
本発明は、蛍光と位相を同時に３次元計測できるディジタルホログラフィック顕微鏡に関するものである。 The present invention relates to a digital holographic microscope capable of simultaneously measuring three-dimensional fluorescence and phase.
生きた細胞の動的３次元イメージングは、バイオ応用分野において重要な計測技術である。例えば、蛍光顕微鏡を使って細胞核中の特定ＤＮＡに蛍光分子を導入し、有糸分裂する細胞の変化を計測する蛍光標識技術が知られている。蛍光分子で染色された細胞内の核やタンパク質の相互作用を可視化することで様々な観測が可能になる。蛍光３次元像を高分解能かつ高コントラストで計測できるものとして、共焦点レーザ走査型顕微鏡が知られている。しかし、共焦点レーザ走査型顕微鏡では計測物体の一点ごとに集光点の走査が必要なため、蛍光３次元像を得るためには時間がかかり、動的物体の変化が速い現象の計測や奥行き位置が異なる複数の細胞の同時計測は不向きであるという本質的な限界がある。
また、蛍光像でだけでなく細胞核や細胞壁などの構造を同時に観察する技術も求められている。構造観察の手段として、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡などがある。位相差像は透明物体の形状測定に有効である。Dynamic three-dimensional imaging of living cells is an important measurement technique in the field of bioapplications. For example, a fluorescent labeling technique is known in which a fluorescent molecule is introduced into specific DNA in a cell nucleus using a fluorescence microscope, and changes in cells undergoing mitosis are measured. Visualization of the interaction between nuclei and proteins in cells stained with fluorescent molecules enables various observations. A confocal laser scanning microscope is known as one capable of measuring a three-dimensional fluorescence image with high resolution and high contrast. However, since the confocal laser scanning microscope requires scanning of the focal point for each point of the measurement object, it takes time to obtain a three-dimensional fluorescence image, and measurement of depth and depth of a dynamic object is fast. There is an essential limitation that simultaneous measurement of a plurality of cells at different positions is not suitable.
There is also a need for a technique for simultaneously observing not only the fluorescence image but also the structure of the cell nucleus and cell wall. Structural observation means include a phase contrast microscope and a differential interference microscope. The phase contrast image is effective for measuring the shape of a transparent object.
蛍光像および位相像を同時観察することができれば、異なる情報を同時に取得することができるため、バイオ反応においてより詳細な情報を提供することが可能になる。
最近では、蛍光像および位相差像を同時観察可能な光学顕微鏡が市販されているが、フィルタの入れ替えが必要な上、一度の計測範囲は１点もしくは２次元に限られるといった制約がある。If the fluorescence image and the phase image can be observed at the same time, different information can be acquired at the same time, so that more detailed information can be provided in the bioreaction.
Recently, an optical microscope capable of simultaneously observing a fluorescence image and a phase difference image is commercially available. However, a filter needs to be replaced, and there is a restriction that a measurement range is limited to one point or two dimensions.
一方、瞬時的な３次元計測を可能とするツールとして、ディジタルホログラフィック顕微鏡（Digital Holographic Microscope；ＤＨＭ）が知られている。ディジタルホログラフィック顕微鏡では、３次元情報をホログラム情報として取得し、計算機内で光波の逆伝搬計算を行うことで奥行き位置に対する物体の光波情報を再構成する。ディジタルホログラフィック顕微鏡の特徴としては、特殊な蛍光染色が必要なく生体細胞の３次元観察が可能であること（ラベルフリー）、計算機再構成により焦点位置を任意に変更できるオートフォーカシング機能を有すること、定量的位相計測が可能であることが挙げられる。このため、３次元的に細胞が動くような状況においても、再構成計算により自動的にピントの合った再構成画像を得ることができる。 On the other hand, a digital holographic microscope (DHM) is known as a tool that enables instantaneous three-dimensional measurement. In the digital holographic microscope, three-dimensional information is acquired as hologram information, and light wave information of the object with respect to the depth position is reconstructed by performing back propagation calculation of the light wave in the computer. The characteristics of the digital holographic microscope are that it does not require special fluorescent staining and enables three-dimensional observation of living cells (label-free), and has an auto-focusing function that can arbitrarily change the focal position by computer reconstruction. It is mentioned that quantitative phase measurement is possible. For this reason, even in a situation where cells move three-dimensionally, it is possible to obtain a reconstructed image in focus automatically by reconstructing calculation.
ディジタルホログラフィック顕微鏡を細胞観察に応用する場合、蛍光情報のホログラム取得が必要となるが、蛍光を用いてホログラフィー技術を実現するためには、蛍光が非常に干渉しにくいインコヒーレント光であるという問題がある。近年、インコヒーレント光からホログラムを作る方法が次々に提案されており、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡（Fluorescence Digital Holographic Microscope；ＦＤＨＭ)に向けた研究が世界中で活性化しているが、空間光変調素子や光学素子を多く有するものが大半である（例えば、特許文献１を参照）。 When applying a digital holographic microscope to cell observation, it is necessary to acquire a hologram of fluorescence information. However, in order to realize holography technology using fluorescence, the problem is that the fluorescence is incoherent light that is very unlikely to interfere. There is. In recent years, methods for making holograms from incoherent light have been proposed one after another, and research toward a Fluorescence Digital Holographic Microscope (FDHM) has been activated all over the world. Most have many optical elements (for example, refer patent document 1).
特許文献１に開示されたホログラム記録装置は、干渉性の低い光（例えば自然光または蛍光等）を観察することができないといった問題を解決するものであり、空間光変調器（波面変調素子）を用いて、互いに偏光方向が異なる第１成分光および第２成分光を含む物体光を、第１成分光の波面形状と第２成分光の波面形状を異なる形状にし、第１成分光に対する第２成分光の位相シフト量に、空間的に周期的に変化する分布を生じさせて、第１成分光と第２成分光とを干渉させてホログラムを形成するものである。これにより、単一の光路を通る干渉性の低い光を用いて、１回の撮像で記録されるホログラムから、被写体の再生像を得ることができるものである。しかしながら、この方法では、干渉性の低い蛍光３次元像の観察に限定されるといった問題がある。 The hologram recording apparatus disclosed in Patent Document 1 solves the problem that light with low coherence (for example, natural light or fluorescence) cannot be observed, and uses a spatial light modulator (wavefront modulation element). Thus, the object light including the first component light and the second component light having different polarization directions are made to have different wavefront shapes of the first component light and the second component light, and the second component with respect to the first component light. In the phase shift amount of light, a distribution that periodically changes in space is generated, and the first component light and the second component light are caused to interfere with each other to form a hologram. As a result, a reproduced image of the subject can be obtained from a hologram recorded by one imaging using light having low coherence passing through a single optical path. However, this method has a problem that it is limited to observation of a three-dimensional fluorescence image with low coherence.
また、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡（ＦＤＨＭ）は、ターゲッティング計測には適しているが、蛍光を発生しない物質に対しては無力であるという問題がある。また、蛍光観察を行う場合に、有害な蛍光分子を使うために計測対象が制限される問題も生じる。そのため、ディジタルホログラフィック顕微鏡（ＤＨＭ）の応用拡大といった視点で見ると、位相像や蛍光像さらには偏光などの多様な情報が観測可能なマルチモーダル（multimodal）ディジタルホログラフィック顕微鏡の登場が望まれている。 In addition, a fluorescence digital holographic microscope (FDHM) is suitable for targeting measurement, but has a problem that it is ineffective for a substance that does not generate fluorescence. In addition, when performing fluorescence observation, there is also a problem that a measurement target is limited because harmful fluorescent molecules are used. Therefore, from the viewpoint of expanding the application of the digital holographic microscope (DHM), the appearance of a multimodal digital holographic microscope capable of observing various information such as phase images, fluorescent images, and polarized light is desired. Yes.
本発明者らは、マルチモーダルディジタルホログラフィック顕微鏡の実現を目指し、蛍光２次元像と位相イメージングが可能なディジタルホログラフィック顕微鏡を既に試作して実験にホログラム画像から再構成している（非特許文献１を参照）。試作した顕微鏡は、蛍光像と位相像を逐次的に取得するものであり、蛍光像と位相像を同時に計測するものではない。
以下、本明細書において、特に断らない限り、蛍光像と蛍光３次元像、位相像と位相３次元像は、それぞれ同じ意味で用いている。The present inventors have already prototyped a digital holographic microscope capable of two-dimensional fluorescence imaging and phase imaging and reconstructed it from a hologram image for the purpose of realizing a multimodal digital holographic microscope (Non-Patent Document). 1). The prototype microscope acquires a fluorescent image and a phase image sequentially, and does not measure the fluorescent image and the phase image at the same time.
Hereinafter, unless otherwise specified, in this specification, a fluorescence image and a fluorescence three-dimensional image, and a phase image and a phase three-dimensional image are used in the same meaning.
上述の試作のディジタルホログラフィック顕微鏡では、蛍光顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡の機能を併せ持つが、シャッターを切替えてそれぞれの像を逐次的に取得するものであり、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡が結合されたものではなく、蛍光像と位相像を同時に３次元計測できるというものではない。
かかる状況に鑑みて、本発明は、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡が結合され、蛍光像と位相像を同時に３次元計測できるディジタルホログラフィック顕微鏡を提供することを目的とする。The prototype digital holographic microscope described above has the functions of both a fluorescence microscope and a phase image detection digital holographic microscope, but each image is acquired sequentially by switching the shutter. It is not a combination of an image detection digital holographic microscope and does not mean that a fluorescence image and a phase image can be measured three-dimensionally at the same time.
In view of such circumstances, an object of the present invention is to provide a digital holographic microscope in which a fluorescence digital holographic microscope and a phase image detection digital holographic microscope are combined, and a fluorescence image and a phase image can be simultaneously measured three-dimensionally. .
上記課題を達成すべく、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡は、下記１）〜４）を備える。
１）第１のレーザ光を用いて観察対象試料を通過する物体光と通過しない参照光とを重ね合せた干渉光による位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系
２）第２のレーザ光を用いて観察対象試料の蛍光励起光による蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系
３）撮像手段
４）偏光依存性を有する２重焦点レンズIn order to achieve the above object, a digital holographic microscope of the present invention comprises the following 1) to 4).
1) First holographic optical system 2 that acquires a phase three-dimensional image by interference light obtained by superimposing object light that passes through the observation target sample and reference light that does not pass using the first laser light 2) Second Second holographic optical system for acquiring a three-dimensional fluorescence image of the sample to be observed by the fluorescence excitation light using laser light 3) Imaging means 4) Double focus lens having polarization dependence
そして、物体光と蛍光信号光とが同軸に重畳するように各々の光学系が配置され、重畳した光軸上に上記４）の２重焦点レンズが配置される。撮像手段が位相３次元像と蛍光３次元像をホログラムとして同時に取得する。撮像手段により取得されたホログラム像から、位相３次元像と蛍光３次元像を分離してそれぞれの干渉強度分布から物体光と蛍光信号光を再構成する。 Then, the respective optical systems are arranged so that the object light and the fluorescent signal light are superimposed on the same axis, and the bifocal lens of 4) is arranged on the superimposed optical axis. An imaging means simultaneously acquires a phase three-dimensional image and a fluorescence three-dimensional image as a hologram. The phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image are separated from the hologram image acquired by the imaging means, and the object light and the fluorescence signal light are reconstructed from the respective interference intensity distributions.
上記構成によれば、観察対象試料から位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系と、蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系との２つの光学系を共通光路として、物体光と蛍光信号光を同軸に重畳させて、１つの撮像手段で２つのホログラム像を取得できる。
ここで、偏光依存性を有する２重焦点レンズとは、光電場の偏光方向に強い異方性を持ち、かつ、２つの焦点距離を持つレンズである。According to the above configuration, the two optical systems of the first holographic optical system that acquires the phase three-dimensional image from the observation target sample and the second holographic optical system that acquires the fluorescent three-dimensional image are used as a common optical path. The two hologram images can be acquired by one imaging means by superimposing the object light and the fluorescent signal light on the same axis.
Here, the double-focus lens having polarization dependence is a lens having strong anisotropy in the polarization direction of the photoelectric field and having two focal lengths.
偏光依存性を有する２重焦点レンズとして、サブ波長周期構造の２焦点フレネルレンズ（Sub-wavelength Periodic structured Fresnel Lens；ＳＰＦＬ）が好適に用いられる。ＳＰＦＬの場合、光の波長よりも短い周期の回折格子構造であるサブ波長周期構造によって、光波の偏光状態によって回折を受けることになる。また、フレネルレンズは、通常のレンズを光の波長で折り返し厚みを減らしたレンズであり、断面は鋸状でありプリズムを並べたような形になる。２焦点フレネルレンズは、１つのビーム光を２つに分けて回折させ、異なる場所で焦点を合わせる機能を持つ。 As the bifocal lens having polarization dependency, a sub-wavelength periodic structured Fresnel lens (SPFL) having a sub-wavelength periodic structure is preferably used. In the case of SPFL, the subwavelength periodic structure, which is a diffraction grating structure having a shorter period than the wavelength of light, is diffracted by the polarization state of the light wave. In addition, the Fresnel lens is a lens in which a normal lens is folded back with the wavelength of light to reduce the thickness, and the cross section is a saw-like shape in which prisms are arranged. The bifocal Fresnel lens has a function of diffracting one beam light into two parts and focusing on different places.
また、偏光依存性を有する２重焦点レンズとして、液晶空間光変調素子を用いても良い。液晶空間光素子では、液晶分子の配向により入射光電場の偏光状態に対して異なる働きを生じさせることができる。例えば、ある方向の直線偏光に対して常光線として作用するときに、それに垂直な直線偏光に対して異常光線として作用する。そのため、特定の直線偏光方向に対してのみ作用する偏光依存性のある２重焦点レンズを実現できる。
なお、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡における蛍光信号光は、液晶空間光変調素子で実現される２重レンズによって、２つの回折光が生じることになる。この２つの回折光は、共に同じ偏光であり、自己干渉が生じる。この点で、偏光方向が異なる第１成分光と第２成分光とを干渉させてホログラムを形成する上述の特許文献１における空間光変調素子とは機能が異なる（本発明の場合、蛍光ホログラム用の蛍光信号光、位相ホログラム用の物体光が、特許文献１の第１成分光と第２成分光に相当するものである。）。Further, a liquid crystal spatial light modulator may be used as a double focus lens having polarization dependency. In the liquid crystal spatial light element, different actions can be generated with respect to the polarization state of the incident photoelectric field depending on the orientation of the liquid crystal molecules. For example, when acting as an ordinary ray with respect to linearly polarized light in a certain direction, it acts as an extraordinary ray with respect to linearly polarized light perpendicular thereto. Therefore, it is possible to realize a double-focus lens having polarization dependency that acts only on a specific linear polarization direction.
The fluorescent signal light in the digital holographic microscope of the present invention generates two diffracted lights by the double lens realized by the liquid crystal spatial light modulator. Both of these two diffracted lights have the same polarization, and self-interference occurs. In this respect, the function differs from the spatial light modulation element in Patent Document 1 described above that forms a hologram by causing the first component light and the second component light having different polarization directions to interfere with each other (in the case of the present invention, for the fluorescence hologram). The fluorescent signal light and the object light for phase hologram correspond to the first component light and the second component light of Patent Document 1.)
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡において、偏光依存性を有する２重焦点レンズは、第２のホログラフィック光学系にのみ作用し、第１のホログラフィック光学系には作用しないように設計される。
位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系の物体光の偏光には感度がなく、レンズ作用を起こすことがないように２重焦点レンズを設計すると共に、蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系の蛍光の偏光には強い感度を持たせるように設計する。第２のホログラフィック光学系の蛍光の偏光は、２つの焦点距離をもつ２重焦点レンズによって、自己干渉が生じることになる。In the digital holographic microscope of the present invention, the double-focus lens having polarization dependency is designed so as to act only on the second holographic optical system and not on the first holographic optical system.
The bifocal lens is designed so that the polarization of the object light of the first holographic optical system that acquires the phase three-dimensional image is insensitive and does not cause lens action, and the fluorescence three-dimensional image is acquired. The second holographic optical system is designed to have a strong sensitivity to the polarization of fluorescence. The polarization of the fluorescence of the second holographic optical system will cause self-interference due to the bifocal lens having two focal lengths.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、蛍光３次元像は同心円状ホログラムであり、位相３次元像は等傾角ホログラムであり、空間周波数面において蛍光３次元像と位相３次元像とを分離する。
蛍光３次元像は、第２のホログラフィック光学系の蛍光の偏光が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。一方、位相３次元像は、等傾角干渉を用いることによってキャリア周波数をもつ干渉パターンにすることができる。同心円状干渉パターンと等傾角干渉パターンは、空間周波数面で分離することが可能であり、撮像手段により撮像した像から、蛍光３次元像と位相３次元像を空間周波数面で分離することができる。２つのホログラムパターンをフーリエ変換することで、空間周波数面で、等傾角干渉パターンの成分をバンドパスフィルタによって抽出することができる。予め、等傾角干渉パターンに用いた参照光強度分布を取得しておくことで、同心円状干渉パターンのみを抽出することが可能になる。In the digital holographic microscope of the present invention, the fluorescence three-dimensional image is a concentric hologram, the phase three-dimensional image is an equiangular hologram, and separates the fluorescence three-dimensional image and the phase three-dimensional image on the spatial frequency plane.
Since the fluorescence polarization of the second holographic optical system self-interferences in the three-dimensional fluorescence image, the interference pattern is concentric. On the other hand, the phase three-dimensional image can be formed into an interference pattern having a carrier frequency by using equi-tilt interference. The concentric interference pattern and the equiangular interference pattern can be separated on the spatial frequency plane, and the three-dimensional fluorescence image and the three-dimensional phase image can be separated on the spatial frequency plane from the image captured by the imaging means. . By Fourier transforming the two hologram patterns, the components of the equi-tilt interference pattern can be extracted by a bandpass filter on the spatial frequency plane. By acquiring the reference light intensity distribution used for the equi-tilt interference pattern in advance, it is possible to extract only the concentric interference pattern.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡において、第２のホログラフィック光学系は、励起用レーザ光源が切替可能であることでもよい。観察対象試料の蛍光特性に応じて、励起用レーザ光源の波長を切り替えるようにする。これにより、蛍光染色試薬の種類に応じて、励起用レーザ光源を切替えて使用することにより、ターゲットとなる細胞を選択して分裂や形状変化などの細胞の状態変化を計測できる。
すなわち、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、一の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、他の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、同時に取得した位相３次元像とから、細胞の挙動を観察する細胞観察方法を実現できる。In the digital holographic microscope of the present invention, the second holographic optical system may be capable of switching the excitation laser light source. The wavelength of the excitation laser light source is switched according to the fluorescence characteristics of the observation target sample. Thus, by switching the excitation laser light source according to the type of fluorescent staining reagent, it is possible to select a target cell and measure cell state changes such as division and shape change.
That is, using the digital holographic microscope of the present invention, a fluorescence three-dimensional image acquired using one excitation laser light source and a fluorescence three-dimensional image acquired using another excitation laser light source were simultaneously acquired. From the three-dimensional phase image, a cell observation method for observing cell behavior can be realized.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、第１のホログラフィック光学系が透過型であり、第２のホログラフィック光学系が反射型（落射型）にすることが好ましい。また、第１及び第２のホログラフィック光学系は、共に試料の設置状態により上下を反転させても構わない。
観察対象試料の蛍光励起光による蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系において、蛍光信号は微弱であるので、透過型にした場合に、強い蛍光励起光だけをカットするのは非常に困難になるからである。
第２のホログラフィック光学系を反射型（落射型）でなく透過型にする場合は、蛍光信号を励起する蛍光励起光を十分にカットし、蛍光信号のみを通過させるダイクロイックミラーや蛍光波長の特定の波長および位相計測のためのレーザ波長を通過させるバンドパスフィルタを用いる必要がある。In the digital holographic microscope of the present invention, it is preferable that the first holographic optical system is a transmission type and the second holographic optical system is a reflection type (an epi-illumination type). In addition, both the first and second holographic optical systems may be turned upside down depending on the sample installation state.
In the second holographic optical system that acquires a three-dimensional fluorescence image of the sample to be observed by fluorescence excitation light, the fluorescence signal is very weak. Therefore, when the transmission type is used, it is very difficult to cut only strong fluorescence excitation light. This is because it becomes difficult.
When the second holographic optical system is made to be a transmission type instead of a reflection type (epi-illumination type), the fluorescence excitation light that excites the fluorescence signal is sufficiently cut, and the dichroic mirror that passes only the fluorescence signal or the specification of the fluorescence wavelength It is necessary to use a band-pass filter that passes the laser wavelength for phase measurement and phase measurement.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡において、細胞観察の際は、蛍光３次元像により細胞核の時空間情報を、位相３次元像により細胞核や細胞壁の時空間構造を同時に取得することが好ましい。
複数の物理量から得られる多次元情報は、従来のバイオイメージング分野における計測では得られておらず、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡によって、従来不可能であった観察を可能にする。本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡は、バイオイメージング分野における強力な計測ルールとして、蛍光３次元像と位相３次元像を同時かつ高速撮影することを可能にする。
すなわち、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、蛍光３次元像により細胞核の時空間情報と、位相３次元像により細胞核や細胞壁の時空間構造とを同時に取得する細胞観察方法を実現できる。In the digital holographic microscope of the present invention, when observing cells, it is preferable to simultaneously acquire spatiotemporal information of cell nuclei from a three-dimensional fluorescence image and spatiotemporal structures of cell nuclei and cell walls from a three-dimensional phase image.
Multidimensional information obtained from a plurality of physical quantities has not been obtained by measurement in the conventional bioimaging field, and enables observation that has been impossible with the digital holographic microscope of the present invention. The digital holographic microscope of the present invention enables simultaneous and high-speed photographing of a three-dimensional fluorescence image and a three-dimensional phase image as a powerful measurement rule in the field of bioimaging.
That is, by using the digital holographic microscope of the present invention, it is possible to realize a cell observation method that simultaneously acquires spatiotemporal information of cell nuclei from a fluorescence three-dimensional image and spatiotemporal structures of cell nuclei and cell walls from a phase three-dimensional image.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡によれば、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡が結合され、蛍光３次元像と位相３次元像を同時に計測できるといった効果がある。 According to the digital holographic microscope of the present invention, the fluorescence digital holographic microscope and the phase image detection digital holographic microscope are combined, and there is an effect that the fluorescence three-dimensional image and the phase three-dimensional image can be measured simultaneously.
以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。 Hereinafter, an example of an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. The scope of the present invention is not limited to the following examples and illustrated examples, and many changes and modifications can be made.
図1は、ディジタルホログラフィック顕微鏡の一実施形態の光学系の構成を示す。図１に示すディジタルホログラフィック顕微鏡は、図２に示す透過型ディジタルホログラフィック顕微鏡と、図３で示す反射型蛍光顕微鏡との２つの光学系を共通光路として、物体光と蛍光信号光を同軸に重畳させて、１つの撮像手段で位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得できるようにしたものである。 FIG. 1 shows a configuration of an optical system according to an embodiment of a digital holographic microscope. The digital holographic microscope shown in FIG. 1 uses the two optical systems of the transmission type digital holographic microscope shown in FIG. 2 and the reflection type fluorescence microscope shown in FIG. Two holograms of a phase three-dimensional image and a fluorescence three-dimensional image can be simultaneously acquired by one image pickup unit by superimposing them.
先ず、波長３５５ｎｍから５５０ｎｍの帯域の励起用レーザ光源６を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する。励起された蛍光分子は、波長３５５ｎｍから５５０ｎｍの帯域の励起用レーザ光源より長波長の蛍光信号を発し、試料ステージ４のガラス基板表面で反射された励起用レーザ光とともに対物レンズ１５に入射する。なお、ダイクロイックミラー１６を設置し、励起用レーザ光を十分に減衰させ、蛍光信号光を強調して蛍光３次元像を取得する。
蛍光３次元像は、２重焦点レンズである２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。ＳＰＦＬ２は、図７に示すように、２つの焦点距離（ｆ１，ｆ２）を持つサブ波長周期構造のフレネルレンズである。光の波長よりも短い周期の回折格子構造（サブ波長周期構造）によって、光波はその偏光状態によって回折を受けることになる。１つのビーム光は、２つの焦点距離をもつフレネルレンズにより、２つの回折波が生成される。そして、２つの回折波は異なる場所で焦点が合うことになる。First, the fluorescent molecules of the observation target sample on the sample stage 4 are excited using the excitation laser light source 6 in the wavelength band of 355 nm to 550 nm. The excited fluorescent molecules emit a fluorescent signal having a long wavelength from an excitation laser light source having a wavelength band of 355 nm to 550 nm, and enter the objective lens 15 together with the excitation laser light reflected from the glass substrate surface of the sample stage 4. A dichroic mirror 16 is installed to sufficiently attenuate the excitation laser light and emphasize the fluorescent signal light to obtain a fluorescent three-dimensional image.
In the fluorescence three-dimensional image, the polarization component of fluorescence self-interfers with the bifocal Fresnel lens (SPFL) 2 that is a bifocal lens, so that the interference pattern is concentric. As shown in FIG. 7, the SPFL2 is a Fresnel lens having a sub-wavelength periodic structure having two focal lengths (f 1 , f 2 ). Due to the diffraction grating structure (subwavelength periodic structure) having a period shorter than the wavelength of light, the light wave is diffracted by its polarization state. One diffracted wave is generated from one light beam by a Fresnel lens having two focal lengths. The two diffracted waves are in focus at different locations.
また同時に、波長６３３（ｎｍ）のＨｅ−Ｎｅレーザ光源５を用いて試料ステージ４上の観察対象試料の計測物体を照明する。Ｈｅ−Ｎｅレーザ光はビームスプリッター１２により、それぞれ計測物体を透過する物体光経路と、何もない参照光経路に分けられ、マッハ・ツェンダー干渉計を構成している。計測物体を透過するＨｅ−Ｎｅレーザ光の波長が波長３５５ｎｍから５５０ｎｍの帯域の励起用レーザ光の波長より長いため、ダイクロイックミラー１６に影響されずに伝搬され、再びビームスプリッター１８により参照光と干渉することができる。この際、物体光と参照光の間にわずかに角度をつけることによって、オフアクシス（off-axis）ホログラム、すなわち等傾角干渉パターンのホログラムを取得する。取得した等傾角干渉パターンのホログラムから、フーリエ変換法を用いて物体光の振幅分布と位相分布を抽出する。オフアクシス法では元の物体位置まで逆伝搬させることにより、観察対象試料の物体光の波面が再生されることになる。 At the same time, the measurement object of the sample to be observed on the sample stage 4 is illuminated using the He—Ne laser light source 5 having the wavelength 633 (nm). The He-Ne laser light is divided into an object light path that passes through the measurement object and an empty reference light path by the beam splitter 12 to constitute a Mach-Zehnder interferometer. Since the wavelength of the He—Ne laser beam that passes through the measurement object is longer than the wavelength of the excitation laser beam in the wavelength band of 355 nm to 550 nm, it is propagated without being affected by the dichroic mirror 16 and is again interfered with the reference beam by the beam splitter 18. can do. At this time, an off-axis hologram, that is, a hologram having an equitilt interference pattern is obtained by slightly setting an angle between the object beam and the reference beam. The amplitude distribution and the phase distribution of the object light are extracted from the acquired hologram of the equal inclination interference pattern using the Fourier transform method. In the off-axis method, the wavefront of the object light of the observation target sample is reproduced by propagating back to the original object position.
そして、撮像手段として用いるイメージセンサ３で、位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得する。
上述の如く、蛍光３次元像は、２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。一方、位相３次元像は、等傾角干渉パターンとなる。同心円状干渉パターンと等傾角干渉パターンは、空間周波数面で分離することが可能であり、イメージセンサ３により撮像した像から、位相３次元像の位相ホログラムと蛍光３次元像の蛍光ホログラムとを空間周波数面で分離することができる。
ＳＰＦＬ２を設けることにより、位相ホログラム用の光が影響を受けないように、１／２波長板２０を設け、位相ホログラム用の光の偏光をＳＰＦＬ２によって影響しない偏光状態に合わせている。また、１／２波長板２１を設けて、蛍光励起用光源の偏光方向をＳＰＦＬ２が働く偏光方向に合せている。Then, two holograms of a phase three-dimensional image and a fluorescence three-dimensional image are simultaneously acquired by the image sensor 3 used as an imaging unit.
As described above, since the fluorescence polarization component self-interferences with the bifocal Fresnel lens (SPFL) 2 in the three-dimensional fluorescence image, the interference pattern is concentric. On the other hand, the phase three-dimensional image becomes an equitilt interference pattern. The concentric interference pattern and the equi-angle interference pattern can be separated on the spatial frequency plane, and the phase hologram of the phase three-dimensional image and the fluorescence hologram of the fluorescence three-dimensional image are spatially separated from the image captured by the image sensor 3. It can be separated in terms of frequency.
By providing the SPFL2, a half-wave plate 20 is provided so that the phase hologram light is not affected, and the polarization of the phase hologram light is adjusted to a polarization state that is not affected by the SPFL2. In addition, a half-wave plate 21 is provided to align the polarization direction of the fluorescence excitation light source with the polarization direction in which the SPFL 2 works.
ここで、位相ホログラムと蛍光ホログラムが重畳した信号は、下記数式１のように示すことができる。 Here, the signal in which the phase hologram and the fluorescence hologram are superimposed can be expressed as the following Equation 1.
上記数式１において、ｏpは位相ホログラム用の物体光波の複素振幅分布を表し、ｒpは参照光波の複素振幅分布を表す。また、ｏＦは２重焦点レンズに入射する蛍光ホログラム用物体光波の複素振幅分布である。ここで、ｆ１，ｆ２は２重焦点レンズの２つの焦点距離を示す。また、ｇはレンズの位相関数および撮像面までのフレネル回折伝搬を表す関数である。
ｒpが下記数２で表される平面波であるとすると、位相ホログラムはオフアクシス型ホログラムとなる。そこで、位相ホログラムの抽出は、上記数式１をフーリエ変換して、空間周波数面で行うことができる。In the above equation 1, o p represents the complex amplitude distribution of the object light wave for phase holograms, r p represents the complex amplitude distribution of the reference light wave. Further, o F is a complex amplitude distribution of the object light wave for a fluorescence hologram incident on the double focus lens. Here, f 1 and f 2 indicate two focal lengths of the bifocal lens. G is a function representing the phase function of the lens and the Fresnel diffraction propagation to the imaging surface.
If r p is assumed to be a plane wave expressed by the following Expression 2, the phase hologram is the off-axis hologram. Therefore, the extraction of the phase hologram can be performed on the spatial frequency plane by Fourier transforming the above Equation 1.
上記数式１をフーリエ変換したものを下記数式３に示す。ここで、Ａは位相ホログラム用の参照光の振幅である。図４（１）は、位相ホログラムと蛍光ホログラムの２つのホログラムが重畳した干渉画像であり、下記数式３を図示化したものである。下記数式３の右辺の第１，２，５，６，７，８項は自己干渉の同心円状ホログラムによる項であり、空間周波数面で原点付近に現れる信号となる（図４（２）を参照）。また、右辺の第３，４項はオフアクシスホログラムによる項であり、空間周波数面で原点からずれた位置に存在する信号となる（図４（２）を参照）。このため、ウィンドウ関数を掛けることにより、図４（２）に示す空間周波数面で、原点付近に現れる蛍光ホログラムと、原点からずれた位置に存在する位相ホログラムの２つのホログラムを分離する（図４（３）を参照）。したがって、オフアクシスホログラムによる項である右辺の第３，４項を、それぞれ、下記数式４と数式５のように取り出すことができる。 Formula 3 below is the result of Fourier transform of Formula 1 above. Here, A is the amplitude of the reference light for the phase hologram. FIG. 4A is an interference image in which two holograms of a phase hologram and a fluorescence hologram are superimposed, and illustrates the following Equation 3. The first, second, fifth, sixth, seventh and eighth terms on the right side of Equation 3 below are terms based on self-interference concentric holograms, which are signals appearing near the origin on the spatial frequency plane (see FIG. 4 (2)). ). Further, the third and fourth terms on the right side are terms based on an off-axis hologram, and are signals present at positions shifted from the origin on the spatial frequency plane (see FIG. 4 (2)). Therefore, by multiplying the window function, the two holograms of the fluorescence hologram that appears near the origin and the phase hologram that exists at a position shifted from the origin are separated on the spatial frequency plane shown in FIG. 4B (FIG. 4). (See (3)). Therefore, the third and fourth terms on the right side, which are terms based on the off-axis hologram, can be extracted as in the following equations 4 and 5.
ここで、位相ホログラム用の参照光の振幅Ａは、予め測定することが可能であるため、上記数式４と数式５から位相ホログラムの物体光ｏpとその複素共役分布を求めることができる。上記数式３に上記数式４と数式５を代入して、蛍光ホログラムとして下記数式６を得る。
ここで、上記数式３における、Ｇ１とＧ２は、それぞれ、ｇ（ＯＦ（ｘ，ｙ），ｆ１）とｇ（ＯＦ（ｘ，ｙ），ｆ２）のフーリエ変換を表している。Here, the amplitude A of the reference light phase hologram, since it is possible to previously measured, it is possible to find the object beam o p and its complex conjugate distribution phase hologram from the equation 4 and equation 5. By substituting the above formulas 4 and 5 into the above formula 3, the following formula 6 is obtained as a fluorescence hologram.
Here, G 1 and G 2 in Equation 3 above represent Fourier transforms of g (O F (x, y), f 1 ) and g (O F (x, y), f 2 ), respectively. Yes.
上述の如く、位相ホログラムと蛍光ホログラムの２つのパターンをフーリエ変換することにより、空間周波数面で原点からずれた位置に存在する信号の等傾角干渉パターンの成分を、バンドパスフィルタによって抽出することができる。また、予め等傾角干渉パターンに用いた参照光の強度分布を取得しておくことで、同心円状の干渉パターンのみを抽出することが可能になる。 As described above, by performing Fourier transform on the two patterns of the phase hologram and the fluorescence hologram, it is possible to extract the component of the equiangular interference pattern of the signal existing at the position shifted from the origin on the spatial frequency plane by the band pass filter. it can. Also, by acquiring the intensity distribution of the reference light used for the equi-angle interference pattern in advance, it is possible to extract only the concentric interference pattern.
（撮像したホログラムの一例）
ここで、撮像したホログラムの一例を示す。イメージセンサ３は、Photometrics社のCoolSNAPKINO-SPK(4.54μm ピッチ、14bit) を使用した。また、対物レンズ１５は、オリンパス社製ＭＤＰｌａｎ４０（ＮＡ＝０．６５）の４０倍の対物レンズを使用した。観察対象としては、Invitrogen 社のTetraSpeck（登録商標）の 直径４μｍの蛍光ビーズを使用した。(Example of imaged hologram)
Here, an example of the imaged hologram is shown. The image sensor 3 used was Photometrics CoolSNAPKINO-SPK (4.54 μm pitch, 14 bits). The objective lens 15 used was an objective lens 40 times as large as MDPlan 40 (NA = 0.65) manufactured by Olympus. As an observation object, TetraSpeck (registered trademark) fluorescent beads of 4 μm in diameter from Invitrogen were used.
蛍光励起中心波長５３２（ｎｍ）、蛍光の中心波長５５０（ｎｍ）で、蛍光像と位相ホログラムを個別にイメージセンサで取得したホログラムのイメージの一例を図５に示す。
図５（１）が蛍光ビーズのホログラム画像であり（蛍光ビーズの部分を拡大した図も付記）、それをフーリエ変換して、図５（２）の空間周波数面を得る。空間周波数面の原点からずれた位置に存在するホログラムを抽出し、図５（３）の位相分布を取得する（拡大位相像も付記）。
図５（４）は、再構成された位相分布の３次元表示を示している。図５（４）から、蛍光ビーズの位相変化量が分かる。FIG. 5 shows an example of a hologram image in which a fluorescence image and a phase hologram are individually acquired by an image sensor at a fluorescence excitation center wavelength 532 (nm) and a fluorescence center wavelength 550 (nm).
FIG. 5 (1) is a hologram image of fluorescent beads (an enlarged view of the fluorescent bead portion is also appended), which is Fourier transformed to obtain the spatial frequency plane of FIG. 5 (2). A hologram existing at a position shifted from the origin of the spatial frequency plane is extracted, and the phase distribution of FIG. 5 (3) is acquired (an enlarged phase image is also appended).
FIG. 5 (4) shows a three-dimensional display of the reconstructed phase distribution. From FIG. 5 (4), the phase change amount of the fluorescent beads can be seen.
蛍光ビーズの蛍光像と、図５のプロセスで得られた位相像を、それぞれ図６（１）、（２）に示す。また位相３Ｄプロットを図６（３）に示す。図６（１）と（２）から蛍光ビーズ像と蛍光ビーズの位相像を確認できる。図６（３）から蛍光ビーズの形状が凸状の球形に近い形状が得られていることがわかる。構築した実験系を用いて、４μｍサイズの蛍光像や１０μｍサイズの細胞形状の位相像などの計測が可能であることを確認した。
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、リアルタイムで細胞の形状変化と核の動きを計測可能である。奥行き位置方向に結像位置を探索するオートフォーカス機能を更に実装することにより、リアルタイムに蛍光３次元像と位相３次元像の観察が実現できるであろう。The fluorescent image of the fluorescent beads and the phase image obtained by the process of FIG. 5 are shown in FIGS. 6 (1) and (2), respectively. A phase 3D plot is shown in FIG. From FIG. 6 (1) and (2), the fluorescent bead image and the phase image of the fluorescent bead can be confirmed. FIG. 6 (3) shows that the shape of the fluorescent beads is close to a convex spherical shape. Using the constructed experimental system, it was confirmed that measurement of a 4 μm size fluorescence image, a 10 μm size cell shape phase image, and the like was possible.
The digital holographic microscope of the present invention can measure cell shape change and nucleus movement in real time. By further implementing an autofocus function for searching for an imaging position in the depth position direction, observation of a fluorescence three-dimensional image and a phase three-dimensional image may be realized in real time.
上述の実施例２のディジタルホログラフィック顕微鏡は、位相ホログラムを取得する第１のホログラフィック光学系が透過型であり、蛍光ホログラムを取得する第２のホログラフィック光学系が反射型であるが、以下に説明するように、蛍光ホログラムを取得する第２のホログラフィック光学系が透過型であっても構わない。
図８は、実施例２のディジタルホログラフィック顕微鏡の光学系の構成図を示している。In the digital holographic microscope of Example 2 described above, the first holographic optical system that acquires a phase hologram is a transmission type, and the second holographic optical system that acquires a fluorescence hologram is a reflection type. As described in the above, the second holographic optical system for acquiring the fluorescence hologram may be a transmission type.
FIG. 8 shows a configuration diagram of an optical system of the digital holographic microscope of the second embodiment.
実施例１のディジタルホログラフィック顕微鏡の光学系と同様に、波長６３３（ｎｍ）のＨｅ−Ｎｅレーザ光源５を用いて試料ステージ４上の観察対象試料の計測物体を照明する。Ｈｅ−Ｎｅレーザ光はビームスプリッター１２により、それぞれ計測物体を透過する物体光経路と、何もない参照光経路に分けられ、マッハ・ツェンダー干渉計を構成する。計測物体を透過するＨｅ−Ｎｅレーザ光の波長が後述する波長５３２ｎｍの帯域の励起用レーザ光源より長いため、ダイクロイックミラー３３に影響されずに伝搬され、再びビームスプリッター１８により参照光と干渉することができる。この際、物体光と参照光の間にわずかに角度をつけることによって、オフアクシスホログラム（等傾角干渉パターンのホログラム）を取得する。 Similar to the optical system of the digital holographic microscope of the first embodiment, the measurement object of the sample to be observed on the sample stage 4 is illuminated using the He—Ne laser light source 5 having a wavelength of 633 (nm). The He-Ne laser light is divided by the beam splitter 12 into an object light path that passes through the measurement object and a reference light path that has nothing, and constitutes a Mach-Zehnder interferometer. Since the wavelength of the He—Ne laser beam that passes through the measurement object is longer than the excitation laser light source in the wavelength band of 532 nm, which will be described later, it is propagated without being influenced by the dichroic mirror 33 and again interferes with the reference light by the beam splitter 18. Can do. At this time, an off-axis hologram (a hologram with an equal inclination interference pattern) is acquired by slightly setting an angle between the object beam and the reference beam.
また、波長５３２ｎｍの帯域の励起用レーザ光源６を用いて、試料ステージ４のガラス基板の裏面から試料ステージ４の表面に置かれた観察対象試料を透過して蛍光分子を励起する。励起された蛍光分子は、５３２（ｎｍ）より長波長の蛍光信号を発し、試料ステージ４を透過した励起用レーザ光とともに対物レンズ１５に入射する。観察対象試料の蛍光励起光による蛍光信号は微弱であるので、本実施例のような透過型にした場合に、蛍光励起光を十分にカットし、蛍光信号のみを通過させるダイクロイックミラー３３を設置し、励起用レーザ光を十分に減衰させ、蛍光信号光を強調して蛍光３次元像を取得する。蛍光３次元像は、サブ波長周期構造の２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。 Further, the excitation laser light source 6 having a wavelength band of 532 nm is used to excite fluorescent molecules through the observation target sample placed on the surface of the sample stage 4 from the back surface of the glass substrate of the sample stage 4. The excited fluorescent molecule emits a fluorescent signal having a wavelength longer than 532 (nm) and enters the objective lens 15 together with the excitation laser light transmitted through the sample stage 4. Since the fluorescence signal by the fluorescence excitation light of the sample to be observed is weak, a dichroic mirror 33 that cuts the fluorescence excitation light sufficiently and allows only the fluorescence signal to pass when the transmission type is used as in this embodiment is installed. The excitation laser beam is sufficiently attenuated, and the fluorescence signal light is emphasized to obtain a fluorescence three-dimensional image. In the fluorescence three-dimensional image, the polarization component of the fluorescence self-interfers with the bifocal Fresnel lens (SPFL) 2 having the sub-wavelength periodic structure, so that the interference pattern is concentric.
そして、イメージセンサ３で、位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得する。蛍光ホログラムの干渉パターンは同心円状となり、位相ホログラムの干渉パターンは等傾角干渉パターンとなる。実施例１と同様に、同心円状干渉パターンと等傾角干渉パターンは、空間周波数面で分離することが可能であり、イメージセンサ３により撮像した像から、位相３次元像の位相ホログラムと蛍光３次元像の蛍光ホログラムとを空間周波数面で分離することができる。また、ＳＰＦＬ２を設けることにより、位相ホログラム用の光が影響を受けないように、１／２波長板２０を設け、位相ホログラム用の光の偏光をＳＰＦＬ２によって影響しない偏光状態に合わせている。また、１／２波長板２１を設けて、蛍光励起用光源の偏光方向をＳＰＦＬ２が働く偏光方向に合せている。 Then, the image sensor 3 simultaneously acquires two holograms of a phase three-dimensional image and a fluorescence three-dimensional image. The interference pattern of the fluorescence hologram is concentric, and the interference pattern of the phase hologram is an equitilt interference pattern. As in the first embodiment, the concentric interference pattern and the equiangular interference pattern can be separated on the spatial frequency plane, and the phase hologram of the three-dimensional phase image and the three-dimensional fluorescence are obtained from the image captured by the image sensor 3. The fluorescence hologram of the image can be separated on the spatial frequency plane. Further, by providing the SPFL 2, the half-wave plate 20 is provided so that the phase hologram light is not affected, and the polarization of the phase hologram light is adjusted to a polarization state that is not affected by the SPFL 2. In addition, a half-wave plate 21 is provided to align the polarization direction of the fluorescence excitation light source with the polarization direction in which the SPFL 2 works.
従来、バイオイメージング分野の顕微鏡観察では、焦点面近傍での細胞の動きのみしか観察できないという限界がある。一方、ディジタルホログラフィーでは、２０倍の対物レンズを用いた場合に、１０００倍の奥行き範囲を観察できることが知られている。実施例１又は２のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、３次元的な細胞の塊や奥行きに異なる細胞における反応を計測し、多数の細胞について３次元位置をマルチトラックキングすることが可能である。 Conventionally, microscopic observation in the field of bioimaging has a limitation that only cell movement in the vicinity of the focal plane can be observed. On the other hand, in digital holography, it is known that when a 20 × objective lens is used, a 1000 × depth range can be observed. Using the digital holographic microscope of Example 1 or 2, it is possible to measure the reaction in different cells with respect to a three-dimensional cell mass or depth, and to multitrack the three-dimensional position of a large number of cells.
時間的に異なる再構成像の各々の点において合焦または非合焦の判別を行って、３次元的にフォーカスの合った再構成像を３０フレーム毎秒のリアルタイムで再生する。位相分布情報に対して奥行きに合焦となる位置を追跡するオートフォーカスを機能を設ける。時間分解能として１０−５秒から１０５秒の１０桁の時間スケールに対応可能なディジタルホログラフィック顕微鏡を構築することも可能である。また、奥行きの異なるがん細胞に対する薬の効果を同時観察することも可能であり、全ての面で焦点のあった再構成像を提供できる。A reconstructed image focused in three dimensions is reproduced in real time at 30 frames per second by determining whether the reconstructed image is different in time or not. An autofocus function is provided for tracking the position where the depth distribution is focused on the phase distribution information. It is also possible to construct a digital holographic microscope that can support a 10-digit time scale of 10 −5 seconds to 10 5 seconds as the time resolution. In addition, it is possible to simultaneously observe the effects of drugs on cancer cells having different depths, and a reconstructed image focused on all aspects can be provided.
図９、１０は、オオカナダモにおける葉緑体の原形質流動を、実施例１のディジタルホログラフィック顕微鏡で観察した画像のイメージを示している。図９（１）はオオカナダモの撮影画像（２層構造を示す断面図も付記）、図９（２）はホログラム、図９（３）の空間周波数面、図９（４）は再現された位相イメージを示している。
葉緑体は染色することなく自家蛍光を発する（図１０（１）を参照）。そのため、蛍光ホログラムと位相ホログラムを同時に取得し、位相測定により細胞壁の構造と葉緑体を同時に計測する（図１０（２）を参照）。葉緑体は３次元的に移動しているため、時系列に並ぶホログラム像をリアルタイムで再構成する。FIGS. 9 and 10 show images of chloroplast protoplast flow observed in the digital holographic microscope of Example 1 in the canard moth. FIG. 9 (1) is a photograph taken by a quasi-canada model (a sectional view showing a two-layer structure is also appended), FIG. 9 (2) is a hologram, FIG. 9 (3) is a spatial frequency plane, and FIG. 9 (4) is a reproduced phase. The image is shown.
Chloroplasts emit autofluorescence without staining (see FIG. 10 (1)). Therefore, a fluorescence hologram and a phase hologram are acquired simultaneously, and the structure of the cell wall and the chloroplast are simultaneously measured by phase measurement (see FIG. 10 (2)). Since the chloroplast is moving three-dimensionally, the hologram images arranged in time series are reconstructed in real time.
また、図９（１）に示すように、オオカナダモは表面と裏面の２層構造をしている。実施例１のディジタルホログラフィック顕微鏡によるディジタルホログラフィー計測では、奥行きに構造が存在する場合にコヒーレンス長が長いため、クロストークノイズが大きい。ディジタルホログラフィーでは奥行き位置の異なる情報をフィルタにより除去あるいは低減させることが可能であるため、信号処理により奥行き分解能を向上させることが可能である。 Further, as shown in FIG. 9 (1), the giant canadian has a two-layer structure of a front surface and a back surface. In the digital holography measurement by the digital holographic microscope of Example 1, the crosstalk noise is large because the coherence length is long when the structure exists in the depth. In digital holography, information with different depth positions can be removed or reduced by a filter, so that depth resolution can be improved by signal processing.
図１１は、ディジタルホログラフィック顕微鏡の他の実施形態の光学系の構成を示す。図１に示すディジタルホログラフィック顕微鏡と同様、透過型ディジタルホログラフィック顕微鏡と反射型蛍光顕微鏡との２つの光学系を共通光路として、物体光と蛍光信号光を同軸に重畳させて、１つの撮像手段で位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得できるようにしたものである。 FIG. 11 shows the configuration of an optical system according to another embodiment of the digital holographic microscope. Similar to the digital holographic microscope shown in FIG. 1, two optical systems of a transmission type digital holographic microscope and a reflection type fluorescent microscope are used as a common optical path, and object light and fluorescent signal light are coaxially superimposed to form one imaging means. Thus, two holograms of a phase three-dimensional image and a fluorescence three-dimensional image can be acquired simultaneously.
図１に示すディジタルホログラフィック顕微鏡と異なる点は、２つの励起用レーザ光源（４１，４２）を備えている点である。具体的には、４７３ｎｍの波長の青色レーザと、５３２ｎｍの波長の緑色レーザを備える。青色レーザは、主に５００〜５３０ｎｍの蛍光を励起することを目的とする。一方、緑色レーザは、主に５４０〜６００ｎｍの蛍光を励起することを目的とする。観察対象の細胞によって、蛍光マーカーが異なることが想定される。そのため、蛍光マーカーが励起する波長のレーザを観察対象試料に照射できるようにする。
例えば、図１１に示す構成の場合、２つのシャッター（４３，４４）とビームスプリッター４６によって、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する励起用レーザ光源（４１，４２）が切替えられる。シャッター（４３，４４）の切り替えは、シャッター制御装置５０から出力されるシャッター制御信号（５１，５２）によって行われる。ビームスプリッター４６の先になるＮＤ（Neutral Density）フィルタ４７は、色彩に影響を与えることなくレーザ光量を低下させるためのものである。The difference from the digital holographic microscope shown in FIG. 1 is that two excitation laser light sources (41, 42) are provided. Specifically, a blue laser having a wavelength of 473 nm and a green laser having a wavelength of 532 nm are provided. The blue laser is mainly intended to excite fluorescence of 500 to 530 nm. On the other hand, the green laser mainly aims to excite fluorescence of 540 to 600 nm. It is assumed that the fluorescent marker varies depending on the cell to be observed. Therefore, the observation target sample can be irradiated with a laser having a wavelength excited by the fluorescent marker.
For example, in the case of the configuration shown in FIG. 11, the excitation laser light source (41, 42) that excites fluorescent molecules of the observation target sample on the sample stage 4 is switched by the two shutters (43, 44) and the beam splitter 46. . The shutter (43, 44) is switched by a shutter control signal (51, 52) output from the shutter control device 50. An ND (Neutral Density) filter 47 ahead of the beam splitter 46 is for reducing the amount of laser light without affecting the color.
２つの励起用レーザ光源（４１，４２）の内、一方の励起用レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する。励起された蛍光分子は、励起用レーザ光源より長波長の蛍光信号を発し、試料ステージ４のガラス基板表面で反射された励起用レーザ光とともに対物レンズ１５に入射する。また、シャッター制御装置５０により、２つのシャッター（４３，４４）を切り替え、もう一方の励起用レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する。
２つの励起用レーザ光源（４１，４２）の各々の蛍光３次元像は、２重焦点レンズである２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。One of the two excitation laser light sources (41, 42) is used to excite fluorescent molecules of the observation target sample on the sample stage 4. The excited fluorescent molecules emit a fluorescent signal having a long wavelength from the excitation laser light source, and enter the objective lens 15 together with the excitation laser light reflected by the glass substrate surface of the sample stage 4. Further, the shutter control device 50 switches the two shutters (43, 44), and excites the fluorescent molecules of the observation target sample on the sample stage 4 using the other excitation laser light source.
In each of the three-dimensional fluorescent images of the two excitation laser light sources (41, 42), the polarization component of the fluorescence self-interfers with the bifocal Fresnel lens (SPFL) 2 which is a bifocal lens, so the interference pattern is concentric. It becomes.
蛍光３次元像の取得と同時に、波長６３３（ｎｍ）のＨｅ−Ｎｅレーザ光源５を用いて試料ステージ４上の観察対象試料の計測物体を照明し、オフアクシス（off-axis）ホログラムを作成し、イメージセンサ３で、位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得する。 Simultaneously with the acquisition of the three-dimensional fluorescence image, the measurement object of the observation target sample on the sample stage 4 is illuminated using the He—Ne laser light source 5 with a wavelength of 633 (nm) to create an off-axis hologram. The image sensor 3 simultaneously acquires two holograms of a phase three-dimensional image and a fluorescence three-dimensional image.
観察対象試料として、径が２．５〜４．５μｍで、黄色とナイルレッドの２色蛍光ビーズを混ぜたものを用いた。図１１の光学系の構成のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、２色蛍光ビーズの位相像と蛍光像を取得した結果を図１２に示す。ただし、本実施例では、蛍光は２次元像の撮影となっている。図１２（１）は、２色蛍光ビーズの位相像を示している。図１２（２）（３）は、それぞれ黄色の蛍光ビーズの蛍光像、ナイルレッドの蛍光ビーズの蛍光像を示している。図１２（２）の黄色の蛍光ビーズの蛍光像は、青色レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起した場合の蛍光像である。また図１２（３）のナイルレッドの蛍光ビーズの蛍光像は、緑色レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起した場合の蛍光像である。図１２（１）の位相像から６つの蛍光ビーズが確認できる。また、図１２（２）の蛍光像では４つの蛍光ビーズが確認でき、図１２（３）の蛍光像では２つの蛍光ビーズが確認できる。これらのことから、構築した実験系を用いて、μオーダサイズの蛍光粒子を、その色毎に識別して確認できることがわかった。
また、図１２（４）は、これらの蛍光ビーズの１つの位相プロファイルを示している。この図から蛍光ビーズの大きさ(約５μｍ）と位相差(２．６ rad程度）を知ることができる。As a sample to be observed, a sample having a diameter of 2.5 to 4.5 μm and mixed with yellow and Nile red two-color fluorescent beads was used. FIG. 12 shows the result of obtaining the phase image and the fluorescence image of the two-color fluorescent beads using the digital holographic microscope having the configuration of the optical system in FIG. However, in this embodiment, the fluorescence is a two-dimensional image. FIG. 12 (1) shows a phase image of two-color fluorescent beads. FIGS. 12 (2) and 12 (3) show a fluorescent image of yellow fluorescent beads and a fluorescent image of Nile red fluorescent beads, respectively. The fluorescent image of the yellow fluorescent beads in FIG. 12 (2) is a fluorescent image when the fluorescent molecules of the sample to be observed on the sample stage 4 are excited using a blue laser light source. The fluorescent image of the Nile red fluorescent beads in FIG. 12 (3) is a fluorescent image when the fluorescent molecules of the observation target sample on the sample stage 4 are excited using a green laser light source. Six fluorescent beads can be confirmed from the phase image of FIG. Further, four fluorescent beads can be confirmed in the fluorescent image of FIG. 12 (2), and two fluorescent beads can be confirmed in the fluorescent image of FIG. 12 (3). From these facts, it was found that μ-order size fluorescent particles can be identified and confirmed for each color using the constructed experimental system.
FIG. 12 (4) shows one phase profile of these fluorescent beads. From this figure, the size of the fluorescent beads (about 5 μm) and the phase difference (about 2.6 rad) can be known.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、リアルタイムで細胞の形状変化と細胞核の動きを計測可能であり、蛍光染色試薬の種類に応じて、励起用レーザ光源を切替えて使用することにより、ターゲットとなる細胞を選択して形状変化と動きを計測できる。
なお、本実施例では、２つの励起用レーザ光源を用いているが、３つ以上であってもよい。また、シャッター制御装置から出力されるシャッター制御信号を高速に切り替えて、蛍光像を取得してもよい。In the digital holographic microscope of the present invention, it is possible to measure changes in cell shape and movement of cell nuclei in real time, and by switching the excitation laser light source according to the type of fluorescent staining reagent, the target cell You can select to measure the shape change and movement.
In this embodiment, two excitation laser light sources are used, but three or more laser light sources may be used. Further, the fluorescent image may be acquired by switching the shutter control signal output from the shutter control device at high speed.
本発明は、バイオイメージング分野の顕微鏡に有用である。 The present invention is useful for a microscope in the field of bioimaging.
１，３０ ディジタルホログラフィック顕微鏡
２ ２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）
３ イメージセンサ
４ 試料ステージ
５ Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源
６，４１，４２ 励起用レーザ光源
１０，１１，１９，３２，３４，３５，３６ レンズ
１２，１８，４６ ビームスプリッター
１３，１４，３１，４５ 反射鏡
１５ 対物レンズ
１６，３３ ダイクロイックミラー
１７ チューブレンズ
２０，２１ １／２波長板
４３，４４ シャッター
４７ ＮＤフィルタ
５０ シャッター制御装置
５１，５２ シャッター制御信号
1,30 Digital holographic microscope 2 Bifocal lens (SPFL)
3 Image sensor 4 Sample stage 5 He-Ne laser light source 6, 41, 42 Excitation laser light source 10, 11, 19, 32, 34, 35, 36 Lens 12, 18, 46 Beam splitter 13, 14, 31, 45 Reflection Mirror 15 Objective lens 16, 33 Dichroic mirror 17 Tube lens 20, 21 1/2 wavelength plate 43, 44 Shutter 47 ND filter 50 Shutter control device 51, 52 Shutter control signal
Claims (11)
第２のレーザ光を用いて前記観察対象試料の蛍光励起光による蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系と、
撮像手段と、
偏光依存性を有する２つの焦点距離を持つ２重焦点レンズと、
を備え、
前記物体光と前記蛍光信号光とが同軸に重畳するように各々の光学系が配置され、重畳した光軸上に前記２重焦点レンズが配置され、
前記撮像手段が前記位相３次元像と前記蛍光３次元像をホログラムとして同時に取得し、前記位相３次元像と前記蛍光３次元像を分離してそれぞれの干渉強度分布から前記物体光と前記蛍光信号光を再構成することを特徴とするディジタルホログラフィック顕微鏡。A first holographic optical system that obtains a phase three-dimensional image by interference light obtained by superimposing the object light passing through the observation target sample and the reference light not passing using the first laser light;
A second holographic optical system that acquires a three-dimensional fluorescence image of the observation target sample by fluorescence excitation light using a second laser beam;
Imaging means;
A bifocal lens with two focal lengths having polarization dependence;
With
Each optical system is disposed so that the object light and the fluorescent signal light are coaxially superimposed, and the double focus lens is disposed on the superimposed optical axis,
The imaging means simultaneously acquires the phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image as holograms, separates the phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image, and extracts the object light and the fluorescence signal from respective interference intensity distributions. A digital holographic microscope characterized by reconstructing light.
蛍光３次元像により細胞核の時空間情報と、位相３次元像により細胞核および細胞壁の時空間構造とを同時に取得する細胞観察方法。Using the digital holographic microscope according to any one of claims 1 to 8,
A cell observation method for simultaneously acquiring spatiotemporal information of a cell nucleus by a fluorescence three-dimensional image and a spatiotemporal structure of a cell nucleus and a cell wall by a phase three-dimensional image.
一の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、他の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、同時に取得した位相３次元像とから、細胞の挙動を観察する細胞観察方法。
Using the digital holographic microscope according to claim 7,
The behavior of the cell is observed from a three-dimensional fluorescence image acquired using one excitation laser light source, a three-dimensional fluorescence image acquired using another excitation laser light source, and a phase three-dimensional image acquired simultaneously. Cell observation method.
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