JP6203195B2 - Tmem16ファミリーメンバーの調節物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
1.TMEM16ファミリーメンバーの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)TMEM16ファミリーメンバー発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
(2)前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される、および
対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。
2.TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Cであり、脂質がホスファチジルコリンおよびガラクトシルセラミドから選択される、前記1に記載の方法。
3.TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Dであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、前記1に記載の方法。
4.TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Gであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、前記1に記載の方法。
5.TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Jであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、前記1に記載の方法。
6.TMEM16ファミリーメンバーの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)TMEM16ファミリーメンバー発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
(2)前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される、および
対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンの分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンの分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。
7.TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Cであり、脂質がホスファチジルコリンである、前記6に記載の方法。
8.TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Dであり、脂質がホスファチジルセリンまたはホスファチジルコリンである、前記6に記載の方法。
9.TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Gであり、脂質がホスファチジルコリンである、前記6に記載の方法。
10.TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Jであり、脂質がホスファチジルコリンである、前記6に記載の方法。
材料および細胞株
ロイシンジッパー付加ヒトFasLは、既報のとおりCOS7細胞において産生した(25)。1単位のFasLは、1.0 x 105細胞のFas発現マウスWR19L細胞(W3細胞)を4時間で死滅させる活性として定義した。カスパーゼインヒビターであるQ-VD-OPh (quinolyl-valyl-O- methylaspartyl- [-2,6-difluorophenoxy]-methyl ketone)は、R&D systems (Minneapolis, MN)より購入した。IFETは、10% FCS (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan)および50μM β-メルカプトエタノールを含有するRPMI培地中で維持した。HEK293TおよびPlat-E細胞(26)は、10% FCS含有DMEM中で培養した。
マウスTMEM16F cDNA (NCBI: NM_175344)は報告されている (20)。マウスTMEM16A (GenBank: BC062959.1)、16B (GenBank: BC033409.1)、および16G (GenBank: BC116706.1)のcDNAは、DNAFORM (Yokohama, Japan)から得た。マウスTMEM16C (NCBI: NM_001128103.1)、16D (Ensemble: ENSMUST 00000070175)、および16K (NCBI: NM_133979.2) cDNAは、RT-PCRにより脳組織から単離し、TMEM16E (NCBI: NM_177694.5)、16H (NCBI: NM_001164679.1)、および16J (NCBI: NM_178381.3) cDNAは、それぞれ骨格筋、胸腺、および胃から得た。cDNAは全て配列決定によりその塩基配列を確認した。TMEM16 cDNAの単離には以下のプライマーを使用した (制限酵素のための追加配列を下線で示す):
TMEM16A, 5'-ATATGGATCCACCATGAGGGTCCCCGAGAAGTA (配列番号1) 、および5'-ATATGAATTCCAGCGCGTCCCCATGGTACT (配列番号2);
TMEM16B, 5'-ATATGAATTCCGCATGCACTTTCACGACAACCA (配列番号3) 、および5'-ATATGAATTCTACATTGGTGTGCTGGGACC (配列番号4);
TMEM16C, 5'-ATATGGATCCAAAATGGTCCACCACTCAGGCTC (配列番号5) 、および5'-ATATCAATTGAGGCCATTCATGGTGAATAG (配列番号6);
TMEM16D, 5'-ATATAGATCTAAAATGGAGGCCAGCTCTTCTGG (配列番号7) 、および5'-ATATCAATTGTGGCCACTCATTGTGATGTG (配列番号8);
TMEM16E, 5'-ATATGGATCCGAGATGGTGGAGCAGGAAGGCTT (配列番号9) 、および5'-ATATCAATTGGACTGTAGTTTTAGCCTTCA (配列番号10);
TMEM16G, 5'-ATATAGATCTGACATGCTGCGGGGGCAAGCGCG (配列番号11) 、および5'-ATATGAATTCGCCTCCGGTAACCCCTACTG (配列番号12);
TMEM16H, 5'-ATATAGATCTGCCATGGCCGAGGCGGCTTCGGG (配列番号13) 、および5'-ATATGAATTCAGGCCTGTGACCTGCGTCCT (配列番号14);
TMEM16J, 5'-ATATGAATTCAGCATGCAGGATGATGAGAGTTC (配列番号15) 、および5'-ATATCAATTGTACATCCGTGCTCCTGGAAC (配列番号16);
TMEM16K, 5'-ATATGGATCCAAGATGAGAGTGACTTTATCAAC (配列番号:17) 、および5'-ATATCAATTGGGTAGCTTCCTTCCCATCTT (配列番号18)。
TMEM16Fコンディショナルターゲッテッドマウスは、UNITECH (Chiba, Japan)に 外注し、作成した。概略を説明すると、PGKプロモーター駆動neo遺伝子を有しFRTに挟まれたneo-loxPカセットをTMEM16F遺伝子のイントロン3に挿入した(図1A)。エクソン2を含む1.0 kbのDNAプラグメントを、対応する配列とloxP 配列とを含むフラグメントに置き換えた。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターにより動くジフテリア毒素Aフラグメント(DT-A)をベクターの5'末端に挿入した。マウスBruce-4 ES細胞にこのターゲッティングベクターをエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、PCRによりG418耐性クローンを相同組み換えについてスクリーニングした。陽性クローンを胚盤胞に注射し、TMEM16F+/NeoFRマウスを得た。
マウスTMEM16 cDNAをpMXs puro c-FLAG (20)に挿入し、C末端でFLAG標識されたタンパク質を発現させた。レトロウイルスをPlat-E細胞で産生させ、TMEM16F-/- IFETに感染させた。安定な形質転換体を2μg/mlピューロマイシンを含む培地で選択した。マウスFas cDNA (GenBank: NM_007987) を、レトロウイルスによる形質転換によりIFETに導入し、その発現を抗Fas mAb (Jo2) (MBL, Nagoya, Japan)を用いたフローサイトメトリーにより確認した。
全RNAを、Superscript III逆転写酵素 (Invitrogen, Carlsbad, CA) またはHigh Capacity RNA-to-cDNA(商標) Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて逆転写した。産物の一部を、LightCycler(登録商標)480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)を含む反応混合物中で増幅した。リアルタイムPCRに用いたプライマーは以下のとおりである:TMEM16A, 5'-ACCCCGACGCCGAATGCAAG (配列番号25) 、および5'-GCTGGTCCTGCCTGACGCTG (配列番号26); 16B, 5'-GAGGCGCACACCTGGGTCAC (配列番号27) 、および5'-ATGGGGCGTGGATCCGGACA (配列番号28); 16C, 5'-GCCAGCAATTGCCAACCCCG (配列番号29) 、および5'-GCAGTCCGACTCCTCCAGCTCT (配列番号30); 16D, 5'-ACAGGCATGCTCTTCCCCGC (配列番号31) 、および5'-GCGATCACTGCTCGGCGTCT (配列番号32); 16E, 5'-AGCAGCTCCAGCTTCGGCCT (配列番号33) 、および5'-TTCACGCTCTGCAGGGTGGC (配列番号34); 16F, 5'-CCCACCTTTGGATCACTGGA (配列番号35) 、および5'-TCGTATGCTTGTCTTTTCCT (配列番号36); 16G, 5'-ACATGTGCCCGCTGTGCTCC (配列番号37) 、および5'-GGGCCGAGGCCTCTCCTCAA (配列番号38); 16H, 5'-TGGAGGAGCCACGTCCCCAG (配列番号39) 、および5'-GCGGGGCAGACCCTTCACAC (配列番号40); 16J, 5'-GCTGTGGTGGTGACTGGGGC (配列番号41) 、および5'-CCAGGCGCGTGGATTTCCCA (配列番号42); 16K, 5'-TGGGGGCAGAAGCAGTCGGT (配列番号43) 、および5'-GGCCTGTGGGTAGCCAGGGAT (配列番号44); β-アクチン, 5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG (配列番号45) 、および5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC (配列番号46)。
細胞をRIPAバッファー [50 mM Hepes-NaOHバッファー (pH 8.0)、1% NP-40、0.1% SDS、 0.5%デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、およびプロテアーゼインヒビターカクテル (cOmplete Mini, Roche Diagnostics)含有]中で溶解した。不溶物を除去した後、細胞溶解物を5 x SDS サンプルバッファー [200 mM Tris-HCl (pH 6.8)、10% SDS、25%グリセロール、5% β-メルカプトエタノール、および0.05% ブロモフェノールブルー含有]と混合し、室温で30分インキュベートした後、10% SDS-PAGE (Bio Craft, Tokyo, Japan)により分離した。PVDF メンブレン (Millipore, Billerica, MA)にタンパク質を転写した後、メンブレンをHRP結合マウス抗FLAG M2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)と反応させ、ペルオキシダーゼ活性をWestern Lightning(登録商標)-ECL system (PerkinElmer, Waltham, MA)を用いて検出した。
Ca2+誘導性PS露出は、既報のとおり試験した(20)。説明すると、5 x 105細胞を、500μlの10 mM Hepes-NaOH バッファー (pH 7.4) (140 mM NaCl、2.5 mM CaCl2、および5μg/ml ヨウ化プロピジウム (PI)、並びに1000倍希釈したCy5標識Annexin V (Bio Vision, Milpitas, CA)を含有)中で、20℃で3.0μM A23187にて刺激し、20℃に設定したFACSAria (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) のインジェクションチャンバーに挿入した。
細胞(106) を、1 ml のHank's Balanced Salt Solution (HBSS)(Gibco, Billings, MT) (1 mM CaCl2、および蛍光プローブ:100 nM 1-オレオイル-2-{6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾキサジアゾール-4-イル)アミノ] ヘキサノイル}-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (NBD-PC)(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)または250 nM N-[6-[(7-ニトロ- 2-1,3-ベンゾキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル]-D-ガラクトシル-β1-1'-スフィンゴシン(C6-NBD ガラクトシルセラミドまたはNBD-GalCer) (Avanti Polar Lipids)含有)中にて、15℃において250 nM A23187にて刺激した。反応液の一部(150μl) を150μl のHBSS(5 mg/ml脂肪酸不含BSA (Sigma-Aldrich)および500 nM Sytoxblue (Molecular Probes, Eugene, OR)含有)と混合し、FACSAriaにて解析した。
アポトーシスは、既報のとおりFasLを用いて誘導した(25)。説明すると、マウスFasを発現するIFETを60単位/mlのFasLで37℃において2時間処理し、PSの露出をCy5-Annexin Vを用いたフローサイトメトリーにより評価した。活性化カスパーゼ3の検出のため、細胞を37℃で10分間1%パラホルムアルデヒド含有PBSで固定し、-20℃において90%メタノールにて透過処理し、活性型カスパーゼ3に対するウサギmAb (Cell Signaling, Danvers, MA)で染色した。次いで、細胞をAlexa 488標識ヤギ抗ウサギIgG (Invitrogen)とともにインキュベートし、FACSAriaにより解析した。
C末端でFLAG標識したTMEM16配列をpEF-BOS-EX(31)に挿入した。HEK293T細胞 (2.5 x 105)に、1.0μgのTMEM16発現ベクターと0.1μgのpMAX-EGFP (Lonza Group, Basel, Switzerland)をFuGENE6 (Promega, Madison, WI)を用いて導入した。24時間後、細胞をフィブロネクチン(Sigma-Aldrich)でコートしたガラスカバースリップ上に再度播種した。再播種から24時間以内に、EGFP発現細胞のホールセルレコーディングを、パッチクランプ増幅器(Axopatch 200B, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて既報のとおり実施した(23, 32)。細胞外液は、140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、30 mMグルコース、および10 mM Hepes-NaOH (pH 7.4)を含有した。細胞内液は、140 mM NaCl、1.12 mM EGTA、1 mM CaCl2、30 mMグルコース、および10 mM Hepes-NaOH (pH7.4)を含有した。遊離のCa2+濃度(500 nM) は、WEBMAXCソフトウェア (http://www.stanford.edu/_cpatton/ maxc.html)を用いて算出した。
TMEM16F-/-胎児胸腺細胞株の樹立
Ca2+依存性PS露出は、TMEM16F mRNAのノックダウンにより減少し、TMEM16Fの過剰発現により促進されることから、TMEM16Fがリン脂質スクランブラーゼであると考えられた (20)。TMEM16FがCa2+依存性リン脂質スクランブリングに関与することを確認し、また、TMEM16Fがアポトーシス細胞死における細胞表面へのPS露出に関与しているかを調べるため、胎児胸腺組織からTMEM16Fを含めTMEM16ファミリーメンバーをほとんど発現しないTMEM16F欠損マウス細胞株を樹立した(下記参照)。
20℃においてCa2+イオノフォアA23187で処理したTMEM16Fflox/flox IFETは、迅速にPSを露出した(図2A)。しかしながら、この露出は、TMEM16-/- IFETでは全く観察されなかった。同様に、TMEM16Fflox/floxIFETをA23187で処理すると、ROペプチド(20)の結合により検出されるPE露出が迅速に起こったが、TMEM16F-/- IFETでは起こらなかった(データ非提示)。次に、脂質取り込みにおけるTMEM16Fの役割を調べたところ、TMEM16Fflox/floxIFETではCa2+イオノフォアの処理によりNBD-PCおよびNBD-GalCerが取り込まれたが、TMEM16-/- IFETでは取り込まれなかった(図2Bおよび図2C)。これらの結果は、TMEM16FがIFETにおけるCa2+依存性の脂質スクランブリングに重要な役割を果たしていることを示している。
10種類のTMEM16ファミリーメンバーは類似のトポロジーを有し、そのアミノ酸配列は20-60%の範囲で同一である(35, 36)。TMEM16ファミリーメンバーにリン脂質をスクランブルする能力が存在するかどうか調べるため、Ca2+依存性の脂質スクランブラーゼ活性が完全に消失しているTMEM16F-/- IFETを、FLAG標識TMEM16ファミリーメンバーを有するマウスレトロウイルスベクターで形質転換した。内在性のDNA配列をもつTMEM16C、16D、および16Eの発現プラスミドは、IFETにおけるタンパク質発現レベルが非常に低かったことから、mRNAの安定性と翻訳効率を最適化するため、それらの配列を改変した。抗FLAG mAbを用いたウェスタンブロッティングにより、各TMEM16ファミリーメンバーに特異的なバンドが検出された(図3A)。TMEM16Kを除き、SDS-PAGEで検出されたそれらの見かけの分子量は計算上の分子量よりも大きいが、これは、これらのメンバーが1-6個のN-グリコシル化部位を有することから、グリコシル化によるものと考えられる。一方、推定N-グリコシル化部位を有さないTMEM16Kの見かけの分子量(65 kDa)は、その推定分子量 (76 kDa)よりもかなり小さかった。一部の膜タンパク質はSDS-PAGEにおいて変則的な挙動をみせることが知られており(37)、TMEM16Kはこのカテゴリーに属する可能性がある。また、ウェスタンブロッティングにおいて、大部分のTMEM16ファミリーメンバーは同様のレベルで発現していたが、他のファミリーメンバーよりもTMEM16Eのレベルは3-5倍低く、TMEM16Kのレベルは5-10倍高かった(図3A)。予想どおり、Ca2+イオノフォアの処理により、TMEM16Fを発現するTMEM16F-/- IFET形質転換体では効率的なPS露出が誘導された(図3B)。TMEM16D、並びにTMEM16Gおよび16Jの形質転換体もまたCa2+の処理によりPSを露出したが、TMEM16Gまたは16JのPSを露出させる能力は、TMEM16Fおよび16Dよりも弱かった。一方、TMEM16A、16B、16C、16E、16H、および16Kでは、PS露出活性は、検出されないか、または非常に弱かった。同様に、TMEM16F-/- IFETは、NBD-PSの取り込み能を消失しており、この活性は、TMEM16D、16F、および16Jで細胞を形質転換することにより強く、TMEM16Gにより弱く、回復した。一方、TMEM16Cおよび16Eを発現するIFET形質転換体は、NBD-PSを取り込まなかった(データ非提示)。
TMEM16Fは、PSおよびPEだけでなく、他の脂質もスクランブルした(図2)。他のTMEM16ファミリーメンバーの脂質スクランブラーゼ活性を調べるため、TMEM16ファミリーメンバーを発現するTMEM16F-/- IFETを蛍光プローブであるNBD-PCまたはNBD-GalCerとインキュベートした。図4Aに示すように、TMEM16Dを発現するTMEM16F-/- IFETは、構成的に、すなわちA23187処理なしで、NBD-PCを取り込み、この取り込みはA23187処理により強く増強された。TMEM16D形質転換体によるA23187誘導性のNBD-PC取り込みは、TMEM16F形質転換体で観察された取り込みよりも強かった。細胞透過性Ca2+キレーターであるBAPTA-AMによりTMEM16D形質転換体を前処理すると、Ca2+イオノフォアなしで観察されたNBD-PC取り込みが減少したことから(図4B)、TMEM16Dのスクランブリング活性には内在性の細胞内Ca2+レベルで十分であると考えられた。PS露出と同様に、TMEM16A、16B、16E、16H、または16Kを発現するIFETでは、A23187処理によりNBD-PC取り込みは誘導されなかった(図4A)。一方、TMEM16C、16G、または16Jを発現する細胞は、Ca2+ イオノフォアで処理するとNBD-PCを取り込んだ。
TMEM16Aおよび16Bは、Ca2+依存性のCl-チャネルである(22-24)。他のTMEM16ファミリーメンバーがCl-チャネル活性を持つかどうか調べるため、また、TMEM16ファミリーメンバーのスクランブラーゼ活性がCl-チャネル活性に依存するかを調べるため、ヒト293T細胞にTMEM16発現プラスミドとGFP発現ベクターを導入した(図5A)。次いで、GFP陽性細胞のCa2+依存性クロライドチャネル活性を、ホールセルパッチクランプ法により解析評価した(23)。293T細胞株を宿主細胞として選択したが、これは、この細胞がCa2+依存性のCl-チャネル活性をほとんど有さず(図5B)、また、この細胞を使用してTMEM16Aおよび16BがCl-チャネルとして機能することが示されているからである(22-24)。
各種マウス組織におけるTMEM16 mRNAのリアルタイムPCR解析により、各組織は限られた数のTMEM16ファミリーメンバーしか発現しないことが示された(図6)。2つのTMEM16ファミリーのCl-チャネル、TMEM16Aおよび16Bのうち、TMEM16Bは脳および眼組織に強く発現しているが、TMEM16Aを強く発現する組織、膵臓、肝臓、唾液腺、胃、肺、皮膚、および乳腺では、ほとんど発現していなかった。TMEM16ファミリーの5つの脂質スクランブラーゼ、すなわち16C、16D、16F、16G、および16J、のうち、TMEM16Fは各種組織に広範に発現していた。一方、他のスクランブラーゼは、少数の組織にのみ存在した。すなわち、TMEM16Cおよび16Jは、それぞれ脳および皮膚に強く発現し、一方、16Dは、脳、卵巣、心臓、および眼などの少数の組織に低レベルで観察され、16Gおよび16Jは胃および腸で観察された。スクランブラーゼ活性またはCl-チャネル活性を示さなかったTMEM16タンパク質のうち、16Hおよび16Kは各種組織に広範に発現し、一方、16Eは筋肉および皮膚にのみ発現していた。
1. Balasubramanian, K., and Schroit, A. (2003) Aminophospholipid asymmetry: A matter of life and death, Annu. Rev. Physiol. 65, 701-734
2. van Meer, G., Voelker, D., and Feigenson, G. (2008) Membrane lipids: where they are and how they behave, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 112-124
3. Nagata, S., Hanayama, R., and Kawane, K. (2010) Autoimmunity and the clearance of dead cells, Cell 140, 619-630
4. Zwaal, R. F., Comfurius, P., and Bevers, E. M. (1998) Lipid-protein interactions in blood coagulation, Biochim. Biophys. Acta 1376, 433-453
5. Boas, F. E., Forman, L., and Beutler, E. (1998) Phosphatidylserine exposure and red cell viability in red cell aging and in hemolytic anemia., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3077-3081
6. Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., and Nagata, S. (2005) Phosphatidylserine- dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells, Nature 437, 754-758
7. Sessions, A., and Horwitz, A. (1983) Differentiation-related differences in the plasma membrane phospholipid asymmetry of myogenic and fibrogenic cells, Biochim. Biophys. Acta 728, 103-111
8. Helming, L., and Gordon, S. (2009) Molecular mediators of macrophage fusion, Trends Cell Biol. 19, 514-522
9. Adler, R., Ng, A., and Rote, N. (1995) Monoclonal antiphosphatidylserine antibody inhibits intercellular fusion of the choriocarcinoma line, JAR, Biol. Reprod. 53, 905-910
10. Gadella, B., and Harrison, R. (2002) Capacitation induces cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-dependent, but apoptosis-unrelated, exposure of aminophospholipids at the apical head plasma membrane of boar sperm cells, Biol. Reprod. 67, 340-350
11. Leventis, P. A., and Grinstein, S. (2010) The Distribution and Function of Phosphatidylserine in Cellular Membranes, Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427
12. Folmer, D., Elferink, R., and Paulusma, C. (2009) P4 ATPases - lipid flippases and their role in disease, Biochim. Biophys. Acta 1791, 628-635
13. Oram, J., and Vaughan, A. (2000) ABCA1-mediated transport of cellular cholesterol and phospholipids to HDL apolipoproteins, Curr. Opin. Lipidol 11, 253-260
14. Williamson, P., Halleck, M., Malowitz, J., Ng, S., Fan, X., Krahling, S., Remaley, A., and Schlegel, R. (2007) Transbilayer phospholipid movements in ABCA1-deficient cells, PLoS ONE 2, e729
15. Bevers, E., and Williamson, P. (2010) Phospholipid scramblase: an update, FEBS Lett. 584, 2724-2730
16. Basse, F., Stout, J. G., Sims, P. J., and Wiedmer, T. (1996) Isolation of an erythrocyte membrane protein that mediates Ca2+-dependent transbilayer movement of phospholipid, J. Biol. Chem. 271, 17205-17210
17. Zhou, Q., Zhao, J., Stout, J., Luhm, R., Wiedmer, T., and Sims, P. (1997) Molecular cloning of human plasma membrane phospholipid scramblase. A protein mediating transbilayer movement of plasma membrane phospholipids, J. Biol. Chem. 272, 18240-18244
18. Zhou, Q., Zhao, J., Wiedmer, T., and Sims, P. J. (2002) Normal hemostasis but defective hematopoietic response to growth factors in mice deficient in phospholipid scramblase 1, Blood 99, 4030-4038
19. Sahu, S., Gummadi, S., Manoj, N., and Aradhyam, G. (2007) Phospholipid scramblases: an overview, Arch. Biochem. Biophys. 462, 103-114
20. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., and Nagata, S. (2010) Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F, Nature 468, 834-838
21. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., and Bevers, E. M. (2011) Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome, Blood 117, 4399-4400
22. Caputo, A., Caci, E., Ferrera, L., Pedemonte, N., Barsanti, C., Sondo, E., Pfeffer, U., Ravazzolo, R., Zegarra-Moran, O., and Galietta, L. (2008) TMEM16A, a membrane protein associated with calcium-dependent chloride channel activity, Science 322, 590-594
23. Schroeder, B., Cheng, T., Jan, Y., and Jan, L. (2008) Expression cloning of TMEM16A as a calcium-activated chloride channel subunit, Cell 134, 1019-1029
24. Yang, Y., Cho, H., Koo, J., Tak, M., Cho, Y., Shim, W., Park, S., Lee, J., Lee, B., Kim, B., Raouf, R., Shin, Y., and Oh, U. (2008) TMEM16A confers receptor-activated calcium-dependent chloride conductance, Nature 455, 1210-1215
25. Shiraishi, T., Suzuyama, K., Okamoto, H., Mineta, T., Tabuchi, K., Nakayama, K., Shimizu, Y., Tohma, J., Ogihara, T., Naba, H., Mochizuki, H., and Nagata, S. (2004) Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif, Biochem. Biophys. Res. Commun. 322, 197-202
26. Morita, S., Kojima, T., and Kitamura, T. (2000) Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses, Gene Ther. 7, 1063-1066
27. Kanki, H., Suzuki, H., and Itohara, S. (2006) High-efficiency CAG-FLPe deleter mice in C57BL/6J background, Exp. Anim. 55, 137-141
28. Imao, T., and Nagata, S. (2012) Apaf-1- and Caspase-8-independent apoptosis, Cell Death Differ
29. Akagi, T., Sasai, K., and Hanafusa, H. (2003) Refractory nature of normal human diploid fibroblasts with respect to oncogene-mediated transformation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 13567-13572
30. Watson, J. D., Morrissey, P. J., Namen, A. E., Conlon, P. J., and Widmer, M. B. (1989) Effect of IL-7 on the growth of fetal thymocytes in culture, J. Immunol. 143, 1215-1222
31. Murai, K., Murakami, H., and Nagata, S. (1998) Myeloid-specific transcriptional activation by murine myeloid zinc finger protein-2, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3461-3466
32. Kuba, H., Yamada, R., and Ohmori, H. (2003) Evaluation of the limiting acuity of coincidence detection in nucleus laminaris of the chicken, J. Physiol. 552, 611-620
33. Ogasawara, J., Suda, T., and Nagata, S. (1995) Selective apoptosis of CD4 CD8 thymocytes by the anti-Fas antibody, J. Exp. Med. 181, 485-491
34. Dive, C., Gregory, C. D., Phipps, D. J., Evans, D. L., Milner, A. E., and Wyllie, A. H. (1992) Analysis and discrimination of necrosis and apoptosis (programmed cell death) by multiparameter flow cytometry, Biochim. Biophys. Acta 1133, 275-285
35. Galietta, L. (2009) The TMEM16 protein family: a new class of chloride channels?, Biophys. J. 97, 3047-3053
36. Duran, C., and Hartzell, H. C. (2011) Physiological roles and diseases of tmem16/anoctamin proteins: are they all chloride channels?, Acta Pharmacolgica Sinica 32, 685-692
37. Rath, A., Glibowicka, M., Nadeau, V. G., Chen, G., and Deber, C. M. (2009) Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 1760-1765
38. Segawa, K., Suzuki, J., and Nagata, S. (2011) Constitutive exposure of phosphatidylserine on viable cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 19246-19251
39. Williamson, P., Christie, A., Kohlin, T., Schlegel, R., Comfurius, P., Harmsma, M., Zwaal, R., and Bevers, E. (2001) Phospholipid scramblase activation pathways in lymphocytes, Biochemistry 40, 8065-8072
40. Schoenwaelder, S., Yuan, Y., Josefsson, E., White, M., Yao, Y., Mason, K., O'Reilly, L., Henley, K., Ono, A., Hsiao, S., Willcox, A., Roberts, A., Huang, D., Salem, H., Kile, B., and Jackson, S. (2009) Two distinct pathways regulate platelet phosphatidylserine exposure and procoagulant function, Blood 114, 663-666
41. Martins, J. R., Faria, D., Kongsuphol, P., Reisch, B., Schreiber, R., and Kunzelmann, K. (2011) Anoctamin 6 is an essential component of the outwardly rectifying chloride channel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 108, 18168-18172
42. Hampton, M., Vanags, D., Porn-Ares, M., and Orrenius, S. (1996) Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis, FEBS Lett. 399, 277-282
43. Hartzell, H. C., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T., and Qu, Z. (2009) Anoctamin/TMEM16 family members are Ca2+-activated Cl- channels, J. Physiol. 587, 2127-2139
44. Schreiber, R., Uliyakina, I., Kongsuphol, P., Warth, R., Mirza, M., Martins, J., and Kunzelmann, K. (2010) Expression and function of epithelial anoctamins, J. Biol. Chem. 285, 7838-7845
45. Duran, C., Qu, Z., Osunkoya, A. O., Cui, Y., and Hartzell, H. C. (2012) ANOs 3-7 in the anoctamin/Tmem16 Cl- channel family are intracellular proteins, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, C482-493
46. Palmgren, M. G., and Nissen, P. (2011) P-type ATPases, Annu. Rev. Biophys. 40, 243-266
47. Chen, T.-Y., and Hwang, T.-C. (2008) CLC-0 and CFTR: chloride channels evolved from transporters, Physiol. Rev. 88, 351-387
48. Ferrera, L., Caputo, A., Ubby, I., Bussani, E., Zegarra-Moran, O., Ravazzolo, R., Pagani, F., and Galietta, L. (2009) Regulation of TMEM16A chloride channel properties by alternative splicing, J. Biol. Chem. 284, 33360-33368
49. Mizuta, K., Tsutsumi, S., Inoue, H., Sakamoto, Y., Miyatake, K., Miyawaki, K., Noji, S., Kamata, N., and Itakura, M. (2007) Molecular characterization of GDD1/TMEM16E, the gene product responsible for autosomal dominant gnathodiaphyseal dysplasia, Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 126-132
50. Bolduc, V., Marlow, G., Boycott, K., Saleki, K., Inoue, H., Kroon, J., Itakura, M., Robitaille, Y., Parent, L., Baas, F., Mizuta, K., Kamata, N., Richard, I., Linssen, W., Mahjneh, I., de Visser, M., Bashir, R., and Brais, B. (2010) Recessive Mutations in the Putative Calcium-Activated Chloride Channel Anoctamin 5 Cause Proximal LGMD2L and Distal MMD3 Muscular Dystrophies, Am. J. Hum. Genet. 86, 213-221
51. Tsutsumi, S., Kamata, N., Vokes, T., Maruoka, Y., Nakakuki, K., Enomoto, S., Omura, K., Amagasa, T., Nagayama, M., Saito-Ohara, F., Inazawa, J., Moritani, M., Yamaoka, T., Inoue, H., and Itakura, M. (2004) The novel gene encoding a putative transmembrane protein is mutated in gnathodiaphyseal dysplasia (GDD), Am. J. Hum. Genet. 74, 1255-1261
52. Vermeer, S., Hoischen, A., Meijer, R. P. P., Gilissen, C., Neveling, K., Wieskamp, N., de Brouwer, A., Koenig, M., Anheim, M., Assoum, M., Drouot, N., Todorovic, S., Milic-Rasic, V., Lochmuller, H., Stevanin, G., Goizet, C., David, A., Durr, A., Brice, A., Kremer, B., Warrenburg, B. P. C. v. d., Schijvenaars, M. M. V. A. P., Heister, A., Kwint, M., Arts, P., van der Wijst, J., Veltman, J., Kamsteeg, E.-J., Scheffer, H., and Knoers, N. (2010) Targeted Next-Generation Sequencing of a 12.5 Mb Homozygous Region Reveals ANO10 Mutations in Patients with Autosomal-Recessive Cerebellar Ataxia, Am. J. Hum. Genet. 87, 813-819
53. van den Eijnde, S., van den Hoff, M., Reutelingsperger, C., van Heerde, W., Henfling, M., Vermeij-Keers, C., Schutte, B., Borgers, M., and Ramaekers, F. (2001) Transient expression of phosphatidylserine at cell-cell contact areas is required for myotube formation, J. Cell Sci. 114, 3631-3642
54. Stowell, S. R., Karmakar, S., Arthur, C. M., Ju, T., Rodrigues, L. C., Riul, T. B., Dias-Baruffi, M., Miner, J., McEver, R. P., and Cummings, R. D. (2009) Galectin-1 induces reversible phosphatidylserine exposure at the plasma membrane, Mol. Biol. Cell 20, 1408-1418
55. Del Buono, B. J., White, S. M., Williamson, P. L., and Schlegel, R. A. (1989) Plasma membrane lipid organization and the adherence of differentiating lymphocytes to macrophages, J. Cell. Physiol. 138, 61-69
56. Fischer, K., Voelkl, S., Berger, J., Andreesen, R., Pomorski, T., and Mackensen, A. (2006) Antigen recognition induces phosphatidylserine exposure on the cell surface of human CD8+ T cells, Blood 108, 4094-4101
57. Ehlen, H. W., Chinenkova, M., Moser, M., Munter, H. M., Krause, Y., Gross, S., Brachvogel, B., Wuelling, M., Kornak, U., and Vortkamp, A. (2013) Inactivation of Anoctamin-6/Tmem16f, a regulator of phosphatidylserine scrambling in osteoblasts, leads to decreased mineral deposition in skeletal tissues, J. Bone Miner. Res. 28, 246-259
58. Charlesworth, G., Plagnol, V., Holmstrom, K. M., Bras, J., Sheerin, U.-M., Preza, E., Rubio-Agusti, I., Ryten, M., Schneider, S. A., Stamelou, M., Trabzuni, D., Abramov, A. Y., Bhatia, K. P., and Wood, N. W. (2012) Mutations in ANO3 cause dominant craniocervical dystonia: ion channel implicated in pathogenesis., Am. J. Hum. Genet. 91, 1041-1050
59. Kashyap, M. K., Marimuthu, A., Kishore, C. J. H., Peri, S., Keerthikumar, S., Prasad, T. S. K., Mahmood, R., Rao, S., Ranganathan, P., Sanjeeviah, R. C., Vijayakumar, M., Kumar, K. V. V., Montgomery, E. A., Kumar, R. V., and Pandey, A. (2009) Genomewide mRNA profiling of esophageal squamous cell carcinoma for identification of cancer biomarkers., Cancer Biol. Ther. 8, 36-46
60. Das, S., Hahn, Y., Nagata, S., Willingham, M., Bera, T., Lee, B., and Pastan, I. (2007) NGEP, a prostate-specific plasma membrane protein that promotes the association of LNCaP cells, Cancer Res 67, 1594-1601
Claims (4)
- TMEM 16Cの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)TMEM 16C発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
(2)前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルコリンおよびガラクトシルセラミドから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を増加させる候補物質は、TMEM 16Cの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を減少させる候補物質は、TMEM 16Cの機能を抑制する調節物質として選択される。 - TMEM 16Dの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)TMEM 16D発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
(2)前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEM 16Dの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEM 16Dの機能を抑制する調節物質として選択される、および
対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を増加させる候補物質は、TMEM 16Dの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を減少させる候補物質は、TMEM 16Dの機能を抑制する調節物質として選択される。 - TMEM 16Gの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)TMEM 16G発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
(2)前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEM 16Gの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEM 16Gの機能を抑制する調節物質として選択される、および
対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を増加させる候補物質は、TMEM 16Gの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を減少させる候補物質は、TMEM 16Gの機能を抑制する調節物質として選択される。 - TMEM 16Jの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)TMEM 16J発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
(2)前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEM 16Jの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEM 16Jの機能を抑制する調節物質として選択される、および
対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を増加させる候補物質は、TMEM 16Jの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を減少させる候補物質は、TMEM 16Jの機能を抑制する調節物質として選択される。
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