JP6716121B2 - Digital holographic microscope - Google Patents
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Description
本発明は、蛍光と位相を同時に３次元計測できるディジタルホログラフィック顕微鏡に関するものである。 The present invention relates to a digital holographic microscope capable of three-dimensionally measuring fluorescence and phase simultaneously.
生きた細胞の動的３次元イメージングは、バイオ応用分野において重要な計測技術である。例えば、蛍光顕微鏡を使って細胞核中の特定ＤＮＡに蛍光分子を導入し、有糸分裂する細胞の変化を計測する蛍光標識技術が知られている。蛍光分子で染色された細胞内の核やタンパク質の相互作用を可視化することで様々な観測が可能になる。蛍光３次元像を高分解能かつ高コントラストで計測できるものとして、共焦点レーザ走査型顕微鏡が知られている。しかし、共焦点レーザ走査型顕微鏡では計測物体の一点ごとに集光点の走査が必要なため、蛍光３次元像を得るためには時間がかかり、動的物体の変化が速い現象の計測や奥行き位置が異なる複数の細胞の同時計測は不向きであるという本質的な限界がある。
また、蛍光像でだけでなく細胞核や細胞壁などの構造を同時に観察する技術も求められている。構造観察の手段として、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡などがある。位相差像は透明物体の形状測定に有効である。Dynamic three-dimensional imaging of living cells is an important measurement technology in bio-application fields. For example, a fluorescent labeling technique is known in which a fluorescent molecule is introduced into a specific DNA in the cell nucleus by using a fluorescence microscope to measure changes in cells that undergo mitosis. Various observations become possible by visualizing the interaction between intracellular nuclei and proteins stained with fluorescent molecules. A confocal laser scanning microscope is known as a device capable of measuring a fluorescence three-dimensional image with high resolution and high contrast. However, in the confocal laser scanning microscope, it is necessary to scan the focal point for each point of the measurement object, so it takes time to obtain a fluorescence three-dimensional image, and measurement of a phenomenon in which the dynamic object changes rapidly and depth There is an inherent limitation that simultaneous measurement of multiple cells at different positions is unsuitable.
There is also a demand for a technique for simultaneously observing not only a fluorescent image but also structures such as cell nuclei and cell walls. As means for observing the structure, there are a phase contrast microscope, a differential interference microscope and the like. The phase difference image is effective for measuring the shape of a transparent object.
蛍光像および位相像を同時観察することができれば、異なる情報を同時に取得することができるため、バイオ反応においてより詳細な情報を提供することが可能になる。
最近では、蛍光像および位相差像を同時観察可能な光学顕微鏡が市販されているが、フィルタの入れ替えが必要な上、一度の計測範囲は１点もしくは２次元に限られるといった制約がある。If the fluorescence image and the phase image can be simultaneously observed, different information can be acquired at the same time, and thus more detailed information can be provided in the bioreaction.
Recently, an optical microscope capable of simultaneously observing a fluorescence image and a phase difference image is commercially available, but there is a restriction that a filter needs to be replaced and a measurement range for one measurement is limited to one point or two dimensions.
一方、瞬時的な３次元計測を可能とするツールとして、ディジタルホログラフィック顕微鏡（Digital Holographic Microscope；ＤＨＭ）が知られている。ディジタルホログラフィック顕微鏡では、３次元情報をホログラム情報として取得し、計算機内で光波の逆伝搬計算を行うことで奥行き位置に対する物体の光波情報を再構成する。ディジタルホログラフィック顕微鏡の特徴としては、特殊な蛍光染色が必要なく生体細胞の３次元観察が可能であること（ラベルフリー）、計算機再構成により焦点位置を任意に変更できるオートフォーカシング機能を有すること、定量的位相計測が可能であることが挙げられる。このため、３次元的に細胞が動くような状況においても、再構成計算により自動的にピントの合った再構成画像を得ることができる。 On the other hand, a digital holographic microscope (DHM) is known as a tool that enables instantaneous three-dimensional measurement. In a digital holographic microscope, three-dimensional information is acquired as hologram information, and light wave back propagation calculation is performed in a computer to reconstruct light wave information of an object with respect to a depth position. The features of the digital holographic microscope are that it allows three-dimensional observation of living cells without the need for special fluorescent staining (label-free), and that it has an autofocusing function that can arbitrarily change the focal position by computer reconstruction. It is possible to perform quantitative phase measurement. Therefore, even in a situation where cells move three-dimensionally, it is possible to automatically obtain a focused reconstructed image by reconstruction calculation.
ディジタルホログラフィック顕微鏡を細胞観察に応用する場合、蛍光情報のホログラム取得が必要となるが、蛍光を用いてホログラフィー技術を実現するためには、蛍光が非常に干渉しにくいインコヒーレント光であるという問題がある。近年、インコヒーレント光からホログラムを作る方法が次々に提案されており、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡（Fluorescence Digital Holographic Microscope；ＦＤＨＭ)に向けた研究が世界中で活性化しているが、空間光変調素子や光学素子を多く有するものが大半である（例えば、特許文献１を参照）。 When applying a digital holographic microscope to cell observation, it is necessary to obtain holograms of fluorescence information, but in order to realize holography technology using fluorescence, the problem is that fluorescence is incoherent light that is extremely difficult to interfere. There is. In recent years, methods for producing holograms from incoherent light have been proposed one after another, and research for a fluorescence digital holographic microscope (FDHM) has been activated all over the world. Most have many optical elements (for example, refer to Patent Document 1).
特許文献１に開示されたホログラム記録装置は、干渉性の低い光（例えば自然光または蛍光等）を観察することができないといった問題を解決するものであり、空間光変調器（波面変調素子）を用いて、互いに偏光方向が異なる第１成分光および第２成分光を含む物体光を、第１成分光の波面形状と第２成分光の波面形状を異なる形状にし、第１成分光に対する第２成分光の位相シフト量に、空間的に周期的に変化する分布を生じさせて、第１成分光と第２成分光とを干渉させてホログラムを形成するものである。これにより、単一の光路を通る干渉性の低い光を用いて、１回の撮像で記録されるホログラムから、被写体の再生像を得ることができるものである。しかしながら、この方法では、干渉性の低い蛍光３次元像の観察に限定されるといった問題がある。 The hologram recording device disclosed in Patent Document 1 solves the problem that light with low coherence (for example, natural light or fluorescence) cannot be observed, and uses a spatial light modulator (wavefront modulator). The object light including the first component light and the second component light whose polarization directions are different from each other, the wavefront shape of the first component light and the wavefront shape of the second component light are made different, and the second component with respect to the first component light A hologram is formed by causing a distribution that periodically changes spatially in the phase shift amount of light and causing the first component light and the second component light to interfere with each other. This makes it possible to obtain a reproduced image of a subject from a hologram recorded by a single image pickup using light with low coherence that passes through a single optical path. However, this method has a problem that it is limited to observation of a fluorescence three-dimensional image with low coherence.
また、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡（ＦＤＨＭ）は、ターゲッティング計測には適しているが、蛍光を発生しない物質に対しては無力であるという問題がある。また、蛍光観察を行う場合に、有害な蛍光分子を使うために計測対象が制限される問題も生じる。そのため、ディジタルホログラフィック顕微鏡（ＤＨＭ）の応用拡大といった視点で見ると、位相像や蛍光像さらには偏光などの多様な情報が観測可能なマルチモーダル（multimodal）ディジタルホログラフィック顕微鏡の登場が望まれている。 Further, although the fluorescence digital holographic microscope (FDHM) is suitable for targeting measurement, it has a problem that it is ineffective for substances that do not generate fluorescence. In addition, when performing fluorescence observation, there is a problem that the measurement target is limited because harmful fluorescent molecules are used. Therefore, from the viewpoint of expanding the applications of digital holographic microscopes (DHMs), the advent of multimodal digital holographic microscopes that can observe various information such as phase images, fluorescence images, and polarizations is desired. There is.
本発明者らは、マルチモーダルディジタルホログラフィック顕微鏡の実現を目指し、蛍光２次元像と位相イメージングが可能なディジタルホログラフィック顕微鏡を既に試作して実験にホログラム画像から再構成している（非特許文献１を参照）。試作した顕微鏡は、蛍光像と位相像を逐次的に取得するものであり、蛍光像と位相像を同時に計測するものではない。
以下、本明細書において、特に断らない限り、蛍光像と蛍光３次元像、位相像と位相３次元像は、それぞれ同じ意味で用いている。The present inventors have already made a prototype of a digital holographic microscope capable of two-dimensional fluorescence image and phase imaging and have reconstructed it from a hologram image in an experiment aiming at realization of a multi-modal digital holographic microscope (Non-Patent Document See 1). The prototype microscope sequentially acquires a fluorescence image and a phase image, and does not simultaneously measure the fluorescence image and the phase image.
Hereinafter, in the present specification, unless otherwise specified, a fluorescent image and a fluorescent three-dimensional image and a phase image and a three-dimensional phase image are used with the same meaning.
上述の試作のディジタルホログラフィック顕微鏡では、蛍光顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡の機能を併せ持つが、シャッターを切替えてそれぞれの像を逐次的に取得するものであり、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡が結合されたものではなく、蛍光像と位相像を同時に３次元計測できるというものではない。
かかる状況に鑑みて、本発明は、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡が結合され、蛍光像と位相像を同時に３次元計測できるディジタルホログラフィック顕微鏡を提供することを目的とする。The prototype digital holographic microscope described above also has the functions of a fluorescence microscope and a phase image detection digital holographic microscope, but it switches the shutter to sequentially acquire each image. The image detection digital holographic microscope is not combined, and the fluorescence image and the phase image cannot be simultaneously measured three-dimensionally.
In view of such a situation, an object of the present invention is to provide a digital holographic microscope in which a fluorescence digital holographic microscope and a phase image detection digital holographic microscope are combined, and a fluorescence image and a phase image can be simultaneously measured three-dimensionally. ..
上記課題を達成すべく、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡は、下記１）〜４）を備える。
１）第１のレーザ光を用いて観察対象試料を通過する物体光と通過しない参照光とを重ね合せた干渉光による位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系
２）第２のレーザ光を用いて観察対象試料の蛍光励起光による蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系
３）撮像手段
４）偏光依存性を有する２重焦点レンズIn order to achieve the above object, the digital holographic microscope of the present invention includes the following 1) to 4).
1) A first holographic optical system 2) that uses a first laser beam to obtain a phase three-dimensional image by interfering light obtained by superimposing object light that passes through an observation target sample and reference light that does not pass through Second holographic optical system for obtaining a three-dimensional image of fluorescence by fluorescence excitation light of a sample to be observed using laser light 3) Imaging means 4) Dual focus lens having polarization dependence
そして、物体光と蛍光信号光とが同軸に重畳するように各々の光学系が配置され、重畳した光軸上に上記４）の２重焦点レンズが配置される。撮像手段が位相３次元像と蛍光３次元像をホログラムとして同時に取得する。撮像手段により取得されたホログラム像から、位相３次元像と蛍光３次元像を分離してそれぞれの干渉強度分布から物体光と蛍光信号光を再構成する。 Then, the respective optical systems are arranged so that the object light and the fluorescence signal light are superposed coaxially, and the double focus lens of 4) is arranged on the superposed optical axis. The imaging means simultaneously acquires the phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image as a hologram. The phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image are separated from the hologram image acquired by the image pickup means, and the object light and the fluorescence signal light are reconstructed from the respective interference intensity distributions.
上記構成によれば、観察対象試料から位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系と、蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系との２つの光学系を共通光路として、物体光と蛍光信号光を同軸に重畳させて、１つの撮像手段で２つのホログラム像を取得できる。
ここで、偏光依存性を有する２重焦点レンズとは、光電場の偏光方向に強い異方性を持ち、かつ、２つの焦点距離を持つレンズである。According to the above configuration, two optical systems, a first holographic optical system that acquires a three-dimensional phase image from a sample to be observed and a second holographic optical system that acquires a three-dimensional fluorescence image, are used as common optical paths. The object light and the fluorescence signal light can be coaxially superimposed to obtain two hologram images with one image pickup unit.
Here, the double focus lens having polarization dependency is a lens having a strong anisotropy in the polarization direction of the photoelectric field and having two focal lengths.
偏光依存性を有する２重焦点レンズとして、サブ波長周期構造の２焦点フレネルレンズ（Sub-wavelength Periodic structured Fresnel Lens；ＳＰＦＬ）が好適に用いられる。ＳＰＦＬの場合、光の波長よりも短い周期の回折格子構造であるサブ波長周期構造によって、光波の偏光状態によって回折を受けることになる。また、フレネルレンズは、通常のレンズを光の波長で折り返し厚みを減らしたレンズであり、断面は鋸状でありプリズムを並べたような形になる。２焦点フレネルレンズは、１つのビーム光を２つに分けて回折させ、異なる場所で焦点を合わせる機能を持つ。 As a double focus lens having polarization dependency, a Sub-wavelength Periodic structured Fresnel Lens (SPFL) having a sub-wavelength periodic structure is preferably used. In the case of SPFL, the sub-wavelength periodic structure, which is a diffraction grating structure having a period shorter than the wavelength of light, is diffracted by the polarization state of the light wave. Further, the Fresnel lens is a lens obtained by folding an ordinary lens at the wavelength of light to reduce the thickness, and has a sawtooth cross section and has a shape in which prisms are arranged. The bifocal Fresnel lens has a function of dividing one beam light into two and diffracting the light to focus at different places.
また、偏光依存性を有する２重焦点レンズとして、液晶空間光変調素子を用いても良い。液晶空間光素子では、液晶分子の配向により入射光電場の偏光状態に対して異なる働きを生じさせることができる。例えば、ある方向の直線偏光に対して常光線として作用するときに、それに垂直な直線偏光に対して異常光線として作用する。そのため、特定の直線偏光方向に対してのみ作用する偏光依存性のある２重焦点レンズを実現できる。
なお、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡における蛍光信号光は、液晶空間光変調素子で実現される２重レンズによって、２つの回折光が生じることになる。この２つの回折光は、共に同じ偏光であり、自己干渉が生じる。この点で、偏光方向が異なる第１成分光と第２成分光とを干渉させてホログラムを形成する上述の特許文献１における空間光変調素子とは機能が異なる（本発明の場合、蛍光ホログラム用の蛍光信号光、位相ホログラム用の物体光が、特許文献１の第１成分光と第２成分光に相当するものである。）。A liquid crystal spatial light modulator may be used as the double focus lens having polarization dependency. In the liquid crystal spatial light device, different functions can be caused depending on the polarization state of the incident optical electric field depending on the orientation of liquid crystal molecules. For example, when acting as an ordinary ray for linearly polarized light in a certain direction, it acts as an extraordinary ray for linearly polarized light perpendicular to it. Therefore, it is possible to realize a bifocal lens having polarization dependency that acts only on a specific linear polarization direction.
Note that the fluorescent signal light in the digital holographic microscope of the present invention is generated by the double lens realized by the liquid crystal spatial light modulator as two diffracted lights. The two diffracted lights have the same polarization, and self-interference occurs. In this respect, the function is different from that of the spatial light modulation element in Patent Document 1 described above that forms a hologram by causing interference between the first component light and the second component light having different polarization directions (in the case of the present invention, for a hologram for fluorescence). The fluorescent signal light and the object light for the phase hologram correspond to the first component light and the second component light of Patent Document 1.).
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡において、偏光依存性を有する２重焦点レンズは、第２のホログラフィック光学系にのみ作用し、第１のホログラフィック光学系には作用しないように設計される。
位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系の物体光の偏光には感度がなく、レンズ作用を起こすことがないように２重焦点レンズを設計すると共に、蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系の蛍光の偏光には強い感度を持たせるように設計する。第２のホログラフィック光学系の蛍光の偏光は、２つの焦点距離をもつ２重焦点レンズによって、自己干渉が生じることになる。In the digital holographic microscope of the present invention, the bifocal lens having polarization dependence is designed so as to act only on the second holographic optical system and not on the first holographic optical system.
The first holographic optical system that acquires a phase three-dimensional image is not sensitive to the polarization of the object light and the double focus lens is designed so as not to cause a lens action, and a fluorescence three-dimensional image is acquired. The second holographic optical system is designed to have strong sensitivity to the polarization of fluorescence. The polarization of the fluorescence of the second holographic optical system will be self-interfering due to the bifocal lens having two focal lengths.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、蛍光３次元像は同心円状ホログラムであり、位相３次元像は等傾角ホログラムであり、空間周波数面において蛍光３次元像と位相３次元像とを分離する。
蛍光３次元像は、第２のホログラフィック光学系の蛍光の偏光が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。一方、位相３次元像は、等傾角干渉を用いることによってキャリア周波数をもつ干渉パターンにすることができる。同心円状干渉パターンと等傾角干渉パターンは、空間周波数面で分離することが可能であり、撮像手段により撮像した像から、蛍光３次元像と位相３次元像を空間周波数面で分離することができる。２つのホログラムパターンをフーリエ変換することで、空間周波数面で、等傾角干渉パターンの成分をバンドパスフィルタによって抽出することができる。予め、等傾角干渉パターンに用いた参照光強度分布を取得しておくことで、同心円状干渉パターンのみを抽出することが可能になる。In the digital holographic microscope of the present invention, the fluorescent three-dimensional image is a concentric circular hologram, the phase three-dimensional image is an equi-tilt angle hologram, and the fluorescent three-dimensional image and the phase three-dimensional image are separated in the spatial frequency plane.
In the fluorescence three-dimensional image, the polarization of fluorescence of the second holographic optical system causes self-interference, so that the interference pattern is concentric. On the other hand, the phase three-dimensional image can be made into an interference pattern having a carrier frequency by using the equal tilt interference. The concentric interference pattern and the equi-tilt angle interference pattern can be separated in the spatial frequency plane, and the fluorescence three-dimensional image and the phase three-dimensional image can be separated in the spatial frequency plane from the image picked up by the image pickup means. .. By Fourier transforming the two hologram patterns, the components of the equi-tilt interference pattern can be extracted by the bandpass filter in the spatial frequency plane. By acquiring the reference light intensity distribution used for the equal tilt interference pattern in advance, it is possible to extract only the concentric interference pattern.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡において、第２のホログラフィック光学系は、励起用レーザ光源が切替可能であることでもよい。観察対象試料の蛍光特性に応じて、励起用レーザ光源の波長を切り替えるようにする。これにより、蛍光染色試薬の種類に応じて、励起用レーザ光源を切替えて使用することにより、ターゲットとなる細胞を選択して分裂や形状変化などの細胞の状態変化を計測できる。
すなわち、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、一の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、他の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、同時に取得した位相３次元像とから、細胞の挙動を観察する細胞観察方法を実現できる。In the digital holographic microscope of the present invention, in the second holographic optical system, the excitation laser light source may be switchable. The wavelength of the excitation laser light source is switched according to the fluorescence characteristic of the sample to be observed. Thus, by switching and using the laser light source for excitation depending on the type of the fluorescent staining reagent, it is possible to select a target cell and measure a change in cell state such as division or shape change.
That is, using the digital holographic microscope of the present invention, a fluorescence three-dimensional image acquired using one excitation laser light source and a fluorescence three-dimensional image acquired using another excitation laser light source were acquired simultaneously. A cell observation method for observing cell behavior can be realized from the phase three-dimensional image.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、第１のホログラフィック光学系が透過型であり、第２のホログラフィック光学系が反射型（落射型）にすることが好ましい。また、第１及び第２のホログラフィック光学系は、共に試料の設置状態により上下を反転させても構わない。
観察対象試料の蛍光励起光による蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系において、蛍光信号は微弱であるので、透過型にした場合に、強い蛍光励起光だけをカットするのは非常に困難になるからである。
第２のホログラフィック光学系を反射型（落射型）でなく透過型にする場合は、蛍光信号を励起する蛍光励起光を十分にカットし、蛍光信号のみを通過させるダイクロイックミラーや蛍光波長の特定の波長および位相計測のためのレーザ波長を通過させるバンドパスフィルタを用いる必要がある。In the digital holographic microscope of the present invention, it is preferable that the first holographic optical system is a transmissive type and the second holographic optical system is a reflective type (incident type). Further, both the first and second holographic optical systems may be turned upside down depending on the installation state of the sample.
In the second holographic optical system that acquires a fluorescence three-dimensional image of the sample to be observed by fluorescence excitation light, the fluorescence signal is weak, so it is extremely difficult to cut only the strong fluorescence excitation light when the transmission type is used. Because it will be difficult.
When making the second holographic optical system a transmissive type instead of a reflective type (episcopic type), the fluorescence excitation light that excites the fluorescence signal is sufficiently cut, and the dichroic mirror that passes only the fluorescence signal and the identification of the fluorescence wavelength are specified. It is necessary to use a bandpass filter that passes the laser wavelength and the laser wavelength for phase measurement.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡において、細胞観察の際は、蛍光３次元像により細胞核の時空間情報を、位相３次元像により細胞核や細胞壁の時空間構造を同時に取得することが好ましい。
複数の物理量から得られる多次元情報は、従来のバイオイメージング分野における計測では得られておらず、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡によって、従来不可能であった観察を可能にする。本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡は、バイオイメージング分野における強力な計測ルールとして、蛍光３次元像と位相３次元像を同時かつ高速撮影することを可能にする。
すなわち、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、蛍光３次元像により細胞核の時空間情報と、位相３次元像により細胞核や細胞壁の時空間構造とを同時に取得する細胞観察方法を実現できる。When observing cells in the digital holographic microscope of the present invention, it is preferable to simultaneously acquire the spatiotemporal information of the cell nucleus by a fluorescence three-dimensional image and the spatiotemporal structure of the cell nucleus or cell wall by a phase three-dimensional image.
Multidimensional information obtained from a plurality of physical quantities has not been obtained by conventional measurement in the field of bioimaging, and the digital holographic microscope of the present invention enables observations that were previously impossible. The digital holographic microscope of the present invention enables simultaneous high-speed imaging of fluorescence three-dimensional images and phase three-dimensional images as a powerful measurement rule in the field of bioimaging.
That is, using the digital holographic microscope of the present invention, it is possible to realize a cell observation method for simultaneously obtaining the spatiotemporal information of the cell nucleus by the fluorescence three-dimensional image and the spatiotemporal structure of the cell nucleus and the cell wall by the phase three-dimensional image.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡によれば、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡が結合され、蛍光３次元像と位相３次元像を同時に計測できるといった効果がある。 According to the digital holographic microscope of the present invention, the fluorescence digital holographic microscope and the phase image detecting digital holographic microscope are combined, and there is an effect that a fluorescence three-dimensional image and a phase three-dimensional image can be simultaneously measured.
以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。 Hereinafter, an example of an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. The scope of the present invention is not limited to the following embodiments and illustrated examples, and many modifications and variations are possible.
図1は、ディジタルホログラフィック顕微鏡の一実施形態の光学系の構成を示す。図１に示すディジタルホログラフィック顕微鏡は、図２に示す透過型ディジタルホログラフィック顕微鏡と、図３で示す反射型蛍光顕微鏡との２つの光学系を共通光路として、物体光と蛍光信号光を同軸に重畳させて、１つの撮像手段で位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得できるようにしたものである。 FIG. 1 shows the configuration of an optical system of an embodiment of a digital holographic microscope. The digital holographic microscope shown in FIG. 1 has two optical systems, a transmission type digital holographic microscope shown in FIG. 2 and a reflection type fluorescence microscope shown in FIG. The two holograms of the phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image can be simultaneously obtained by superimposing them by one imaging means.
先ず、波長３５５ｎｍから５５０ｎｍの帯域の励起用レーザ光源６を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する。励起された蛍光分子は、波長３５５ｎｍから５５０ｎｍの帯域の励起用レーザ光源より長波長の蛍光信号を発し、試料ステージ４のガラス基板表面で反射された励起用レーザ光とともに対物レンズ１５に入射する。なお、ダイクロイックミラー１６を設置し、励起用レーザ光を十分に減衰させ、蛍光信号光を強調して蛍光３次元像を取得する。
蛍光３次元像は、２重焦点レンズである２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。ＳＰＦＬ２は、図７に示すように、２つの焦点距離（ｆ１，ｆ２）を持つサブ波長周期構造のフレネルレンズである。光の波長よりも短い周期の回折格子構造（サブ波長周期構造）によって、光波はその偏光状態によって回折を受けることになる。１つのビーム光は、２つの焦点距離をもつフレネルレンズにより、２つの回折波が生成される。そして、２つの回折波は異なる場所で焦点が合うことになる。First, the excitation laser light source 6 in the wavelength band of 355 nm to 550 nm is used to excite the fluorescent molecules of the observation target sample on the sample stage 4. The excited fluorescent molecule emits a long-wavelength fluorescence signal from the excitation laser light source in the wavelength band of 355 nm to 550 nm, and enters the objective lens 15 together with the excitation laser light reflected by the glass substrate surface of the sample stage 4. In addition, the dichroic mirror 16 is installed, the excitation laser light is sufficiently attenuated, the fluorescence signal light is emphasized, and a fluorescence three-dimensional image is acquired.
In the fluorescence three-dimensional image, the polarization components of the fluorescence self-interfere by the bifocal Fresnel lens (SPFL) 2 which is a bifocal lens, so that the interference pattern becomes concentric. The SPFL 2 is a Fresnel lens having a sub-wavelength periodic structure having two focal lengths (f 1 , f 2 ) as shown in FIG. 7. Due to the diffraction grating structure (sub-wavelength periodic structure) having a period shorter than the wavelength of light, the light wave is diffracted by its polarization state. Two diffracted waves are generated from one beam light by a Fresnel lens having two focal lengths. Then, the two diffracted waves are focused at different places.
また同時に、波長６３３（ｎｍ）のＨｅ−Ｎｅレーザ光源５を用いて試料ステージ４上の観察対象試料の計測物体を照明する。Ｈｅ−Ｎｅレーザ光はビームスプリッター１２により、それぞれ計測物体を透過する物体光経路と、何もない参照光経路に分けられ、マッハ・ツェンダー干渉計を構成している。計測物体を透過するＨｅ−Ｎｅレーザ光の波長が波長３５５ｎｍから５５０ｎｍの帯域の励起用レーザ光の波長より長いため、ダイクロイックミラー１６に影響されずに伝搬され、再びビームスプリッター１８により参照光と干渉することができる。この際、物体光と参照光の間にわずかに角度をつけることによって、オフアクシス（off-axis）ホログラム、すなわち等傾角干渉パターンのホログラムを取得する。取得した等傾角干渉パターンのホログラムから、フーリエ変換法を用いて物体光の振幅分布と位相分布を抽出する。オフアクシス法では元の物体位置まで逆伝搬させることにより、観察対象試料の物体光の波面が再生されることになる。 At the same time, the measurement object of the observation target sample on the sample stage 4 is illuminated by using the He-Ne laser light source 5 having a wavelength of 633 (nm). The He-Ne laser light is divided by a beam splitter 12 into an object light path that passes through the measurement object and a reference light path that does not exist, and constitutes a Mach-Zehnder interferometer. Since the wavelength of the He-Ne laser light passing through the measurement object is longer than the wavelength of the excitation laser light in the wavelength band of 355 nm to 550 nm, the He-Ne laser light propagates without being affected by the dichroic mirror 16 and again interferes with the reference light by the beam splitter 18. can do. At this time, by slightly making an angle between the object light and the reference light, an off-axis hologram, that is, a hologram having an equal tilt angle interference pattern is acquired. The amplitude distribution and the phase distribution of the object light are extracted from the obtained hologram of the equi-tilt interference pattern by using the Fourier transform method. In the off-axis method, the wave front of the object light of the sample to be observed is reproduced by back propagation to the original object position.
そして、撮像手段として用いるイメージセンサ３で、位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得する。
上述の如く、蛍光３次元像は、２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。一方、位相３次元像は、等傾角干渉パターンとなる。同心円状干渉パターンと等傾角干渉パターンは、空間周波数面で分離することが可能であり、イメージセンサ３により撮像した像から、位相３次元像の位相ホログラムと蛍光３次元像の蛍光ホログラムとを空間周波数面で分離することができる。
ＳＰＦＬ２を設けることにより、位相ホログラム用の光が影響を受けないように、１／２波長板２０を設け、位相ホログラム用の光の偏光をＳＰＦＬ２によって影響しない偏光状態に合わせている。また、１／２波長板２１を設けて、蛍光励起用光源の偏光方向をＳＰＦＬ２が働く偏光方向に合せている。Then, the image sensor 3 used as the image pickup means simultaneously acquires two holograms of the phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image.
As described above, the fluorescence three-dimensional image has concentric circular interference patterns because the polarization components of the fluorescence self-interfere by the bifocal Fresnel lens (SPFL) 2. On the other hand, the phase three-dimensional image has an equal tilt interference pattern. The concentric interference pattern and the isoclinic interference pattern can be separated in the spatial frequency plane, and the phase hologram of the phase three-dimensional image and the fluorescence hologram of the fluorescence three-dimensional image are spatially separated from the image captured by the image sensor 3. They can be separated in terms of frequency.
By providing the SPFL2, the 1/2 wavelength plate 20 is provided so that the light for the phase hologram is not affected, and the polarization of the light for the phase hologram is adjusted to the polarization state that is not affected by the SPFL2. In addition, the half-wave plate 21 is provided to match the polarization direction of the fluorescence excitation light source with the polarization direction in which the SPFL 2 operates.
ここで、位相ホログラムと蛍光ホログラムが重畳した信号は、下記数式１のように示すことができる。 Here, the signal in which the phase hologram and the fluorescence hologram are superposed can be expressed by the following mathematical formula 1.
上記数式１において、ｏpは位相ホログラム用の物体光波の複素振幅分布を表し、ｒpは参照光波の複素振幅分布を表す。また、ｏＦは２重焦点レンズに入射する蛍光ホログラム用物体光波の複素振幅分布である。ここで、ｆ１，ｆ２は２重焦点レンズの２つの焦点距離を示す。また、ｇはレンズの位相関数および撮像面までのフレネル回折伝搬を表す関数である。
ｒpが下記数２で表される平面波であるとすると、位相ホログラムはオフアクシス型ホログラムとなる。そこで、位相ホログラムの抽出は、上記数式１をフーリエ変換して、空間周波数面で行うことができる。In the above equation 1, o p represents the complex amplitude distribution of the object light wave for phase holograms, r p represents the complex amplitude distribution of the reference light wave. Further, o F is the complex amplitude distribution of the object light wave for fluorescence hologram incident on the double focus lens. Here, f 1 and f 2 represent two focal lengths of the double focus lens. Further, g is a function representing the phase function of the lens and the Fresnel diffraction propagation to the imaging surface.
If r p is a plane wave represented by the following equation 2, the phase hologram is an off-axis type hologram. Therefore, the extraction of the phase hologram can be performed in the spatial frequency plane by performing the Fourier transform of the equation (1).
上記数式１をフーリエ変換したものを下記数式３に示す。ここで、Ａは位相ホログラム用の参照光の振幅である。図４（１）は、位相ホログラムと蛍光ホログラムの２つのホログラムが重畳した干渉画像であり、下記数式３を図示化したものである。下記数式３の右辺の第１，２，５，６，７，８項は自己干渉の同心円状ホログラムによる項であり、空間周波数面で原点付近に現れる信号となる（図４（２）を参照）。また、右辺の第３，４項はオフアクシスホログラムによる項であり、空間周波数面で原点からずれた位置に存在する信号となる（図４（２）を参照）。このため、ウィンドウ関数を掛けることにより、図４（２）に示す空間周波数面で、原点付近に現れる蛍光ホログラムと、原点からずれた位置に存在する位相ホログラムの２つのホログラムを分離する（図４（３）を参照）。したがって、オフアクシスホログラムによる項である右辺の第３，４項を、それぞれ、下記数式４と数式５のように取り出すことができる。 A Fourier transform of Equation 1 is shown in Equation 3 below. Here, A is the amplitude of the reference light for the phase hologram. FIG. 4(1) is an interference image in which two holograms, a phase hologram and a fluorescence hologram, are superposed, and illustrates the following mathematical formula 3. The 1st, 2nd, 5th, 6th, 7th, and 8th terms on the right-hand side of Equation 3 below are terms due to concentric holograms of self-interference, and are signals that appear near the origin in the spatial frequency plane (see FIG. 4 (2)). ). Further, the third and fourth terms on the right side are terms due to the off-axis hologram, and are signals existing at positions deviated from the origin in the spatial frequency plane (see FIG. 4(2)). Therefore, by multiplying by a window function, two holograms of a fluorescence hologram appearing near the origin and a phase hologram existing at a position displaced from the origin are separated in the spatial frequency plane shown in FIG. (See (3)). Therefore, the third and fourth terms on the right side, which are terms due to the off-axis hologram, can be extracted as in the following Equations 4 and 5, respectively.
ここで、位相ホログラム用の参照光の振幅Ａは、予め測定することが可能であるため、上記数式４と数式５から位相ホログラムの物体光ｏpとその複素共役分布を求めることができる。上記数式３に上記数式４と数式５を代入して、蛍光ホログラムとして下記数式６を得る。
ここで、上記数式３における、Ｇ１とＧ２は、それぞれ、ｇ（ＯＦ（ｘ，ｙ），ｆ１）とｇ（ＯＦ（ｘ，ｙ），ｆ２）のフーリエ変換を表している。Here, the amplitude A of the reference light phase hologram, since it is possible to previously measured, it is possible to find the object beam o p and its complex conjugate distribution phase hologram from the equation 4 and equation 5. By substituting the equations 4 and 5 into the equation 3, the following equation 6 is obtained as a fluorescence hologram.
Here, G 1 and G 2 in Equation 3 above represent the Fourier transform of g(O F (x,y),f 1 ) and g(O F (x,y),f 2 ), respectively. There is.
上述の如く、位相ホログラムと蛍光ホログラムの２つのパターンをフーリエ変換することにより、空間周波数面で原点からずれた位置に存在する信号の等傾角干渉パターンの成分を、バンドパスフィルタによって抽出することができる。また、予め等傾角干渉パターンに用いた参照光の強度分布を取得しておくことで、同心円状の干渉パターンのみを抽出することが可能になる。 As described above, by performing the Fourier transform on the two patterns of the phase hologram and the fluorescence hologram, the components of the equi-tilt interference pattern of the signal existing at the position deviated from the origin in the spatial frequency plane can be extracted by the bandpass filter. it can. Further, by acquiring the intensity distribution of the reference light used for the equal tilt interference pattern in advance, it is possible to extract only the concentric interference pattern.
（撮像したホログラムの一例）
ここで、撮像したホログラムの一例を示す。イメージセンサ３は、Photometrics社のCoolSNAPKINO-SPK(4.54μm ピッチ、14bit) を使用した。また、対物レンズ１５は、オリンパス社製ＭＤＰｌａｎ４０（ＮＡ＝０．６５）の４０倍の対物レンズを使用した。観察対象としては、Invitrogen 社のTetraSpeck（登録商標）の 直径４μｍの蛍光ビーズを使用した。(Example of imaged hologram)
Here, an example of the imaged hologram is shown. The image sensor 3 used was CoolSNAPKINO-SPK (4.54 μm pitch, 14 bit) manufactured by Photometrics. Further, as the objective lens 15, a 40 times objective lens of MDPlan40 (NA=0.65) manufactured by Olympus Corporation was used. As an observation target, fluorescent beads of TetraSpeck (registered trademark) having a diameter of 4 μm manufactured by Invitrogen were used.
蛍光励起中心波長５３２（ｎｍ）、蛍光の中心波長５５０（ｎｍ）で、蛍光像と位相ホログラムを個別にイメージセンサで取得したホログラムのイメージの一例を図５に示す。
図５（１）が蛍光ビーズのホログラム画像であり（蛍光ビーズの部分を拡大した図も付記）、それをフーリエ変換して、図５（２）の空間周波数面を得る。空間周波数面の原点からずれた位置に存在するホログラムを抽出し、図５（３）の位相分布を取得する（拡大位相像も付記）。
図５（４）は、再構成された位相分布の３次元表示を示している。図５（４）から、蛍光ビーズの位相変化量が分かる。FIG. 5 shows an example of an image of a hologram in which the fluorescence image and the phase hologram are individually acquired by the image sensor at the fluorescence excitation center wavelength 532 (nm) and the fluorescence center wavelength 550 (nm).
FIG. 5(1) is a hologram image of the fluorescent beads (also an enlarged view of the fluorescent beads is shown), and Fourier transform is performed on the hologram image to obtain the spatial frequency plane of FIG. 5(2). A hologram existing at a position deviated from the origin of the spatial frequency plane is extracted and the phase distribution of FIG. 5C is acquired (also an enlarged phase image is added).
FIG. 5(4) shows a three-dimensional display of the reconstructed phase distribution. The amount of phase change of the fluorescent beads can be seen from FIG. 5(4).
蛍光ビーズの蛍光像と、図５のプロセスで得られた位相像を、それぞれ図６（１）、（２）に示す。また位相３Ｄプロットを図６（３）に示す。図６（１）と（２）から蛍光ビーズ像と蛍光ビーズの位相像を確認できる。図６（３）から蛍光ビーズの形状が凸状の球形に近い形状が得られていることがわかる。構築した実験系を用いて、４μｍサイズの蛍光像や１０μｍサイズの細胞形状の位相像などの計測が可能であることを確認した。
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、リアルタイムで細胞の形状変化と核の動きを計測可能である。奥行き位置方向に結像位置を探索するオートフォーカス機能を更に実装することにより、リアルタイムに蛍光３次元像と位相３次元像の観察が実現できるであろう。The fluorescent image of the fluorescent beads and the phase image obtained by the process of FIG. 5 are shown in FIGS. 6(1) and 6(2), respectively. A phase 3D plot is shown in Fig. 6(3). From FIG. 6 (1) and (2), the fluorescent bead image and the phase image of the fluorescent bead can be confirmed. It can be seen from FIG. 6C that the shape of the fluorescent beads is close to a convex spherical shape. It was confirmed that it is possible to measure a fluorescence image of 4 μm size, a phase image of cell shape of 10 μm size, etc. using the constructed experimental system.
The digital holographic microscope of the present invention can measure the shape change of cells and the movement of nuclei in real time. It is possible to realize real-time observation of a fluorescence three-dimensional image and a phase three-dimensional image by further mounting an autofocus function that searches for an imaging position in the depth position direction.
上述の実施例２のディジタルホログラフィック顕微鏡は、位相ホログラムを取得する第１のホログラフィック光学系が透過型であり、蛍光ホログラムを取得する第２のホログラフィック光学系が反射型であるが、以下に説明するように、蛍光ホログラムを取得する第２のホログラフィック光学系が透過型であっても構わない。
図８は、実施例２のディジタルホログラフィック顕微鏡の光学系の構成図を示している。In the digital holographic microscope of Example 2 described above, the first holographic optical system that acquires a phase hologram is a transmission type, and the second holographic optical system that acquires a fluorescence hologram is a reflection type. As described in Section 2, the second holographic optical system for acquiring the fluorescence hologram may be a transmissive type.
FIG. 8 is a block diagram of the optical system of the digital holographic microscope of the second embodiment.
実施例１のディジタルホログラフィック顕微鏡の光学系と同様に、波長６３３（ｎｍ）のＨｅ−Ｎｅレーザ光源５を用いて試料ステージ４上の観察対象試料の計測物体を照明する。Ｈｅ−Ｎｅレーザ光はビームスプリッター１２により、それぞれ計測物体を透過する物体光経路と、何もない参照光経路に分けられ、マッハ・ツェンダー干渉計を構成する。計測物体を透過するＨｅ−Ｎｅレーザ光の波長が後述する波長５３２ｎｍの帯域の励起用レーザ光源より長いため、ダイクロイックミラー３３に影響されずに伝搬され、再びビームスプリッター１８により参照光と干渉することができる。この際、物体光と参照光の間にわずかに角度をつけることによって、オフアクシスホログラム（等傾角干渉パターンのホログラム）を取得する。 Similar to the optical system of the digital holographic microscope of the first embodiment, the He-Ne laser light source 5 having a wavelength of 633 (nm) is used to illuminate the measurement object of the observation target sample on the sample stage 4. The He-Ne laser light is divided by a beam splitter 12 into an object light path that passes through a measurement object and a reference light path that does not exist, and constitutes a Mach-Zehnder interferometer. Since the wavelength of the He-Ne laser light that passes through the measurement object is longer than that of the excitation laser light source in the wavelength band of 532 nm described later, the He-Ne laser light propagates without being affected by the dichroic mirror 33 and again interferes with the reference light by the beam splitter 18. You can At this time, an off-axis hologram (a hologram having an equal tilt interference pattern) is acquired by slightly forming an angle between the object light and the reference light.
また、波長５３２ｎｍの帯域の励起用レーザ光源６を用いて、試料ステージ４のガラス基板の裏面から試料ステージ４の表面に置かれた観察対象試料を透過して蛍光分子を励起する。励起された蛍光分子は、５３２（ｎｍ）より長波長の蛍光信号を発し、試料ステージ４を透過した励起用レーザ光とともに対物レンズ１５に入射する。観察対象試料の蛍光励起光による蛍光信号は微弱であるので、本実施例のような透過型にした場合に、蛍光励起光を十分にカットし、蛍光信号のみを通過させるダイクロイックミラー３３を設置し、励起用レーザ光を十分に減衰させ、蛍光信号光を強調して蛍光３次元像を取得する。蛍光３次元像は、サブ波長周期構造の２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。 In addition, the excitation laser light source 6 having a wavelength band of 532 nm is used to excite the fluorescent molecules from the back surface of the glass substrate of the sample stage 4 through the observation target sample placed on the surface of the sample stage 4. The excited fluorescent molecule emits a fluorescent signal having a wavelength longer than 532 (nm), and enters the objective lens 15 together with the exciting laser beam that has passed through the sample stage 4. Since the fluorescence signal due to the fluorescence excitation light of the sample to be observed is weak, a dichroic mirror 33 that sufficiently cuts the fluorescence excitation light and allows only the fluorescence signal to pass when the transmission type as in the present embodiment is used is installed. , The excitation laser light is sufficiently attenuated, the fluorescence signal light is emphasized, and a fluorescence three-dimensional image is acquired. In the fluorescence three-dimensional image, the polarization components of the fluorescence self-interfere by the bifocal Fresnel lens (SPFL) 2 having the sub-wavelength periodic structure, so that the interference pattern is concentric.
そして、イメージセンサ３で、位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得する。蛍光ホログラムの干渉パターンは同心円状となり、位相ホログラムの干渉パターンは等傾角干渉パターンとなる。実施例１と同様に、同心円状干渉パターンと等傾角干渉パターンは、空間周波数面で分離することが可能であり、イメージセンサ３により撮像した像から、位相３次元像の位相ホログラムと蛍光３次元像の蛍光ホログラムとを空間周波数面で分離することができる。また、ＳＰＦＬ２を設けることにより、位相ホログラム用の光が影響を受けないように、１／２波長板２０を設け、位相ホログラム用の光の偏光をＳＰＦＬ２によって影響しない偏光状態に合わせている。また、１／２波長板２１を設けて、蛍光励起用光源の偏光方向をＳＰＦＬ２が働く偏光方向に合せている。 Then, the image sensor 3 simultaneously acquires two holograms of the phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image. The interference pattern of the fluorescence hologram becomes concentric, and the interference pattern of the phase hologram becomes an equiclined interference pattern. Similar to the first embodiment, the concentric interference pattern and the equi-tilt angle interference pattern can be separated in the spatial frequency plane, and from the image captured by the image sensor 3, the phase hologram of the phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image can be obtained. The fluorescence hologram of the image can be separated in the spatial frequency plane. Further, by providing the SPFL2, the half-wave plate 20 is provided so that the light for the phase hologram is not affected, and the polarization of the light for the phase hologram is adjusted to a polarization state that is not affected by the SPFL2. In addition, the half-wave plate 21 is provided to match the polarization direction of the fluorescence excitation light source with the polarization direction in which the SPFL 2 operates.
従来、バイオイメージング分野の顕微鏡観察では、焦点面近傍での細胞の動きのみしか観察できないという限界がある。一方、ディジタルホログラフィーでは、２０倍の対物レンズを用いた場合に、１０００倍の奥行き範囲を観察できることが知られている。実施例１又は２のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、３次元的な細胞の塊や奥行きに異なる細胞における反応を計測し、多数の細胞について３次元位置をマルチトラックキングすることが可能である。 Conventionally, microscopic observation in the field of bioimaging has a limitation that only the movement of cells near the focal plane can be observed. On the other hand, in digital holography, it is known that a depth range of 1000 times can be observed when an objective lens of 20 times is used. By using the digital holographic microscope of Example 1 or 2, it is possible to measure the reaction in three-dimensional cell clusters or cells having different depths, and perform multi-tracking of three-dimensional positions for many cells.
時間的に異なる再構成像の各々の点において合焦または非合焦の判別を行って、３次元的にフォーカスの合った再構成像を３０フレーム毎秒のリアルタイムで再生する。位相分布情報に対して奥行きに合焦となる位置を追跡するオートフォーカスを機能を設ける。時間分解能として１０−５秒から１０５秒の１０桁の時間スケールに対応可能なディジタルホログラフィック顕微鏡を構築することも可能である。また、奥行きの異なるがん細胞に対する薬の効果を同時観察することも可能であり、全ての面で焦点のあった再構成像を提供できる。Focusing or non-focusing is discriminated at each point of the reconstructed images that differ temporally, and the reconstructed image that is three-dimensionally focused is reproduced in real time at 30 frames per second. A function is provided for auto-focusing that tracks the position in focus with respect to the phase distribution information in depth. It is also possible to construct a digital holographic microscope capable of supporting a 10-digit time scale of 10 −5 seconds to 10 5 seconds as a time resolution. In addition, it is possible to simultaneously observe the effects of the drug on cancer cells having different depths, and it is possible to provide a reconstructed image with a focus on all surfaces.
図９、１０は、オオカナダモにおける葉緑体の原形質流動を、実施例１のディジタルホログラフィック顕微鏡で観察した画像のイメージを示している。図９（１）はオオカナダモの撮影画像（２層構造を示す断面図も付記）、図９（２）はホログラム、図９（３）の空間周波数面、図９（４）は再現された位相イメージを示している。
葉緑体は染色することなく自家蛍光を発する（図１０（１）を参照）。そのため、蛍光ホログラムと位相ホログラムを同時に取得し、位相測定により細胞壁の構造と葉緑体を同時に計測する（図１０（２）を参照）。葉緑体は３次元的に移動しているため、時系列に並ぶホログラム像をリアルタイムで再構成する。9 and 10 show images of images obtained by observing the chloroplast cytoplasmic flow in the giant scorpionfish with the digital holographic microscope of Example 1. FIG. 9(1) is a photographed image of O. canadian (a cross-sectional view showing a two-layer structure is also added), FIG. 9(2) is a hologram, FIG. 9(3) is a spatial frequency plane, and FIG. 9(4) is a reproduced phase. Shows an image.
Chloroplasts emit autofluorescence without staining (see FIG. 10(1)). Therefore, the fluorescence hologram and the phase hologram are acquired at the same time, and the structure of the cell wall and the chloroplast are simultaneously measured by the phase measurement (see FIG. 10(2)). Since the chloroplast moves three-dimensionally, the hologram images arranged in time series are reconstructed in real time.
また、図９（１）に示すように、オオカナダモは表面と裏面の２層構造をしている。実施例１のディジタルホログラフィック顕微鏡によるディジタルホログラフィー計測では、奥行きに構造が存在する場合にコヒーレンス長が長いため、クロストークノイズが大きい。ディジタルホログラフィーでは奥行き位置の異なる情報をフィルタにより除去あるいは低減させることが可能であるため、信号処理により奥行き分解能を向上させることが可能である。 Further, as shown in FIG. 9(1), the giant squirrel has a two-layer structure of a front surface and a back surface. In the digital holographic measurement by the digital holographic microscope of the first embodiment, the crosstalk noise is large because the coherence length is long when the structure exists in the depth. In digital holography, since information having different depth positions can be removed or reduced by a filter, it is possible to improve depth resolution by signal processing.
図１１は、ディジタルホログラフィック顕微鏡の他の実施形態の光学系の構成を示す。図１に示すディジタルホログラフィック顕微鏡と同様、透過型ディジタルホログラフィック顕微鏡と反射型蛍光顕微鏡との２つの光学系を共通光路として、物体光と蛍光信号光を同軸に重畳させて、１つの撮像手段で位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得できるようにしたものである。 FIG. 11 shows the configuration of the optical system of another embodiment of the digital holographic microscope. Similar to the digital holographic microscope shown in FIG. 1, two optical systems, a transmission type digital holographic microscope and a reflection type fluorescence microscope, are used as a common optical path, and the object light and the fluorescence signal light are coaxially superposed on each other to form one imaging means. It is possible to simultaneously obtain two holograms of a phase three-dimensional image and a fluorescence three-dimensional image.
図１に示すディジタルホログラフィック顕微鏡と異なる点は、２つの励起用レーザ光源（４１，４２）を備えている点である。具体的には、４７３ｎｍの波長の青色レーザと、５３２ｎｍの波長の緑色レーザを備える。青色レーザは、主に５００〜５３０ｎｍの蛍光を励起することを目的とする。一方、緑色レーザは、主に５４０〜６００ｎｍの蛍光を励起することを目的とする。観察対象の細胞によって、蛍光マーカーが異なることが想定される。そのため、蛍光マーカーが励起する波長のレーザを観察対象試料に照射できるようにする。
例えば、図１１に示す構成の場合、２つのシャッター（４３，４４）とビームスプリッター４６によって、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する励起用レーザ光源（４１，４２）が切替えられる。シャッター（４３，４４）の切り替えは、シャッター制御装置５０から出力されるシャッター制御信号（５１，５２）によって行われる。ビームスプリッター４６の先になるＮＤ（Neutral Density）フィルタ４７は、色彩に影響を与えることなくレーザ光量を低下させるためのものである。The difference from the digital holographic microscope shown in FIG. 1 is that it is provided with two excitation laser light sources (41, 42). Specifically, a blue laser having a wavelength of 473 nm and a green laser having a wavelength of 532 nm are provided. Blue lasers are primarily intended to excite fluorescence between 500 and 530 nm. On the other hand, the green laser mainly aims to excite fluorescence of 540 to 600 nm. It is assumed that the fluorescent markers differ depending on the cells to be observed. Therefore, it is possible to irradiate the sample to be observed with a laser having a wavelength that the fluorescent marker excites.
For example, in the case of the configuration shown in FIG. 11, two shutters (43, 44) and the beam splitter 46 switch the excitation laser light source (41, 42) for exciting the fluorescent molecules of the sample to be observed on the sample stage 4. .. Switching of the shutters (43, 44) is performed by a shutter control signal (51, 52) output from the shutter control device 50. An ND (Neutral Density) filter 47 at the tip of the beam splitter 46 is for reducing the laser light amount without affecting the color.
２つの励起用レーザ光源（４１，４２）の内、一方の励起用レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する。励起された蛍光分子は、励起用レーザ光源より長波長の蛍光信号を発し、試料ステージ４のガラス基板表面で反射された励起用レーザ光とともに対物レンズ１５に入射する。また、シャッター制御装置５０により、２つのシャッター（４３，４４）を切り替え、もう一方の励起用レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する。
２つの励起用レーザ光源（４１，４２）の各々の蛍光３次元像は、２重焦点レンズである２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。One of the two excitation laser light sources (41, 42) is used to excite the fluorescent molecule of the sample to be observed on the sample stage 4. The excited fluorescent molecule emits a fluorescence signal having a long wavelength from the excitation laser light source, and enters the objective lens 15 together with the excitation laser light reflected on the glass substrate surface of the sample stage 4. Further, the shutter control device 50 switches between the two shutters (43, 44), and the other excitation laser light source is used to excite the fluorescent molecules of the observation target sample on the sample stage 4.
The fluorescence three-dimensional images of each of the two excitation laser light sources (41, 42) have concentric circular interference patterns because the polarization components of the fluorescence self-interfere by the bifocal Fresnel lens (SPFL) 2 which is a bifocal lens. Becomes
蛍光３次元像の取得と同時に、波長６３３（ｎｍ）のＨｅ−Ｎｅレーザ光源５を用いて試料ステージ４上の観察対象試料の計測物体を照明し、オフアクシス（off-axis）ホログラムを作成し、イメージセンサ３で、位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得する。 Simultaneously with the acquisition of the fluorescence three-dimensional image, the He-Ne laser light source 5 having a wavelength of 633 (nm) is used to illuminate the measurement object of the observation target sample on the sample stage 4 to create an off-axis hologram. The image sensor 3 simultaneously acquires two holograms of a phase three-dimensional image and a fluorescence three-dimensional image.
観察対象試料として、径が２．５〜４．５μｍで、黄色とナイルレッドの２色蛍光ビーズを混ぜたものを用いた。図１１の光学系の構成のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、２色蛍光ビーズの位相像と蛍光像を取得した結果を図１２に示す。ただし、本実施例では、蛍光は２次元像の撮影となっている。図１２（１）は、２色蛍光ビーズの位相像を示している。図１２（２）（３）は、それぞれ黄色の蛍光ビーズの蛍光像、ナイルレッドの蛍光ビーズの蛍光像を示している。図１２（２）の黄色の蛍光ビーズの蛍光像は、青色レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起した場合の蛍光像である。また図１２（３）のナイルレッドの蛍光ビーズの蛍光像は、緑色レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起した場合の蛍光像である。図１２（１）の位相像から６つの蛍光ビーズが確認できる。また、図１２（２）の蛍光像では４つの蛍光ビーズが確認でき、図１２（３）の蛍光像では２つの蛍光ビーズが確認できる。これらのことから、構築した実験系を用いて、μオーダサイズの蛍光粒子を、その色毎に識別して確認できることがわかった。
また、図１２（４）は、これらの蛍光ビーズの１つの位相プロファイルを示している。この図から蛍光ビーズの大きさ(約５μｍ）と位相差(２．６ rad程度）を知ることができる。As the sample to be observed, one having a diameter of 2.5 to 4.5 μm and mixed with two-color fluorescent beads of yellow and Nile red was used. FIG. 12 shows the result of acquiring the phase image and the fluorescence image of the two-color fluorescent beads using the digital holographic microscope having the optical system configuration of FIG. However, in this embodiment, fluorescence is a two-dimensional image. FIG. 12(1) shows a phase image of the two-color fluorescent beads. 12(2) and 12(3) show a fluorescent image of yellow fluorescent beads and a fluorescent image of Nile red fluorescent beads, respectively. The fluorescent image of the yellow fluorescent beads in FIG. 12B is a fluorescent image when the fluorescent molecules of the sample to be observed on the sample stage 4 are excited by using the blue laser light source. The fluorescent image of the Nile red fluorescent beads in FIG. 12C is a fluorescent image when the fluorescent molecules of the sample to be observed on the sample stage 4 are excited by using the green laser light source. Six fluorescent beads can be confirmed from the phase image of FIG. 12(1). Further, four fluorescent beads can be confirmed in the fluorescent image of FIG. 12(2), and two fluorescent beads can be confirmed in the fluorescent image of FIG. 12(3). From these, it was found that the constructed experimental system can be used to identify and confirm the fluorescent particles of μ order size for each color.
Further, FIG. 12(4) shows one phase profile of these fluorescent beads. From this figure, the size of the fluorescent beads (about 5 μm) and the phase difference (about 2.6 rad) can be known.
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、リアルタイムで細胞の形状変化と細胞核の動きを計測可能であり、蛍光染色試薬の種類に応じて、励起用レーザ光源を切替えて使用することにより、ターゲットとなる細胞を選択して形状変化と動きを計測できる。
なお、本実施例では、２つの励起用レーザ光源を用いているが、３つ以上であってもよい。また、シャッター制御装置から出力されるシャッター制御信号を高速に切り替えて、蛍光像を取得してもよい。In the digital holographic microscope of the present invention, it is possible to measure the shape change of cells and the movement of cell nuclei in real time, and by switching the laser light source for excitation depending on the type of the fluorescent staining reagent, the target cell You can measure the shape change and movement by selecting.
Although two laser light sources for excitation are used in this embodiment, the number of laser light sources for excitation may be three or more. Further, the shutter control signal output from the shutter control device may be switched at high speed to acquire the fluorescent image.
本発明は、バイオイメージング分野の顕微鏡に有用である。 The present invention is useful for microscopes in the field of bioimaging.
１，３０ ディジタルホログラフィック顕微鏡
２ ２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）
３ イメージセンサ
４ 試料ステージ
５ Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源
６，４１，４２ 励起用レーザ光源
１０，１１，１９，３２，３４，３５，３６ レンズ
１２，１８，４６ ビームスプリッター
１３，１４，３１，４５ 反射鏡
１５ 対物レンズ
１６，３３ ダイクロイックミラー
１７ チューブレンズ
２０，２１ １／２波長板
４３，４４ シャッター
４７ ＮＤフィルタ
５０ シャッター制御装置
５１，５２ シャッター制御信号
1,30 Digital holographic microscope 2 Bifocal Fresnel lens (SPFL)
3 Image Sensor 4 Sample Stage 5 He-Ne Laser Light Source 6,41,42 Excitation Laser Light Source 10, 11, 19, 32, 34, 35, 36 Lens 12, 18, 46 Beam Splitter 13, 14, 31, 45 Reflection Mirror 15 Objective lens 16,33 Dichroic mirror 17 Tube lens 20,21 1/2 wavelength plate 43,44 Shutter 47 ND filter 50 Shutter control device 51,52 Shutter control signal
Claims (11)
第２のレーザ光を用いて前記観察対象試料の蛍光励起光による蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系と、
撮像手段と、
偏光依存性を有する２つの焦点距離を持つ２重焦点レンズと、
を備え、
前記物体光と蛍光信号光とが同軸に重畳するように各々の光学系が配置され、重畳した光軸上に前記２重焦点レンズが配置され、
前記撮像手段が前記位相３次元像と前記蛍光３次元像をホログラムとして同時に取得し、前記位相３次元像と前記蛍光３次元像を分離してそれぞれの干渉強度分布から前記物体光と前記蛍光信号光を再構成することを特徴とするディジタルホログラフィック顕微鏡。 A first holographic optical system that obtains a phase three-dimensional image by interference light obtained by superimposing object light that passes through a sample to be observed and reference light that does not pass using the first laser light;
A second holographic optical system for obtaining a fluorescence three-dimensional image of the sample to be observed by fluorescence excitation light using a second laser beam;
Imaging means,
A bifocal lens having two focal lengths having polarization dependence,
Equipped with
The respective optical systems are arranged so that the object light and the fluorescence signal light are coaxially superimposed, and the double focus lens is arranged on the superimposed optical axis.
The imaging unit simultaneously acquires the phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image as holograms, separates the phase three-dimensional image and the fluorescence three-dimensional image, and determines the object light and the fluorescence signal from the respective interference intensity distributions. A digital holographic microscope characterized by reconstructing light.
蛍光３次元像により細胞核の時空間情報と、位相３次元像により細胞核および細胞壁の時空間構造とを同時に取得する細胞観察方法。Using the digital holographic microscope according to any one of claims 1 to 8,
A cell observation method for simultaneously acquiring spatiotemporal information of a cell nucleus by a fluorescence three-dimensional image and a spatiotemporal structure of a cell nucleus and a cell wall by a phase three-dimensional image.
一の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、他の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、同時に取得した位相３次元像とから、細胞の挙動を観察する細胞観察方法。
Using the digital holographic microscope according to claim 7,
Observing cell behavior from a fluorescence three-dimensional image acquired using one excitation laser light source, a fluorescence three-dimensional image acquired using another excitation laser light source, and a phase three-dimensional image acquired simultaneously Cell observation method.
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