JPWO2016084935A1 - Iii型コラーゲン産生促進剤 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]下記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩を含有することを特徴とするIII型コラーゲン産生促進剤。
(1)X1−X2−Val−Tyr−X5−X6(式中X1、X2、X5およびX6は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。)
(2)X2−Val−Tyr−X5−X6−X7(式中X2、X5、X6およびX7は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。)
(3)Ser−X2−X3−(Tyr/Phe/Trp)−X5−X6(式中X2、X3、X5およびX6は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。)
(4)X2−X3−(Tyr/Phe/Trp)−X5−X6−Arg(式中X2、X3、X5およびX6は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。)
[2]前記ペプチドが、前記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列をN末端およびC末端の少なくとも一方に有することを特徴とする前記[1]に記載のIII型コラーゲン産生促進剤。
[3]前記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列が、配列番号1〜6のいずれかで示されるアミノ酸配列である前記[1]または[2]に記載のIII型コラーゲン産生促進剤。
[4]前記ペプチドが、配列番号1、2もしくは7で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号1、2もしくは7で示されるアミノ酸配列を含むペプチドである前記[1]〜[3]のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤。
[5]前記ペプチドが、ヒトオステオポンチンのフラグメントである前記[1]〜[4]のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤。
[6]前記ペプチドが、配列番号11で示されるアミノ酸配列またはその一部からなるペプチドである前記[5]に記載のIII型コラーゲン産生促進剤。
[7]前記[1]〜[6]のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤を含有する化粧品。
[8]前記[1]〜[6]のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤を含有する医薬部外品。
[9]前記[1]〜[6]のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤を含有する創傷治癒促進用、皮膚萎縮改善用またはIII型コラーゲン合成不全改善用医薬。
[10]前記[1]〜[6]のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤を含有する生体吸収性ゲル。
(1)X1−X2−Val−Tyr−X5−X6(式中X1、X2、X5およびX6は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。)
(2)X2−Val−Tyr−X5−X6−X7(式中X2、X5、X6およびX7は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。)
(3)Ser−X2−X3−(Tyr/Phe/Trp)−X5−X6(式中X2、X3、X5およびX6は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。)
(4)X2−X3−(Tyr/Phe/Trp)−X5−X6−Arg(式中X2、X3、X5およびX6は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。)
Ser−Val−Val−Tyr−Gly−Leu(配列番号1)
Val−Val−Tyr−Gly−Leu−Arg(配列番号2)
Ser−Val−Val−Phe−Gly−Leu(配列番号3)
Val−Val−Phe−Gly−Leu−Arg(配列番号4)
Ser−Val−Val−Trp−Gly−Leu(配列番号5)
Val−Val−Trp−Gly−Leu−Arg(配列番号6)
Ser−Val−Val−Tyr−Gly−Leu−Arg(配列番号7)
Ser−Val−Val−Phe−Gly−Leu−Arg(配列番号8)
Ser−Val−Val−Trp−Gly−Leu−Arg(配列番号9)
なかでも、配列番号1、2または7で示されるアミノ酸配列を含み、かつ総アミノ酸残基数が20以下のペプチドがより好ましく、配列番号1、2または7で示されるアミノ酸配列からなるペプチドがさらに好ましい。
創傷とは、外的、内的要因によって生じる物理的な損傷を意味する。具体的には、例えば、切創、裂創、刺創、咬創、擦過傷、銃創、挫傷、熱傷、褥瘡、糖尿病性潰瘍、化学損傷等が挙げられるが、これらに限定されない。創傷治癒とは、損傷した組織または細胞が、再生および/または修復するこという。本発明の医薬を創傷部位に適用することにより、創傷部位においてIII型コラーゲン産生が促進され、創傷治癒を促進することができる。
皮膚萎縮とは、真皮厚が薄くなる、単位面積当たりの皮膚質量が低下して皮膚がやせる、皮膚の弾力性が失われる等の症状を意味する。本発明の医薬を皮膚萎縮部位に適用することにより、皮膚萎縮部位においてIII型コラーゲン産生が促進され、真皮におけるIII型コラーゲンの割合を回復させることにより皮膚萎縮を改善することができる。
III型コラーゲンの合成不全を原因とする疾患としては、例えばエーラス・ダンロス症候群(Ehlers-Danlos Syndrome)の血管型(IV型)などが挙げられる。本発明の医薬によりIII型コラーゲン産生を促進すれば、III型コラーゲンの合成不全を原因とする疾患の症状を改善することができる。
本発明のIII型コラーゲン産生促進剤を外皮に適用する化粧品、医薬部外品、医薬品として人に適用する場合、その使用方法は使用対象の皮膚の状態、年齢、性別などによって異なるが、例えば、1日数回(例えば1〜5回、好ましくは1〜3回)、1回当たり適量(例えば、約0.05〜5g)を皮膚に適用(塗布、噴霧、貼付など)すればよい。また、III型コラーゲン産生促進剤の有効成分となるペプチドまたはその塩の1日使用量が、例えば、約0.0005〜0.05g、好ましくは0.001〜0.02g、より好ましくは約0.002〜0.01gとなるように適用すればよい。また、塗布期間は、例えば、約2週間〜6ヶ月、好ましくは約1〜6ヶ月間とすればよい。
(a1)哺乳動物に対して、上記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩を投与することを特徴とするIII型コラーゲンの産生促進方法。
(a2)哺乳動物に対して、上記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩を投与することを特徴とする皮膚のしわまたはたるみの予防または改善方法。
(a3)哺乳動物に対して、上記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩を投与することを特徴とする創傷治癒促進方法。
(a4)哺乳動物に対して、上記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩を投与することを特徴とする皮膚萎縮改善方法。
(a5)哺乳動物に対して、上記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩を投与することを特徴とするIII型コラーゲン合成不全改善方法。
(b1)III型コラーゲン産生促進剤を製造するための、上記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩の使用。
(b2)皮膚のしわまたはたるみの予防または改善用化粧品または医薬部外品を製造するための、上記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩の使用。
(b3)創傷治癒促進用、皮膚萎縮改善用またはIII型コラーゲン合成不全改善用医薬を製造するための、上記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩の使用。
(c1)III型コラーゲンの産生促進に使用するための、上記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩。
(c2)皮膚のしわまたはたるみの予防または改善に使用するための、上記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩。
(c3)創傷治癒促進、皮膚萎縮改善またはIII型コラーゲン合成不全改善に使用するための、上記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩。
(1)使用ペプチド
被験ペプチドとして、配列番号7で示されるアミノ酸配列からなるペプチド(以下「SV」)、全長オステオポンチン(配列番号10、Accession: BAH58215、以下「OPN」)、トロンビンで切断されたオステオポンチンのN末端側フラグメント(配列番号11、以下「N−OPN」)、トロンビンで切断されたオステオポンチンのC末端側フラグメント(配列番号12、以下「C−OPN」)、N−OPNからSVを欠失させたフラグメント(配列番号13、以下「ΔSV−OPN」)、コントロールペプチド(配列番号14、SVペプチドと同一アミノ酸構成で配列が異なるペプチド、以下「CONT」)を用いた。
N−OPN、C−OPNおよびΔSV−OPNは、リコンビナントペプチドを作製して使用した。具体的には、OPNをコードするcDNAの塩基配列(配列番号15、Accession: AB469789)に基づいて、N−OPN、C−OPNおよびΔSV−OPNをそれぞれコードするcDNAを取得し、GST融合タンパク質発現用ベクターpGEX4T−2(GEヘルスケア)に組み込んだ。得られた発現用ベクターをBL21大腸菌にトランスフォームし、LB培地を用いてOD値が0.6−0.7になるまで大腸菌を培養し、IPTGを0.5mMになるように添加し、37℃で3時間発現誘導を行った。培養液の10分の1量のlysis buffer(50 mM Tris pH 8.0, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40)を加え、氷上で超音波破砕した。破砕液を遠心分離して上清を回収した。上清にグルタチオンセファロースビーズを加え、4℃で4時間ローテートを行い反応させた。グルタチオンセファロースビーズに結合したリコンビナントペプチドをelution buffer (1.2mM NaCl with Tris-HCL pH8.0)で溶出することにより精製した。精製した各リコンビナントペプチドについて、SDS−PAGEにより純度および濃度を確認した。
線維芽細胞は、ヒト心臓線維芽細胞(Human normal cardiac fibroblasts: NHCF-V)をLONZA社から購入して使用した。培地には、LONZAが推奨するFGM−3 BulletKitを用いた。
無処理群、OPN群、OPN+トロンビン群、N−OPN群、ΔSV−OPN群、C−OPN群、SV群およびCONT群の8群を設けた(各群n=4)。OPN群、N−OPN群、ΔSV−OPN群およびC−OPN群には、OPN、N−OPN、ΔSV−OPNおよびC−OPNをそれぞれ1μg/mLになるように培地に添加した。SV群およびCONT群には、SVおよびCONTをそれぞれ10ng/mLになるように培地に添加した。OPN+トロンビン群には、1μg/mLのOPNと0.12ユニットのトロンビン(BPS Bioscience)を添加した。120時間培養を続け、培養上清を回収した。I型コラーゲンまたはIII型コラーゲンの産生量をELAISAにより測定した。I型コラーゲンの測定には、ELISA Kit for Collagen Type I (COL1) Homo sapiens (Human)(Uscn Life Science Inc.、製品コード:SEA571Hu)を使用し、III型コラーゲンの測定には、ELISA Kit for Collagen Type III (COL3) Homo sapiens (Human)(Uscn Life Science Inc.、製品コード:SEA176Hu)を使用した。
実施例1のヒト心臓線維芽細胞に代えてラット皮膚線維芽細胞(Rat dermal fibroblasts: RDF)をCell Applications社から購入して使用した。培地には、Cell Applicationsが推奨するRat Fibroblast Growth Mediumを用いた。ペプチドには、実施例1で用いたSVおよびN−OPNを用いた。無処理群、SV群およびN−OPN群の3群を設け(各群n=3)、実施例1と同じ方法でIII型コラーゲンの産生量を測定した。
実施例2と同じラット皮膚線維芽細胞を使用し、ペプチドには実施例1で用いたSVおよびCONTを用いた。
無処理群、CONT群、SV10群およびSV100群の4群を設けた(各群n=4)。皮膚線維芽細胞を35mm培養ディッシュに播種し、コンフルエントになるまで培養した。200μl用ピペットチップを用いて、約2mm幅に細胞を剥離し、その後培地にペプチドを添加した。CONT群およびSV10群は終濃度が10ng/mLになるように、SV100群は終濃度が100ng/mLになるように、ペプチドを添加した。倒立型光学顕微鏡を用いて、細胞運動能によって修復される様子を経時的に観察し、細胞運動による溝の修復率を比較した。修復率(%)は以下の式で計算した。
修復率(%)=(観察時の剥離部分の面積/0時間の剥離部分の面積)×100
実施例1のヒト心室性心臓線維芽細胞に代えてヒト表皮角化細胞(Human Epidermal Keratinocytes、以下「HEK」と略記する。)をThermo Fisher Scientific社から購入して使用した。培地には、Gibco社の推奨するMedium154 for Keratinocytes培地を用いた。ペプチドには、実施例1で用いたSVおよびCONTを用いた。また、陽性対照として市販のTGFβを用いた。無処理群、SV群、CONT群およびTGFβ群の4群を設け(各群n=6)、実施例1と同じ方法でIII型コラーゲンの産生量を測定した。TGFβの添加量は、他のペプチドと同じ10ng/mLとした。
実施例4と同じヒト表皮角化細胞を使用し、ペプチドには実施例1で用いたSVおよびCONTを用いた。また、陽性対照として、実施例4と同じTGFβを用いた。
無処理群、CONT群、SV群およびTGFβ群の4群を設けた(各群n=6)。ヒト表皮角化細胞を35mm培養ディッシュに播種し、コンフルエントになるまで培養した。200μl用ピペットチップを用いて、約2mm幅に細胞を剥離し、その後培地にペプチドまたはTGFβを終濃度が10ng/mLになるように添加した。倒立型光学顕微鏡を用いて、細胞運動能によって修復される様子を経時的に観察し、細胞運動による溝の修復率を比較した(実施例3参照)。
Claims (10)
- 下記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列を含み、総アミノ酸残基数が200以下のペプチドまたはその塩を含有することを特徴とするIII型コラーゲン産生促進剤。
(1)X1−X2−Val−Tyr−X5−X6(式中X1、X2、X5およびX6は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。)
(2)X2−Val−Tyr−X5−X6−X7(式中X2、X5、X6およびX7は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。)
(3)Ser−X2−X3−(Tyr/Phe/Trp)−X5−X6(式中X2、X3、X5およびX6は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。)
(4)X2−X3−(Tyr/Phe/Trp)−X5−X6−Arg(式中X2、X3、X5およびX6は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。) - 前記ペプチドが、前記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列をN末端およびC末端の少なくとも一方に有することを特徴とする請求項1に記載のIII型コラーゲン産生促進剤。
- 前記式(1)、(2)、(3)または(4)で示されるアミノ酸配列が、配列番号1〜6のいずれかで示されるアミノ酸配列である請求項1または2に記載のIII型コラーゲン産生促進剤。
- 前記ペプチドが、配列番号1、2もしくは7で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号1、2もしくは7で示されるアミノ酸配列を含むペプチドである請求項1〜3のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤。
- 前記ペプチドが、ヒトオステオポンチンのフラグメントである請求項1〜4のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤。
- 前記ペプチドが、配列番号11で示されるアミノ酸配列またはその一部からなるペプチドである請求項5に記載のIII型コラーゲン産生促進剤。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤を含有する化粧品。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤を含有する医薬部外品。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤を含有する創傷治癒促進用、皮膚萎縮改善用またはIII型コラーゲン合成不全改善用医薬。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のIII型コラーゲン産生促進剤を含有する生体吸収性ゲル。
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