JPWO2015156275A1 - Atp11cまたはcdc50aの阻害物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
マウス、細胞株、プラスミド、組換えタンパク質、抗体および試薬
C57BL/6J および BALB/c ヌードマウスは、Japan Cleaより購入した。MerTK−/− マウス(41)は、Jackson Laboratoryより購入した。全てのマウス実験は、京都大学医学研究科・医学部動物実験委員会により承認を受けた。
ハプロイド遺伝子スクリーニングは、実質的に既報のとおりに行った (17, 46)。簡単に説明すると、ジーントラップウイルスを製造するため、HEK293T細胞(2.4×107 細胞)に、Fugene6 (Promega)を用いて、pGT-GFP、pGT-GFP+1、およびpGT-GFP+2の混合物(36μg)を、pAdvantage(8.4μg)、pCMV-VSV-G(9.0μg)、およびpGag-pol-IRES-bsr(9.6μg)と組み合わせてトランスフェクトし、48時間インキュベートした。上清中のウイルスを、6,000×g にて16時間遠心して濃縮した。KBM7細胞(1×108)を24ウェルディッシュ(Corning)に1ウェル当たり1.5×106細胞で播種し、8μg/mlポリブレンの存在下、スピン感染法により、700×g、45分間にて、濃縮したウイルスを感染させた。感染は約80%の導入効率であって、4日間増殖させ、スクリーニングに使用した。
プロウイルス挿入部位に隣接する宿主配列を同定するため、インバースPCRを行い、その後、既報のとおりディープシークエンシング(deep sequencing)した(17, 46)。簡単に説明すると、ゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)を用いて2×106 のLF細胞から単離し、DNA(4μg)をNlaIIIで消化した。消化したDNAを、Wizard SV GelおよびPCR clean-up column (Promega)を用いて精製し、DNA(1.0μg)を、300μlの容量でT4 DNA リガーゼ (Takara Bio)を用いてライゲーションした。このDNAを上記のとおり精製し、ジーントラップベクターの内部配列に相補的な外向き(outward−facing)プライマー (5’−AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATCTGATGGTTCTCTAGCTTGCC−3’(配列番号2)および5’−CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGGTTAAGATCAAGGTC−3’ (配列番号3); ディープシークエンシングのためのアダプター配列を下線で示す)を用いてPCRした。PCR産物を、Wizard SV GelおよびPCR clean-up columnにより精製し、MiSeq シークエンサー (Illumina)にてプライマー (5’− CTAGCTTGCCAAACCTACAGGTGGGGTCTTTCA−3’ (配列番号4)) を用いて配列決定した。
ジーントラップ挿入を有する細胞株を得るため、LF細胞を限界希釈した。ゲノムDNAを各クローンからQIAamp DNA Mini Kitを用いて単離し、NlaIIIで消化し、Wizard SV GelおよびPCR clean-up columnを用いて精製した。このDNAをT4 DNAリガーゼを用いてライゲーションし、上記のとおり精製し、ジーントラップベクターの内部配列に相補的な外向きプライマー(5’− CTGCAGCATCGTTCTGTGTT−3’ (配列番号5)および 5’− TCTCCAAATCTCGGTGGAAC−3’ (配列番号6)) を用いてPCRした。増幅したPCR産物を、プライマー(5’−CTCGGTGGAACCTCCAAAT−3’ (配列番号7))を用いて、DNAシークエンサー (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Life Technologies)により直接配列決定した。ATP11CまたはCDC50Aに変異を有するクローンを、それぞれATP11CGT および CDC50AGTと命名した。
CRISPR−Cas システム (19)を用いて、W3およびW3-Ildm細胞におけるmCDC50AおよびATP11C遺伝子の編集を行った。mCDC50A (TMEM30A) (ID: MGI 106402) および mATP11C (ID: MGI 1859661) 遺伝子における好適な標的配列を、UCSC のZhangの研究室でのCRISPR デザインツール (http://www.genome−engineering.org/crispr/?page_id=41) を用いて設計した。相補的オリゴヌクレオチド(CDC50A: 5’− AAACCATCGGCCTCATCTTCATCCCCATCGGCATGT−3’ (配列番号8)および 5’− TAAAACATGCCGATGGGGATGAAGATGAGGCCGATG−3’ (配列番号9); ならびにATP11C: 5’− CACCGTCACCAAACGGTTGAGGGTC−3’ (配列番号10)およびd 5’−AAACGACCCTCAACCGTTTGGTGAC− 3’ (配列番号11)、CDC50AおよびATP11Cについて標的配列を下線で示す)を、T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (Takara Bio)でリン酸化し、95℃で5分間加熱し、室温で放置してアニーリングさせ、BbsIで消化したpX260ベクター (CDC50A)またはpX330ベクター (ATP11C)にライゲートし、大腸菌の形質転換に用いた。この標的化配列を有するpX プラスミド DNAを、Super Electroporator NEPA21 type II (NepaGene)を用いたエレクトロポレーションにより、W3またはW3-Ildm細胞中に導入した。10% FCS含有RPMI中で3日間培養後、細胞にpXベクターを再びトランスフェクトした。
5’-cDNA末端の増幅を、キット(5’-Full RACE Core Set; Takara Bio) を用いて製造者の指示書にしたがい行った。簡単に説明すると、RNAを、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてKBM7細胞から調製した。5’-リン酸化プライマー (5’− CTTAGATGAGAC−3’ (配列番号16))を用いて、AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 逆転写酵素によりファーストストランドcDNAを合成した。RNase HでRNAを消化後、合成したファーストストランドcDNAを、T4 RNA リガーゼを用いてライゲートし、ネステッド (nested) PCR用のテンプレートとして用いた。ネステッドPCRは、以下のプライマーを用いて行った (1st PCR: 5’−TGGCAATCATCCAGTTTCGG−3’ (配列番号17)および 5’− ACACTGTGCGTGTGCCAAC−3’ (配列番号18)、2nd PCR: 5’−CGGAAACAGAAGCTTACATTGC−3’ (配列番号19)および 5’−TCGTTTCTCTTCTCCAGCAC−3’ (配列番号20))。PCR産物を、pGEM-T easy vector中にクローニングし、DNA配列をDNAシークエンサー(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer)を用いて決定した。
ヒトCDC50A cDNA (NCBI: NM_018247.3)を、KBM7細胞からのRNAを用いてRT-PCRにより調製した。天然の塩基配列を持つhATP11C cDNA (NCBI:XM_005262405.1) (47)は、哺乳動物細胞におけるタンパク質レベルが低かったことから、mRNAの安定性および翻訳効率が増強された配列を、GENEART (Regensburg, Germany)にて特注で製造した。Mut1+2、1+3、2+3、または1+2+3 変異体を作製するため、変異ヌクレオチドを含む以下のプライマー(配列中、制限酵素部位を下線で示す)を用いた組み換えPCR (48)により、hATP11C cDNA に変異を導入した。cDNAの真正性は、DNA配列決定により確認した。
hATP11C , 5’− CATTTAATTAAGCCACCATGTTCAG−3’ (配列番号21) および 5’−CCAGGAATTCCAGCACGTTGGACTC− 3’ (配列番号22);
Mut1, 5’−CTGTCTGGCTCAGGCCGGCCACTTCCTGGGTCACG−3’ (配列番号23)および 5’− CGTGACCCAGGAAGTGGCCGGCCTGAGCCAGACAG−3’ (配列番号24);
Mut2, 5’−GAAGTAGGTCAGTGTGCCAGCTGTCTGGCTCAGGC−3’ (配列番号25) および 5’−GCCTGAGCCAGACAGCTGGCACACTGACCTACTTC−3’ (配列番号26);
Mut3, 5’−CTCTGTGGCGCCGGCCACGGCGGCGTTGGTCTTGA−3’ (配列番号27)および 5’−TCAAGACCAACGCCGCCGTGGCCGGCGCCACAGAG−3’ (配列番号28)。
アポトーシスを誘導するため、W3-Ildm細胞(1×106)をFasL(33 ユニット/ml)にて37℃で1-2時間処理し、細胞生存率を、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム, モノナトリウム塩(WST-1; Dojin Laboratories) および1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルスルファートを用いるWST-1アッセイにより、既報(20)のとおり測定した。
膜画分を、hATP11C-GFPを発現する細胞またはその変異体より既報 (49)のとおり調製し、20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、140 mM NaCl、1% Triton X−100、10% グリセロールおよび1 mM (p−アミノフェニル)メタンスルホニルフルオリド(APMSF)中に溶解した。不溶性物質を遠心により除去後、膜タンパク質 (10μg)を、100μl の 50 mM Hepes-NaOH (pH 7.4)、5% グリセロール、5 mM DTT、10 mM EDTA、0.1 mM APMSF および0.1% CHAPS中、3ユニットの各種ヒト組み換えカスパーゼ (Biovision)と共に37℃にて1時間インキュベートし、ウエスタンブロットにより解析した。
細胞または膜画分を、RIPA バッファー (50 mM HEPES-NaOH (pH 8.0)、1% NP-40、0.1% SDS、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、およびプロテアーゼインヒビターカクテル [cOmplete, Mini, EDTA−free, Roche Diagnostics])中に溶解した。不溶性物質を遠心により除去後、溶解物を、3×SDSサンプルバッファー(200 mM Tris−HCl [pH 6.8]、10% SDS、25% グリセロール、15% β−メルカプトエタノール、および0.05% ブロモフェノールブルー)と3:1の比率で混合し、室温で20分間インキュベートした。タンパク質を7.5%または10-20%勾配ゲル(Bio Craft)のSDS−PAGEにより分離し、PVDFメンブレン (Millipore)に転写した。膜を、マウス抗 GFP mAb、ウサギ抗活性型カスパーゼ−3 mAb、ウサギ抗 hATP11C Ab、ウサギ抗α−チューブリンmAb、またはラット抗 mFas mAbとインキュベートし、次いで、HRP結合ヤギ抗マウスIg、ヤギ抗ウサギIgまたはウサギ抗ラットIg (Dako)と共にインキュベートした。ペルオキシダーゼ活性は、Western Lightning-ECL システム(PerkinElmer)により検出した。
チオグリコール酸誘発腹腔マクロファージ(thoglycollate-elicited peritoneal macrophages, thio-pMacs)を調製するために、7-12週齢のメスのC57BL/6J マウスに、60 mgのチオグリコール酸(Sigma-Aldrich)を腹腔内注入し、4日後に腹腔マクロファージを集めた。貪食は、pHrodoで染色した獲物(prey)のマクロファージリソソームへの輸送により解析した (50, 51)。簡単に説明すると、thio-pMacs(5×105)を、12ウェルプレート(Corning)中で一晩増殖させた。増殖中の細胞またはアポトーシスを起こした細胞(2.0×107)をPBSで洗浄し、pHrodo(40 ng/ml)と共に室温にて10分間インキュベートし、標識した。FCS(2 ml)で反応を停止させた後、細胞を10% FCSを含むIMDMで洗浄し、1% メチルセルロース(Sigma-Aldrich)を含む培地中にてマクロファージに添加し、スインギングローターを用いて500×gで室温にて4分間スピンし、37℃でインキュベートした。マクロファージを0.25%トリプシンで処理してプレートから剥がし、APC結合ラット抗マウスMac1で染色した後、150 mM NaCl、2% FCS、および200 nM Sytox Blueを含む20 mM CHES-NaOH バッファー (pH 9.0) 中に懸濁し、FACSCanto IIを用いてフローサイトメトリーにより解析した。貪食作用は、Mac-1+ Sytox Blue- 集団におけるpHrodo陽性細胞の割合と定義した。
マウスthio-pMacsを、上記のとおり、10% FCSおよび1% メチルセルロースを含むIMDM中で2時間獲物と共にインキュベートした。その後、マクロファージをプレートから擦過により剥がし、4%パラホルムアルデヒドおよび2%グルタルアルデヒド(Nacalai Tesque)を含むPBS中で4℃で一晩インキュベートして固定化した。細胞を 0.1 M リン酸バッファーで3回洗浄後、0.1M リン酸バッファー中の1% OsO4を用いて4℃で2時間固定化(post-fixed)し、段階的に希釈したエタノール(50、60、70、80、90、および99%エタノール) 中で各20分間連続してインキュベートすることにより脱水し、次いで、100%エタノール中での30分間の浸漬を2回行った。次いで、このサンプルを、プロピレン酸化物中で1時間、プロピレン酸化物とエポキシドの1:1混合物(Luveak 812, Nacalai Tesque)中で1.5時間、プロピレン酸化物とエポキシドの1:3混合物中で1.5時間、そしてエポキシド中で12時間インキュベートすることを2回行った。その後、これらを60℃にて3日間インキュベートしてエポキシド内に取り込ませた。超薄切片(60-80 nm) を、Ultramicrotome EM UC6 (Leica)を用いて切り出し、ウラニル酢酸塩およびクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡 H-7650 (Hitachi)で観察した。
細胞(2×106)を、1.5 μMのNBD-PS、NBD-PE、またはNBD-PCと共に、25℃にて15-20分間、600μlの HBSS(1 mM MgCl2 および 2.5 mM CaCl2を含有)中でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心により回収し、脂肪酸不含有BSA(5 mg/ml)を含むHBSS中に再懸濁し、FACSAria IIにより解析した。スクランブラーゼ活性の測定のため、1.5×106の細胞を0.5 μMのNBD-PCとともに25℃にて4分間インキュベートした。
腫瘍発生を誘導するために、1×106の細胞を、7週齢のメスBALB/c無胸腺ヌードマウスに皮下注射した。4週間後、腫瘍を切り出し、計量した。
RNAを、Isogen (Nippon Gene)とRNeasy Mini Kit(Qiagen)とを用いて調製し、High Capacity RNA-to-cDNA(商標) Kit (Life Technologies, Applied Biosystems)を用いて逆転写した。このcDNAを、LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics)を用いて増幅させた。リアルタイム RT−PCRのためのプライマーは、以下のとおりである。
hCDC50A, 5’− CGATGGCGATGAACTATAACGC−3’ (配列番号29)および 5’−CGGTATAATCAATCTCGATCTC−3’ (配列番号30);
hATP11C, 5’−GGAACGTAATGCAATGGATGGG−3’ (配列番号31)および 5’− GGTTAGTTCTAAGAGCTCAGTG−3’ (配列番号32);
hβ−アクチン, 5’−GCATCCTCACCCTGAAGTAC−3’ (配列番号33)および 5’−CTTAATGTCACGCACGATTTC−3’ (配列番号34);
mCDC50A, 5’−TGCCAACAGCATGTTTAATGA−3’ (配列番号35)および 5’− TTCGAGGCTCTCTTTTCCAG−3’ (配列番号36);
mCDC50B, 5’−AACGACTCCTTCTCGCTCTG−3’ (配列番号37)および 5’−CACGAAGTCCTGGTTGATGA−3’ (配列番号38);
mCDC50C, 5’−TTTCGGAATCCAAGATCCAG−3’ (配列番号39)および 5’−CAGTCGGCGGTACAGTTTTT−3’ (配列番号40);
mATP11C, 5’−TTACAGTTGGGGCCCTTCTT− 3’ (配列番号41)および 5’−TATCCAAGGCGAGCTTCAGA−3’ (配列番号42);
mβ−アクチン, 5’− TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG−3’ (配列番号43)および 5’−TTTGATGTCACGCACGATTTCC−3’ (配列番号44)。
KBM7細胞におけるP4−ATPase および CDC50 ファミリーメンバーのPCR解析は、Takatsu ら(52)に記載される特異的プライマーを用いて行った。
データはいずれも、平均標準偏差で示す。グループ間の相違の統計的有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定した。
リン脂質フリッパーゼのハプロイド遺伝子スクリーニング
フリッパーゼをコードする遺伝子を同定するため、第8染色体を除きハプロイドの染色体からなるヒト白血病KBM7を用いたハプロイド遺伝子スクリーニングをおこなった(16)。KBM7は、NBD-PSを取り込んだ。これは、KBM7がフリッパーゼを発現していることを示す。KBM7細胞にレトロウイルスジーントラップベクターに感染させることによって、変異を誘発し、NBD-PSと共にインキュベートし、フローサイトメトリーを行った。NBD-PSの取り込みが障害された約1.0%の細胞を回収して増殖させ、2回目のソーティングを行い(図1A)、フリッパーゼの活性が低下した細胞集団を得た(LF, 低フリッピング細胞)。ジーントラップ挿入部位をLF由来のDNAを用いたインバースPCRにより増幅し、マス・シークエンシングによって同定した(17)。近接する複数のジーントラップ挿入を含む遺伝子領域における近接インデックス解析により、2種の遺伝子が同定された(図1B)。CDC50A(細胞周期制御タンパク質50A またはTMEM30A)に41個の挿入が存在し、ATP11Cに86個の挿入が存在した。ヒトゲノムデータベースの情報(UCSC Genome Browser, http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?org=human)および5'-RACE分析(図7)に基づいて解析したところ、大部分の挿入がイントロン1に割り当てられ、挿入されたレトロウイルスは転写と同じ方向であった(図1B)。逆方向の挿入はエクソン1またはプロポーター領域に存在し、遺伝子を不活性化すると考えられた。
マウス(m)ATP11Cを、W3細胞において、CRISPR/Cas (clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/cas)システムを用いて変異させた(19)。この操作により、ATP11Cの切断・不活化をもたらす挿入を有する4種のクローンを同定した。そして、そのうちの2種(ATP11CED22およびATP11CED23)を用いて更なる解析をおこなった(図3A)。ATP11CED22およびATP11CED23ではNBD-PSおよびNBD-PEの取り込みがかなり減少したが、NBD-PCは減少しなかった(図3Bおよび図8A)。
3カ所のカスパーゼ認識部位を全て変異させたカスパーゼ耐性ATP11C(CasR)を発現するATP11CED22変異体は、野生型ATP11Cを発現する細胞と同程度に効率よくNBD-PSを取り込んだ(図4A)。このことは、この変異体がフリッパーゼ活性を保持していることを示している。一方、CasRは、アポトーシス時におこるPtdSerの露出を阻害した。FasLを用いて細胞を処理すると、W3細胞、ATP11CED22、および野生型ATP11Cを発現するATP11CED22形質転換体はPtdSerを露出したが、CasRを発現するATP11CED22形質転換体ではPtdSerの露出は認められなかった(図4B)。一方、カスパーゼ-3は、これらの各種細胞のいずれにおいても活性化された(図4C)。CasR ATP11Cは、NBD-PCの取り込みによって測定されるFasL誘導性のスクランブル活性には影響しなかった (図4D)。これらの結果は、CasR形質転換体におけるFasL誘導性のPtdSer露出の欠失が、ATP11Cがカスパーゼによって不活性化されないためであることを示す。
次いで、CDC50ファミリーメンバーのうちCDC50Aのみを発現するマウスW3-Ildm細胞(図5A)を用いて、CDC50A遺伝子をCrispr/Casシステムを用いて変異させた。2種のクローン(CDC50AED29およびCDC50AED62)において、CDC50A遺伝子の両アレルに変異が導入されていた(図5B)。これらの変異体ではNBD-PSの取り込みが障害されており(図5C)、PtdSerを構成的にアポトーシス細胞と同レベルで露出した(図5Dおよび図10A)。hCDC50A cDNAを用いてCDC50AEDを形質転換すると、フリッパーゼが完全に回復し(図5C)、PtdSerは露出されなくなった(図5D)。
pHrodoで標識された CDC50AED生細胞を1.0% メチルセルロースを含む培地でthio-pMacsと培養すると、20%を越えるマクロファージがCDC50AED細胞を貪食した(図6A)。Thio-pMacsは、W3-Ildm、W3-D430G-L、またはhCDC50Aを発現するCDC50AED形質転換体を貪食しなかった。CDC50AED29の貪食は、PtdSerをマスクするMFG-E8のD89E変異体(21)によって阻害されたことから、この工程がPtdSer依存性であることが確認された。チロシンキナーゼ受容体であるMERは、thio-pMacsによるアポトーシス細胞の貪食に必須である(22)。同様に、CDC50AED生細胞は、MerTK-/- thio-pMacsによって貪食されなかった(図6B)。アポトーシス細胞をマークするために、CellEvent(商標) Caspase 3/7 Greenを培養物に加え、貪食を低速度撮影顕微鏡によってモニターした(図6C)。リソソームが強いpHrodo陽性を示すことからわかるように、CellEvent(商標)で染色されていない生細胞であってもマクロファージに高い頻度で貪食され、リソソームに移動した。また、CellEvent(商標)により染色されるアポトーシスを起こした細胞は、全体の細胞の10%未満であり、これらはマクロファージによって貪食された。132回の貪食事象をモニターすることによって、貪食された細胞のうち約80%が生存している細胞を貪食したもの、20%がアポトーシス細胞を貪食したものであることが分かった。上皮細胞のアノイキス誘導エントーシスについて報告された通り(23)、CDC50AED生細胞の貪食は、特定の時点までは可逆であるようである。すなわち、貪食された細胞の約3%が、pHrodoのシグナルが強くなる前にマクロファージから解放された(図6D)。貪食された細胞の解放は、カスパーゼ陽性細胞では観察されなかった。電子顕微鏡で調べると、貪食された生細胞は膨張した形態を有し(図6E)、凝縮した形態を示すFasL処理アポトーシス細胞とは異なっていた。同様に、CDC50A欠損KBM7細胞においても、PtdSer露出生細胞のthio-pMacsによる貪食が観察された(図11)。
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Claims (10)
- ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質をスクリーニングする方法であって、(a)細胞表面におけるホスファチジルセリンの露出、(b)細胞のマクロファージによる貪食、または(c)ATP11Cのカスパーゼによる切断を調べることを含む方法。
- 以下の工程を含む、請求項1記載の方法:
(1)ATP11CおよびCDC50Aを発現する細胞と、該阻害物質の候補物質とを接触させる工程、および、
(2)該細胞の細胞表面におけるホスファチジルセリンの露出を調べる工程、
ここで、対照と比較してホスファチジルセリンの露出を増加させる候補物質がATP11CまたはCDC50Aの阻害物質として選択される。 - 以下の工程を含む、請求項1記載の方法:
(1)ATP11CおよびCDC50Aを発現する細胞と、該阻害物質の候補物質とを接触させる工程、および、
(2)該細胞のマクロファージによる貪食を調べる工程、
ここで、対照と比較してマクロファージによる貪食を増加させる候補物質がATP11CまたはCDC50Aの阻害物質として選択される。 - 以下の工程を含む、請求項1記載の方法:
(1)ATP11CまたはCDC50Aを発現する細胞またはその膜画分と、該阻害物質の候補物質とを接触させる工程、および、
(2)ATP11Cのカスパーゼによる切断を調べる工程、
ここで、対照と比較してATP11Cの切断を増加させる候補物質がATP11Cの阻害物質として選択される。 - がんまたはアポトーシス関連疾患を治療または予防するための薬剤のスクリーニングのための、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- アポトーシス関連疾患が自己免疫疾患である、請求項5に記載の方法。
- マクロファージによる細胞の貪食を誘導する方法であって、ATP11CまたはCDC50Aを阻害することを含む方法。
- 細胞ががん細胞である、請求項7に記載の方法。
- がんまたはアポトーシス関連疾患を治療または予防するための、請求項7または8に記載の方法。
- ATP11CまたはCDC50Aの阻害物質を対象に投与することを含む、請求項7〜9のいずれかに記載の方法。
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