PL245202B1

PL245202B1 - Lipopeptydowe koniugaty i ich sole, sposób wytwarzania lipopeptydowych koniugatów i ich soli, kompozycja farmaceutyczna zawierająca lipopeptydowy koniugat i jego sole do leczenia ran przewlekłych

Info

Publication number: PL245202B1
Application number: PL433169A
Authority: PL
Inventors: Monika Lahutta; Michał PIKUŁA; Michał Pikuła; Krystyna Dzierzbicka; Adriana Schumacher; Piotr Sass; Paweł SOSNOWSKI; Paweł Sosnowski; Paweł SACHADYN; Paweł Sachadyn; Anna Wardowska; Ewa NOWICKA; Ewa Nowicka; Jakub Baczyński-Keller
Original assignee: Gdanski Univ Medyczny; Politechnika Gdanska
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2024-06-03
Also published as: PL433169A1; EP3925626A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowy lipopeptydowy koniugat, bogaty w reszty hydroksyproliny o sumarycznym wzorze ogólnym (I) Nα-acyl-(AK5-AK4-AK3-AK2-AK1)n-NH2. Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania lipopeptydowych koniugatów w szczególności bogatych w reszty L-hydroksyproliny opisanych wzorem ogólnym Nα-acyl-(AK5-AK4-AK3-AK2-AK1)n-NH2(I) lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, w którym: AK1, AK2, AK3, AK4, AK5 oznaczają reszty aminokwasowe lub ich brak; AK1 oznacza resztę lizyny o konfiguracji L lub D; AK2 jest resztą aminokwasową wybraną z grupy obejmującej aminokwasy niepolarne, obojętne: Phe, Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Val, Trp lub jej brak; AK3 jest resztą aminokwasową wybraną spośród Hyp, Phe, Ala, Gly, Ile Leu, Met, Pro, Val, Trp; AK4 jest resztą aminokwasową wybraną spośród Pro, Hyp lub jej brak; AK5 oznacza resztę glicyny; Nα-acyl oznacza wybrane z grupy R1-C(=0), w którym R1 oznacza nasycony łańcuch węglowy o długości od C7 do C17, n oznacza liczbę łańcucha peptydowego od 1 do 2 o wzorze ogólnym: AK5-AK4-AK3-AK2-AK1. Dodatkowo wynalazek dotyczy użycia kompozycji farmaceutycznej, zawierającej co najmniej jeden lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub preparatu do stymulacji proliferacji oraz migracji fibroblastów i keratynocytów, zawierającego kompozycję farmaceutyczną jako podstawowy komponent do wytwarzania opatrunku w postaci roztworów wodnych, zawiesiny, emulsji w areozolu, kremu, maści, trójwymiarowego płata, hydrożelu w tubce, mających zastosowanie w leczeniu ubytków tkankowych, obejmujących pełną grubość skóry (jej głębsze warstwy), tj. ran oparzeniowych (II i III stopnia), ran podtrzymywanych przez zaburzenia w odpływie żylnym, owrzodzenia i odleżyny (rany ziarninujące III-IV stopnia) czy zaburzenia o podłożu metabolicznym, jak stopa cukrzycowa, będące powikłaniem istniejących chorób układu krążenia czy cukrzycy.

Description

Przedmiot wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania lipopeptydowych koniugatów w szczególności bogatych w reszty L-hydroksyproliny opisanych wzorem ogólnym: N“-acyl-(AKs-AK4-AK3-AK2-AKi)-NH2 (I) lub N“-acyl-AK5-AK4-AK3-AK2-AK1)-(AK₅’-AK4’-AK3’-AK2’-AK1’)-NH2 (II) ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, w którym: AK1, AK2, AK3, AK4, AK5, AK1’, AK2’, AK3’, AK4’, AK5’ oznaczają reszty aminokwasowe lub ich brak; AK1 oznacza resztę lizyny o konfiguracji L lub D; AK2 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy obejmującej aminokwasy niepolarne, obojętne takie jak Phe, Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Val, Trp; AK3 oznacza resztę aminokwasową wybraną spośród Hyp, Ala, Gly, Leu, Met lub Pro; AK4 oznacza resztę aminokwasową wybraną spośród Pro lub Hyp; AK5 oznacza resztę glicyny; AK1’ oznacza resztę Lys o konfiguracji L lub D; AK2’ oznacza resztę Gly; AK3’ oznacza resztę aminokwasową wybraną spośród Hyp lub Gly; AK4’ oznacza resztę aminokwasową wybraną spośród Pro lub Hyp; AK5’ oznacza resztę Gly; N“-acyl oznacza wybrane z grupy R1-C(=0), w którym R1 oznacza nasycony łańcuch węglowy o długości od C7 do C13. Dodatkowo wynalazek dotyczy użycia kompozycji farmaceutycznej, zawierającej co najmniej jeden lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub preparatu do stymulacji proliferacji oraz migracji fibroblastów i keratynocytów, zawierającego kompozycję farmaceutyczną jako podstawowy komponent do wytwarzania opatrunku w postaci roztworów wodnych, zawiesiny, emulsji w areozolu, kremu, maści, trójwymiarowego płata, hydrożelu w tubce, mających zastosowanie w leczeniu ubytków tkankowych, obejmujących pełną grubość skóry (jej głębsze warstwy), tj. ran oparzeniowych (II i III stopnia), ran podtrzymywanych przez zaburzenia w odpływie żylnym, owrzodzenia i odleżyny (rany ziarninujące III-IV stopnia) czy zaburzenia o podłożu metabolicznym, jak stopa cukrzycowa, będące powikłaniem istniejących chorób układu krążenia czy cukrzycy.

Stan techniki

Synteza peptydowych połączeń zawierających resztę Hyp

Synteza peptydowych połączeń bogatych w reszty hydroksyproliny i ich pochodnych stanowi obecnie ważny kierunek prac nad stabilnością struktury potrójnej, ściśle upakowanej α-helisy kolagenu. Łańcuch kolagenu będący składnikiem ECM (matrycy zewnątrzkomórkowej) tworzą regularnie powtarzające się triady aminokwasów (Gly-X-Y) zawierające X resztę proliny i Y resztę hydroksyproliny (Hyp) czy hydroksylizyny (Hyl) - produkty posttranslacyjnej modyfikacji (hydroksylacji), wpływające na jego zwiększoną stabilność. W świetle wynalazku stał się on kluczowy w projektowaniu i opracowaniu efektywnej i szybkiej metody do otrzymywania nowych lipopeptydowych koniugatów z wysoką wydajnością i wysokim stopniem czystości. Otrzymywanie połączeń bogatych w reszty Hyp i pochodnych odbywa się zarówno w warunkach syntezy w roztworze homogenicznym, jak i na fazie stałej. W obu przypadkach dla produktu końcowego znaczenie mają reakcje sprzęgania z pochodną hydroksyaminokwasu tj. zastosowane odczynniki sprzęgające i osłony grup funkcyjnych czy warunki prowadzonych reakcji.

Ochrona grupy funkcyjnej w łańcuchu bocznym hydroksyaminokwasu w syntezie peptydów ogranicza powstawanie niepożądanych produktów, będących wynikiem O-acylowania podczas tworzenia wiązania peptydowego w syntezie liniowych połączeń. Acylowanie alkoholi jest stosunkowo łatwą reakcją z udziałem pochodnych z wolną grupą karboksylową i zachodzi z dużą ilością dostępnych kwasów karboksylowych. Łatwość acylowania uzależniona jest w dużej mierze od rzędowości alkoholu. Pierwszorzędowa grupa hydroksylowa reszty seryny czy grupa fenolowa reszty tyrozyny dość łatwo ulega acylowaniu, w szczególności w obecności reagentów wyciągających proton, standardowo stosowanych w syntezie dodatków antyracemiazcyjnych, przykładowo HOBt oraz reagentów sprzęgających, w szczególności karbodiimidowych pochodnych. Z kolei drugorzędowa grupa hydroksylowa, przykładowo reszta treoniny może być niereaktywna podczas reakcji sprzęgania, i tak w niektórych przypadkach nie została chroniona podczas syntezy prowadzonej w roztworze. W syntezie na fazie stałej, w zależności od natury grupy ochronnej stosowanej do osłony α-aminowej grupy, praktyką jest stosowanie ochrony w łańcuchu bocznym hydroksyaminokwasu, gdzie aktywowany karboksylowy komponent stosowany jest w nadmiarze.

Estry Pfp czy Dhbt reszty aminokwasu w obecności HOBt są korzystne do otrzymania na żywicy produktu bogatego w reszty hydroksyaminokwasu. Estry aktywne są w szczególności rekomendowane, stanowiąc alternatywę dla innych odczynników sprzęgających tj. zastępując pochodne karbodiimidowe. Użycie ich w syntezie peptydów bogatych w reszty hydroksyaminokwasu na żywicy nie prowadzi do tworzenia produktów, będących wynikiem podstawienia grupy hydroksylowej. Ta metoda tworzenia wiązania peptydowego stała się użyteczna w wielu laboratoriach z uwagi na wygodę prowadzenia jej w zautomatyzowanym procesie syntezy. Jakkolwiek reakcje kondensacji z użyciem Pfp estrów reszty treoniny przebiegały wolniej niż innych reszt aminokwasów, wymagały powtórzeń i prowadziły do zanieczyszczenia produktu końcowego fragmentami z dodatkowo przyłączoną resztą treoniny.

Istotne znaczenie w efektywnym utworzeniu wiązania peptydowego ma odpowiednio zastosowany odczynnik sprzęgający, tak i istotny jest jego dobór i warunki syntezy w eliminowaniu produktów ubocznych. Zastosowanie najbardziej popularnych in situ reagentów sprzęgających w postaci pochodnych karbodiimidowych może prowadzić do utworzenia produktów O-acylowania reszty hydroksyaminokwasu w trakcie syntezy. Utworzenie bezwodników czy estrów benzotriazolu podczas aktywacji z użyciem BOP może w odpowiednich warunkach wyeliminować niekorzystne reakcje uboczne w syntezie z użyciem niechronionej w łańcuchu bocznym reszty treoniny.

Prace syntetyczne z udziałem pochodnych Hyp stosowanych do otrzymania peptydów są ograniczone. Pojawiają się jednakże w literaturze coraz częściej rozważania i selekcje grupy ochronnej w łańcuchu bocznym, podobnie jak w przypadku reszty seryny i reszty treoniny. Synteza liniowych peptydów, zawierających resztę Hyp sięga 1944 r., kiedy otrzymywano pierwsze sekwencje tj. Gly-4-Hyp-L-Pro-Gly, 4-Hyp-L-Pro-Gly czy pochodne z udziałem 4-Hyp, di- i tripeptydy. W tym czasie opisano wydajną syntezę analogów angiotensyny II (Ile5-Hyp7-Angiotensyna II). Jakkolwiek reakcje kondensacji prowadzono z wykorzystaniem metody azydkowej, obecnie już rzadko stosowanej, napotykano na trudności w tworzeniu wiązania peptydowego czy izolacji produktu. W syntezie oktapeptydu, pochodną Cbc(Cbz)-Hyp-Phe-ONBzl uzyskano z wydajnością rzędu 77%, przeprowadzając N-chronioną resztę Hyp do postaci mieszanego bezwodnika z udziałem chloromrówczanu etylu w obecności tri-n-butyloaminy z acylowaniem aminokomponentu. Sól HBr dipeptydu poddawano w dalszym etapie reakcji z odczynnikiem acylujacym (odpowiednim azydkiem), otrzymując produkt, który po przeprowadzeniu w sól poddawano dalszej reakcji kondensacji. Jednakże acylowanie prowadzono z użyciem azydku dipeptydu (Cbz-Ile-His-N3), uzyskując wymagany produkt z wyższą wydajnością. Uzyskiwana sól HBr estru metylowego czy p-nitrobenzylowego tripeptydu His-Hyp-Phe była trudna do izolacji z uwagi na znaczne zanieczyszczenie produktu.

Reakcje kondensacji z udziałem reszty Hyp jako aminokomponentu w syntezie liniowych peptydów prowadzono w szczególności z użyciem obecnie rzadko stosowanych odczynników acylujących tj. chlorku acylu czy azydku, ale i z użyciem estrów aktywnych, przykładowo estru N-hydroksysukcynoimidu. Pochodną Cbz-Gly-Hyp-OH otrzymywano z użyciem chronionego estru N-hydroksysukcynoimidu (Cbz-Gly-OSu) z wydajnością rzędu 50:60%. Metody te tworzenia wiązania peptydowego z użyciem mieszanych bezwodników nie przedstawiały istotnych różnic. Jakkolwiek reakcje kondensacji z użyciem estrów aktywnych N-chronionej Hyp(Cbz-Gly-Hyp-OSu) z różnymi pochodnymi aminokwasów przykładowo: Hyp-OH, Hyp-OMe*HCl, Leu-OH nie były efektywne. W większości nie uzyskiwano pożądanych produktów kondensacji czy uzyskiwane wydajności były niezadowalające. Produkty kondensacji aminokwasu i N-chronionego karboksylowego komponentu Hyp (przykładowo: Cbz-Gly-Hyp-Hyp-OBzl) otrzymano z użyciem metody mieszanych bezwodników lub metody karbodiimidowej. Podejmowane dalsze próby otrzymania różnych kombinacji z udziałem reszt Hyp były wynikiem rosnącego zainteresowania peptydowymi strukturami. Cbz-Pro-4-Hyp-OH otrzymywano efektywnie, stosując ester aktywny tj. Cbz-Pro-OSu czy z użyciem chlorku kwasowego Cbz-Pro-Cl lub poprzez saponifikację Cbz-Pro-4-Hyp-OMe. Jakkolwiek analogicznie, nie otrzymano Cbz-Pro-Hyp-Gly z użyciem estru aktywnego Cbz-Pro-OSu, pomimo modyfikacji warunków reakcji tj. temperatury czy stężenia stosowanych substratów. Właściwego produktu nie uzyskano również wykorzystując metodę karbodiimidową i stosując pochodne Cbz-Pro-4-Hyp-OH i HBr*Gly-ONp. W rezultacie produkt przygotowano z użyciem Cbz-4-Hyp-Gly, który sprzęgano z solą estru p-nitrofenylu proliny (HBr*Pro-ONp) z zastosowaniem pochodnej karbodiimidowej w ACN lub w reakcji kondensacji Cbz-Pro-4-Hyp i HCl*Gly-OEt i właściwą saponifikację.

Wraz z postępem metod syntetycznych i analitycznych wskazywano na konieczność rozwoju odpowiednich osłon grupy funkcyjnej Hyp. Badano możliwe grupy do ochrony grupy hydroksylowej aminokwasu, z których osłonę benzylową (Bzl) wytypowano jako najbardziej odpowiednią. Pochodną Boc-Hyp(Bzl)-OH stosowano do otrzymania oligopeptydów, tj. Pro-Hyp-Gly, Hyp-Pro-Gly. Reakcję kondensacji pochodnych aminokwasowych: Boc-Hyp(Bzl)-OH z HCl*Pro-OBzl przeprowadzono z użyciem DCU w obecności TEA. Po usunięciu estru benzylowego, pochodną dipeptydu - Boc-Hyp(Bzl)-Pro-OH sprzęgano z Gly-OEt do otrzymania estru etylowego chronionego tripeptydu, dając po właściwej hydrolizie produkt w postaci soli cykloheksyloaminy z wydajnością rzędu 75%.

Do otrzymania peptydów na fazie stałej (SPPS) zgodnym ze strategią Fmoc, stosowano różnorodne pochodne Hyp, których grupy ochronne stosowane w łańcuchu bocznym do osłony grupy hydroksylowej, mogą być ortogonalnie usuwane po syntezie, czy selektywnie modyfikowane do utworzenia podstawionych pochodnych proliny.

Komercyjnie dostępna jest pochodna bez osłony tj. Fmoc-4R-Hyp-OH i posiadająca w łańcuchu bocznym osłonę t-butylową (Fmoc-4R-Hyp(OtBu)-OH). Tert-butyl jest powszechnie stosowaną osłoną w syntezie, nie łatwo jednak usuwaną selektywnie w SPPS. Jest stabilna w większości łagodnych warunków zasadowych, natomiast preferowanym reagentem do deprotekcji jest często kwas trifluorooctowy (95%). Jakkolwiek w literaturze opisywano zastosowanie 9-fluorenylometoksykarbonylowej pochodnej hydroksyproliny (Fmoc-Hyp-OH) z wolną grupą hydroksylową do otrzymania peptydu osadzonego na żywicy Rink Amide. Wprowadzenie osłony tritylowej w łańcuchu bocznym hydroksyproliny odbywało się bezpośrednio na żywicy po jej osadzeniu, działając chlorkiem tritylu (opcjonalnie imidazolu) w obecności DIPEA w DMF.

Chroniony dipeptyd Fmoc-Hyp(OTrt)Asn(Trt)-NH2 następnie zastosowano do otrzymania pożądanej sekwencji Thr(OtBu)Tyr(Otbu)Hyp(OTrt)Asn(Trt)-NH2 z użyciem pochodnej HBTU w obecności DIPEA w DMF. Grupa tritylowa jest selektywnie usuwana po otrzymaniu łańcucha peptydowego z zastosowaniem DCM-TES-TFA (93 : 5 : 2, v/v/v), podczas gdy odszczepienie peptydu od żywicy następuje standardowo z użyciem stężonego roztworu TFA.

Wprowadzając kilka reszt hydroksyaminokwasu do łańcucha peptydowego, stosowano alternatywną i ortogonalną ochronę dla reszty Hyp, traktując grupę hydroksylową TBSCI i otrzymując eter silylu. Osłona ulegała deprotekcji z udziałem TBAF bezpośrednio po osadzeniu łańcucha peptydowego na żywicy RinkAmide. Do osłony grupy hydroksylowej Hyp stosowano również węglan Alloc. Osłonę wprowadzano z użyciem chloromrówczanu allilu, w obecności DMAP i trietyloaminy, w toluenie. Metoda nie była częścią automatyzowanej syntezy, wymagała podwyższonej temperatury (50°C) i dostosowania warunków przy jej usuwaniu. Pozostawała ona jednak stabilna w warunkach deprotekcji i odszczepienia z udziałem mieszaniny TFA.

Modyfikacja grupy hydroksylowej prowadząca do O-acylowania/alkilowania w łańcuchu bocznym reszty Hyp odbywa się w dużej mierze bezpośrednio po jej przyłączeniu. Sekwencje, zawierające resztę Hyp z łatwością ulegały acylowaniu w SPPS, używając pochodnej karbodiimidowej - DIPCI w obecności katalizatora - DMAP, dając główne produkty O-acylowania z dobrą wydajnością po deprotekcji z użyciem standardowej mieszaniny TFA. Acylowanie łańcucha bocznego reszty Hyp uzyskano z udziałem biotyny, celem zwiększenia zdolności poznawczych, ale i następowało z udziałem aminokwasów polarnych czy peptydów.

Istotnym elementem syntezy peptydów, w tym powtarzających się jednostek peptydowych, jest polikondensacja. Pierwszą syntezę na fazie stałej prowadzącą do otrzymania produktów polikondensacji (Gly-X-Y)n zakończoną sukcesem opisali Sakakibara i wsp. Polikondensacja różnych sekwencji peptydowych, zawierających reszty Pro, Hyp w większości odbywa się z udziałem strategii Boc na żywicach Merffielda, MBHA (chlorowodorek benzyhydryloaminy związany z polimerem), otrzymując goto wy produkt po usunięciu z żywicy z użyciem HF.

Jakkolwiek zastosowano chemię Fmoc do otrzymania sekwencji polipeptydowej, będącej rezultatem polikondensacji chronionych fragmentów na żywicy polistyrenowej. Polikondensacja chronionych fragmentów do otrzymania 28-aminokwasowego łańcucha polipeptydu osadzonego na żywicy Fmoc-Gly-2-chlorotritylowej przebiegała każdorazowo z użyciem 4-krotnego nadmiaru monomeru, który służył do otrzymania estru z HATU w obecności NMM. Gotowy produkt po uwolnieniu z żywicy z użyciem standardowej mieszaniny TFA był pozbawiony zanieczyszczeń, jednakże niska wydajność produktu po oczyszczaniu z użyciem RP-HPLC rzędu 15% (w skali syntezy: 50 μmola) skłania do prowadzenia intensywnych poszukiwań innych rozwiązań. Fragmenty o wymaganym stopniu czystości używane w reakcjach polikondensacji otrzymywane są metodami syntezy w układzie homogenicznym, wymagają jednak oczyszczania po każdorazowym etapie sprzęgania z użyciem standardowych technik stosowanych w chemii organicznej tj. krystalizacja, techniki chromatograficzne.

W literaturze zaproponowano metodę syntezy w roztworze do otrzymywania odpowiednio chronionych tripeptydów (powszechnie występujących w strukturze kolagenu) z wysoką wydajnością i o wysokiej czystości, przeznaczonych bezpośrednio do użycia w reakcji polikondensacji. Metoda syntezy polegała na reakcji sprzęgania reszt aminokwasu z użyciem chloromrówczanu izobutylu do utworzenia produktu przejściowego bezwodnika lub używając wspomnianych estrów pentafluorofenylowych (Pfp). Zastosowane reagenty prowadziły do otrzymania produktów łatwych do oddzielenia. Jednakże kolejno prowadzone etapy syntezy były czasochłonne, reakcje z udziałem pochodnych Cbz-Hyp(tBu)-Gly-OMe i Fmoc-Pro-OPf pokazały się mało efektywne (przebiegały z wydajnością rzędu 25%), a uzyskiwane produkty wymagały oczyszczania z użyciem krystalizacji.

Uzyskane niskie wydajności reakcji sprzęgania z pochodną Hyp wynikały z zastosowanej osłony tBu, obecności zawady sterycznej i właściwości elektronowych otrzymanego fragm entu Hyp(tBu)-Gly-OMe. Grupa tert-butylowa z wyboru stosowana jako osłona może stanowić przeszkodę w utworzeniu efektywnego wiązania peptydowego. Obecność grupy elektronowy ciągającej obniża nukleofilowość grupy α-aminowej reszty Hyp, a zatem przyłączanie reszt aminokwasowych do pochodnej Hyp(tBu) okazywało się każdorazowo najmniej wydajnym etapem syntezy, generującym powstawanie trudnych do usunięcia produktów ubocznych.

W tej metodzie, reakcja chronionego estru N-hydroksysukcynoimidu dipeptydu (Fmoc-Gly-Pro-OSu) z Hyp(tBu)-OH, prowadziła głównie do tworzenia cyklicznego produktu dipeptydu (diketopiperazyny) oraz tetrapeptydu Fmoc-Gly-Pro-Gly-Pro-OH, będącego wynikiem odszczepienia osłony Fmoc a następnie reakcji kondensacji. Niepożądane diketopiperazyny powstają, w szczególności, w przypadku występowania cis wiązania peptydowego tworzonego przez reszty aminokwasowe tj. Gly, Pro. Podejmowano próby użycia osłony Cbz, eliminując zawadę steryczną, jednakże ponownie prowadząc do formowania diketopiperazonów. Analiza widm masowych surowych produktów wskazywała głównie na powstawanie produktu pomniejszonego o masę, pochodzącego z uformowania diketopiperazyny i odszczepienia jednostki dipeptydu Gly-Pro z N-końca rosnącego łańcucha peptydowego. Opisywane reakcje uboczne powstawały w wielu analogicznych syntezach w trakcie deprotekcji osłony Fmoc i na etapie acylowania. Minimalizowano je w przypadku syntezy peptydowych sekwencji kolagenu z użyciem strategii Boc/Bzl (z utworzeniem odpowiednio chronionej pochodnej Boc-Gly-Pro-Hyp(Bzl)-OH), gdzie deprotekcja α-aminowej grupy następuje z użyciem TFA. Powielano tą strategię, do otrzymania jednostek Pro -Pro-Gly, Pro-Hyp-Gly, stanowiących substraty w syntezie polimerowych peptydów. Przygotowany odpowiednio chroniony tripeptyd Cbz-Pro-Hyp-Gly-OBzl w reakcji Cbz-Pro-Hyp-OH z H-Gly-OBzl z użyciem EDCI i HOBt, poddawano hydrogenolizie w obecności kwasu p-toluenosulfonowego i acylowano z użyciem Fmoc-Su. Produkt końcowy Fmoc-Pro-Hyp-Gly-OH otrzymywano z dobrą wydajnością, zapobiegając tworzeniu diketopiperazyny. Spodziewano się w tych warunkach utworzenia produktów O-acylowania, będących wynikiem silnie sprzęgających reagentów tj. HBTU i HOBt. By zapobiec tworzeniu produktów O-acylowania, wydłużanie łańcucha peptydowego prowadzono z zastosowaniem odpowiednio chronionej Fmoc-Hyp(tBu)-OH.

Leczenie trudno gojących, przewlekłych ran

Istnieje ogromna potrzeba projektowania i otrzymywania nowych związków, w tym struktur opartych o połączenia peptydowe w aspekcie rozwijających się chorób układu krążenia, czy chorób o podłożu metabolicznym tj. cukrzycy, przedstawiających się jako 7% i 5% wzrost wskaźnika zapadalności rocznie, a zatem związanych z nimi powikłań w postaci przedłużającego się lub nawracającego stanu zapalnego, rany zakażonej, destrukcji tkanek z obecnością neuropatii i niedokrwienia, trudno gojących, niegojących czy ze skłonnością do ponownego pojawiania (ran przewlekłych).

Powstające ubytki tkankowe, obejmujące pełną grubość skóry, do których zaliczamy również rany oparzeniowe (II-III stopnia) stanowią poważny, obarczony wysokim ryzykiem śmiertelności problem społeczny. Proces gojenia takich ran jest procesem szczególnie złożonym, wymaga współdziałania wielu elementów, aktywacji i koordynacji procesów o charakterze biochemicznym czy komórkowym. Istotne znaczenie mają czynniki wzrostu, inicjujące dalszy etap tworzenia nowej tkanki (przejście z fazy zapalnej do fazy proliferacyjnej).

W przypadku słabo lub niegojącego owrzodzenia, dodatkowo mają wpływ patofizjologiczne mechanizmy. Obecność prozapalnej cytokiny TNF-α, stymulującej komórki fibroblastów i keratynocytów, przyczyniającej się do ekspresji czynników wzrostu i regulacji odpowiedzi przeciwmikrobiologicznej w ranach trudno- i niegojących osiąga zbyt wysoki poziom. Jest to związane ze zwiększonym poziomem stresu oksydacyjnego promującego zapalenie i przyczynia się do naruszonego procesu proliferacji komórek fibroblastów w procesie odbudowy tkanek, będących źródłem protein matrycy zewnątrzkomórkowej tj. kolagenu, fibronektyny. Cytokina powoduje apoptozę zarówno fibroblastów, jak i keratynocytów, w szczególności w warunkach podwyższonego poziomu glukozy. Zwiększoną liczbę fibroblastów ulegających apoptozie w obliczu istniejących zmian spowodowanych cukrzycą obserwuje się zarówno na mysim modelu, jak i u ludzi. W ranach przewlekłych obserwuje się również obniżony poziom receptora TGF-β, prowadzący do zmniejszonego powstawania wyspecjalizowanych komórek - miofibroblastów, uczestniczących w procesie kontrakcji brzegów rany i produkcji matrycy zewnątrzkomórkowej.

Osłabione zdolności proliferacyjne i migracyjne komórek w miejscu trudno gojącej rany czy owrzodzenia dotyczą również zmian morfologicznych i obniżonej ekspresji markerów migracji.

Właściwe leczenie ran oparzeniowych II/III stopnia, ale i owrzodzeń żylnych, stopy cukrzycowej wymaga zaangażowania transplantologii rekonstrukcyjnej. Pomimo, iż postępy w leczeniu ran obejmują nowe, zaawansowane technologie, zarówno opatrywanie jak i terapia wciąż stanowi ogromne wyzwanie. Obecnie obok transplantologii, duże nadzieje w leczeniu ran oparzeniowych (II/III stopnia), owrzodzeń żylnych, stopy cukrzycowej pokłada się w medycynie regeneracyjnej i rozwoju inżynierii tkankowej. Metody inżynierii tkankowej proponują nowe podejście w leczeniu uzupełnień ubytków tkanek, terapii rozległych i trudno gojących ran. Terapia wykorzystuje rusztowania komórkowe do regulacji procesu proliferacji i różnicowania komórek, wykazując zdolność do produkcji składników natywnej macierzy łącznotkankowej. Obecnie zatwierdzone do stosowania w klinice, produkowane na skalę przemysłową są biotechnologiczne opatrunki czy substytuty skóry (ekwiwalenty tkanki). Głębokie oparzenia II/III stopnia (obejmujące dermis) z wyboru kwalifikowane są do leczenia z udziałem hodowanych nabłonków. Pierwszy produkt zatwierdzony przez FDA w 1996 r. w leczeniu oparzeń stanowi nieożywiona macierz pozakomórkowa złożona z kolagenu i siarczanu 6-chondroityny-Integra™. Z opisu patentowego WO99/63051 znana jest metoda wytwarzania żywej, dwuwarstwowej allogennej skóry o nazwie Apligraf(Graftskin)™ (Organogenesislnc, Novartis Pharmaceutical Corporation), opartej na matrycy kolagenu. W 1998 r. Apligraf (Graftskin)™ został zarejestrowany i zatwierdzony przez FDA do stosowana w leczeniu owrzodzenia żylnego i stopy cukrzycowej. Wysoki koszt, jak i inne wymagania stosowanych terapii wymagają udoskonaleń i skłaniają do poszukiwań stale nowych metod leczenia.

Coraz więcej uwagi poświęca się na rozwój miejscowych terapii z udziałem biologicznie aktywnych związków, które są zaangażowane w promowanie gojenia ran. Większość opisywanych obecnie środków terapeutycznych w leczeniu ran przewlekłych to czynniki wzrostu, cytokiny, chemokiny, kolagen i kwas hialuronowy. W leczeniu owrzodzeń neuropatycznych stopy cukrzycowej o mniejszej rozległości rozciągających się do tkanki podskórnej zatwierdzony został bekaplermin - ludzki czynnik wzrostu BB pochodzenia płytkowego, zachowujący aktywność endogennego PDGF, produkowany przez firmę Johnson&Johnson. W opisie patentowym EP0575484 wskazano wytwarzanie i skuteczność farmaceutycznej kompozycji, zawierającej PDGF. Z kolei w opisach patentowych US6800286, US5155214 i US5981606 ujawniono działanie molekularnych czynników wzrostu tj. FGF i TGF-β, które regulują różne funkcje biologiczne, m.in. proliferację komórek, ich przeżycie, migrację i różnicowanie. Te środki terapeutyczne pomimo szeregu zalet, odznaczają się wysokim kosztem otrzymywania, a ich stosowanie miejscowe powoduje pieczenie i rumień, a i krótki czas półtrwania, obniżoną stabilność. Ponadto obserwowano również efekty uboczne terapii, stosując wysokie stężenia czynników wzrostu, tj. nadmierny wzrost komórek, łuszczycę, upośledzone funkcje skóry i ryzyko występowania nowotworu.

Z drugiej strony opis patentowy US 2017/0007662 oraz WO 2014200651 wskazuje na krótkie sekwencje peptydowe wywodzące się z ludzkich chemokin C-X-C o wzorze X1-K-X2, gdzie X1 wybierane jest spośród reszt aminokwasowych tj. Glu, Gln lub Lys, X2 spośród reszt aminokwasowych tj. Met, Phe, Ile, Trp, Val, które jako wielofunkcyjne cząsteczki efektorowe są odpowiedzialne za stymulację migracji keratynocytów, neutralizację procesu prozapalnego związanego z działaniem bakteryjnych składników ściany komórkowej oraz indukcję angiogenezy w hodowanych komórkach śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej. Badano również ich zdolność do zmniejszenia stanu prozapalnego na modelu skóry z łuszczycą SOR-300-F, co mogłoby przyczynić się do leczenia różnych chorób skóry o podłożu zapalnym, tj. łuszczyca, atopowe zapalenie skóry i trądzik różowaty.

Inne ważne oczekiwanie, związane z zastosowaniem nowych substancji, stanowią metody dostarczenia ich do lokalnego miejsca działania, które w przeważającej większości wymagają użycia dużych ilości protein dla efektu biologicznego. Prowadzone w ostatnich latach próby stworzenia konstrukcji polimerowych uwzględniających ich długoterminowe uwalnianie, poprawiające stabilność zamykanych protein, wciąż stanowią wyzwanie na najbliższe lata. Długoterminowe uwalnianie czynników wzrostu nadal jest trudne do kontrolowania, wymaga utrzymywania bioaktywności protein podczas wydłużonego czasu podania. Chociaż bioaktywność protein, czynników wzrostu jest uzależniona od metody ich inkorporacji, nie została ona dokładnie zgłębiona. Zamykanie protein w systemach polimerowych polepsza ich stabilność, jednakże modyfikacja ich struktury może redukować ich funkcjonalność.

Poszukiwanie związku biologicznie aktywnego, charakteryzującego się niskim indeksem terapeutycznym, pozbawionego efektów ubocznych, wykazującego efekt zależny od stężenia, działającego selektywnie stanowi ważny cel efektywnej terapii.

Problem techniczny:

Standardowe procedury stosowane w syntezie peptydów, wciąż podlegają modyfikacjom i optymalizacji w celu uzyskania zamierzonych sekwencji, zwiększonej efektywności, wydajności i czystości uzyskiwanych produktów. W opisywanych dotychczas doniesieniach stosowane warunki syntezy, używane metody tworzenia wiązania peptydowego czy dobór pochodnych aminokwasowych stały się istotne w budowaniu sekwencji bogatych w reszty hydroksyaminokwasów. Syntezę na fazie stałej wprowadzono w 1963 r. za sprawą Bruce’a Merrfielda, chcąc dokonać postępu w otrzymywaniu dużych cząsteczek biologicznych i przezwyciężyć trudności związane z oczyszczaniem produktów pośrednich, występujących w przypadku syntezy w roztworze. Efektywna synteza na fazie stałej wymaga jednak zastosowania odpowiednich warunków i optymalizacji. Postęp w tym zakresie zapewnia dostęp do nowoczesnych odczynników sprzęgających, antyracemizacyjnych, i innych dodatków, które finalnie mają znaczący udział w zwiększaniu wydajności otrzymywanych peptydów i ich połączeń do aplikacji medycznych czy kosmetycznych.

Konwergentna strategia, pozwalająca na łączenie otrzymanych (zarówno w roztworze i na fazie stałej) chronionych fragmentów peptydowych stanowi również ważny punkt w opracowywaniu i otrzymywaniu sekwencji kolagenu. Polikondensacja fragmentów peptydowych zwiększa efektywność tj. wydajność i czystość wielu uzyskiwanych produktów. Jednakże wymaga optymalizacji i modyfikacji warunków syntezy celem otrzymania łańcuchów bogatych w reszty hydroksyaminokwasów.

Problemem w otrzymywaniu sekwencji (kolagenowych) bogatych w reszty hydroksyaminokwasu (Hyp) jest niska wydajność procesów prowadzących do przyłączania kolejno reszt aminokwasowych czy produktów polikondensacji oraz powstawanie trudnych do wydzielenia produktów ubocznych. Preferowane grupy ochronne stosowane do osłony grupy hydroksylowej reszty Hyp nie prowadziły do otrzymywania produktów z wysoką wydajnością. Pomimo tendencji do zabezpieczania grup funkcyjnych w łańcuchu bocznym cząsteczki otrzymywanej na fazie stałej w strategii Boc czy Fmoc, nieoczekiwanie rozwiązanie wg. wynalazku, w którym zastosowano komercyjnie dostępną pochodną hydroksyaminokwasu tj. Fmoc-Hyp-OH pozbawioną osłony w łańcuchu bocznym (grupy hydroksylowej) pozwoliło na zbudowanie określonych sekwencji z wysoką wydajnością i wysoką czystością z użyciem powszechnie stosowanych odczynników, zaadoptowanych do reakcji polikondensacji opisanej w wynalazku. Fmoc chroniona reszta L-hydroksyproliny okazała się odporna na O-acylowanie w zastosowanych wg. wynalazku warunkach zarówno podczas przyłączania reszt aminokwasowych jak i budowania produktów polikondensacji, nie zanieczyszczając przy tym produktu. Metoda syntezy wymagała optymalizacji reakcji sprzęgania podczas przyłączania kolejnych reszt aminokwasowych budowanych fragmentów, jak i ich łączenia pod względem doboru reagentów, odczynników sprzęgających, stosowanych dodatków, czasu i temperatury reakcji, nie prowadziła zatem do powstawania innych produktów ubocznych, trudnych do wydzielenia.

Cel wynalazku:

Celem wynalazku jest opracowanie szybkiej, efektywnej, wydajnej i skalowalnej metody syntezy, umożliwiającej otrzymywanie lipopeptydowych koniugatów bogatych w reszty hydroksyaminokwasów, w szczególności hydroksyproliny i zaadoptowanie jej do otrzymania wysokiej czystości nowych lipopeptydowych koniugatów, ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli do użycia w kompozycji farmaceutycznej lub preparacie do stymulacji proliferacji oraz migracji fibroblastów i keratynocytów jako podstawowego komponentu do wytwarzania opatrunku w postaci roztworu, zawiesiny, emulsji w aerozolu, kremu, maści, trójwymiarowego płata, hydrożelu w tubce, mających zastosowanie w leczeniu ubytków tkankowych, tj. ran oparzeniowych (II i III stopnia), ran podtrzymywanych przez zaburzenia w odpływie żylnym, owrzodzenia, odleżyny (rany ziarninujące III-IV stopnia) czy zaburzenia o podłożu metabolicznym, jak stopa cukrzycowa, będące powikłaniem istniejących chorób układu krążenia czy cukrzycy. Zaproponowana metoda otrzymywania zapewnia wysokie bezpieczeństwo stosowania lipopeptydowych koniugatów i warunkuje ich wysoką aktywność biologiczną.

Istota wynalazku:

Prezentowany wynalazek zapewnia nowe lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole bogate w reszty Hyp usytuowane w pozycjach AK3, AK4, będące mediatorami regeneracji tkanek, poprzez stymulację proliferacji oraz migracji fibroblastów i kreatynocytów. Peptydowe struktury (liczące <10 AK) wykazują szereg zalet w rozwoju nowej i efektywnej terapii. Zainteresowanie peptydowymi strukturami w terapii ran wynika z ich wysokiej specyficzności działania. Jakkolwiek z uwagi na niższą masę cząsteczkową i degradowalność nie pozostają w organizmie przez długi czas, wykazują niski profil toksyczności i lepszą penetrację przez tkanki.

PL 245202 Β1

Obiektem badań prowadzonych przez naszą grupę badawczą są produkty degradacji kolagenu i ECM oraz otrzymywanie ich tłuszczowych pochodnych tj. lipopeptydowe połączenia bogatych w reszty proliny i hydroksyaminokwasów, w szczególności hydroksyproliny, stanowiące nowe biologicznie aktywne struktury, zaangażowane w proces gojenia ran. Uszkodzenia skóry, charakteryzujące się znacznie osłabionym procesem odbudowy, przedłużonym stanem zapalnym w obliczu wspomnianych chorób tj. układu krążenia, cukrzycy stanowią krytyczny etap w rozwoju infekcji, destrukcji tkanek, neuropatii, niedokrwienia, śmiertelności w następstwie amputacji. Dlatego zasadnicze wysiłki są podejmowane w celu rozwijania i otrzymywania nowych biologicznie aktywnych związków, wysoce efektywnych, których działanie polega na bezpośrednim zaangażowaniu w procesy komórkowe w II fazie gojenia tj. proliferacji, niezbędne w tworzeniu czy indukowaniu formowania się nowej tkanki, jak i utrzymywaniu bariery ochronnej po jej odbudowaniu, w których główną rolę odgrywają komórki keratynocytów i fibroblastów.

Istotą wynalazku jest lipopeptydowy koniugat bogaty w reszty hydroksyproliny o wzorze ogólnym: N“-acyl-(AK₅-AK4-AK3-AK2-AKi)-NH₂ (I) lub Na-acyl-(AK5-AK4-AK3-AK2-AKi)-(AK₅’-AK4’-AK3’-AK2’-AKi’)-NH2 (II) lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w którym:

AKi, AK2, AK3, AK4, AK5, AK1’, AK2’, AK3’, AK4’, AK5’ oznaczają reszty aminokwasowe lub ich brak, przy czym AK1 oznacza resztę Lys o konfiguracji L lub D;

AK2 oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy obejmującej aminokwasy niepolarne, obojętne takie jak Phe, Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Val, Trp;

AK3 oznacza resztę aminokwasową wybraną spośród Hyp, Ala, Gly, Leu, Met lub Pro;

AK4 oznacza resztę aminokwasową wybraną spośród Pro lub Hyp;

AK5 oznacza resztę Gly;

AKT oznacza resztę Lys o konfiguracji L lub D;

AK2’ oznacza resztę Gly;

AK3’ oznacza resztę aminokwasową wybraną spośród Hyp lub Gly;

AK4’ oznacza resztę aminokwasową wybraną spośród Pro lub Hyp;

AK5’ oznacza resztę Gly;

N“-acyl oznacza wybrane z grupy Ri-C(=0), w którym R1 oznacza nasycony łańcuch węglowy o długości od C7 do C13.

Korzystnie lipopeptydowy koniugat (I) lub (II) jest wybrany spośród grupy związków wymienionych w tabeli 1, przy czym forma amidowa koniugatu lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól wybrana jest spośród grupy obejmującej trifluorooctan, octan, chlorowodorek, bromowodorek, jodowodorek i fluorek.

Tabela 1

Lp.	N°-acyl = Ri-C(=O)	AKs	AK<	AKj	AKi	AKi	ΑΚΪ	AKT	AK2'	AKi’	n
1	Cli	Gly		Pro		L-Lys	-	-	-	-	1
2	Cu	Gly	Hyp	Hyp	-	L-Lys	-	-	-	-	1
3	Cn	Gly	Pro	Hyp	-	L-Lys	-	-	-	-	1
4	Cu	Gly	Hyp	Ala	-	L-Lys	-	-	-	-	1
5	Cu	Gly	Hyp	Hyp		D-Lys	-	-	-	-	1
6	Cli	Gly	Hyp	Pro	-	l.-l.ys	-	-	-		1
7	C₇	Gly	Hyp	Hyp	-	L-Lys	-	-	-	-	1
8	Cu	Gly	Pro	Hyp	Gly	L-Lys	-	-	-	-	1
9	Cu	Gly	Pro	Hyp	Met	L-Lys	-	-	-	-	1
10	Cli	Gly	Pro	Hyp	Trp	l-I.ys	-	-	-	-	1
11	Cu	Gly	Hyp	Gly	Pro	L-Lys	-	-	-	-	1
12	Cu	Gly	Pro	Hyp	tle	L-Lys	-	-	-	-	1
13	Cu	Gly	Pro	Hyp	Phe	[.-Lys	-	-	-	-	1
14	Cn	Gly	Pro	Hyp	Ala	[.-Lys	-	-	-	-	1
15	C11	Gly	Pro	Hyp	Leu	L-Lys	-	-	-	-	1
16	Cu	Gly	Hyp	Hyp	Val	L-Lys	-	-	-	-	1
17	Cn	Gly	Hyp	Hyp	Pro	[.-Lys	-	-	-	-	1
18	Cn	Gly	Hyp	Leu	Pro	[.-Lys	-	-	-	-	1
19	Cn	Gly	Hyp	Met	Pro	L-Lys	-	-	-	-	1
20	Cu	Gly	Hyp	Ala	Pro	L-Lys	-	-	-	-	1

PL 245202 Β1

21	Cu	Gly	Hyp	Hyp	Gly	L-Lys	-	-	-	-	1
22	Cli	Gly	Hyp	Hyp	Met	L-Lys	-	-	-	-	1
23	Cu	Gly	Hyp	Hyp	Trp	L-Lys	-	-	-	-	1
24	Cu	Gly		Hyp	Gly	L-Lys	-	-	-	-	1
25	Cu	Gly	Hyp	Hyp	-	l.-Lys	Pro	Hyp	-	I.-I.ys	2
26	Cu	Gly	Hyp	Hyp	-	L-Lys	Hyp	Hyp	-	L-Lys	2
27	Cu	Gly		Pro	-	L-Lys	Pro	Hyp	-	L-Lys	2
28	Cu	Gly	-	Pro	-	L-Lys	Hyp	Hyp	-	L-Lys	2
29	Cu	Gly	Pro	Hyp	-	l.-Lys	Hyp	Hyp		l.-T.ys	2
30	Cu	Gly	Pro	Hyp	-	L-Lys	Hyp	Hyp	-	D-Lys	2
31	C?	Gly	Pro	Hyp	-	L-Lys	Hyp	Hyp	-	L-Lys	2
32	C15	Gly	Pro	Hyp	-	L-Lys	Hyp	Hyp	-	L-Lys	2
33	C17	Gly	Pro	Hyp	-	L-Lys	Hyp	Hyp	-	L-Lys	2
34	Cu	Gly	Pro	Hyp	-	L-Lys	Pro	Hyp	Gly	L-Lys	2
35	Cu	Gly	Pro	Hyp	-	L-Lys	Hyp	Gly	-	L-Lys	2
36	Cu	Gly	Pro	Hyp	-	L-Lys		Hyp	Gly	L-Lys	2

Sposób otrzymywania na nośniku polimerowym lipopeptydowego koniugatu o wzorze I, przebiega w następujących etapach:

a) reakcja kondensacji estru aktywnego Fmoc-L-Lys(Boc)-OH lub Fmoc-D-Lys(Boc)-OH przebiega z aktywnym aminometylopolistyrenem, posiadającym jako linker 4-(2’,4’-dimetoksyfenylo-Fmoc-aminometylo)-fenoksyacetamid;

b) przyłączenie Fmoc-chronionych reszt aminokwasowych prowadzi się w warunkach bezwodnych, w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3l5 godzin, z udziałem DIPCI oraz HOBt w stosunku molowym 1 :1 :1 z zastosowaniem 2,5H-5,0-krotnego nadmiaru reagentów w stosunku do osadzenia na nośniku w mieszaninie rozpuszczalników NMP-DMF-DCM (1 :1 :1, v/v/v);

c) wprowadzenie długołańcuchowego kwasu tłuszczowego (Cs-hC-m) na N“-koniec łańcucha peptydylonośnika przebiega w warunkach bezwodnych, w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3l5 godzin z udziałem TBTU, HOBt oraz DIPEA w stosunku molowym 1 :1 :1 :2 z zastosowaniem 2,5-krotnego nadmiaru reagentów w stosunku do osadzenia na nośniku w DMF z dodatkiem 1% niejonowego surfaktanta polioksyetyleno t-oktylofenolu (1% NSP) (Cmc = 267, HLB = 14,4);

d) usuwanie z nośnika pojedynczych łańcuchów peptydowych skoniugowanych z kwasem tłuszczowym odbywa się w atmosferze gazu obojętnego, korzystnie azotu, w ciemności, przez okres 2l3 godzin w mieszaninie stężonego TFA, wymiatacza jonowego i/lub przeciwutleniacza;

e) oczyszczanie odszczepionego lipopeptydowego koniugatu odbywa się z użyciem ekstrakcji do fazy stałej w układzie faz odwróconych (RP-SPE).

Sposób otrzymywania na nośniku polimerowym lipopeptydowego koniugatu o wzorze II, prowadzi się równolegle i otrzymywane są dwa łańcuchy peptydowe A i B odpowiednio na nośniku 2-chlorotritylowym (fragment A) i aminometylopolistyrenowym (fragment B) w sekwencji następujących po sobie reakcji:

a) reakcja kondensacji estru aktywnego Fmoc-L-Lys(Boc)-OH lub Fmoc-D-Lys(Boc)-OH z aktywnym nośnikiem polimerowym, którym jest odpowiednio polistyren posiadający jako linker ester 2-chlorotritylu (fragment A) oraz aminometylopolistyren posiadający jako linker 4-(2’,4’-dimetoksyfenylo-Fmoc-aminometylo)-fenoksyacetamid (fragment B);

b) przyłączenie kolejnych Fmoc chronionych reszt aminokwasowych do utworzenia zdefiniowanych fragmentów peptydu A i B prowadzi się w warunkach bezwodnych, w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3l5 godzin, z udziałem DIPCI oraz HOBt w stosunku molowym 1 :1 :1 z zastosowaniem 2,5H-5,0-krotnego nadmiaru reagentów w stosunku do osadzenia na nośniku w mieszaninie rozpuszczalników NMP-DMF-DCM (1 :1 :1, v/v/v);

c) wprowadzenie długołańcuchowego kwasu tłuszczowego (CslCw) na N“-koniec łańcucha peptydylonośnika fragmentu A przebiega w warunkach bezwodnych, w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3l5 godzin, z udziałem TBTU, HOBt w obecności DIPEA w stosunku molowym 1:1:1:2 z zastosowaniem 2,5-krotnego nadmiaru reagentów w stosunku do osadzenia na nośniku, w DMF z dodatkiem 1% niejonowego surfaktanta polioksyetyleno t-oktylofenolu(1% NSP) (Cmc = 267, HLB = 14,4);

d) odszczepianie od nośnika li po peptydowych łańcuchów (lipo-fragment A) poprzez traktowanie nośnika mieszaniną DCM-TFA (95 :5, v/v) albo DCM-TFA-iPrsSiH (90 :5 :5, v/v/v) w atmosferze gazu obojętnego, korzystnie azotu, w ciemności, przez okres 30 minut, kolejno neutralizację odszczepionych lipopeptydowych łańcuchów i oczyszczanie,

e) reakcja polikondensacji fragmentów peptydowych: oczyszczonego lipo-fragmentu A i fragmentu B osadzonego na nośniku aminometylopolistyrenowym przebiega w warunkach bezwodnych w temperaturze 25 ±2°C przez okres 2,5: 5,0 godzin z użyciem TBTU, HOBt w obecności DIPEA w stosunku molowym 1 : 2 : 2 : 4, stosując 2,5:8,0-krotny nadmiar reagentów w stosunku do osadzenia na nośniku w DMF;

f) usuwanie z nośnika lipopeptydowego koniugatu odbywa się w atmosferze gazu obojętnego, korzystnie azotu, w ciemności, przez okres 2:3 godzin w obecności mieszaniny stężonego TFA, wymiatacza jonowego i/lub przeciwutleniacza;

g) oczyszczanie od szczepionego lipopeptydowego koniugatu odbywa się z użyciem ekstrakcji do fazy stałej w układzie faz odwróconych (RP-SPE).

Korzystnie sposób otrzymywania w etapie a). gdzie osadzenie pierwszego aminokwasu tj. Fmoc-L-Fys(Boc)-OH albo Fmoc-D-Fys(Boc)-OH na nośniku 2-chlorotritylowym jest w zakresie (0,655:1,245) ±0,040 mmol/g, a na nośniku aminometylopolistyrenowym jest w zakresie (0,345:0,790) ±0,050 mmol/g.

Korzystnie lipopeptydowe koniugaty bogate w hydroksyprolinę otrzymywane opisane wzorem ogólnym I według wynalazku otrzymywane są z użyciem Fmoc-N“-chronionego hydroksyaminokwasu tj. Fmoc-L-4-hydroksyproliny.

Korzystnie reakcję kondensacji pomiędzy wolną grupą α-aminową reszty aminokwasowej w sekwencji peptydu zawierającego L-4-hydroksyprolinę osadzonego na nośniku a grupą karboksylową kolejno wprowadzanej Fmoc chronionej reszty aminokwasu do otrzymania lipopeptydowego koniugatu bogatego w reszty hydroksyproliny określonego wzorem ogólnym I i II, prowadzi się stosując Fmoc chroniony aminokwas (Fmoc-AK-OH), odczynnik sprzęgający DIPCI i środek antyracemizacyjny (HOBt) w stosunku molowym 2 : 2 : 2 w mieszaninie rozpuszczalników NMP, DMF i DCM w stosunku objętościowym 1 : 1 : 1, w temperaturze 18 ±2°C, przez 3,5 ±0,5 godziny.

Korzystnie sposób otrzymywania, gdzie lipopeptydowe koniugaty bogate w reszty L-hydroksyproliny są odszczepiane od nośnika aminometylopolistyrenowego z użyciem mieszaniny, zawierającej stężony TFA oraz wymiatacze jonowe: PhOH, iPraSiH, H2O w stosunku objętościowym 88 : 5,8 : 2 : 4,2 w czasie od 2 do 3 godzin, temperaturze 25 ±2°C albo mieszaniny zawierającej stężony TFA oraz wymiatacze jonowe: PhOH, iPraSiH, H2O z dodatkiem przeciwutleniacza jodowego - NH4I, w stosunku objętościowym 86,5 : 5,8 : 4,2 : 1,5 w czasie od 3 do 4 godzin w obniżonej temperaturze, korzystnie w temperaturze 0°C.

Korzystnie sposób otrzymywania, gdzie lipopeptydowe koniugaty odszczepione od nośnika polimerowego według wynalazku poddaje się procesowi oczyszczania z użyciem RP-SPE, z zastosowaniem kolumienek wypełnionych żelem krzemionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi, stosując elucję gradientową o wzrastającym stężeniu w zakresie od 0% do 30% acetonitrylu w wodzie z dodatkiem 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) oraz doczyszcza się prowadząc elucję izokratyczną.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera co najmniej jeden lipopeptydowy koniugat (I, II) lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól określone w ilości od 0,0001% do 10% w/w oraz co najmniej jeden farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik.

Korzystnie w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku lipopeptydowy koniugat wybrany jest spośród Lauroilo-Gly-Pro-Lys-NH2, Lauroilo-Gly-Hyp-Hyp-Lys-NH2 i Lauroilo-Gly-Pro-Hyp-Lys-NH2.

Preparat do stymulacji proliferacji oraz migracji fibroblastów i keratynocytów zawiera kompozycję farmaceutyczną według wynalazku w ilości od 0,01% do 10% wagowych w przeliczeniu na całkowitą masę preparatu.

Korzystnie preparat według wynalazku zawiera ponadto karboksymetylocelulozę.

Zastosowanie preparatu według wynalazku jako opatrunek w postaci roztworu, zawiesiny, emulsji w aerozolu, kremu, maści, trójwymiarowego płata, czy hydrożelu w tubce.

Kompozycja farmaceutyczna zdefiniowana powyżej zawierająca lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól określoną powyżej albo preparat zdefiniowany powyżej mogą być stosowane do leczenia ran przewlekłych, korzystnie ran oparzeniowych, ran podtrzymywanych przez zaburzenia w odpływie żylnym, owrzodzenia/odleżyny, stopy cukrzycowej, jak również tych będących powikłaniem istniejących chorób układu krążenia czy cukrzycy.

Oznaczenie aktywności biologicznej kompozycji farmaceutycznej, zawierającej nowy lipopeptydowy koniugat bogaty w reszty hydroksyproliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól albo preparatu albo opatrunku obejmowało badania przedkliniczne, zarówno in vitro, jak i in vivo. Przykład 7 określa zdolność kompozycji farmaceutycznej, zawierającej nowy lipopeptydowy koniugat bogaty w reszty hydroksyproliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól według wynalazku do inicjowania i modulowania szybkości migracji komórek i zmniejszenia powierzchni ran. Kompozycję farmaceutyczną, zawierającą nowy lipopeptydowy koniugat bogaty w reszty hydroksyproliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól albo preparat otrzymywane według wynalazku badano, stosując metodę opisaną na Przykładzie 7. Fotografie przedstawiające proces migracji komórek z ludzkiej skóry i wyniki oznaczeń tj. pomiaru powierzchni „rany”, pokrywającej się komórkami po traktowaniu kompozycją farmaceutyczną, zawierającą nowy lipopeptydowy koniugat bogaty w reszty hydroksyproliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól w określonym stężeniu przedstawiono na Figurze 4 i Figurze 7. Obserwowano istotny udział kompozycji farmaceutycznej, zawierającej nowy lipopeptydowy koniugat bogaty w reszty hydroksyproliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól albo preparatu w inicjowaniu, modulowaniu szybkości migracji komórek uzależniony zarówno od zastosowanego stężenia, jak i sekwencji aminokwasowej. Jakkolwiek obserwowano jednocześnie aktywność proliferacyjną komórek skórnych ocenianą na podstawie metody opisanej na Przykładzie 8. Wyniki, przedstawiające względną liczbę komórek poddawanych działaniu kompozycji farmaceutycznej, zawierającej nowy lipopeptydowy koniugat bogaty w reszty hydroksyproliny lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól w zależności od stężenia zostały uwidocznione na Figurze 5, Figurze 6 oraz w Tabeli 4. Lipopeptydowe koniugaty bogate w reszty hydroksyproliny lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole w szeregu prowadzonych badań zapewniały odpowiednie środowisko do wzrostu, namnażania i prawidłowego funkcjonowania ludzkich komórek skórnych. Określono wzrost aktywności komórek keratynocytów, jak i znaczną aktywację procesu proliferacji transformowanej populacji ludzkich komórek fibroblastów i komórek fibroblastów (z tkanek od pacjentów) w obecności kompozycji farmaceutycznej zawierającej lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól w szerokim zakresie stężeń.

Lipopeptydowe koniugaty bogate w reszty hydroksyproliny lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole otrzymywane według wynalazku ilustrowanego na przykładach od 1 do 6 prezentują odróżniające cechy od konkurencyjnych produktów, ich działanie jest wysoce specyficzne i efektywne, ponadto przedstawiają wysoki profil bezpieczeństwa określony zarówno na podstawie aktywności hemolitycznej, jak i działania cytotoksycznego. Aktywność hemolityczną lipopeptydowych koniugatów i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli badano, stosując ogólną metodę opisaną na Przykładzie 10.

W Tabeli 6 przedstawiono wyniki oznaczeń z pomiarów, wyznaczone wartości HC10 lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli według wynalazku mieszczą się w zakresie stężeń 0,19:1,62 mM. W całym testowanym zakresie stężeń nie zaobserwowano silnego działania hemolitycznego, powodującego 50% hemolizę wszystkich komórek (HC50), co tym samym potwierdza ich wysokie bezpieczeństwo, biozgodność i działanie protekcyjne wobec komórek.

Aktywność cytotoksyczną lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli badano stosując testy LDH, XTT opisane na Przykładzie 9, w Tabeli 5 zestawiono wartości wyznaczonych stężeń EC10 i EC50 dla lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli według wynalazku. Wyniki przeprowadzonych testów (Tabela 5) prezentowały wysoki profil bezpieczeństwa lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli według wynalazku w stosunku do komórek ludzkiej skóry. Przeprowadzone badania potwierdziły rozszerzony profil bezpieczeństwa poprzez brak efektu toksycznego wywieranego na komórki w szerokim zakresie stężeń znacznie powyżej działania biologicznego lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Dotychczas nie są znane i komercyjnie dostępne czy klinicznie stosowane metody zaopatrywania ran przewlekłych z użyciem kompozycji farmaceutycznej zawierającej lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól lub preparatu według wynalazku. Kombinacje polimerowych matryc i różnorodnych peptydowych fragmentów są głównie opisywane w badaniach przedklinicznych. Jedynie wyrób Granexin® oparty na hydroksyetylocelulozie, zawierający peptydowy fragment ACT1 (RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI) wszedł w II fazę badań klinicznych (2015 r.). Takie połączenia, zawierające innowacyjne lipopeptydowe koniugaty pozwalają na wytwarzanie wyrobów nowej generacji tj. opatrunku w postaci roztworu, zawiesiny, emulsji w aerozolu, kremu, maści, trójwymiarowego płata, hydrożelu w tubce do zaopatrywania trudno gojących się ran o podłożu metabolicznym i żyl nym.

Wytworzona sposobem według wynalazku kompozycja farmaceutyczna, zawierająca lipopeptydowy koniugat lub ich farmaceutycznie dopuszczalną sól albo preparat mogą być podawane zewnętrznie w sytuacji wymagającej leczenia w terapeutycznie skutecznej ilości. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól albo preparat według wynalazku mogą być użyte w opatrunku w postaci roztworu, zawiesiny, emulsji w aerozolu, kremu, maści, trójwymiarowego płata, amorficznego hydrożelu wyciskanego z tubki.

Opatrunki w hydrożelu zawierają jako polimerową matrycę, w szczególności pochodne celulozy (MC, HPMC, CMC, HPC), mogą zawierać również inne składniki, farmaceutycznie i kosmetycznie dopuszczone do stosowania. Wśród farmaceutycznie dopuszczalnych rozcieńczalników mogą być stosowane: woda, bufory, w szczególności fosforanowy, sól fizjologiczna, czy inne fizjologicznie zbalansowane roztwory soli.

Inne substancje, stosowane do przygotowania emulsji, kremu, maści stanowią fazę olejową. Przygotowane preparaty, opatrunki mogą być płynne lub stałe, kompozycje farmaceutyczne zawierające lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole są podawane w postaci zawiesiny lub roztworu do uzyskania ilości uznanej za terapeutyczną od 0,0001% do 10% (w/w). W jednej z postaci wykonania wynalazku, preparat zawierający co najmniej jeden lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól zawiera jako polimerową matrycę pochodną karboksymetylocelulozy dla kontrolowanego uwalniania.

Kompozycja farmaceutyczna zawierająca lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól albo preparat aplikowane są poprzez wypełnienie ubytku tkanki, po czym zabezpieczone są opatrunkiem okluzyjnym chroniącym przed infekcją, czynnikami zewnętrznymi tj. zanieczyszczeniem, urazami i odpowiednio mocowane. Kompozycja farmaceutyczna albo preparat według wynalazku mogą być podawane w ilościach w zależności od schematu leczenia. Określenie właściwej ilości i schematu podawania jest możliwe do oszacowania na podstawie przeprowadzonych testów i powiązaniu z właściwymi danymi dotyczącymi efektu terapeutycznego w odniesieniu do podanej ilości kompozycji farmaceutycznej zawierającej lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól albo preparatu.

Przykłady ilustrują użycie kompozycji farmaceutycznej zawierającej lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól albo preparatu w terapeutycznie skutecznej ilości 0,1%-4,0% w/w. Miejscowe zastosowanie kompozycji farmaceutycznej albo preparatu odbywa się w obszarze dotkniętym chorobą z zastosowaniem dowolnych standardowych środków do podawania miejscowego.

Pochodne celulozy wykazują istotny potencjał do przygotowania hydrożelu i charakteryzują się wysoką zgodnością chemiczną w prowadzonych badaniach laboratoryjnych z lipopeptydowymi koniugatami i ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami według wynalazku. Preparaty na bazie pochodnych karboksymetylocelulozy (CMC) (stanowiące podstawę komercyjnie dostępnych opatrunków nowej generacji tj. Granugel® (ConvaTec), Intrasitegel® czy Solositegel® (Smith&Nephew)) charakteryzują się pożądanymi właściwościami fizycznymi, kontrolowanymi zdolnościami uwalniania, jak i różną lepkością. W jednej postaci wykonania wynalazku, opatrunek zawiera kompozycję farmaceutyczną, zawierającą lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól albo preparat w ilości od 0,01% do 5% wagowych oraz karboksymetylocelulozę w ilości od 1% do 20%.

W innej postaci wynalazku, krem, emulsja w aerozolu (emulsja o/w) wytwarzana konwencjonalnymi technikami farmaceutycznymi i kosmetycznymi, składa się z układu emulgującego i zawiera kompozycję farmaceutyczną albo preparat w ilości 0,2:10% wagowych masy emulsji. Układ emulgujący korzystnie składa się: ze stałych lipidów (emolienty 1:10% tj. lanolina, alkohole tłuszczowe (tj. cetylowy, stearynowy)), 1:10% związku powierzchniowo-czynnego (emulgatora), fazę wodną stanowią humektanty 1:15% (tj. 2:10% gliceryna, glikol propylenowy, butylenowy), substancja konserwująca, np. 0,1:2% fenoksyetanol, ester metylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego, ester etylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego oraz do 100% woda destylowana.

Przeprowadzone testy przedkliniczne wykazały, że kompozycje farmaceutyczne albo preparaty albo opatrunki, zawierające lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole wpływają na poprawę naturalnego procesu gojenia ran, tj. ran cukrzycowych. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej zawierającej lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól albo preparatu albo opatrunku pozwalają na leczenie metodami nowej generacji, tj. leczenie ran w środowisku wilgotnym, stwarzając warunki sprzyjające gojeniu, możliwości rozwoju i proliferacji komórek keratynocytów i fibroblastów, bezpośrednio zaangażowanych w budowę nowej tkanki poprzez ziarninowanie i epitelizację. Leczenie ran z użyciem kompozycji farmaceutycznej zawierającej lipopeptydowy koniugat

PL 245202 Β1 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól albo preparatu albo opatrunku, odbywa się przez określony czas, w zależności od zaawansowania choroby, stanu rany. Wymiana opatrunku odbywa się na 2h-3 dzień, co pozwala na łatwiejszą aplikację i dostosowanie do systemu podawania. Skuteczność zarówno kompozycji farmaceutycznych albo preparatów albo opatrunków otrzymywanych według Przykładu 11 wykazano również poprzez ocenę zdolności do aktywacji procesu gojenia ran in vivo jak opisano w Przykładach 13, 14. Wyniki przedstawiające efekt wygojenia i odbudowy pełń owa rstwowej skóry BALB/c, db/db w trakcie kilkunastodniowego leczenia kompozycją farmaceutyczną, zawierającą lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól albo preparatem albo opatrunkiem, ujawniono na Figurach 8-M 7.

Pozytywny efekt nowej grupy lipopeptydowych koniugatów w procesie gojenia ran jest przypisywany zaangażowaniu w II fazę gojenia tj. właściwą proliferację, niezbędny etap w tworzeniu czy indukowaniu formowania się nowej tkanki (pokrycia ubytku ziarniną, naskórkowania, zamykania rany) czy utrzymywaniu bariery ochronnej po jej odbudowaniu.

Jak wykazano, nowe lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole są zdolne do inicjowania i stymulowania zarówno ukierunkowanej migracji (chemotaksji) jak i proliferacji komórek keratynocytów i fibroblastów w badaniach in vitro. Badania ich aktywności udowodniły bezpośredni wpływ na komórki tj. fibroblastów, powodując ich silny wzrost w hodowli, pośrednio wpływając na zwiększoną syntezę kolagenu przez fibroblasty w środowisku rany.

Opis figur i tabel:

Fig. 1 - przedstawia schematycznie sposób otrzymywania lipopeptydowych koniugatów o wzorze I (n = 1) na nośniku aminometylopolistyrenowym

Fig. 2 - przedstawia schematycznie sposób orzymywania N“-lauroilo-Gly-Pro-Hyp-Lys-Gly-Hyp-Hyp-Lys-NH2 z zastosowaniem (poli)kondensacji N“-acylopeptydu (Lipo-fragment A) z a-aminową grupą fragmentu peptydowego (Fragment B) osadzonego na nośniku aminometylopolistyrenowym

Fig. 3 - przedstawia schematycznie sposób otrzymywania lipopeptydowych koniugatów o wzorze I (n = 2) na nośniku aminometylopolistyrenowym

Fig. 4 - przedstawia analizę zdolności do migracji ludzkich komórek skórnych stymulowanych kompozycją farmaceutyczną (wodnym roztworem), zawierającą lipopeptydowy koniugat ΐΠ 2d, 3® w stężeniu 0,01 pg/ml i 0,1 pg/ml, mediana i min-max, n = 3 *różnice statystyczne w stosunku do kontroli dla p<0,05. K+ kontrola pozytywna w pożywce DMEM, A. transformowana linia fibroblastów BR1N, B. pierwotne fibroblasty.

Fig. 5 - przedstawia efekt zastosowanej kompozycji farmaceutycznej (wodnego roztworu), zawierającej lipopeptydowy koniugat id, 20, 30 w zakresie stężeń 0,001^-25 pg/ml na proliferację ludzkich komórek skóry: pierwotnych fibroblastów, wartość średnia ±SD, n = 3, różnice statystyczne w stosunku do kontroli (K) *p<0.05, **p<0.01, (K+) ^#p<0,05. K kontrola w pożywce DMEM, K+ kontrola pozytywna w pożywce DMEM.

Fig. 6 - ilustruje efekt zastosowanej kompozycji farmaceutycznej (wodnego roztworu), zawierającej lipopeptydowy koniugat lO, lipopeptydowy koniugat 20, lipopeptydowy koniugat 30 w zakresie stężeń 0,001^-25 pg/ml na proliferację ludzkich komórek skóry: A. keratynocytów linii HaCaT, B. transformowanej linii fibroblastów BR1N, wartość średnia ±SD, n = 3, różnice statystyczne w stosunku do kontroli (K) *p<0.05, **p<0.01, (K+) ^#p<0,05. K kontrola w pożywce DMEM, K+ kontrola pozytywna w pożywce DMEM.

Fig. 7 - ilustruje zdjęcia mikroskopowe, prezentujące wpływ zastosowanych kompozycji farmaceutycznych zawierających: a. lipopeptydowy koniugat 1, b. lipopeptydowy koniugat 2 na inicjowanie procesu migracji reprezentatywnej hodowli komórek ludzkiej skóry (fibroblasty pierwotne). K+ kontrola pozytywna w pożywce DMEM, komórki w pożywce DMEM traktowane kompozycją farmaceutyczną (wodnym roztworem), zawierającym lipopeptydowy koniugat: 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml,

Fig. 8 - przedstawia efekt gojenia ran po traktowaniu preparatem (0,1% w/w). Zmniejszenie powierzchni rany (n (ilość ran) =12) (kontrola żelu FA4 n = 12)) w czasie. Powierzchnia tworzonego naskórka (% rany początkowej (w dniu 0)) w czasie leczenia preparatem, zawierającym lipopeptydowy koniugat. Proces reepitalizacji następuje od dnia 3 po traktowaniu preparatem według wynalazku. Rezultaty reprezentują wartość średnią ±SEM. Różnice statystyczne w odniesieniu do kontroli p<0,05. Przykładowe mikroskopowe fotografie barwionych według Massona sekcji skóry. Próbki pochodzą od myszy BALB/c leczonych preparatem zawierającym lipopetydowy koniugat: 2 (a), 3 (b), w odniesieniu do kontroli (c), 18 dni po uszkodzeniu. Szare strzałki wskazują na margines rany. Szara i czarna

PL 245202 Β1 strzałka wskazują powiększenie fragmentu nowo utworzonego naskórka i fragmentu naskórka przy nieuszkodzonej skórze w 18 dniu. Barwienie trójbarwne według Massona. Prawidłowe wygojenie rany, brak jąder pyknotycznych w gruczołach łojowych, brak zmian w wielkości gruczołów łojowych, włókna kolagenowe i elastynowe o prawidłowej architekturze, właściwa odbudowa naskórka, bez uwypukleń w rejonie uszkodzenia. Naskórkowanie rany u myszy BALB/c 18 dni po uszkodzeniu. W grupie eksperymentalnej obserwowano znaczne pogrubienie naskórka w rejonie wygojonej rany (powiększenie) w porównaniu do kontroli (c).

Fig. 9 - ilustruje schemat podawania i wpływ stężenia zaaplikowanego lipopeptydowego koniugatu 1 na pełń owa rstwowe wygojenie rany u myszy BALB/c w czasie. Różnice w wielkości rany i pokrycia jej nowym nabłonkiem widoczne są od dnia 3. Aplikacja na rany (n (ilość ran) = 12) preparatu 0,1% w/w odbywała się codziennie (dO-ndlO), preparatu 4,0% w/w odbywała się w dO, d3, d7, d10 (4-krotnie) w trakcie 18-dniowego leczenia. Odbudowanie pełnowarstwowej skóry określa się na podstawie zmniejszenia pola powierzchni niezamkniętego obszaru w czasie (linia ciągła). Obszar nowo utworzonego naskórka w czasie określa się w odniesieniu do pola powierzchni rany w czasie (linia przerywana). Rezultaty reprezentują wartość średnią ±SEM. Różnice statystyczne w odniesieniu do kontroli (hydrożelowego opatrunku nowej generacji (FA4), n=10-12 (d10, d14)) *p<0.05, **p<0.01, ***p<0,001).

Fig.10 - ilustruje działanie lipopeptydowego koniugatu 2 w czasie po jego aplikacji na pełnowarstwowe rany u myszy BALB/c. Zastosowanie preparatu w ilości terapeutycznej 0,1h-4,0%, w/w. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej w polimerowej matrycy - soli sodowej karboksymetylocelulozy w ilości 4,0% w/w pozwala na swobodne uwalnianie lipopeptydowego koniugatu w trakcie eksperymentu do czasu wymiany opatrunku (dO, d3, d7, d10). Różnice w wielkości rany i pokrycia jej nowym nabłonkiem widoczne są od dnia 3. Aplikacja na rany (n (ilość ran) = 12) 0,1% w/w preparatu odbywała się codziennie (dO-nd10), 4,0% w/w preparatu odbywała się w dO, d3, d7, d10 (4-krotnie) w trakcie 18-dniowego leczenia. Odbudowanie pełnowarstwowej skóry określa się na podstawie zmniejszenia pola powierzchni niezamkniętego obszaru w czasie (linia ciągła). Obszar nowo utworzonego naskórka w czasie określa się w odniesieniu do pola powierzchni pozostałej rany w czasie (linia przerywana). Rezultaty reprezentują wartość średnią ±SEM. Różnice statystyczne w odniesieniu do kontroli zastosowanej polimerowej matrycy, n=10-12, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

Fig. 11 - ilustruje działanie lipopeptydowego koniugatu 3 w czasie po jego aplikacji na pełnowarstwowe rany u myszy BALB/c. Zastosowanie preparatu w ilości terapeutycznej 0,1h-4,0%, w/w. Różnice w wielkości rany i pokrycia jej nowym nabłonkiem widoczne są od dnia 3. Aplikacja na rany (n (ilość ran) = 12) preparatu 0,1% odbywała się codziennie (dO-ndlO), preparatu 4,0% odbywała się w dO, d3, d7, d10 (4-krotnie) w trakcie 18-dniowego leczenia. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej w polimerowej matrycy - soli sodowej karboksymetylocelulozy w ilości 4% w/w pozwala na swobodne uwalnianie lipopeptydowego koniugatu w trakcie eksperymentu do czasu wymiany opatrunku (dO, d3, d7, d10). Odbudowanie pełnowarstwowej skóry określa się na podstawie zmniejszenia pola powierzchni niezamkniętego obszaru w czasie (linia ciągła). Obszar nowo utworzonego naskórka w czasie określa się w odniesieniu do pola powierzchni pozostałej rany w czasie (linia przerywana). Rezultaty reprezentują wartość średnią ±SEM. Różnice statystyczne w odniesieniu do kontroli zastosowanej polimerowej matrycy, n=10-12, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

Fig. 12 - przedstawia preparaty zawierające lipopeptydowe koniugaty, które stymulują proces gojenia pełń owa rstwowych ran u myszy. A. Makroskopowa ocena przedstawia zamykanie ran u myszy BALB/c w trakcie leczenia ich przygotowanymi opatrunkami w hydrożelu. Fotografie pochodzą od wybranej myszy w grupie leczonych FA1 (b), FA2 (c), FA3 (d) w porównaniu z kontrolą FA4 (a). Rany utworzone zostały w miejscu grzbietowej skóry w dniu 0. B. Diagram przedstawiający wartość średnią powierzchni rany (% początkowej rany) El, obszaru pokrytego naskórkiem O obszaru zagojonego □ w dniu 10, leczonej opatrunkiem FA2 (po lewej) w porównaniu z FA4 (po prawej). C. Podział przedstawiający powierzchnię ran w dniu 10 po leczeniu opatrunkiem FA2 w porównaniu z FA4.

Fig. 13 - przedstawia zmiany w masie ciała myszy płci żeńskiej db/db po leczeniu ran opatrunkami: FA2 i FA4. Punkty reprezentują wartość średnią ±SD (n=5). Różnice statystyczne w odniesieniu do kontroli (FA4)*p<0,05.

Fig. 14 - przedstawia zamykanie poprzez regenerację ran po zastosowaniu opatrunku FA1. Odbudowanie pełnowarstwowej skóry określane na podstawie zmniejszenia powierzchni rany (n (ilość ran) =10) (kontrola (FA4) n=12-14)) w czasie (linia ciągła). Obszar rany (% rany początkowej (w dniu 0)) wskazywał na postępujący proces reepitalizacji od dnia 3 po leczeniu opatrunkiem FA1 (linia przerywana). Rezultaty reprezentują wartość średnią ±SEM. Różnice statystyczne w odniesieniu do kontroli (FA4) *p<0.05.

PL 245202 Β1

Fig. 15 - przedstawia zamykanie poprzez regenerację ran po zastosowaniu opatrunku FA2. Odbudowanie pełń owa rstwowej skóry określane na podstawie zmniejszenia powierzchni rany (n (ilość ran) =12-16) (kontrola opatrunku w hydrożelu (FA4), n=12-14)) w czasie (linia ciągła). Obszar rany wskazywał na postępujący proces reepitalizacji od dnia 3 po leczeniu opatrunkiem w hydrożelu (linia przerywana). Rezultaty reprezentują wartość średnią ±SEM. Różnice statystyczne w odniesieniu do kontroli (FA4) *p<0,05.

Fig. 16 - przedstawia zamykanie poprzez regenerację ran po zastosowaniu opatrunku FA3. Odbudowanie pełń owa rstwowej skóry określane na podstawie zmniejszenia powierzchni rany (n (ilość ran)=8-10) (kontrola opatrunku w hydrożelu(FA4), n=12-14)) w czasie (linia ciągła). Obszar rany wskazywał na postępujący proces reepitalizacji od dnia 3 po leczeniu opatrunkiem w hydrożelu (linia przerywana). Rezultaty reprezentują wartość średnią ±SEM. Różnice statystyczne w odniesieniu do kontroli (FA₄) *p<0,05, **p<0,01.

Fig. 17 - przedstawia efekt działania pozwalający na odbudowę pełń owa rstwowej skóry u myszy zarówno nieobciążonych cukrzycą BALB/c jak i z cukrzycą db/db po zastosowaniu przykładowej formulacji FA2. Rany myszy BALB/c (n=12-16), jaki db/db (n=6/8) leczono opatrunkiem FA2 w dO, d3, d7, d10, mierzono powierzchnię otwartej rany pokrywanej nowym nabłonkiem. IA. Odbudowanie pełnowarstwowej skóry określa się na podstawie zmniejszenia pola powierzchni niezamkniętego obszaru w czasie d3, d7, d10, d14 (wypełniona kolumna FA4 £3 FA2). IB. Obszar nowo tworzonego naskórka w czasie określa się w odniesieniu do pola powierzchni pozostałej rany w czasie (pusta kolumna □O FA4 ŁJłJ FA2).W dniu 18 rany zostały całkowicie wygojone w odniesieniu do kontroli (opatrunku w hydrożelu FA4). Rezultaty reprezentują wartość średnią ±SEM. Różnice statystyczne w odniesieniu do kontroli *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. II. Makroskopowa ocena przedstawia zamykanie ran u myszy z cukrzycą db/db w trakcie leczenia opatrunkiem FA2. Fotografie pochodzą od wybranej myszy w grupie leczonych FA2 (a) w porównaniu z kontrolą FA4 (b). Rany utworzone zostały w miejscu grzbietowej skóry w dniu 0. III. Diagram przedstawiający porównanie wartości średnich powierzchni rany u myszy nieobciążonej cukrzycą i z zaawansowanym stadium cukrzycy (% początkowej rany) H, obszaru pokrytego naskórkiem EJ, obszaru zagojonego D w dniu 7, 10, leczonej FA4.

Tabela 1. Seria lipopeptydowych koniugatów określonych wzorem ogólnym I

Tabela 2. Porównanie warunków reakcji kondensacji pomiędzy wolną grupą α-aminową reszty aminokwasowej w sekwencji peptydu zawierającego resztę Hyp osadzonego na nośniku aminometylopolistyrenowym a grupą karboksylową kolejno wprowadzanej Fmoc chronionej reszty AK do otrzymania lipopeptydowego koniugatu bogatego w reszty hydroksyproliny.

Tabela 3. Efektywność skalowania procesu wytwarzania lipopeptydowych koniugatów na nośniku aminometylopolistyrenowym z zastosowaniem metody 1.

Tabela 4. Zamykanie rany z udziałem hodowli ludzkich komórek keratynocytów poddanych działaniu kompozycji farmaceutycznej (wodnego roztworu), zawierającej lipopeptydowy koniugat.

Tabela 5. Efektywne stężenie lipopeptydowych koniugatów powodujące 10% i 50% spadek żywotności ludzkich komórek skórnych.

Tabela 6. Aktywność hemolityczna lipopeptydowych koniugatów wobec erytrocytów ludzkich HC10; HC50 określone jako najmniejsze stężenie lipopeptydowego koniugatu powodujące 10% i 50% lizę komórek; mediana, współczynnik 25h-75%; no - nie oznaczono 50% lizy komórek po zastosowaniu koniugatu w badanym zakresie stężeń, *10h-500 pg/ml.

Tabela 7. Skład przykładowych hydrożeli

Tabela 8. Skład emulsji o/w w sprayu (FB) przygotowanej na podstawie US20050255048, zawierającej dodatkowo lipopeptydowe koniugaty

Tabela 9. Skład emulsji o/w (FC) zawierającej dodatkowo lipopeptydowe koniugaty

Wykaz stosowanych skrótów i symboli:

Skróty aminokwasów i ich pochodnych stosowane w pracy są zgodne z zaleceniami Komisji Nomenklatury Biochemicznej (IUPAC-IUB. (1984), Eur. J. Biochem., 138:9, Jones J.H. (2003) J. Pept. Sci,9:1).

AK - aminokwas

Alloc - grupa alliloksykarbonylowa

Boc - grupa tert-butyloksykarbonylowa

Bzl - grupa benzylowa

Cbz - grupa benzyloksykarbonylowa

CMC Cmc DCU DCC DCM Dhbt DIPCI DIPEA DMAP DMEM DMF DNA EC10, EC50	- karboksymetyloceluloza - krytyczne stężenie micelarne (ang. critical micellar concentraction) - dicykloheksylomocznik - N,N’-dicykloheksylokarbodiimid - chlorek metylenu, dichlorometan - grupa 3,4-dihydro-4-okso-1,2,3-benzotriazyn-3-ylowa - N,N’-diizopropylokarbodiimid - N,N-diizopropyloetyloamina - 4-(dimetyloamino)pirydyna - pożywka Eagle’s w modyfikacji Dulbecco - N,N-dimetyloformamid - kwas dezoksyrybonukleinowy (ang. deoxyribonucleic acid) - efektywne stężenie związku powodujące 10 i 50% spadek żywotności ludzkich komórek skórnych
ECM	- macierz pozakomórkowa, istota/substancja międzykomórkowa (ang. extracellular matrix)
EGF EGFR ESI-MS	- naskórkowy czynnik wzrostu (ang. epidermal growth factor) - receptor czynnika wzrostu naskórka (ang. epidermal growth factor receptor) - spektrometria mas z jonizacją elektrosprejową (ang. electrospray ionization mass spectrometry)
FCS FGF Fmoc HaCaT HBTU HBDs HF HC10, HC50	- bydlęca surowica płodowa (ang. fetal calm serum) - czynnik wzrostu fibroblastów (ang. fibroblast growth factor) - grupa fluorenylo-9-metoksykarbonylowa - linia ludzkich kreatynocytów (ang. Human Adult Calcium High Temperature) - heksafluorofosforan O-benzotriazolo-1-ylo-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy - ludzkie β-defensyny (ang. Human β-defensins) - fluorowodór - najmniejsze stężenie związku powodujące 10 i 50% lizę komórek (ang. hemolytic concentraction
HLB HOBt HPLC	- równowaga hydrofilowo-lipofilowa (ang. hydrophilic-lipophilic balance) - 1-hydroksybenzotriazol - wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. high performance liquidchromatography)
HPC HPMC IL LDH MALDI-TOF-MS	- hydroksypropyloceluloza - hydroksypropylometyloceluloza - interleukiny (ang. interleukin) - dehydrogenaza mleczanowa - spektrometria mas z jonizacją lasera w matrycy i analizatorem czasu przelotu (ang. matrix assisted laser desorption and ionisation)
MMP MTT NMP PBS PDGF PFA Pfp Rf	- metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej (ang. matrix metalloproteinases) - bromek [3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazolu] - N-metylo-2-pirolidon - buforowany roztwór soli fizjologicznej (ang. Phosphate Buffered Saline) - płytkopochodny czynnik wzrostu (ang. Platelet-derived growth factor) - paraformaldehyd - grupa pentafluorofenylowa - stosunek długości drogi substancji do długości drogi fazy ruchomej w chromatografii cienkowarstwowej
Rt RP-HPFC	- czas retencji - wysokosprawna chromatografia cieczowa w układzie faz odwróconych (ang. high performance liquid chromatography)
RP-SPE	- ekstrakcja do fazy stałej w układzie faz odwróconych (ang. reverse-phase solid-phase extraction)
SPPS STAT	- synteza peptydów na fazie stałej (ang. solid-phase peptide synthesis) - czynnik transkrypcyjny aktywowany przez kinazę JAK (ang. signal transducer and activtor of transcription pathway)

NSu	-	grupa N-hydroksysukcynimidylowa
t-Bu	-	grupa tert-butylowa
TBAF	-	fluorek tetrabutyloamoniowy
TBS	-	grupa tert-butylosilylowa
TBSCl	-	chlorek tert-butylosilylu
TBTU	-	tetrafluoroboran 2-(1-benzotriazolilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy
TIMP	-	tkankowy inhibitor metaloproteinazy (ang. tissue inhibitor of metalloproteinase)
TES	-	trietylosilan (ang.triethylsilane)
TFA	-	kwas trifluorooctowy
TGF	-	transformujący czynnik wzrostu (ang. transforming growth factor)
TIPS	-	triizopropylosilan
TLC	-	chromatografia cienkowarstwowa
Trt	-	grupa tritylowa
XTT	-	2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-2H-tetrazolu-5-karboanilid

Skróty nieuwzględnione w powyższym wykazie zostały użyte zgodnie z zaleceniami IUPAC Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, niestanowiące jego ograniczenia Szczegółowy opis syntezy na przykładach wykonania

Odczynniki stosowane w syntezie były dostępne handlowo, używane bez wcześniejszego oczyszczania. Rozpuszczalniki organiczne zastosowane w syntezie zostały oczyszczone i osuszone zgodnie z metodami literaturowymi.

Przykład 1

Otrzymywanie lipopeptydowego koniugatu N“-lauroilo-Gly-Pro-Hyp-Lys-NH2

a) Otrzymanie sekwencji aminokwasowej Gly-Pro-Hyp-Lys(Boc) na nośniku aminometylo- polistyrenowym

Przed przystąpieniem do syntezy nośnik aminometylopolistyrenowy zawierający linker 4-(2’,4’-dimetoksyfenylo-Fmoc-aminometylo)-fenoksyacetamidu (o pojemności : 0,30:1,00 mmol/g, wielkości cząstek: 100:200 μm firmy ChemPep) umieszczono w rozpuszczalniku DMF na okres 1 h (15 ml /1 g nośnika) w temperaturze pokojowej w zamkniętym naczynku reakcyjnym w celu napęcznienia ziaren. Przyłączenie Fmoc-Lys(Boc)-OH odbywało się dwuetapowo:

I etap: 10 ml 25% roztworu piperydyny w DMF wprowadzono do naczynka reakcyjnego zawierającego spęczniony nośnik polimerowy, całość mieszano przez 25 min, po czym nośnik polimerowy odsączono i przemyto trzykrotnie rozpuszczalnikami w kolejności DMF, DMF-DCM (1 : 1, v/v), DCM (po 1 min). Po tym etapie wykonano test na obecność grup aminowych. W tym celu pobierano 1 mg nośnika polimerowego za pomocą szklanej kapilary do naczynka i umieszczano roztwór do testu chloranilowego (2% roztworu acetaldehydu, 2% roztworu p-chloranilu w DMF (1 : 2, v/v)), po 5 min w temperaturze pokojowej dokonywano odczytu. Niebiesko-zielone/czerwone zabarwienie ziaren nośnika polimerowego świadczyło o odblokowaniu grup aminowych. Test powtarzano każdorazowo przy etapie deprotekcji i sprzęgania, oceniając barwę ziaren. Następnie powtarzano przemywanie nośnika polimerowego rozpuszczalnikami w odwrotnej kolejności (trzykrotnie po 1 min) przed przystąpieniem do drugiego etapu.

II etap - W osobnym naczynku przygotowano: 0,492 g (1,05 mmola) (0,246 g (0,52 mmola)) Fmoc-Lys(Boc)-OH (MW = 468,54 g/mol) oraz 0,142 g (1,05 mmola) (0,071 g (0,52 mmola)) HOBt (monohydrat, MW = 135,12 g/mol) rozpuszczone w 3 ml DMF. Mieszaninę reakcyjną umieszczono w naczynku reakcyjnym, dodając 162,6 μl (1,05 mmola) (81,3 μl (0,52 mmola)) DIPCI (MW = 126,20 g/mol, q²⁰°^c = 0,815 g/ml). Reakcję prowadzono w temperaturze 25 ±2°C przez 3 h, z jednoczesnym wytrząsaniem naczynka reakcyjnego na wytrząsarce laboratoryjnej. Po upływie tego czasu nośnik odsączono i przemyto trzykrotnie rozpuszczalnikami w kolejności: DMF, DMF-DCM (1 : 1, v/v), DCM. Kolejnym etapem syntezy było zabezpieczenie nieprzereagowanych grup aminowych obecnych na nośniku polimerowym. W tym celu przygotowano w osobnym naczynku mieszaninę, zawierającą 560,1 μl (5,92 mmola) bezwodnika octowego (Ac2O, MW = 102,1 g/mol, q²⁰°^c = 1,08 g/ml) i 318,8 μl (3,95 mmola) pirydyny (MW = 79,1 g/mol, q²⁰°^c = 0,98 g/ml), za każdym razem przygotowując świeży roztwór bezpośrednio przed wprowadzeniem do naczynka reakcyjnego (czas 5 min). Po wprowadzeniu mieszaniny do naczynka z uprzednio osadzonym na nośniku polimerowym Fmoc-aminokwasem (Fmoc-AK), całość wytrząsano w temperaturze pokojowej przez okres 30 minut, po czym nośnik odsączano i przemywano trzykrotnie serią rozpuszczalników: DMF, DMF-DCM (1 : 1, v/v), DCM, na koniec traktując eterem dietylowym. Nośnik z osadzonym aminokwasem poddano suszeniu w eksykatorze próżniowym do 48 godzin. Stopień osadzenia na nośniku polimerowym aminokwasu wyznaczono na podstawie przyrostu masy (wysuszony nośnik polimerowy zważono) i metodą spektrofotometryczną, polegającą na pomiarze absorbancji roztworu, zawierającego uwolniony chromofor w postaci adduktu piperydyna-dibenzofulwen przy długości fali 290 nm. W tym celu, odważono 2 mg (1,5 μmol w przeliczeniu na osłonę Fmoc) wysuszonego nośnika polimerowego z osadzonym pierwszym Fmoc-aminokwasem (Fmoc-AK) do 2 kuwet spektrofotometrycznych; wprowadzono 3 ml 25% roztworu piperydyny w DMF i mieszano za pomocą pipety Pasteura przez 5:10 minut. Kuwetę z badaną próbką i odnośnikiem, zawierającym 25% roztwór piperydyny w DMF umieszczono w spektrofotometrze. Osadzenie [mmol/g] wyliczono jako średnią z pomiarów. Wartości wahały się w zakresie 0,345:0,790. Do obliczeń metodą spektrofotometryczną zastosowano wzór L Fmoc-AK = Apróbki/(1,75^my[mg]).

Wysuszony nośnik polimerowy poddawano spęcznianiu poprzez umieszczenie go w rozpuszczalniku (DMF) i wytrząsano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po tym czasie przystępowano do wydłużania łańcucha peptydowego, w pierwszej kolejności dokonując deprotekcji grupy α-aminowej i usuwając ugrupowanie Fmoc, poprzez dodanie do naczynka reakcyjnego 25% roztworu piperydyny w DMF (10 ml) i wytrząsanie w temperaturze pokojowej kolejno 1 x 5 min, następnie 1 x 15 min. Po tym czasie nośnik polimerowy przemywano rozpuszczalnikami trzykrotnie po 1 min w kolejności: DMF, DCM-DMF (1 : 1, v/v), DCM. Pozytywny wynik testu chloranilowego (zabarwienie ziaren nośnika polimerowego) po etapie deprotekcji każdorazowo pozwalał na przemycie ziaren nośnika rozpuszczalnikami w odwrotnej kolejności i przejście do etapu acylowania. W naczyniu o pojemności 20 ml rozpuszczano odpowiednio (w przeliczeniu na 1 g stosowanego nośnika polimerowego): Fmoc-AK-OH i 0,267 g (1,975 mmola) (0,116 g (0,863 mmola)) HOBt (monohydrat, MW = 135,12 g/mol) w 9 ml mieszaniny rozpuszczalników NMP-DMF-DCM (1 : 1 : 1, v/v/v) a następnie dodawano 305,8 μl (1,975 mmola) (133,6 μl (0,863 mmola)) DIPCI (MW = 126,20 g/mol, p²⁰°^C = 0,815 g/ml), całość wytrząsano w naczynku reakcyjnym na wytrząsarce laboratoryjnej w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3,5 h. Reakcję sprzęgania z udziałem pochodnych Fmoc-Pro-OH i Fmoc-Gly-OH prowadzono w temperaturze 18 ±2°C przez okres 3,5 h. Etapy odpowiednio deprotekcji i sprzęgania powtarzano do uzyskania zaplanowanej sekwencji aminokwasowej. Po reakcji sprzęgania za każdym razem przeprowadzano test chloranilowy (oczekiwano negatywnego wyniku testu (bezbarwne ziarenka nośnika polimerowego), świadczącego o przyłączeniu Fmoc-AK-OH). Dokładne ilości wykorzystywanych pochodnych aminokwasowych wynosiły: 0,698 g (1,975 mmola) (0,305 g (0,863 mmola) Fmoc-Hyp-OH (MW = 353,37 g/mol), 0,666 g (1,975 mmola) (0,291 g (0,863 mmola)) Fmoc-Pro-OH (MW = 337,37 g/mol), 0,587 g (1,975 mmola) (0,256 g (0,863 mmola)) Fmoc-Gly-OH (MW = 297,31 g/mol).

b) Otrzymywanie koniugatu N^a-Lauroilo-Gly-Pro-Hyp-Lys(Boc) na nośniku aminometylo- polistyrenowym

Fragment Gly-Pro-Hyp-Lys(Boc) osadzony na nośniku aminometylopolistyrenowym poddawano modyfikacji z udziałem kwasu tłuszczowego. Kolejne etapy obejmowały:

etap I - dodanie do naczynka reakcyjnego 25% roztworu piperydyny w DMF (10 ml), wytrząsanie w temperaturze pokojowej kolejno 1 x 5 min, następnie 1 x 15 min; etap II - w naczynkach przygotowywano (w przeliczeniu na 1 g nośnika polimerowego): 0,395 g (1,975 mmola) (0,173 g (0,863 mmola)) kwasu laurynowego (MW = 200,32 g/mol, o czystości 99,0% (firmy Brenntag)) rozpuszczonego w 8 ml DMF z dodatkiem 1% NSP (o czystości 99% firmy Sigma Aldrich) oraz 0,267 g (1,975 mmola) (0,116 g (0,863 mmola)) HOBt (monohydrat, MW = 135,12 g/mol) i 0,634 g (1,975mmola) (0,277 g (0,863 mmola)) TBTU (MW = 321,09 g/mol) rozpuszczonych w 7 ml DMF oraz odmierzono 688,1 μl (3,950 mmola) (300,5 pl (1,725 mmola)) DIPEA (MW = 129,25 g/mol, e²⁵°^C=0,742g/ml). Do naczynka z peptydylonośnikem wprowadzono przygotowane roztwory a następnie wytrząsano 3,5 godzin. Każdorazowo po etapach przeprowadzono przemywanie peptydylonośnika rozpuszczalnikami trzykrotnie po 1 min w kolejności: DMF, DCM-DMF (1 : 1, v/v), DCM; przeprowadzając test chloranilowy i w odwrotnej kolejności przed etapem sprzęgania (etap II).

c) Otrzymywanie N^a-Lauroilo-Gly-Pro-Hyp-Lys-NH2

N“-lauroilopeptyd otrzymany na nośniku polimerowym według powyższej procedury przenoszono na lejek filtracyjny ze spiekiem i przemywano dwukrotnie DCM oraz eterem dietylowym, po czym suszono w eksykatorze próżniowym nad środkiem suszącym. Następnie przystępowano do odszczepienia produktu od nośnika polimerowego. W tym celu wysuszony peptydylonośnik (0,5 g) umieszczano w kolbie kulistej o pojemności 50 ml, zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne i poddawano działaniu 20 ml mieszaniny TFA-PhOH-iPr3SiH-H2O (88 : 5,8 : 2 : 4,2, v/v/v/v) prowadząc reakcję w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3 h w atmosferze azotu. Nośnik polimerowy odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem na lejku filtracyjnym ze spiekiem, przemywano dwukrotnie niewielką ilością użytej mieszaniny TFA. Przesącz odparowano do sucha na wyparce rotacyjnej, a pozostałość rozpuszczono w 10% kwasie octowym i przemywano trzykrotnie eterem dietylowym. Warstwę organiczną odrzucano a wodną zamrażano i liofilizowano.

Otrzymano 220,5 mg surowego koniugatu. Zsyntezowany lipopeptydowy koniugat oczyszczano, wprowadzając na kolumienkę wypełnioną żelem krzemionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi (SilicaGel C18, firmy Macherey-Nagel, objętość kolumny/wielkość złoża 15 ml / 2000 mg). Wymywanie analitów prowadzono w gradiencie rozpuszczalników o wzrastającym udziale (8 ml) rozpuszczalnika B w zakresie 0:30% B w A (0,1% TFA w wodzie (A), 80% acetonitrylu w wodzie z dodatkiem 0,1% TFA (B). Analizy produktu dokonano w oparciu o TLC, HPLC. Oczyszczony związek poddawano liofilizacji i przechowywano w eksykatorze próżniowym nad środkiem suszącym. Po oczyszczeniu uzyskano 152,1 mg (wydajność 69,0%) bladożółtego produktu o czystości >98% (RP-HPLC). Trifluorooctanową sól koniugatu o wzorze cząsteczkowym C30H54N6O6+nCF3COOH+H2O scharakteryzowano za pomocą MS, RP-HPLC. MALDI-TOF-MS; obliczone [M+H]+, [M+Na]⁺, [M+K]⁺: 595,8, 617,8; 633,8, znalezione 595,6; 617,5; 633,3, Rf = 0,53 (n-BuOH-AcOH-H2O; 4 : 1 : 2, v/v/v). Analiza LC-MS, Rt = 16,36 [min] (gradient liniowy w zakresie 0:80% rozpuszczaknika B w A, 30 min (0,1% HCOOH w H2O (A), 0,1% HCOOH w acetonitrylu (B); przepływ: 0,8 ml/min, detekcja UV przy długości fali 224:228 nm lub 203:207 nm, detekcja ESI-MS, kolumna: Eclipse XDB-C8 4,6 x 150 mm (5 μm), temperatura kolumny: 25°C). Przykład 2 Otrzymywanie lipopeptydowego koniugatu N“-lauroilo-Gly-Hyp-Hyp-Lys-NH2

a)

Otrzymanie sekwencji aminokwasowej Gly-Hyp-Hyp-Lys(Boc) na nośniku aminomety lopolistyrenowym

W warunkach opisanych jak na przykładzie 1 a) przygotowano osadzony na nośniku polimerowym Fmoc-Lys(Boc)-OH i przystępowano do wydłużania łańcucha peptydowego w kolejnych etapach deprotekcji i acylowania. Stopień osadzenia na nośniku polimerowym aminokwasu: 0,345:0,790 mmol/g.

Do etapu acylowania każdorazowo przygotowywano w naczyniu o pojemności 20 ml (w przeliczeniu na 1 g stosowanego nośnika polimerowego): Fmoc-AK-OH i 0,267 g (1,975 mmola) (0,116 g (0,863 mmola)) HOBt (monohydrat, MW = 135,12 g/mol) w 9 ml mieszaniny rozpuszczalników NMP-DMF-DCM (1 : 1 : 1, v/v/v) a następnie dodawano 305,8 μl (1,975 mmola) (133,6 μl (0,863 mmola)) DIPCI (MW = 126,20 g/mol, p²⁰°^C=0,815 g/ml). Dokładne ilości wykorzystywanych pochodnych aminokwasowych wynosiły: 0,698 g (1,975 mmola) (0,305 g (0,863 mmola) Fmoc-Hyp-OH (MW = 353,37 g/mol), (MW = 353,37 g/mol),

0,698 g (1,975 mmola) (0,305 g (0,863 mmola)

0,587 g (1,975 mmola) (0,256 g (0,863 mmola))

Fmoc-Hyp-OH Fmoc-Gly-OH (MW = 297,31 g/mol). Całość reagentów umieszczano za każdym razem w naczynku reakcyjnym i wytrząsano na wytrząsarce laboratoryjnej w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3,5 h. Reakcję sprzęgania z udziałem pochodnych Fmoc-Hyp-OH i Fmoc-Gly-OH prowadzono w temperaturze 18 ±2°C przez 3,5 h.

b)

Otrzymywanie koniugatu N^a-Lauroilo-Gly-Hyp-Hyp-Lys(Boc) na nośniku aminometylo polistyrenowym

Fragment Gly-Hyp-Hyp-Lys(Boc) osadzony na nośniku polimerowym używany do otrzymania koniugatów według procedury na przykładzie 5 (osadzenie: 0,345 mmol/g) poddano deprotekcji i wykorzystywano z pominięciem etapu modyfikacji pochodną lipidową). Modyfikacje z udziałem kwasu tłuszczowego prowadzono jak na przykładzie 1 b; I etap - z użyciem 25% roztworu piperdyny, wytrząsanie naczynka reakcyjnego w temperaturze pokojowej kolejno 5 min, następnie 15 min); II etap: reakcja acylowania z udziałem (w przeliczeniu na 1 g stosowanego nośnika polimerowego): 0,395 g (1,975 mmola) (0,173 g (0,863 mmola)) kwasu laurynowego (MW = 200,32 g/mol, o czystości 99,0% (firmy Brenntag)) rozpuszczonego w 8 ml DMF z dodatkiem 1% NSP (o czystości 99% firmy Sigma Aldrich) oraz 0,267 g (1,975 mmola) (0,116 g (0,863 mmola)) HOBt (monohydrat, MW = 135,12 g/mol) i 0,634 g (1,975 mmola) (0,277g (0,863 mmola)) TBTU (MW = 321,09 g/mol) rozpuszczonego w 7 ml DMF w obecności 688,1 pl (3,950 mmola) (300,5 pl (1,725 mmola)) DIPEA (MW = 129,25 g/mol, q25°c = 0,742 g/ml), prowadzona w naczynku reakcyjnym w temperaturze 25 ±2°C przez 3,5 h.

c) Otrzymywanie N^a-Lauroilo-Gly-Hyp-Hyp-Lys-NH2

Etap suszenia i odszczepiania prowadzono analogicznie jak opisano na przykładzie 1c. Wysuszony peptydylonośnik (0,5 g) umieszczano w kolbie kulistej o pojemności 50 ml, zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne i poddawano działaniu 20 ml mieszaniny TFA-PhOH-iPr3SiH-H2O (88 : 5,8 : 2 : 4,2, v/v/v/v) prowadząc reakcję w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3 h w atmosferze azotu.

Otrzymano 226,5 mg surowego koniugatu. Zsyntezowany lipopeptydowy koniugat oczyszczano, wprowadzając na kolumienkę wypełnioną żelem krzemionkowym modyfikowanym grup ami oktadecylowymi (SilicaGel C18, firmy Macherey-Nagel, objętość kolumny/wielkość złoża 15 ml / 2000 mg). Wymywanie analitów prowadzono w gradiencie rozpuszczalników o wzrastającym udziale (8 ml) rozpuszczalnika B w zakresie 0-30% B w A (0,1% TFA w wodzie (A), 80% acetonitrylu w wodzie z dodatkiem 0,1% TFA (B). Analizy produktu dokonano w oparciu o TLC, HPLC. Oczyszczony związek poddawano liofilizacji i przechowywano w eksykatorze próżniowym nad środkiem suszącym. Po oczyszczeniu uzyskano 133,6 mg (wydajność 59,0%) bladożółtego produktu o czystości >97% (RP-HPLC). Trifluorooctanową sól koniugatu o wzorze cząsteczkowym C30H54N6O7+nCFsCOOH+H2O scharakteryzowano za pomocą MS, RP-HPLC. MALDI-TOF-MS; obliczone [M+H]⁺, [M+Na]⁺, [M+K]⁺: 611,8; 633,8; 649,8, znalezione 611,2; 633,2; 649,9, Rf = 0,50 (n-BuOH-AcOH-H2O; 4 : 1 : 2, v/v/v). Analiza LC-MS, Rt = 16,30 [min] (gradient liniowy w zakresie 0:80% rozpuszczalnika B w A, 30 min (0,1% HCOOH w H2O (A), 0,1% HCOOH w acetonitrylu (B); przepływ: 0,8 ml/min, detekcja UV przy długości fali 224:228 nm lub 203:207 nm, detekcja ESI-MS, kolumna: Eclipse XDB-C8 4,6 x 150 mm (5 pm), temperatura kolumny: 25°C).

Przykład 3

Otrzymywanie lipopeptydowego koniugatu N“-lauroilo-Gly-Pro-Hyp-Lys-OH (lipo-fragment A)

a) Otrzymanie sekwencji aminokwasowej Gly-Pro-Hyp-Lys(Boc) na nośniku 2-chloro- tritylowym

Sekwencję aminokwasową Gly-Pro-Hyp-Lys(Boc) osadzoną na nośniku 2-chlorotritylowym (o pojemności: 1,00:1,60 g/mmoli wielkości cząstek: 100:200 μm, Novabiochem) otrzymano, używając 1,181 g (2,52 mmola) (0,591 g (1,26 mmola)) pochodnej aminokwasowej Fmoc-Lys(Boc)-OH (MW = 468,54 g/mol), którą rozpuszczono w 10 ml mieszaniny DCM-DMF (9 : 1, v/v), a następnie wprowadzono do naczynka reakcyjnego, zawierającego spęczniony nośnik polimerowy (1g / 15 ml DCM, minimum 0,5 h, temperatura pokojowa). Następnie do naczynka reakcyjnego dodano 878,1 μl (5,041 mmola) (439,1 pi 2,52 mmola)) DIPEA (MW = 129,25 g/mol, e²⁵°^C = 0,742 g/ml) i całość wytrząsano przez 120 minut. Po tym czasie przystępowano do etapu zamknięcia nieprzereagowanych karbokationów obecnych na nośniku polimerowym poprzez kowalencyjne przyłączenie cząsteczki metanolu. W tym celu przepłukiwano nośnik trzykrotnie 10 ml świeżo przygotowanej mieszaniny DCM-MeOH-DIPEA (17 : 2 : 1, v/v/v) oraz kolejno trzykrotnie DCM, dwukrotnie DMF i kolejno dwukrotnie DCM. Nośnik polimerowy z osadzonym aminokwasem przeniesiono na lejek filtracyjny ze spiekiem i suszono w eksykatorze próżniowym nad KOH, po czym wyznaczono osadzenie nośnika polimerowego równe: 0,655:1,245 mmol/g. Następnie zakotwiczony nośnik polimerowy przygotowano do reakcji sprzęgania z odpowiednim Fmoc-AK-OH, które odbywało się dwuetapowo.

I etap - 10 ml 25% roztworu piperydyny w DMF wprowadzono do naczynka reakcyjnego, zawierającego spęczniony nośnik polimerowy. Całość mieszano przez 25 min, po czym nośnik polimerowy odsączono, przemywano rozpuszczalnikami w kolejności trzykrotnie DMF, trzykrotnie DMF-DCM (1 : 1, v/v), trzykrotnie DCM (po 1 min), wykonano test chloranilowy i powtórzono przemywanie nośnika rozpuszczalnikami w odwrotnej kolejności (trzykrotnie po 1 min). W osobnym naczynku (II etap) przygotowywano pochodne aminokwasowe (Fmoc-AK-OH), 0,420 g (3,113 mmola) (0,221 g (1,638 mmola)) HOBt (monohydrat, MW = 135,12 g/mol) rozpuszczone w 9 ml NMP-DMF-DCM (1 : 1 : 1, v/v/v). Ilości kolejno przyłączanych pochodnych aminokwasowych wynoszą: 1,099 g (3,113 mmola) (0,579 g (1,638 mmola) Fmoc-Hyp-OH (MW = 353,37 g/mol), 1,050 g (3,113 mmola) (0,552 g (1,638 mmola)) Fmoc-Pro-OH (MW = 337,37 g/mol), 0,925 g (3,113 mmola) (0,487 g (1,638 mmola)) Fmoc-Gly-OH (MW = 297,31 g/mol). Mieszaninę reakcyjną wraz 481,9 μl (3,113 mmola) (253,6 μl (1,638 mmola)) DIPCI (MW = 126,20 g/mol, p²⁰°^C =0,815 g/ml) umieszczano w naczynku reakcyjnym i wytrząsano na wytrząsarce laboratoryjnej w temperaturze 25 ±2°C przez 3,5 h. Reakcję sprzęgania z udziałem pochodnych aminokwasowych: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH prowadzono w temperaturze 18 ±2°C przez okres 3,5 h. Po każdorazowym etapie sprzęgania przeprowadzano test chloranilowy, płucząc peptydylonośnik rozpuszczalnikami jak opisywano poprzednio (sumarycznie 3 przemywania trzykrotnie po 1 min).

b) Otrzymywanie koniugatu N^a-Lauroilo -Gly-Pro-Hyp-Lys(Boc) na nośniku 2-chlorotritylowym

Fragment Gly-Hyp-Hyp-Lys(Boc) osadzony na nośniku 2-chlorotritylowym poddawano modyfikacji z udziałem kwasu tłuszczowego. Etapy, tj. I - deprotekcji i II - reakcje acylowania prowadzono analogicznie jak w przypadku procedury stosowanej na nośniku aminometylopolistyrenowym. Do reakcji acylowania używano: 0,623 g (3,113 mmola) (0,328 g (1,638 mmola)) kwasu laurynowego (MW = 200,32 g/mol, o czystości 99,0% (firmy Brenntag)), 0,421 g (3,113 mmola) (0,221 g (1,638 mmola)) HOBt (monohydrat, MW = 135,12 g/mol), 0,999 g (3,113 mmola) (0,526 g (1,638 mmola)) TBTU (MW = 321,09 g/mol), 1084,3 pi (6,225 mmola) (570,5 pi (3,275 mmola)) DIPEA (MW = 129,25 g/mol, g²⁵°^C =0,742 g/ml).

c) Otrzymywanie N^a-Lauroilo-Gly-Pro-Hyp-Lys-OH

N“-lauroilopeptyd otrzymany na nośniku 2-chlorotritylowym według powyższej procedury przenoszono na lejek filtracyjny ze spiekiem, przemywano dwukrotnie DCM, eterem dietylowym i suszono w eksykatorze próżniowym nad środkiem suszącym. Odszczepienie produktu od nośnika polimerowego następowało dwuetapowo. I etap: wysuszony peptydylonośnik (0,5 g) umieszczano w kolbie kulistej o pojemności 50 ml zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne i poddawano działaniu 20 ml mieszaniny DCM-TFA-iPraSiH (90 : 5 : 5, v/v/v). Reakcję prowadzono w temperaturze 25 ±2°C przez 30 minut, w atmosferze azotu, po czym nośnik polimerowy odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem na lejku filtracyjnym ze spiekiem, przemywano dwukrotnie niewielką ilością użytej mieszaniny TFA a przesącz odparowywano. II etap: gotowy produkt traktowano 20 ml mieszaniny TFA-DCM (9 : 1, v/v) w temperaturze 5°C przez 30 minut, monitorując przebieg reakcji za pomocą TLC. Mieszaninę reakcyjną odparowywano do sucha na wyparce rotacyjnej, pozostałość trzykrotnie traktowano schłodzonym eterem dietylowym. Rozpuszczalnik każdorazowo dekantowano, zalewając produkt świeżą porcją rozpuszczalnika. Powstały produkt oddzielono i poddawano liofilizacji. Otrzymano 355,5 mg surowego koniugatu. Zsyntezowany lipopeptydowy koniugat oczyszczano, wprowadzając w ilości 250 mg / 5 ml wody na kolumienkę wypełnioną żelem krzemionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi (SilicaGel C18, firmy Macherey-Nagel, objętość kolumny/wielkość złoża 15 ml / 2000 mg). Wymywanie analitów prowadzono w gradiencie rozpuszczalników o wzrastającym udziale (8 ml) rozpuszczalnika B w zakresie C: 30% B w A (0,1% TFA w wodzie (A), 80% acetonitryl w wodzie z dodatkiem 0,1% TFA (B). Analizy produktu dokonano w oparciu o TLC, HPLC. Oczyszczony związek poddawano liofilizacji i przechowywano w eksykatorze próżniowym nad środkiem suszącym. Po oczyszczeniu uzyskano 259,6 mg (wydajność 73,0%) bladożółtego produktu o czystości >97% (RP-HPLC). Trifluorooctanową sól koniugatu o wzorze cząsteczkowym C3₀H₅3N₅O7+nCF3COOH+H2O scharakteryzowano za pomocą MS, RP-HPLC. MALDI-TOF-MS; obliczone [M+H]⁺, [M+Na]⁺, [M+K]⁺: 596,8, 618,8; 634,8, znalezione 596,2; 618,5; 634,7, Rf = 0,47 (n-BuOH-AcOH-H2O 4 : 1 : 2, v/v/v). Analiza LC-MS, Rt = 15,40 [min] (gradient liniowy w zakresie 0:80% rozpuszczalnika B w A, 30 min (0,1% HCOOH w H2O (A), 0,1% HCOOH w acetonitrylu (B); przepływ: 0,8 ml/min, detekcja UV przy długości fali 224:228 nm lub 203:207 nm, detekcja ESI-MS, kolumna: Eclipse XDB-C8 4,6 x 150 mm (5 μm), temperatura kolumny: 25°C).

Przykład 4

Otrzymywanie lipopeptydowego koniugatu N“-lauroilo-Gly-Pro-Lys-OH (lipo-fragment A)

a) Otrzymanie sekwencji aminokwasowej Gly-Pro-Lys(Boc) na nośniku 2-chlorotritylowym

W warunkach opisanych jak na przykładzie 3a) przygotowano osadzony na nośniku polimerowym Fmoc-Lys(Boc)-OH i przystępowano do wydłużania łańcucha peptydowego. Stopień osadzenia na nośniku polimerowym aminokwasu wynosił: 0,655:1,245 mmol/g.

Do etapu acylowania każdorazowo przygotowywano w naczyniu o pojemności 20 ml: Fmoc-AK-OH i 0,420 g (3,113 mmola) (0,221 g (1,638 mmola)) HOBt (monohydrat, MW = 135,12 g/mol) rozpuszczone w 9 ml NMP-DMF-DCM (1 : 1 : 1, v/v/v) a następnie 481,9 pl (3,113 mmola) (253^l (1,638 mmola)) DIPCI (MW = 126,20 g/mol, q²⁰°^c= 0,815 g/ml). Dokładne ilości wykorzystywanych pochodnych aminokwasowych: 1,050 g (3,113 mmola) (0,552 g (1,638 mmola)) Fmoc-Pro-OH (MW = 337,37 g/mol), 0,925 g (3,113 mmola) (0,487 g (1,638 mmola)) Fmoc-Gly-OH (MW = 297,31 g/mol). Całość reagentów umieszczano za każdym razem w naczynku reakcyjnym i wytrząsano na wytrząsarce laboratoryjnej w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3,5 h.

b) Otrzymywanie koniugatu N^a-Lauroilo-Gly-Pro-Lys(Boc) na nośniku 2-chlorotritylowym

Fragment Gly-Hyp-Hyp-Lys(Boc) osadzony na nośniku 2-chlorotritylowym (osadzenie 0,655:1,245 mmol/g) poddano modyfikacji pochodną lipidową. Reakcję acylowania z użyciem kwasu tłuszczowego prowadzono analogicznie jak na przykładzie 3b w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3,5 h. Ilości użytych odczynników do reakcji acylowania wynoszą: 0,623 g (3,113 mmola) (0,328 g (1,638 mmola)) kwasu laurynowego (MW = 200,32 g/mol, o czystości 99,0% (firmy Brenntag)), 0,421 g (3,113 mmola) (0,221 g (1,638 mmola)) HOBt (monohydrat, MW = 135,12 g/mol), 0,999 g (3,113 mmola) (0,526 g (1,638 mmola)) TBTU (MW = 321,09 g/mol), 1084,3 pi (6,225 mmola) (570,5 pi (3,275 mmola)) DIPEA (MW = 129,25 g/mol, g²⁵°^C = 0,742 g/ml).

c) Otrzymywanie N^a-Lauroilo -Pro-Lys-OH

Podczas etapu suszenia i odszczepiania produktu postępowano analogicznie jak opisano na przykładzie 3c. I etap - wysuszony peptydylonośnik (0,5 g) umieszczano w kolbie kulistej o pojemności 20 ml zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne i poddawano działaniu 20 ml mieszaniny DCM-TFA-iPraSiH (90 : 5 : 5, v/v/v), w temperaturze 25 ±2°C przez 30 minut, w atmosferze azotu. Przesącz odparowano do sucha na wyparce rotacyjnej. II etap - produkt traktowano 20 ml mieszaniny TFA-DCM (9 : 1, v/v) w temperaturze 5°C przez 30 minut, po czym mieszaninę reakcyjną odparowywano do sucha a pozostałość trzykrotnie traktowano schłodzonym eterem dietylowym. Produkt oddzielono i poddano liofilizacji.

Otrzymano 285,4 mg surowego koniugatu. Zsyntezowany lipopeptydowy koniugat oczyszczano, wprowadzając w ilości 250 mg / 5 ml wody na kolumienkę wypełnioną żelem krzemionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi (SilicaGel C18, firmy Macherey-Nagel, objętość kolumny/wielkość złoża 15 ml / 2000 mg). Wymywanie analitów prowadzono w gradiencie rozpuszczalników o wzrastającym udziale (8 ml) rozpuszczalnika B w zakresie 0-30% B w A (0,1% TFA w wodzie (A), 80% acetonitrylu w wodzie z dodatkiem 0,1% TFA (B). Analizy produktu dokonano w oparciu o TLC, HPLC. Oczyszczony związek poddawano liofilizacji i przechowywano w eksykatorze próżniowym nad środkiem suszącym. Po oczyszczeniu uzyskano 180,3 mg (wydajność 63,0%) bladożółtego produktu o czystości >96% (RP-HPLC). Trifluorooctanową sól koniugatu o wzorze cząsteczkowym C2₅H46N4O₅+nCF3COOH+H2O scharakteryzowano za pomocą MS, RP-HPLC. MALDI-TOF-MS; obliczone [M+H]⁺, [M+Na]⁺, [M+K]⁺: 483,7; 505,7; 521,7 znalezione 483,3; 505,7; 521,4, Rf = 0,41 (n-BuOH-AcOH-H2O 4 : 1 : 2;v/v/v).

Analiza LC-MS, Rt = 15,48 [min] (gradient liniowy w zakresie 0 = 80% rozpuszczalnika B w A, 30 min (0,1% HCOOH w H2O (A), 0,1% HCOOH w acetonitrylu (B); przepływ: 0,8 ml/min, detekcja UV przy długości fali 224:228 nm lub 203:207 nm, detekcja ESI-MS, kolumna: Eclipse XDB-C8 4,6 x 150 mm (5 μm), temperatura kolumny: 25°C). Przykład 5 Otrzymywanie (polikondensacja jednostek sekwencji aminokwasowych skoniugowanych z pochodną lipidową) N“-lauroilo-Gly-Pro-Hyp-Lys-Gly-Hyp-Hyp-Lys-NH2

I. Otrzymanie Fragmentu B (Gly-Hyp-Hyp-Lys(Boc)-NH2) osadzonego na nośniku aminometylopolistyrenowym

Fragment B-nośnik aminometylopolistyrenowy zsyntezowano stosując nośnik polimerowy osadzony pochodną lizyny (0,345 mmol/g, skala syntezy: 0,345 mmol). Każdorazowo etapy deprotekcji osłony Fmoc prowadzono z udziałem 25% roztworu piperydyny w DMF w temperaturze pokojowej przez 5 min a następnie 15 min. Reakcje sprzęgania prowadzono z wykorzystaniem 2,5-krotnego nadmiaru aktywowanego in situ Fmoc-AK-OH przy użyciu 133,5 μl (0,863 mmola)) DIPCI i 0,116 g (0,863 mmola) HOBt (monohydrat, MW = 135,12 g/mol) w mieszaninie rozpuszczalników NMP-DMF-DCM (1 : 1 : 1, v/v/v) (9 ml). Ilości stosowanych w reakcjach pochodnych aminokwasowych wynosiły odpowiednio: 0,305 g (0,863 mmola) Fmoc-Hyp-OH (MW = 353,37 g/mol), 0,305 g (0,863 mmola) Fmoc-Hyp-OH (MW = 353,37 g/mol), 0,256 g (0,863 mmola) Fmoc-Gly-OH (MW = 297,31 g/mol). W końcowym etapie, Fmoc chroniony łańcuch peptydowy poddano działaniu 25% roztworu piperydyny w DMF w temperaturze pokojowej przez 5 min, 15 min, a następnie nośnik polimerowy przenoszono na lejek filtracyjny ze spiekiem i przemywano dwukrotnie DCM oraz eterem dietylowym i suszono w eksykatorze próżniowym nad środkiem suszącym. Fragment B scharakteryzowano po traktowaniu próbki peptydylonośnika mieszaniną TFA, według opisanej procedury na przykładzie 2c. Produkt Gly-Hyp-Hyp-Lys-NH2 potwierdzono na widmie masowym. MALDI-TOF-MS; obliczone [M+H]⁺, [M+Na]⁺, [M+K]⁺: 429,5; 451,5; 467,5 znalezione 429,2; 451,1; 467,6.

II. Otrzymanie fragmentu N^a-lauroilo-Gly-Pro-Hyp-Lys(Boc)-OH (lipo-fragment A)

Lipo-fragment A otrzymano zgodnie z protokołem, na nośniku 2-chlorotritylowym (osadzenie pierwszego aminokwasu: 0,655 mmol/g, skala syntezy: 1,310 mmol). Etap odszczepiania koniugatu od nośnika polimerowego prowadzono w kolbie kulistej o pojemności 50 ml zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne, traktując peptydylonośnik 20 ml mieszaniny DCM-TFA (95 : 5, v/v). Reakcję prowadzono przez okres 30 minut w atmosferze azotu, po czym nośnik polimerowy odsączono pod zmniejszonym

PL 245202 Β1 ciśnieniem na lejku filtracyjnym ze spiekiem i przemywano dwukrotnie niewielką ilością użytej mieszaniny TFA. Następnie przesącz zagęszczono i traktowano schłodzonym eterem dietylowym. Rozpuszczalnik każdorazowo dekantowano i zalewano świeżą porcją. Powstały chroniony peptyd (lipo-fragment A) oddzielono, rozpuszczono w wodzie, neutralizowano z użyciem 0,01 Μ KOH, a następnie ekstrahowano trzykrotnie z zastosowaniem DCM. Połączone ekstrakty organiczne suszono i odparowywano. Produkt potwierdzono na podstawie widm masowych. MALDI-TOF obliczone [M+H]⁺; [M+Na]⁺; [M+K]⁺: 696,9; 718,9; 734,9, znalezione 696,3; 718,2; 734,7. Produkt o wystarczającej czystości (>95%), nie wymagał dodatkowego oczyszczania.

III. Kondensacja lipo-fragmentu A i fragmentu B do otrzymania koniugatu N-lauroilo-G\y-Pro-Hyp-Lys-Gly-Hyp-Hyp-Lys-NH2

Rozpuszczono 0,481 g (0,692 mmola) lipo-fragmentu A w 8 ml DMF, dodano 0,444 g (1,384 mmola) TBTU (MW = 321,09 g/mol) i 0,187 g (1,384 mmola) HOBt monohydrat, MW = 135,12 g/mol) w 10 ml DMF. Do mieszaniny dodano 482,2 pl (2,768 mmola) DIPEA (MW = 129,25 g/mol, q^{25 C}= 0,742 g/ml). Całość przenoszono do naczynka reakcyjnego zawierającego 0,5 g peptydylonośnika (Fragmentu B) z wolną grupą α-aminową (skala: 0,173 mmol) i wytrząsano w temperaturze 25 ±2°C przez okres 2,545 h. Reakcję kondensacji powtarzano. Całkowitość reakcji kondensacji określano z użyciem testu chloranilowego. Po tym czasie nośnik polimerowy odsączono, przepłukiwano kolejno DMF, DCM, eterem dietylowym, suszono w eksykatorze próżniowym, przystępując do etapu odszczepiania lipopeptydowego koniugatu od nośnika polimerowego. Uwolnienie lipopeptydowego koniugatu następowało po traktowaniu stężonym TFA.

Wysuszony peptydylonośnik umieszczano w tym celu w kolbie kulistej o pojemności 50 ml, zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne, po czym zalewano 20 ml mieszaniny TFA-PhOH-iPrsSiH-łW (88:5,8:2:4,2, v/v/v/v).

Reakcję prowadzono w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3 h w atmosferze azotu. Po tym czasie nośnik polimerowy odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem na lejku filtracyjnym ze spiekiem oraz przemywano dwukrotnie niewielką ilością użytej mieszaniny TFA. Przesącz odparowywano do sucha, a pozostałość rozpuszczano w 10% kwasie octowymi przemywano trzykrotnie eterem dietylowym. Warstwę organiczną odrzucano a wodną zamrażano, liofilizowano.

Otrzymano 148,5 mg surowego lipopeptydowego koniugatu, który scharakteryzowano za pomocą RP-HPLC, dając główny sygnał (Kolumna: Eclipse XDB-C8 4,6 x 150 mm (5 pm), tR = 16,56, gradient liniowy w zakresie 0480% rozpuszczaknika B w A, 30 min (0,1% HCOOH w H2O (A), 0,1% HCOOH w acetonitrylu (B); przepływ: 0,8 ml/min, detekcja UV przy długości fali 2244228 nm lub 2034207 nm, detekcja ESI-MS) i MALDI-TOF-MS obliczone [M+H]⁺: 1007,2, znalezione 1007,5. Produkt oczyszczano za pomocą RP-SPE ((SilicaGel C18, firmy Macherey-Nagel, objętość kolumny/wielkość złoża 15 ml / 2000 mg) w gradiencie rozpuszczalników o wzrastającym udziale (8 ml) rozpuszczalnika B w zakresie 0^-50% B w A (0,1% TFA w wodzie (A), 100% acetonitryl z 0,1% TFA (B)). Oczyszczony związek poddawano liofilizacji i przechowywano w eksykatorze próżniowym nad środkiem suszącym. Po oczyszczeniu uzyskano 111,4 mg (wydajność 75,0%) bladożółtego produktu o czystości >95% (RP-HPLC). Przykład 6 Optymalizacja warunków reakcji w uzyskiwaniu lipopeptydowych koniugatów bogatych w reszty hydroksyproliny

a) optymalizacja warunków reakcji kondensacji pomiędzy wolną grupą α-aminową reszty aminokwasowej w sekwencji peptydu zawierającego resztę Hyp osadzonego na nośniku aminometylopolistyrenowym a grupą karboksylową kolejno wprowadzanej Fmoc chronionej reszty AK.

Tabela 2

Metoda 1	Warunki reakcji	Wydajność
Odczynnik kondensujący DIPCI/HOBt	Użyty rozpuszczalnik NMP/CH_?CI_?/DMF (l:l:l,v/v/v)	Stosunek molowy użytych reagentów FmocAKOH/DIPCI/HOBt (2:2:2)	1 Temperatura \| rq i 18 1	Czas [h] 34-6
2	DIPCI/HOBt	DMF/DCM (1:1, v/v)	Fmoc-AK-OH/DIPCI/HOBt (1:1:1)	! 25 1	448	46450 1

'Wydajność lipopeptydowego koniugatu po oczyszczeniu

PL 245202 Β1

b) zwiększanie skali syntezy do otrzymywania lipopeptydowych koniugatów

Protokół otrzymywania lipopeptydowych koniugatów został zaadoptowany do stopniowego zwiększania skali syntezy celem otrzymania lipopeptydowych koniugatów do badań biologicznych. Zoptymalizowane warunki pozwoliły na efektywność skalowania procesu wytwarzania lipopeptydowych koniugatów o wysokim profilu bezpieczeństwa. Powtarzalność procesu otrzymywania lipopeptydowych koniugatów i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli (n=3) uzyskiwano zwiększając skalę (od 0,395 mmola do 1,185 mmola) - Tabela 3.

Efektywność skalowania procesu wytwarzania według wynalazku została potwierdzona na podstawie parametrów granicznych wartości wyznaczonej wydajności otrzymywanych lipopeptydowych koniugatów 59% ±10% oraz uzyskanego stopnia czystości >97% ±3%.

Tabela 3

Skala procesu [mmol]	Pojemność naczynka reakcyjnego [ml]	Nośnik aminometylo polistyrenowy fe]	Wydajność otrzymanego produktu (%]¹	Stopień czystości P4]
0,395	firl4	0,5	59	99^z
0,790	Ζ5Ϊ5Ο	1,0	65	97^z
1,185	5CH-1OO		GO	95^z

'Wydajność po oczyszczeniu, ³ określona na podstawie analizy RP-HPLC

Farmaceutycznie dopuszczalne sole lipopeptydowych koniugatów są otrzymywane in situ w czasie końcowej izolacji i oczyszczania lipopeptydowych koniugatów według wynalazku, lub odrębnie przez poddanie reakcji wolnej grupy zasadowej z odpowiednim kwasem organicznym (trifluorooctan, octan) lub kwasem mineralnym (chlorowodorek, bromowodorek, jodowodorek, fluorek).

Przykłady zastosowania

Przykład 7

Określenie zdolności lipopeptydowych koniugatów do inicjowania i modulowania szybkości migracji komórek i zmniejszenia powierzchni ran in vitro

Migrację ludzkich komórek skóry stymulowanych kompozycją farmaceutyczną, zawierającą lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole określono w oparciu o test z użyciem silikonowych insertów Ibidi, pozwalający na obserwację pokrywania się nimi szczeliny (kanału) utworzonej w konfluentnej hodowli (monowarstwie komórek) do uzyskania połączeń międzykomórkowych. W prowadzonych eksperymentach komórki fibroblastów z ludzkiej skóry, keratynocyty linii HaCaT wysiano na 2-dołkową płytkę w ilości 1,5 χ 10⁴ w 70 pl pożywki Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), uzupełnionej 10% surowicy cielęcej (FCS) na dołek i hodowano do uzyskania konfluencji 90^-100% w temperaturze 37°C przez 24 h w atmosferze o składzie 95% powietrza i 5% CO2. Po usunięciu silikonowych insertów Ibidi, wolny obszar (powierzchnię niepokrytą komórkami) przepłukiwano porcją pożywki DMEM, a następnie PBS. Monowarstwę komórek poddawano preinkubacji przez 30 minut w obecności mitomycyny C (8 pg/ml), inhibitora replikacji DNA, proliferacji komórek. Następnie świeżą porcję pożywki DMEM i komórki traktowano kompozycją farmaceutyczną, zawierającą lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól w określonym stężeniu końcowym. Przygotowano również hodowle traktowane kompozycją farmaceutyczną niezawierającą li po peptydowego koniugatu lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, stanowiące hodowle kontrolne. Hodowle komórkowe inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 h w atmosferze o składzie 95% powietrza i 5% CO2. Pożywkę usuwano, przepłukiwano komórki roztworem PBS oraz dodawano 1 ml 1% roztworu PFA i utrwalano komórki przez 30 minut. Po tym czasie komórki ponownie przepłukiwano roztworem PBS i barwiono 0,05% roztworem fioletu krystalicznego przez 20 minut. Wybarwione komórki przepłukiwano 2-krotnie i dodawano do każdego dołka 1 ml wody podwójnie destylowanej. Powierzchnie ran wizualizowano mikroskopowo z użyciem odwróconego mikroskopu Zeiss (stosując 4-krotne powiększenie) i fotografowano. Fotografie, przedstawiające proces migracji komórek fibroblastów z ludzkiej skóry traktowanych kompozycją farmaceutyczną, zawierającą lipopeptydowy koniugat zamieszczono na Figurze 7. Analizę procesu migracji komórek oparto o pomiary powierzchni „rany” pokrywającej się komórkami (z użyciem programu Imaging Software NIS-Elements Basic Research). Wyniki oznaczeń przedstawiono na Figurze 4 w postaci pola powierzchni „rany” uzyskanego po traktowaniu komórek kompozycją farmaceutyczną zawierającą lipopeptydowy koniugat w określonym stężeniu w porównaniu do kontroli K

PL 245202 Β1 (komórek „hodowanych w warunkach fizjologicznych”) z 3 niezależnych cykli eksperymentów. Obserwowano zdolność kompozycji farmaceutycznych, zawierających lipopeptydowe koniugaty do inicjowania i modulowania szybkości migracji komórek. Najsilniejsze działanie lipopeptydowych koniugatów, stymulujące komórki do wzrostu i jednocześnie aktywujące, prowadzące do pokrywania się nimi wolnej przestrzeni miało miejsce w stężeniu 0,01 pg/ml. Całkowita liczba migrujących komórek fibroblastów do wolnego obszaru była znacznie wyższa niż dla zastosowanej kontroli. Obszar „rany” niepokrytej komórkami uległ zmniejszeniu o 10,3+20,7%. Efekt ten był istotny statystycznie. Całkowita migracja komórek fibroblastów z tkanek od pacjentów (charakteryzujących się inną wrażliwością i dużą zmiennością osobniczą) była znacznie wyższa po 24 h. Wzrost stężenia lipopeptydowych koniugatów powodował różnice w szybkości migracji komórek pochodzących od pacjentów. Obserwowano zmniejszenie powierzchni rany po zastosowaniu kompozycji farmaceutycznej zawierającej lipopeptydowy koniugat (przykładowo lipopeptydowy koniugat 1,2) w 10-krotnie wyższym stężeniu. Efekt ten uzależniony był od sekwencji aminokwasowej lipopeptydowego koniugatu. Lipopeptydowy koniugat 3 ułatwiał migrację komórek w niższych stężeniach <0,1 pg/ml. W stężeniu 0,01 pg/ml powodował znaczny napływ komórek pochodzących od pacjentów i zmniejszenie powierzchni rany o 18,29% w porównaniu do kontroli. Tak silnego efektu zależnego od stężenia nie obserwowano po traktowaniu transformowanej populacji ludzkich fibroblastów skórnych kompozycją farmaceutyczną, zawierającą lipopeptydowy koniugat. Pokrywanie się rany komórkami jest w dużej mierze efektem również zwiększonej proliferacji keratynocytów po działaniu kompozycją farmaceutyczną, zawierającą lipopeptydowy koniugat. W przeprowadzonych eksperymentach obserwowano słabszy napływ hodowli komórek keratynocytów preikubowanych z mitomycyną C. W aspekcie przeprowadzonych eksperymentów wzmożona stymulacja procesu proliferacji komórek HaCaT, w który zaangażowane są lipopeptydowe koniugaty jest jednym z ważnych procesów, świadczącym o ich potencjale regeneracyjnym (Tabela 4).

Tabela 4

Powierzchnia rany w warunkach fizjologicznych (kontrola K) została określona jako 100%. Powierzchnie rany po traktowaniu kompozycją farmaceutyczną, zawierającą lipopeptydowe koniugaty przedstawiono w odniesieniu do kontroli K. Aktywność proliferacyjną komórek in vitro w środowisku rany w obecności lipopeptydowych koniugatów zastosowanych w stężeniach 0,01 pg/ml i 0,1 pg/ml przedstawiono jako krotność w odniesieniu do hodowli w pożywce DMEM, nie podlegającej stymulacji (K, kontrola). Aktywność proliferacyjną komórek porównano do hodowli komórek skóry w pożywce DMEM stymulowanych FCS (K+, kontrola pozytywna).

Lipope pirydowy koniugat	Zamknięcie rany
Proliferacja keratynocytów [n-krotność kontroli]¹	Migracja keratynocytów [% kontroli]²
Stężenie [pg/ml]	0,01	0,10	FCS	0,01	0,10
1	1,0810,04	1,08+0,04	1,37+0,12	98,70 (94,10+115,40)	103,27 (96,00+106,30)
2	1,33+0,22	1,42+0,26	1,66+0,30	100,40(96,80+110,00)	106,93 (102,50+114,20)*
3	1,2910,17	1,34+0,11	1,38+0,16	107,40 (100,20+110,90)*	102,21 (98,60+108,00)

Proces proliferacji I migracji keratynocytów określano zgodnie z opisaną procedurą.

¹ Rezultaty zeŁi«iiie w tabeli przedstawiają wziusl prulilerauji kumóiek w IkkJowIi w odniesieniu du kuriLiuli (K}, leprezenLują wartość średnią+SD z 3 niezależnych eksperymentów, * różnice statystyczne w odniesieniu do kontroli /χθ,ϋ·5.

² Rezultaty przedstawiające zdolność migracji komórek keratynocytów prezentują medianę oraz min-max z 2/ł eksperymentów, Tóżnice statystyczne w odniesieniu do kontroli 05.

Przykład 8

Badanie aktywności proliferacyjnej komórek skórnych w obecności lipopeptydowych koniugatów.

Oznaczenie aktywności biologicznej lipopeptydowych koniugatów przeprowadzono, badając zdolność kompozycji farmaceutycznej, zawierającej lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól do inicjowania i stymulacji proliferacji komórek skórnych w teście proliferacji z użyciem soli tetrazolowej (soli sodowej 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-2H-tetrazolo-5-karboksyanilidu) (ΧΤΤ). Oznaczenia dokonano zgodnie z procedurą opisaną przez Baranowska-Rybak i wsp. (2013), Kukowska i wsp. (2016). W tym celu wyizolowane ze skóry ludzkiej pierwotne fibroblasty, transformowana linia fibroblastów BR1N oraz unieśmiertelnione keratynocyty linii HaCaT wysiewano na 96-dołkową płytkę w ilości 5 χ 10³ komórek w 200 pl pożywki DMEM suplementowanej 10% FCS na dołek i hodowano w temperaturze 37°C przez 24 h o składzie 95% powietrza i 5% CO2. Po tym czasie hodowle 2-krotnie przepłukiwano pożywką DMEM, dodawano nową porcję świeżej pożywki DMEM i traktowano następnie kompozycją farmaceutyczną (wodnym roztworem) zawierającą lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól, uzyskując stężenia końcowe 0,001 pg/ml, 0,01 μο/ml, 0,1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml, 25 μg/ml. Płytki inkubowano przez 48 h w temperaturze 37°C w atmosferze o składzie 95% powietrza i 5% CO2. W tych samych warunkach, co hodowle stymulowane kompozycją farmaceutyczną zawierającą lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, równocześnie inkubowano hodowle kontrolne tj. hodowle w pożywce DMEM podlegające stymulacji kompozycji farmaceutycznej niezawierającej lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli określone jako „komórki hodowane w warunkach fizjologicznych, K” oraz hodowle komórek skóry stymulowane FCS (K+, kontrola pozytywna). Liczbę żywych komórek określono po inkubacji z roztworem XTT, na podstawie zmierzonej spektrofotometrycznie (przy długości fali 490 nm, spektrofotometr firmy Perkin Elmer) ilości barwnego formazanu, powstałego dzięki działaniu mitochondrialnej dehydrogenazy bursztynianowej, aktywnej w komórkach o nienaruszonym metabolizmie i łańcuchu oddechowym. Wyniki stanowią średnią z 3 niezależnych cykli doświadczeń, przedstawiają względną liczbę komórek poddawanych działaniu kompozycji farmaceutycznej, zawierającej lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól w określonym stężeniu (Figura 5, Figura 6, Tabela 4). Komórki kontrolne „hodowane w warunkach fizjologicznych” stanowią 100% liczby komórek. Lipopeptydowe koniugaty zapewniają odpowiednie środowisko do wzrostu, namnażania i prawidłowego funkcjonowania ludzkich komórek skórnych. Odpowiedź komórkowa zależna od stężenia osiąga wysoki poziom po traktowaniu ich kompozycją farmaceutyczną, zawierającą lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól w stężeniach: 0,01 μg/ml i 0,1 μg/ml. W badanym zakresie stężeń zaobserwowano silny, zbliżony do działania czynnika mitogennego FCS wzrost aktywności komórek keratynocytów, świadczący o zachodzących intensywnych podziałach komórkowych, prowadzących do uzupełniania nabłonkowej warstwy skóry. Określono znaczną aktywację procesu proliferacji transformowanej populacji ludzkich komórek fibroblastów oraz komórek fibroblastów (z tkanek od pacjentów) w obecności lipopeptydowych koniugatów w szerokim zakresie stężeń.

Przykład 9

Oznaczenie aktywności cytotoksycznej lipopeptydowych koniugatów (ocena bezpieczeństwa)

Aktywność cytotoksyczną lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli badano również na dwóch typach komórek tj. keratynocytów i fibroblastów, z użyciem hodowli unieśmiertelnionej i transformowanej oraz hodowli pierwotnej, równolegle i niezależnie za pomocą dwóch różnych testów przeżywalności. Komórki transformowanej linii fibroblastów BR1N, komórki fibroblastów z ludzkiej skóry oraz keratynocyty linii HaCaT wysiewano na płytkę 96-dołkową w ilości 5 x 103 komórek w 200 μl pożywki DMEM suplementowanej 10% FCS na dołek i hodowano w temperaturze 37°C przez 24 h w atmosferze o składzie 95% powietrza i 5% CO2. Następnie hodowlę 2-krotnie przepłukiwano pożywką DMEM, wymieniono na świeżą porcję pożywki DMEM, zawierającą seryjne rozcieńczenia lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli (w zakresie stężeń od 1000 do 1 μg/ml). W tych samych warunkach inkubowano hodowle kontrolne: kontrolę negatywną stanowiły kultury komórkowe w pożywce DMEM, niezawierającej lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli natomiast kontrolę pozytywną kultury komórkowe traktowane 0,9% roztworem detergentu Tritonu X-100 (stanowiącą 100% śmiertelności). Po inkubacji dokonano oceny toksyczności lipopeptydowych koniugatów oddzielnie i niezależnie za pomocą dwóch testów, poprzez pomiar pośredni na podstawie aktywności wewnątrzkomórkowego enzymu cytozolowego dehydrogenazy mleczanowej (LDH) oraz za pomocą testu określającego spadek żywotności komórek, mierzony spadkiem aktywności mitochondrialnego metabolizmu do redukcji XTT. Uwolnienie enzymu LDH z komórek bezpośrednio do środowiska, świadczące o uszkodzeniu błony plazmatycznej i śmierci komórki, mierzono po usunięciu supernatanta, kolorymetrycznie poprzez inkubację z reagentem, zawierającym chlorek 2[4-jodofenylo]-3-[4-nitrofenylo]-5-fenylotetrazoliowy. Pomiaru absorbancji produktu dokonano za pomocą czytnika mikropłytek przy długości fali 490 nm (spektrofotometr PerkinElmer). W tych warunkach redukcja chlorku tetrazolowego do jego soli formazanu jest proporcjonalna do aktywności LDH. Test XTT przeprowadzono natomiast na komórkach osadzonych w studzienkach, dodając do studzienek roztwór XTT. Po czasie inkubacji, mierzono absorbancję powstałego barwnego produktu przy długości fali 490 nm. Uzyskane wartości absorbancji uśredniono z 3 niezależnych cykli eksperymentów i przeliczono na wartości procentowe śmiertelności komórek. Wartości absorbancji dla komórek ze studzienek kontroli negatywnej przyjęto jako 0%, natomiast dla komórek ze studzienek kontroli pozytywnej za 100%

PL 245202 Β1 śmiertelności. Wyniki uzyskane na podstawie przeprowadzonych testów LDH, ΧΤΤ (Tabela 5) prezentowały wysoki profil bezpieczeństwa lipopeptydowych koniugatów w stosunku do komórek ludzkiej skóry. Udowodniono brak efektu toksycznego wywieranego na komórki w szerokim zakresie stężeń znacznie powyżej działania biologicznego lipopeptydowych koniugatów. Wyniki wskazują, że lipopeptydowe koniugaty wywierają mierzalną aktywność cytotoksyczną w stężeniach rzędu 10 ⁴ M wobec badanych komórek, udokumentowaną za pomocą dwóch testów. Wzrost aktywności LDH w hodowli pierwotnej, komórek fibroblastów linii BR1N i keratynocytów linii HaCaT korelowany ze spadkiem żywotności komórek obserwowany był po zastosowaniu lipopeptydowych koniugatów powyżej stężenia 1,71-10^-4 M (p<0,05 VS. Kontrola). Wyznaczone wartości stężeń, przy których lipopeptydowe koniugaty powodowały 10% spadek żywotności komórek hodowli przedstawione zostały w Tabeli 2. Silniejszy efekt toksyczny wyrażony 50% spadkiem żywotności komórek był obserwowany dla lipopeptydowych koniugatów w stosunku do komórek pierwotnych fibroblastów powyżej stężenia 6,85-10 ⁴ M. Efekt określany dezintegracją membrany (oceniony na podstawie testu redukcji ΧΤΤ) był obserwowany przy niższym stężeniu i poprzedzał uszkodzenie membrany oraz uwolnienie enzymu LDH do środowiska. Wartości EC50 na podstawie testu LDH określono przy stężeniach powyżej 1,13-10^-3 M.

Analiza statystyczna:

Dane uzyskane z pomiarów opracowano statystycznie przy użyciu programu StartsoftStatistica Wer. 8.0 oraz za pomocą arkusza kalkulacyjnego Microsoft Excel 2010. W przeprowadzonych badaniach dla porównania zmiennych zastosowano test parametryczny ANOVA w połączeniu z testem posthoc NIR. W obliczeniach przyjmowano wartości p<0,05 jako znamienne statystycznie.

Tabela 5

Test		Lipopeptydowy koniugat 1	Lipopeptydowy koniugat 2	Lipopeptydowy koniugat 3
	EC [pM]
Linie komórkowe:	EC₁₀		EC₁₀	EC_a:	EC_łQ	ECgj
LDH	Komórki linii HaCaT	537,1+45,3	no	346,9+35,0	no	171,4+78,3	no
Hodowla pierwotna Komórki linii BR1N	890,9+171,9 no	no no¹	409,6±66,9 432,8134,5	1131,7+337,5 no	420,6142,1 no	1682,31420,6 no
MTT	Komórki linii HaCaT	254,1+85,5	no	no	no	210,2+110,4	no
Hodowla pierwotna	722,2+177,2	no¹	431,2+34,7	819,1+163,8	399,7+35,8	685,0+137,5
Komórki linii BR1N	no	no	327,6+40,9	no	>504,7	no

no-nie oznaczono w zakresie stężeń końcowych lipopeptydowych koniugatów¹1+1OOO pg/ml

Przykład 1 0

Oznaczenie aktywności hemolitycznej lipopeptydowych koniugatów (ocena bezpieczeństwa)

Aktywność hemolityczną lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli określano poprzez inkubację 2% zawiesiny ludzkich erytrocytów (n=3) z seryjnymi rozcieńczeniami lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli (w zakresie stężeń od 1000 pg/ml do 10 pg/ml). Inkubację prowadzono w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS), w temperaturze 37°C przez 1 h. Po inkubacji płytkę odwirowano (10 minut przy 500xg) a supernatant przenoszono do czystych studzienek. Uwalnianie hemoglobiny mierzono jako absorbancja supematanta przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek (Victor, PerkinElmer). Jako kontrolę 100% lizy komórek stosowano zawiesinę erytrocytów poddaną lizie w obecności 1% roztworu detergentu Tritonu Χ-100. Wyniki oznaczeń z 3 niezależnych cykli pomiarów analizowano w odniesieniu do kontroli w celu określenia aktywności hemolitycznej lipopeptydowych koniugatów (Tabela 6). Przeprowadzona ocena działania toksycznego wskazywała, że nowa grupa lipopeptydowych koniugatów jest pozbawiona

PL 245202 Β1 znacznej aktywności litycznej. Badania prowadzono w szerokim zakresie stężeń w odniesieniu do działania biologicznego. Dla lipopeptydowych koniugatów, które powodują 10% hemolizę wszystkich komórek erytrocytów wyznaczono wartości stężeń HC10 mieszczące się w zakresie stężeń 0,19:1,62 mM (Tabela 6). W całym testowanym zakresie stężeń nie zaobserwowano silnego działania hemolitycznego, powodującego 50% hemolizę wszystkich komórek (HC50).

Tabela 6

Przykładowy lipopeptydowy koniugat	Aktywność hemolityczna
	HCio[pg/ml]	HC_S0 [pg/ml]
1	142,5 (0,2962 mM)	>500 (1,0387 mM)
2	113,4(0,1858 mM)	nu
3	961,1 (1,6169 mM)	no*

HC_1D; HC₅₀określone jako najmniejsze stężenie lipopeptydowego koniugatu powodujące 10% i 50% lizę komórek; mediana, współczynnik 25:75%;

no - nie oznaczono 50% lizy komórek po zastosowaniu lipopeptydowego koniugatu w badanym zakresie stężeń, ‘10500 pg/ml.

Przykład 11

Przygotowanie opatrunku w hydrożelu FAi:FA4

Sól sodową karboksymetylocelulozy (NaCMC C5678, Sigma Aldrich, lepkość 50:200cP dla 4% wodnego roztworu w temperaturze 25°C) dodawano porcjami do buforu fosforanowego (0,05 M, pH 7,2) i mieszano łagodnie do uzyskania odpowiedniego stopnia dyspersji, a następnie sterylizowano. Przygotowanie opatrunku, wymagało wprowadzenia kroplami kompozycji farmaceutycznej albo preparatu, zawierających lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól do NaCMC w temperaturze 25°C. Odpowiednio przygotowany hydrożel przechowywano w temperaturze 1:5°C.

Tabela 7

Skład przykładowych hydrożeli

Opatrunek w hydrożelu Składniki % (w/w)	FAi	FA₂	fa₃	fa₄
CMC (sól sodowa karboksymetylocelulozy)	8,5	8,5	8,5	8,5
bufor fosforanowy	87,5	87,5	87,5	87,5
Lipopeptydowykoniugat 1	2,0	0	0	0
Lipopeptydowykoniugat 2	0	2,0	0	0
Lipopeptydowykoniugat 3	0	0	2,0	0
woda destylowana	do 100	do 100	do 100	do 100
substancja konserwująca	0	0	0	0

Przykład 1 2

Przygotowanie przykładowych emulsji FB i FC

Wszystkie składniki fazy wodnej i olejowej emulsji ogrzewano w osobnych naczyniach do uzyskania temperatury 75°C. Po czym obie fazy łączono, wprowadzając składniki fazy olejowej do wodnej, poddając kolejno homogenizacji, otrzymując emulsję o/w. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodawano lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól, substancję konserwującą oraz regulowano pH (5:7).

PL 245202 Β1

Tabela 8

Skład emulsji o/w w sprayu (FB) przygotowanej na podstawie US20050255048, zawierającej dodatkowo lipopeptydowe koniugaty

Składniki fazy olekowej	Składniki fazy wodnej	Pozostałe składniki
Distearynian poligliccrylo-3metyloglukozy 1,5%	Woda dejonizowana do 100%	Lipopeptydowy koniugat 2%
Olej mineralny 2,75%	Glikol propylenowy 2,5%	Propcllant HFC 134a (1,1,1,2-tctrafluoroctan) 50% *
Stearynian gliceryny 0,9%	Gliceryna 1,25%	Substancja konserwująca: Metyloizotiazolinon, ester metylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego, ester etylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego (Microcare MEM, Thor Personal Care) 0,8%
Alkohol stearylowy 0,4%
*70% koncentratu, 30% HFC, 3g propcl	ant na 7g koncentratu

Tabela 9

Skład emulsji o/w (FC) zawierającej dodatkowo lipopeptydowe koniugaty

Składniki fazy olejowej	Składniki fazy wodnej	Pozostałe składniki
Distearynian poliglicerylo-3- mctyloglukozy 3%	Woda dejonizowana do 100%	Lipopeptydowy koniugat 2%
Stearynian gliceryny 2%	Glikol propylenowy/butylenowy 1,5%	Substancja konserwująca: Metyloizotiazolinon, ester metylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego, ester etylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego (Microcare MEM. Thor Personal Care) 0,8%
Alkohol stearylowy 1 %	Gliceryna 2,5%
C12-15 Benzoesan alkilu 9,5%
Trigliceryd kaprylowo-kaprynowy 9,5%

Przykład 13

Ocena zdolności lipopeptydowych koniugatów do aktywacji procesu gojenia ran in vivo

Zdolność preparatów, zawierających lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli do aktywacji procesów prowadzących do zamykania ran określono początkowo w warunkach in vivo z wykorzystaniem modelu zwierzęcego. W eksperymentach wykorzystano myszy gatunku Mus musculus BALB/c płci żeńskiej w przedziale wiekowym 8:10 tygodni (pochodzące z kolekcji Trójmiejskiej Akademickiej Zwierzętarni Doświadczalnej Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego). Myszy przebywały w standardowych i kontrolowanych warunkach środowiska z 12-godzinnym cyklem dzień/noc, temperaturą 22 ±2°C, wilgotnością 55 ±10%, ze stałym dostępem do wody i pożywienia. Na tydzień przed prowadzonym eksperymentem zwierzęta zostały poddane procedurze handlingu. Opracowany protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Lokalną Komisję Etyczną ds. doświadczeń na zwierzętach (nr uchwały 31/2018 z dn. 28.06.2018 r.). Myszy w prowadzonych eksperymentach podzielono na grupy, tj. grupy kontrolne (n=6) i grupy eksperymentalne (n=6). Zwierzęta znieczulono wziewnie 3:5% izofluranem, po czym grzbiet myszy ogolono z sierści i zdezynfekowano. Skórę układano w fałd biegnący równolegle do kręgosłupa, który następnie przebijano sztancą biopsyjną o średnicy 6 mm, pozwalającą na powstanie dwóch symetrycznych ran. Na powierzchnię ran sześciu zwierząt (w grupie eksperymentalnej) wprowadzano preparat lub opatrunek w hydrożelu, zawierający lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. Następnie przykrywano je transparentnym i półprzepuszczalnym opatrunkiem Tegaderm® (3M, Trans Med. Medical) o wymiarach 2 x 3 cm i zabezpieczano. Stopień zamykania ran w czasie porównywano w grupie zwierząt kontrolnych, tj. stosowano kontrolę żelu (FA4). Opracowano system aplikacji preparatów albo opatrunków, zawierających lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, czas przebywania w ranie zwierzęcia uwzględniający proces swobodnego uwalniania ich z polimerowej matrycy, od codziennej aplikacji do kilku dni z każdorazową ich wymianą w trakcie kilkunastodniowego leczenia. Postęp procesu gojenia ran oceniano według określonego schematu podawania, w odstępach czasowych (d0, d3, d7, d10, d14). Po usunięciu preparatu w ostatni dzień prowadzonego eksperymentu, zwierzęta uśmiercano, a fragmenty odbudowanej skóry wraz z 0,5 cm fragmentem okalającym skórę pobierano, zamrażano i przechowywano do dalszej analizy. Powierzchnie ran za każdym razem fotografowano za pomocą aparatu Nikon Coolpix S5100 i obliczano z użyciem Image J. Wygojenie rany (odbudowanie pełnowarstwowej skóry) interpretowane jest w postaci procentowego zmniejszenia powierzchni pierwotnej rany w czasie. Oceniano również proces naskórkowania (reepitalizacji), wskazując na obszar pokryty nowym nabłonkiem, rozciągającym się poza krawędzie rany. Proces naskórkowania oszacowany jest jako różnica powierzchni ran zmniejszonej w czasie do powierzchni zajmowanej przez ranę. Przykład 1 4

Ocena zdolności lipopeptydowych koniugatów do aktywacji gojenia ran cukrzycowych in vivo

Aby ocenić w dalszym etapie zdolność lipopeptydowych koniugatów i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli do wygojenia ran cukrzycowych przeprowadzono eksperymenty z wykorzystaniem modelu myszy, oddającego biologię choroby. Szczep myszy zastosowany w badaniu posiada mutację genetyczną w receptorze leptyny, reprezentuje model cukrzycy typu II, charakteryzuje się hiperglikemią, otyłością, hiperinsulinemią i upośledzonym gojeniem. 12-tygodniowe myszy płci żeńskiej Mus musculus db/db BKS.Cg-Dock+/+Lepr/J pochodziły od Charles Rivers. Eksperymenty przeprowadzono w Trójmiejskiej Akademickiej Zwierzętarni Doświadczalnej Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego po uzyskaniu zgody Komisji Etycznej ds. doświadczeń na zwierzętach (nr uchwały 31/2018 z dn. 28.06.2018 r.). Myszy przechowywano w kontrolowanych i standardowych warunkach. Eksperymenty rozpoczęto po osiągnięciu stanu zaawansowanej choroby. W surowicy krwi pobieranej z okolicy nasady ogona dokonywano oznaczeń parametrów biochemicznych tj. poziomu glukozy z użyciem One Touch® Blood GlucoseMeter (LifeScan Inc., Milpitas, CA) (na początku eksperymentu w grupie eksperymentalnej, leczonej opatrunkami w hydrożelu FAi(27,39 ±4,6 mmol/l), FA2(28,90 ±1,08 mmol/l), FAs(22,69 ±5,97 mmol/l)), kontrolnej FA4 (26,30 ±3,22 mmol/l). Aplikacja preparatu według wynalazku na rany myszy odbywała się zgodnie z procedurą użytą dla myszy Mus musculus BALB/c. Sześciu myszom w danej grupie eksperymentalnej aplikowano na rany sterylne preparaty FAi:FA3, sześć otrzymywało na ranę sterylny hydrożel (FA4) (grupa kontrolna), w każdym przypadku ranę pokrywano opatrunkiem Tegaderm® i zabezpieczano. Rany obserwowano w określonych odstępach czasowych, w trakcie kilkunastodniowego leczenia do 18 dnia. W trakcie eksperymentów oceniano ogólny stan zdrowia myszy i ważono je. Na początku eksperymentu waga myszy wahała się od 51,5 g do 70,6 g. Średnia waga myszy w grupie kontrolnej wynosiła 62,0 g. Średni spadek masy w czasie wynosił w grupie kontrolnej:

FA4 (14,61 ±6,28 g) i eksperymentalnej FAi (14,72 ±3,46 g), FA2 (15,56 ±5,03 g), FA3 (9,68 ±2,77 g). Różnice w spadku mas pomiędzy dwoma grupami nie były istotne statystycznie. Średni poziom glukozy we krwi w trakcie eksperymentów wynosił w grupie eksperymentalnej: leczonej FA1 (22,99 ±5,72 mmol/l), FA2 (27,39 ±3,16 mmol/l), FA3 (19,87 ±6,49 mmol/l), kontrolnej FA4 (23,53 ±4,26 mmol/l). Myszy, które nie przyjmowały pożywienia z powodu pogorszenia stanu zdrowia poddawano eutanazji i wykonano sekcję zwłok.

Do oceny histopatologicznej wycinki tkankowe o określonej powierzchni pochodzące zarówno od myszy nieobciążonych cukrzycą (n=3), jak myszy z cukrzycą (z grup kontrolnych i eksperymentalnych, n=3) utrwalano w formalinie, zatapiano w bloczki parafinowe i przygotowywano do barwienia eozyną i hematoksyliną oraz barwienia trójbarwnego według Massona.

Przeprowadzone obserwacje wskazywały na poprawę procesu gojenia rany, prowadzącego do odbudowy pełnowarstwowej skóry. Eksperymenty z udziałem modelu zwierzęcego wskazywały na zaangażowanie lipopeptydowych koniugatów lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli w proces gojenia od dnia 3, postępujący proces reepitalizacji w porównaniu do kontroli opatrunku w hydrożelu, stanowiącego podstawę dostępnych na rany produktów medycznych „nowej generacji”. Od dnia 7 do 10 obserwowano szybsze zamykanie rany. Indukowane rany u myszy wykazywały znaczny stopień wygojenia w dobie 10 i pokrycie rany nowym nabłonkiem po zastosowaniu preparatów, zawierających lipopeptydowe koniugaty w ilości mieszczącej się w zakresie uznanej za terapeutyczną. Na Fig. 8, Fig. 9, Fig. 10, Fig. 11 przedstawiono efekt gojenia ran u myszy w trakcie leczenia przykładowymi preparatami, zawierającymi lipopeptydowe koniugaty w ilości terapeutycznej. Określono wpływ zastosowanej polimerowej matrycy, uwzględniając stopień ich uwolnienia do wytworzenia opatrunku. Udowodniono w przeprowadzonych testach in vitro, iż kompozycje farmaceutyczne, zawierające lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole aktywują procesy zachodzące z udziałem hodowli komórek skórnych. W odbudowę skóry zangażowane są komórki keratynocytów, które migrują z brzegów rany i proliferują, zapoczątkowując proces reepitalizacji. W przeprowadzonych eksperymentach obserwowano korzystny efekt kompozycji farmaceutycznych, zawierających lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole związany ze zdolnością do stymulowania procesu proliferacji i inicjowania oraz modulowania szybkości migracji komórek skórnych. Na podstawie przeprowadzonych badań z użyciem hodowli komórek in vitro zauważono, że dominującym procesem, w które zaangażowane są komórki keratynocytów, jest ich proliferacja. Przeprowadzony test XTT potwierdził efekt stymulujący wzrost komórek keratynocytów w hodowli w obecności kompozycji farmaceutycznych, zawierających lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku promują gojenie również poprzez wzmożoną aktywację proliferacji i migracji komórek fibroblastów zaangażowanych w tworzenie nowej tkanki ziarnistej. Proces migracji komórek fibroblastów po traktowaniu kompozycją farmaceutyczną, zawierającą lipopeptydowy koniugat obserwowano w teście in vitro i analizowano pod mikroskopem. Całkowita liczba migrujących komórek skórnych w obszarze „rany” wzrastała. Obszar rany niepokrytej komórkami uległ znacznie zmniejszeniu w czasie 24 h w porównaniu do zastosowanej kontroli (Fig. 4). Figura 7 przedstawia zdjęcia mikroskopowe prezentujące wpływ zastosowanej kompozycji farmaceutycznej zawierającej lipopeptydowy koniugat na inicjowanie procesu migracji reprezentatywnej hodowli komórek ludzkiej skóry (fibroblasty pierwotne).

Analiza histolopatologiczna tkanek pobranych fragmentów skóry traktowanych preparatami zawierającymi lipopeptydowe koniugaty przedstawiała prawidłowy obraz tkanek, bez uwypukleń w rejonie uszkodzenia. Ocena mikroskopowa w d18 wskazywała na udział ich w odbudowę i rekonstrukcję skóry, utworzenie nowego naskórka i tkanki ziarnistej. Na podstawie reprezentatywnych zdjęć tkanek barwionych według Massona w grupie eksperymentalnej zwierząt leczonych preparatem, zawierającym lipopeptydowy koniugat uwidoczniono nieznaczne pogrubienie naskórka w rejonie zagojonej skóry, świadczące o nasilonej aktywacji procesu proliferacji keratynocytów i stymulacji procesu naskórkowania (na przykładzie lipopeptydowego koniugatu 3). Wskazywano na obecność włókien kolagenowych o prawidłowej architekturze, będącej efektem zwiększonej produkcji kolagenu przez komórki fibroblastów.

Zastosowanie opatrunków w hydrożelu według wynalazku na rany myszy wskazywało na efektywne uwolnienie lipopeptydowego koniugatu w czasie eksperymentu. Działanie przygotowanych preparatów, zawierających lipopeptydowe koniugaty przedstawiono na Figurze 12. Makroskopowa ocena ran prowadzona w trakcie eksperymentów przedstawia korzystny efekt po zastosowaniu FA1:FA3. Na przykładzie stosowanego opatrunku FA2 uzyskano wysoki poziom wygojenia rany w dniu 10 w po równaniu do kontroli (FA4). Średnie wartości powierzchni obszaru niezamkniętego, tj. rany i części pokrytej naskórkiem wynosiły 7,44% i 10,46%, podczas gdy wygojony obszar stanowił 82,10% wartości początkowej rany (w dniu 0).

Działanie przygotowanych opatrunków, zawierających lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole określono na modelu myszy obciążonej cukrzycą z zaawansowanym stadium choroby. Wpływ na zamykanie i regenerację ran po zastosowaniu przykładowych opatrunków FA1 :FA^ przedstawiono na figurach (Fig. 14, Fig. 15, Fig. 16). Zaangażowanie lipopeptydowych koniugatów w regenerację rany cukrzycowej zaobserwowano już na początku eksperymentu w 3 dniu, znaczne zmniejszenie obszaru rany i pokrycie nowym naskórkiem uzyskano w dniu 10. W grupie eksperymentalnej leczonej opatrunkiem FA1, FA2, FA3 według wynalazku średnia wartość obszaru niezamkniętego (% początkowej rany), tj. rany i utworzonego naskórka wynosiła 17,18% i 41,26% (FA1); 13,8% i 39,12% (FA2); 13,36% i 41,27% (FA3), obszaru wygojonego: 41,56% (FA1), 47,08% (FA2), 45,37% (FA3). Całkowitą odbudowę pełnowarstwowej skóry określono w dniu 18.

Regeneracja ran cukrzycowych u myszy była znacznie opóźniona w porównaniu do ran indukowanych u myszy nieobciążonych cukrzycą. Po traktowaniu ran cukrzycowych z wydłużonym procesem zapalnym standardowo stosowanym opatrunkiem w hydrożelu (FA4) nie obserwowano początkowo efektów. Tworzenie nowego naskórka obserwowano w 7 dniu. Diagram (Fig. 17) przedstawia porównanie wartości średnich powierzchni niezamkniętego obszaru i wygojonego u myszy nieobciążonej cukrzycą i z zaawansowanym stadium choroby. W dniu 7 wygojony obszar u myszy db/db (w grupie kontrolnej) stanowił 11,94% początkowej rany, podczas gdy u myszy BALB/c 47,99%. W 10 dniu wygojony obszar u myszy db/db wzrósł do 25,92%. Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów zastosowane opatrunki FAi:FA3, według wynalazku wskazywały na przyspieszenie procesu gojenia ran cukrzycowych. Makroskopowa ocena ran w trakcie leczenia tymi opatrunkami wskazywała na całkowite pokrycie ran naskórkiem w dniu 14. Przykładowe fotografie ran w grupie myszy leczonych FA2 w porównaniu z FA4 umieszczono na Fig. 17.

W trakcie prowadzonych eksperymentów na modelu myszy, oceniono bezpieczeństwo stosowania lipopeptydowych koniugatów w szerokim zakresie stężeń; określono ich niską aktywność hemolityczną. Nie zaobserwowano efektu toksycznego w kontakcie z organizmem żywym, niepożądanych działań ogólnoustrojowych, negatywnego działania tj. szkodliwego, drażniącego, zmian w masie, zachowaniu myszy w grupie leczonych preparatami albo opatrunkami, zawierającymi lipopeptydowe koniugaty lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Analiza statystyczna:

Rezultaty reprezentują wartości ±błąd standardowy średniej. Różnice w wartościach średnich między grupami analizowano pod kątem istotności stosując odpowiednio test t-Studenta lub ANOVA i nieparametryczny U Manna-Whitneya.

Literatura:

1. Fields i wsp. (1996). Biopolymer, 40:345;

2. Boulegue i wsp. (2008). Antioxid. Redox Signal. 20:113;

3. Fields (2010). OrgBiomol Chem. 21:1237;

4. Bella i wsp. (1994). Science, 266:75;

5. Ramshaw i wsp. (1998). J Struct Biol. 122:86-91;

6. Fisher i wsp. (1991). Int. J Peptide Protein Res. 38:491;

7. Bodanszky, M. (1988). Peptide Chemistry, pp. 86-88, Springer-Verlag, Berlin;

8. Fischer i wsp. (1991). Int. J Peptide Protein Res. 38:491;

9. Smith, E.L., Bergmann, M. (1944). J. Biol. Chem. 1944, 153:627

10. Mauger, A.B., Witkop, B. (1966).Chem. Rev. 66:47;

11. Stewart i wsp. (1974). J. Med. Chem. 17:537;

12. Shibnew i wsp. (1968). Bull. Acad. Sci. USSR, Div. Chem. Sci. 8, 1725-1728;

13. Adams, E. (1976). Int. J. Pept. Protein Res., 8(5): 503;

14. Sivanandaiah i wsp. (1996). Biochemistry, 5(4): 1224;

15. Schwarz i wsp. (1959). J. Am. Chem. Soc. 81: 5691;

16. Adams, E. (1976). Int. J. Pept.Protein Res., 8(5): 503;

17. Wielandti wsp. (1959). LiebigS Ann. Chem. 626:154;

18. Beyerman i wsp. (1973). Roc. Trav. Chim. 92: 481;

19. Shibnev i wsp. (1969). Bull. Acad. Sci. USSR, Div. Chem. Sci. 2:342;

20. Neuman, R. E., Smith, E. L. (1951). J. Biol. Chem. 193, 97-111;

21. Justova i wsp. (1975). Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 40:662;

22. Inouye i wsp. (1982). Arch Biochem Biophys,.219(1): 198;

23. Pandey i wsp. (2013). J Am ChemSoc, 135(11):4333;

24. Greene I wsp.; John Wiley & Sons Inc.: New York, 1999; 65-67; 404-408;

25. Sakakibara i wsp. (1973). Biochim. Biophys. Acta, 303:198;

26. Goodman i wsp. (1996). J. Am. Chem. Soc. 118:5156;

27. Feng i wsp. (1996). J. Am. Chem. Soc. 118:10351;

28. Goodman i wsp. (1996). J. Am. Chem. Soc. 118:10928;

29. Hoyo i wsp. (1997). Tetrahedron 53:14263-14274;

30. Fields i wsp. (1993). Biopolymers 33:1695;

31. Fields i wsp. (1993). J. Biol. Chem. 268:14153;

32. Grab i wsp. (1995). J. Biol. Chem. 271:12234;

33. Aubrey i wsp. (2015). Biopolymers, 104(6):674;

34. Sakakibara i wsp. (1968). Bull. Chem. Soc. Jpn. 41:1273;

35. RAND Corporation 2000 Market Research&Consulting, Grand View Research (2014);

36. Kavithai wsp. (2014). World J Diabetes, 5(4): 546;

37. Wu i wsp. (2007). l/asc Health Risk Manag., 3(1):65;

38. Landen i wsp. (2016). Cell. Mol. Life Sci. 2016, 73(20): 3861;

39. Xu i wsp. (2013). BiomedResearch Int. 2013:1;

40. Siqueira i wsp. (2010). Diabetologia, 53(2):378;

41. Wallaceand i wsp. (1998). J Investig. Dermatol. 110(3):292;

42. Kaiser i wsp. (1997). Gastroenterology, 112(4): 1231 ;

43. Liu i wsp. (2006). Am. J Pathol. 168, 3:757;

44. Hasnan i wsp. (2010). Singapore Med. J. 51 (1): 50;

45. Rai i wsp. (2005). J. Wound Care, 14(6):277;

46. Petrache i wsp. (2000). Am. J Physiol. 278(2):L312;

47. Ruckert i wsp. (2000). Br. J. Dermatol. 143(5): 1036;

48. Frank i wsp. (1996). J. Biol.Chem. ,271(17): 10188;

49. Jude i wsp. (2002). Diabetic Med. 19(6):440;

50. Al-Mulla i wsp. (2011). Mol. Biosyst. 7(11):3006;

51. Galkowska i wsp. (2003). Surgery, 134(2):213;

52. Usui i wsp.(2008). Cytochem. 56(7):687-696;

53. Lan i wsp. (2008). J. Dermatol, 159(5): 110;

54. Brem i wsp. (2007). J. Clin. Invest. 117(5): 1219;

55. Corredor i wsp. (2003). Am. J. Physiol. 284(4):C953;

56. Nicholas i wsp. (2017). J. Cutan. Med. Surg., 21(1):23;

57. Merrifield, R.B. (1963). J.Am. Chem. Soc., 85, 14:2149;

58. Kukowska i wsp. (2016). RSC Advances, 116:115220;

59. Kukowska i wsp. (2015). Bioorg. Med. Chem. Lett., 25:542;

60. Grek i wsp. (2015). Wound Repair Regen., 23(2):203;

61. Gomes i wsp. (2017). Molecules, 22(10): 1743.

62. Arendt i wsp. Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej, rok wyd.(1980);

63. Barańska-Rybak i wsp. (2013). Acta Pol. Pharm., 70:795;

Claims

1. Lipopeptydowy koniugat bogaty w reszty hydroksyproliny o wzorze ogólnym

N“-acyl-(AK5-AK4-AK3-AK2-AKi)-NH2 (I) lub

N“-acyl-(AK5-AK4-AK3-AK2-AKi)-(AK5’,-AK4’,-AK3’,-AK2’,-AKi’)-NH2 (II) lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól, w którym:

AKi, AK2, AK3, AK4, AK5, AKi’ AK2’ AK3’, AK4’, AK5’ oznaczają reszty aminokwasowe lub ich brak, przy czym

AK1 oznacza resztę Lys o konfiguracji L lub D;

AK4 oznacza resztę aminokwasową wybraną spośród Pro lub Hyp;

AK5 oznacza resztę Gly;

AKi’ oznacza resztę Lys o konfiguracji L lub D;

AK2’ oznacza resztę Gly;

AK3’ oznacza resztę aminokwasową wybraną spośród Hyp lub Gly;

AK4’ oznacza resztę aminokwasową wybraną spośród Pro lub Hyp;

AK5’ oznacza resztę Gly;

N“-acyl oznacza wybrane z grupy Ri-C(=0), w którym Ri oznacza nasycony łańcuch węglowy o długości od C7 doCi3.

2. Lipopeptydowy koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że koniugat (I) lub (II) jest wybrany spośród grupy związków wymienionych w tabeli 1, przy czym forma amidowa koniugatu lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól wybrana jest spośród grupy obejmującej trifluorooctan, octan, chlorowodorek, bromowodorek, jodowodorek i fluorek.

3. Sposób otrzymywania lipopeptydowego koniugatu (I) jak określono w zastrz. 1 na nośniku polimerowym, zgodnie ze strategią Fmoc, obejmujący reakcję kondensacji estru aktywnego Fmoc chronionej reszty aminokwasowej z odpowiednio aktywowanym nośnikiem polimerowym, przyłączenie chronionych reszt aminokwasowych do uzyskania zdefiniowanych sekwencji obejmujące odpowiednio: deprotekcję osłony Fmoc, stosując 25% roztwór piperydyny w DMF i reakcję sprzęgania z użyciem pochodnej karbodiimidowej w mieszaninie rozpuszczalników DCM/DMF, a następnie wprowadzenie długołańcuchowego kwasu tłuszczowego na N“-koniec łańcucha peptydylonośnika z zastosowaniem soli typu uroniowego i odczynnika antyracemizacyjnego w obecności zasady oraz usuwanie z nośnika pojedynczych łańcuchów peptydowych skoniugowanych z kwasem tłuszczowym poprzez traktowanie nośnika TFA o różnym stężeniu 1:95%, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) reakcję kondensacji estru aktywnego Fmoc-L-Lys(Boc)-OH lub Fmoc-D-Lys(Boc)-OH z aktywnym aminometylopolistyrenem posiadającym jako linker 4-(2’,4’-dimetoksyfenylo-Fmoc-aminometylo)-fenoksyacetamid;

b) przyłączenie Fmoc-chronionych reszt aminokwasowych w warunkach bezwodnych, w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3:5 godzin, z udziałem DIPCI oraz HOBt w stosunku molowym 1 : 1 : 1 z zastosowaniem 2,5:5,0-krotnego nadmiaru reagentów w stosunku do osadzenia na nośniku w mieszaninie rozpuszczalników NMP-DMF-DCM (1 : 1 : 1, v/v/v);

c) wprowadzenie długołańcuchowego kwasu tłuszczowego (Cb:C14) na N“-koniec łańcucha peptydylonośnika w warunkach bezwodnych, w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3:5 godzin z udziałem TBTU, HOBt oraz DIPEA w stosunku molowym 1 : 1 : 1 : 2 z zastosowaniem 2,5-krotnego nadmiaru reagentów w stosunku do osadzenia na nośniku w DMF z dodatkiem 1% niejonowego surfaktanta polioksyetyleno t-oktylofenolu (Cmc=267, HLB = 14,4);

d) usuwanie z nośnika pojedynczych łańcuchów peptydowych skoniugowanych z kwasem tłuszczowym w atmosferze gazu obojętnego, korzystnie azotu, w ciemności, przez okres 2:3 godzin w mieszaninie stężonego TFA, wymiatacza jonowego i/lub przeciwutleniacza;

e) oczyszczanie odszczepionego lipopeptydowego koniugatu z użyciem ekstrakcji do fazy stałej w układzie faz odwróconych.

4. Sposób otrzymywania lipopeptydowego koniugatu (II) jak określono w zastrz. 1 na nośniku polimerowym, zgodnie ze strategią Fmoc, obejmujący reakcję (poli)kondensacji N“-acylopeptydu z α-aminową grupą fragmentu łańcucha peptydowego osadzonego na nośniku, gdzie następuje wprowadzenie długołańcuchowego kwasu tłuszczowego na N“-koniec łańcucha peptydylonośnika z zastosowaniem soli typu uroniowego i odczynnika antyracemizacyjnego w obecności zasady oraz usuwanie z nośnika łańcuchów peptydowych skoniugowanych z długołańcuchowym kwasem tłuszczowym poprzez traktowanie nośnika TFA o różnym stężeniu 1:95%, znamienny tym, że równolegle otrzymywane są dwa łańcuchy peptydowe A i B, odpowiednio fragment A na nośniku 2-chlorotritylowym i fragment B na nośniku aminometylopolistyrenowym w sekwencji następujących po sobie reakcji:

b) przyłączenie kolejnych Fmoc chronionych reszt aminokwasowych do utworzenia zdefiniowanych fragmentów peptydu A i B prowadzi się w warunkach bezwodnych, w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3:5 godzin, z udziałem DIPCI oraz HOBt w stosunku molowym 1 : 1 : 1 z zastosowaniem 2,5:5,0-krotnego nadmiaru reagentów w stosunku do osadzenia na nośniku w mieszaninie rozpuszczalników NMP-DMF-DCM (1 : 1 : 1, v/v/v);

c) wprowadzenie długołańcuchowego kwasu tłuszczowego (C8:Ci4) na N“-koniec łańcucha peptydylonośnika fragmentu A przebiega w warunkach bezwodnych, w temperaturze 25 ±2°C przez okres 3:5 godzin, z udziałem TBTU, HOBt w obecności DIPEA w stosunku molowym 1 : 1 : 1 : 2 z zastosowaniem 2,5-krotnego nadmiaru reagentów w stosunku do osadzenia na nośniku, w DMF z dodatkiem 1 % niejonowego surfaktanta polioksyetyleno t-oktylofenolu (Cmc = 267, HLB = 14,4);

d) odszczepianie od nośnika lipopeptydowych łańcuchów (lipo-fragment A) poprzez traktowanie nośnika mieszaniną DCM-TFA (95 : 5, v/v) albo DCM-TFA-iPr3SiH (90 : 5 : 5, v/v/v) w atmosferze gazu obojętnego, korzystnie azotu, w ciemności, przez okres 30 minut, kolejno neutralizację odszczepionych lipopeptydowych łańcuchów i oczyszczanie,

e) reakcja polikondensacji fragmentów peptydowych: oczyszczonego lipo-fragmentu A i fragmentu B osadzonego na nośniku aminometylopolistyrenowym przebiega w warunkach bezwodnych w temperaturze 25 ±2°C przez okres 2,5:5,0 godzin się z użyciem TBTU, HOBt w obecności DIPEA w stosunku molowym 1 : 2 : 2 : 4, stosując 2,5:8,0-krotny nadmiar reagentów w stosunku do osadzenia na nośniku w DMF;

f) usuwanie z nośnika lipopeptydowego koniugatu (II) odbywa się w atmosferze gazu obojętnego, korzystnie azotu, w ciemności, przez okres 2:3 godzin w obecności mieszaniny stężonego TFA, wymiatacza jonowego i/lub przeciwutleniacza;

g) oczyszczanie odszczepionego lipopeptydowego koniugatu odbywa się z użyciem ekstrakcji do fazy stałej w układzie faz odwróconych.

5. Sposób według zastrz. 3 albo zastrz. 4, znamienny tym, że w etapie a). osadzenie Fmoc-L-Lys(Boc)-OH albo Fmoc-D-Lys(Boc)-OH na nośniku 2-chlorotritylowym jest w zakresie (0,655:1,245) ±0,040 mmol/g, a na nośniku aminometylopolistyrenowym jest w zakresie (0,345:0,790) ±0,050 mmol/g.

6. Sposób według zastrz. 3 albo zastrz. 4, znamienny tym, że lipopeptydowe koniugaty bogate w reszty L-hydroksyproliny są odszczepiane od nośnika aminometylopolistyrenowego z użyciem mieszaniny stężonego kwasu TFA, wymiatacza jonowego: TFA-PhOH-iPr3SiH-H2O (88 : 5,8 : 2 : 4,2, v/v/v/v) przez okres 2:3 h, temperaturze 25 ±2°C albo z użyciem mieszaniny stężonego kwasu TFA, wymiatacza jonowego i przeciwutleniacza: TFA-PhOH-iPr3SiH-H2O z dodatkiem NH4I (86,5 : 5,8 : 4,2 : 1,5, v/v/v/v) przez okres 3:4 h w temperaturze 0°C.

7. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 3 do 6 znamienny tym, że lipopeptydowe koniugaty bogate w hydroksyprolinę otrzymywane są z użyciem Fmoc-L-4-hydroksyproliny.

8. Sposób według któregokolwiek zastrz. od 3 do 7 znamienny tym, że reakcję kondensacji pomiędzy wolną grupą α-aminową reszty aminokwasowej w sekwencji peptydu zawierającego L-4-hydroksyprolinę osadzonego na nośniku a grupą karboksylową kolejno wprowadzanej Fmoc chronionej reszty aminokwasu do otrzymania lipopeptydowego koniugatu bogatego w reszty hydroksyproliny o wzorze ogólnym I i II, przy czym Fmoc-chroniony aminokwas, DIPCI i HOBt używa się w stosunku molowym 2 : 2 : 2, a reakcję prowadzi w mieszaninie rozpuszczalników NMP-DMF-DCM (1 : 1 : 1, v/v/v) w temperaturze 18 ±2°C, przez okres 3,5 ±0,5 godziny.

9. Sposób według któregokolwiek zastrz. od 3 do 7 znamienny tym, że lipopeptydowe koniugaty odszczepione od nośnika polimerowego poddaje się w procesowi oczyszczania z użyciem ekstrakcji do fazy stałej w układzie faz odwróconych, z zastosowaniem kolumienek wypełnionych żelem krzemionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi, stosując elucję gradientową o wzrastającym stężeniu w zakresie (0:30% acetonitrylu w wodzie z dodatkiem 0,1% kwasu trifluorooctowego oraz elucję izokratyczną.

10. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca co najmniej jeden lipopeptydowy koniugat lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól określone w zastrz. 1 lub zastrz. 2 w ilości od 0,0001% do 10% w/w, oraz co najmniej jeden farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik.

11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że lipopeptydowy koniugat wybrany jest spośród Lauroilo-Gly-Pro-Lys-NH2, Lauroilo-Gly-Hyp-Hyp-Lys-NH2 i Lauroilo-Gly-Pro-Hyp-Lys-NH2.

12. Preparat do stymulacji proliferacji oraz migracji fibroblastów i keratynocytów zawierający kompozycję farmaceutyczną określoną w zastrzeżeniu 10 albo 11.

13. Preparat według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera kompozycję farmaceutyczną w ilości od 0,01% do 10% wagowych w przeliczeniu na całkowitą masę preparatu.

14. Preparat według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera ponadto karboksymetylocelulozę.

15. Preparat według któregokolwiek zastrz. od 12 do 14 do zastosowania jako opatrunek w postaci roztworu, zawiesiny, emulsji w aerozolu, kremu, maści, trójwymiarowego płata, hydrożelu w tubce.