JPWO2015151738A1 - 分析装置 - Google Patents
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Abstract
分析装置は、光透過性を有する第１の基板と、流体の注入口と排出口を有する第２の基板とを少なくとも備えるフローチップと、前記フローチップを保持する保持部材と、前記保持部材が設置される固定部材であって、前記フローチップの前記第２の基板と接触する固定部材と、前記流体を前記注入口へ送り、前記排出口から排出させる流体送液部と、前記フローチップの前記第１の基板側に配置された光学検出部と、前記保持部材をＸＹ方向に駆動する駆動部と、を備える。
Description
本発明は、分析装置に関する。
１９９０年から２００５年の間に３０億ドルの予算を投じたヒトゲノム計画では、解読に必要な技術や方法を遺産として残した。そうした技術はその後もさらに改良が進み、今日では、実質的に１０００ドルで実用に耐えられる精度でのゲノム解読が可能になってきている。
次世代シーケンスの計測の中心となるのは、多数の微小反応場を固定したフローチップである。フローチップ上に固定された微小反応場上にて化学反応を行い、そこから発せられる蛍光信号を解析することにより、核酸の塩基配列の解析が可能となる。フローチップは多数の微小反応場を固定したスライドガラスの消耗品であり、試薬の注入口と排出口を持つ流路を備える。この注入口と排出口を通じて、塩基伸長反応に必要となる酵素、異なる複数の蛍光色素で修飾されたヌクレオチド、伸長をブロックする保護基を分解する試薬、及び、イメージング時にフローチップ流路などを満たすイメージングバッファなどの１０−４０種類の試薬がフローチップに送られる。また、ここで説明する微小反応場の代表的な例として１μｍのビーズを挙げることができる。
試薬を送液した後に、フローチップ内流路にある試薬の種類に応じて、フローチップ内の試薬の温度制御が必要な場合がある。これは化学反応を正確かつ効率良く進行させるために必要であり、一般にヒートブロックと呼ばれるアルミの板にフローチップを密着させ、１０−８０℃の範囲で温調する。送液と温調動作を段階的に進め、微小反応場上のＤＮＡに１塩基分の蛍光ヌクレオチドを取り込ませることができる。次に光学計測を行う。一般にフローチップの片側は温調を行うヒートブロックに密着しているため、フローチップの別の側に対物レンズを配置する。対物レンズを介してフローチップ基板上の微小反応場に励起光が照射されると、蛍光を発する。この蛍光をＣＭＯＳカメラなどの２次元センサに捉えることにより、フローチップ基板上に多数固定された微小反応場の蛍光情報を画像として得ることができる。
次に必要となるのがフローチップの計測視野を、固定された対物レンズの光軸に対して移動させることである。より具体的には、フローチップが固定されているヒートブロックをＸＹステージに固定し、ＸＹステージを一定距離駆動させることにより、隣接したパネルを光軸上に逐次位置合わせする。従って、フローチップ周辺部は、試薬送液、温度制御、光学検出、及びステージ駆動の制御を行うがための部品および動作が局所的に集中・密集する箇所である。このため、それぞれの部品が機械的に衝突・干渉せず、円滑に駆動することが必要となる。
一方、次世代シーケンサの診断への応用が急速に進んでいる。診断分野における次世代シーケンサ技術の展開における重要な課題の一つとして、診断コストの低減化がある。このような状況の中、消耗品であるフローチップのコストを低減することが診断コスト低減への鍵となる。より具体的にはフローチップの小型化が課題となっている。
上記課題に対して、特許文献１は、フローチップ内で流路を迂回させることで、流路系の注入口と排出口を近接させる構成を開示している。この構成によれば、フローチップ上の流路接続部品の位置を２箇所から１箇所に集約することができる。これにより、対物レンズと流路接続部の干渉箇所数を低減し、フローチップの小型化を実現している。具体的には、フローチップの大きさは７５ｍｍ×２５ｍｍであったが、これを３０ｍｍ×１５ｍｍのサイズまで小型化している。さらに、特許文献１には、フローチップの操作性を考慮して、フローチップを保持するフローチップカートリッジについても記載されている。
一方、１回の画像で計測できるフローチップの領域を１パネルと呼ぶ。フローチップ１枚の大きさは３０ｍｍ×１５ｍｍであるのに対して、非特許文献１に示されるように、計測するパネル数は１４パネルである。１パネルの大きさは大きく見積もっても最大０．７５ｍｍ×０．７５ｍｍであるため、光学計測に用いる領域は１０．５ｍｍ×０．７５ｍｍとなる。すなわち、フローチップの高々２％の領域しか実際の光学計測には使用されていない。従って、さらなるフローチップ小型化の余地は依然として大きい。また、特許文献１において、流路を迂回させることができるのはパネルを１２×１の数に限定したためである。つまり、１列方向にのみパネルを配置し、Ｘ方向のみにステージ駆動を限定することにより、フローチップ内で流路を迂回させている。ＸＹの２方向にフローチップを駆動させる構成に適用する場合、迂回する流路を形成する構成では、流路壁のためにフローチップを大きくすることができない。また、迂回する流路を形成する構成では、製造方法が煩雑になるため、コストが上昇する。従って、特許文献１の流路迂回方式が有効であるのは、パネル数を１０程度に限定した場合のみであり、スループットが限定され、かつ適用できるアプリケーションもスループットが低いものに限定される。
また、フローチップの長手方向に３０ｍｍの大きさを必要とするのは、以下の理由からである。温調のためにフローチップの片面にヒートブロックを設置し、フローチップの他方の面において試薬の送液と光学検出を行う必要がある。したがって、フローチップの流路接続部と対物レンズの機械的な干渉を回避するため、フローチップのサイズを一定以上の大きさにする必要がある。したがって、従来ではフローチップの小型化が困難であった。
また、次世代シーケンス開発において重要視される指標はスループットである。スループットとは１ランあたりに出力できる総塩基数であり、これを増加させるために技術開発が進んでいる。従来、フローチップ基板上には反応場がランダムばらまかれ、固定されていた。しかしながら、上記のランダム固定の構成では、（１）反応場同士が一定の確率で近接してしまうため、分解能以上に近接した反応場の解析が困難になる、（２）輝点間の距離がランダムであるため、輝点間のクロストークの影響が輝点毎に異なり、検出精度のばらつきが大きいなど、いくつかの課題がある。これらの課題を克服すべく、近年注目されているのが反応場を格子状に基板に配置することができる技術である。
非特許文献２では、半導体リソグラフィー技術を用いてシリコン基板上にアミノシラン膜を格子状に配置する技術が記載されている。また、非特許文献３では、単分子シーケンサにおける、基板上に格子状にサンプルを配置する方法について記載されている。本技術は光リソグラフィーによってガラス基板上にナノ開口と呼ばれる穴を形成する。このナノ開口は半導体リソグラフィー技術により規則正しく基板上に形成される。ナノ開口の直径は波長よりも短いため、ナノ開口に固定された蛍光単分子を励起するための励起光は直接ナノ開口を通過することができない。しかし、光の染み出しにより、ナノ開口近傍の微小領域のみを照明することができる。この効果により、溶液に浮遊する蛍光色素を励起することを回避し、検出したいごく微小な領域にのみ励起光を照射することができる。これにより、単分子リアルタイムシーケンスを達成することが可能となる。なお、単分子リアルタイムシーケンスにおいては、シーケンス反応時に視野を固定して、反応を連続的に２次元カメラで１００Ｈｚのフレームレートで高速に撮像する。このため反応中の試薬の置換は必要とならない。
上述したフローチップ上に反応場を規則的に配置する技術は、スループットの増大に大きく寄与するが、同時に基板の製造に要するコストが増大する。従来のランダム固定に用いる基板がリソグラフィー工程を必要としないのに対して、反応場を基板上に規則的に配置するためにはリソグラフィー工程が必要となるからである。これは消耗品であるフローチップのコストの増大を不可避とする。従って、ここでも対物レンズと流路接続部の干渉を回避し、フローチップを小さくすることによりコストの増大を回避する必要がある。
「MiSeq System User Guide」、Part # 15027617、Rev. F、Illumina社、November 2012、pages 8, 13
Science. 2010 Jan 1; 327(5961):78-81
Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 29; 105(4):1176-81
従来のシーケンス計測では、フローチップの片面にヒートブロックを設置して温調しながら、もう片方のフローチップの面において試薬の送液と光学検出を行う必要があった。フローチップの流路接続部と対物レンズの機械的な干渉を回避するため、フローチップのサイズを一定以上の大きさにする必要があり、消耗品であるフローチップのコストの低減が困難であった。
本発明の目的は、フローチップの流路接続部と対物レンズの機械的な干渉を回避しながら、フローチップの小型化が可能な分析装置を提供することにある。
上記課題を解決する為に、例えば請求の範囲に記載の構成を採用する。本願は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例をあげるならば、光透過性を有する第１の基板と、流体の注入口と排出口を有する第２の基板とを少なくとも備えるフローチップと、前記フローチップを保持する保持部材と、前記保持部材が設置される固定部材であって、前記フローチップの前記第２の基板と接触する固定部材と、前記流体を前記注入口へ送り、前記排出口から排出させる流体送液部と、前記フローチップの前記第１の基板側に配置された光学検出部と、前記保持部材をＸＹ方向に駆動する駆動部と、を備える分析装置が提供される。
本発明によれば、フローチップを小型化できるため、フローチップに必要となるコストを低減することが可能となる。
本発明に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施例の説明により明らかにされる。
本発明に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施例の説明により明らかにされる。
以下、添付図面を参照して本発明の実施例について説明する。なお、添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施例を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。以下の実施例は、分析装置に関し、より具体的には、ＤＮＡあるいはＲＮＡなどの核酸の塩基配列を解読するための核酸配列解析装置に関するものである。
図１０は、従来のフローチップの構成を示す図である。従来のフローチップ１０００は、カバーガラス１００１、スペーサ１００４、及び、基板１００６の３つの部材を張り合わせて作製される。カバーガラス１００１は、流路の注入口１００２及び排出口１００３を有する。スペーサ１００４は、ＰＤＭＳなどの素材より製造されることが一般的である。スペーサ１００４の厚さは３０―１００μｍであり、より詳細には５０μｍであることが望ましい。また、スペーサ１００４は、上記３つの部材を貼り合わせたときに流路を形成するための打ち抜き穴１００５を有する。スペーサ１００４をカバーガラス１００１及び基板１００６で挟みこむことにより、流路が形成される。また、基板１００６の表面には化学修飾が施されており、ＤＮＡ断片を効率的に結合することができる。基板１００６の代表的な表面修飾の方法として、ポリリジン、アミノシランあるいはエポキシコーティングを挙げることができる。いずれの方法も電気的に負の電荷を持つＤＮＡ分子に対して正の電荷を持つことを特徴としている。
これに対して、図１は、本実施例における基板背面に流路穴を有するフローチップの構成を示す図である。本実施例のフローチップ１００は、光学的に透明な特性（光透過性）を有するカバーガラス１０１、スペーサ１０２、及び、基板１０３の３つの部材を張り合わせて作製される。スペーサ１０２は、流路を形成するための打ち抜き穴１０４を有する。また、本発明の特徴として、基板１０３が、流路の注入口１０５及び排出口１０６を有する。その他の構成は、上述した従来のフローチップと同様である。
フローチップ１００の基板１０３は、シリコン基板であり、基板１０３には、半導体光リソグラフィー工程を経てＤＮＡを選択的に吸着できる吸着サイトが形成されている。すなわち、基板１０３は、半導体光リソグラフィー工程により、格子状かつ規則的に一定間隔で反応部位を有する。吸着サイトには、具体的にはＤＮＡを選択的に結合できるアミノシラン、ポリリジン、あるいはエポキシが結合している。あるいは、吸着サイトには、ＤＮＡを選択的に結合できる表面処理が施されている。
この構成によれば、フローチップの小型化が可能となる。本実施例のフローチップ１００の具体的なサイズについては後述する。なお、図１では、スペーサ１０２を用いて流路を形成する例を示したが、この構成に限定されない。例えば、カバーガラス及び基板の２つの部材を張り合わせてフローチップを構成してもよい。この場合、カバーガラス及び基板の一方に溝を形成することにより流路が形成される。
図２Ａ〜図２Ｄは、本実施例のフローチップ用のカートリッジの構成を示す図であり、フローチップカートリッジ２０１を裏方向より見た図である。フローチップカートリッジ２０１は、小型化したフローチップ１００のハンドリング性を向上させるために、フローチップ１００を保持するものである。なお、この例において、フローチップ１００の大きさは横５０ｍｍ×縦１０ｍｍ×厚さ０．９ｍｍである。
図２Ａに示すように、フローチップカートリッジ２０１は、平面視で略長方形の形状であり、チップ保持部２０２と、カートリッジ固定部２０３とを備える。チップ保持部２０２は、開口部２０４を有する。開口部２０４により、フローチップ１００のカバーガラス１０１側を光学検出系に露出させ、かつ、フローチップ１００の基板１０３を、以下で説明する温調部に接触させることができる。フローチップカートリッジ２０１の長手方向の端部には、フローチップ１００用の挿入口２０５が設けられている。図２Ｂに示すように、開口部２０４の位置に対して、挿入口２０５からフローチップ１００が挿入される。
図２Ｃに示すように、開口部２０４の長辺側には、接触部２０７、２０８が設けられている。フローチップカートリッジ２０１に対してフローチップ１００をさらに奥方向にスライドさせると、接触部２０７、２０８がフローチップ１００に接触する。例えば、接触部２０７、２０８の接触長さ（開口部２０４側への突き出し長さ）は１ｍｍであり、これにより、フローチップ１００を開口部２０４の位置で保持することができる。
フローチップカートリッジ２０１の挿入口２０５の位置には、爪部２０６が設けられている。図２Ｄに示すように、フローチップカートリッジ２０１に対してフローチップ１００が最後まで押し込まれると、爪部２０６がフローチップ１００の端部を押さえ付ける。これにより、フローチップ１００が固定される。フローチップカートリッジ２０１の大きさは６５ｍｍ×３０ｍｍであるため、作業者のフローチップ１００の取り扱いが容易になる。なお、カートリッジ固定部２０３には、第１の穴２０９及び第２の穴２１０が設けられている。ここで、第１の穴２０９が長穴であり、第２の穴２１０が丸穴である。第１の穴２０９及び第２の穴２１０は、後述するヒートブロックの固定ピンに挿入されるものであり、フローチップカートリッジ２０１の正確な位置出しを行うために使用される。
次に、基板背面に流路穴を持つフローチップと対物レンズとの位置関係について説明する。まず、従来の構成について説明する。図１１Ａは、従来のフローチップに対する対物レンズの位置関係を示す図であり、図１１Ｂは、従来のフローチップをカバーガラス側から見た図である。
フローチップ１０００のカバーガラス１００１は、試薬用の注入口１００２及び排出口１００３を有する。フローチップ１０００内には、流路が形成されている。注入口１００２及び排出口１００３には、それぞれ、チューブ１１０１、１１０２が接続されている。フローチップ１０００のシリコンの基板１００６には、半導体リソグラフィー工程を経て、ＤＮＡが選択的に固定できるように表面処理が施されている。基板１００６において、ＤＮＡの増幅産物であるＤＮＢ１００８を選択的かつ格子状に６００ｎｍピッチで配置することができる。ＤＮＢ１００８はターゲットＤＮＡをローリングサークル増幅法で増幅したもので、直径３００ｎｍの球状な形状を持つ。
また、図示してはいないが、フローチップ１０００はヒートブロック上に配置され、１０−８０℃の範囲で温度調節される。さらに、フローチップ１０００のカバーガラス１００１の注入口１００２には、チューブ１１０１を介して試薬が送液され、その後、試薬は、排出口１００３からチューブ１１０２を介して排出される。また、図示してはいないが、フローチップ１０００を保持するヒートブロックは、ＸＹステージ上に固定されている。このため、対物レンズ１１０３に対してフローチップ１０００およびチューブ１１０１、１１０２が相対的に移動する。しかしながら、チューブ１１０１、１１０２と対物レンズ１１０３は、ＸＹステージの駆動に伴って機械的に干渉する可能性がある。このため、ＸＹステージが駆動できる範囲はこれらが干渉しない範囲に限定される。より具体的には、図１１Ｂに示すように、フローチップ１０００において実際に蛍光計測が可能な領域は、斜線で示される領域１０２１に限定される。このため、フローチップ１０００の領域１０２１の外側の領域においては、ＤＮＢサンプルは固定されるものの、対物レンズ１１０３とチューブ１１０１、１１０２との干渉のため、蛍光計測を行うことができない。従って、従来の構成では、フローチップ１０００のＤＮＢ固定領域を有効に利用できない。
図３Ａは、本実施例のフローチップに対する対物レンズの位置関係を示す図であり、図３Ｂは、本実施例のフローチップをカバーガラス側から見た図である。上述したように、フローチップ１００の下面にある基板１０３が、流路の注入口１０５及び排出口１０６を有する。そして、注入口１０５及び排出口１０６には、それぞれ、チューブ３０１、３０２が接続されている。また、対物レンズ３０３は、フローチップ１００のカバーガラス１０１の上方に配置されている。従って、従来の構成（図１１Ａ）で生じるような対物レンズとチューブとの機械的な干渉は発生しない。図３Ｂに示すように、本実施例のフローチップ１００では、実際に蛍光計測が可能な領域は、斜線で示される領域３２１となる。従って、従来と同じ大きさのフローチップを使用しても、計測可能な領域が拡大し、スループットを増大することができるという効果をもたらす。これはまた、実質的にフローチップのコストを低減することにもなる。
図３Ｃは、本実施例の別の例のフローチップに対する対物レンズの位置関係を示す図であり、図３Ｄは、本実施例の別の例のフローチップをカバーガラス側から見た図である。図３Ｃ及び図３Ｄの例では、フローチップ１００がさらに小型化されている。上述したように、フローチップ１００の下面にある基板１０３が、流路の注入口１０５及び排出口１０６を有する。そして、注入口１０５及び排出口１０６には、それぞれ、チューブ３０１、３０２が接続されている。また、対物レンズ３０３は、フローチップ１００のカバーガラス１０１の上方に配置されている。これにより、チューブ３０１、３０２と対物レンズ３０３との機械的な干渉を回避することができる。従って、蛍光計測が可能である領域３３１の大きさを、図１１Ｂの領域１０２１と同一面積にしながら、フローチップ１００の大きさを従来のフローチップ１０００（図１１Ｂ）より小さくすることができる。これにより、フローチップ１００を小型化することによりコストを低減することが可能となる。
ここで、図１１Ａ及び図１１Ｂにおいて、ＤＮＢ１００８が固定されている領域１０２１の面積を４０ｍｍ×５ｍｍとする。つまり、図１１Ｂにおいて長さ１０２２が４０ｍｍであり、長さ１０２３が５ｍｍである。図１１Ａ及び図１１Ｂでは、対物レンズ１１０３とチューブ１１０１、１１０２との干渉を回避するために、フローチップ１０００を大きくする必要がある。チューブ１１０１、１１０２の接続部分のために必要となる長さ１０２４は、２１ｍｍである。従って、フローチップ１０００のＸ方向の大きさは、４０ｍｍ＋２１ｍｍ×２＝８２ｍｍとなる。また、Ｙ方向はチューブの接続を考慮する必要はないため、長さ１０２５は５ｍｍであり、長さ１０２６は２．５ｍｍである。したがって、フローチップ１０００のＹ方向の長さは、５ｍｍ＋２．５ｍｍ×２＝１０ｍｍとなる。
図３Ｃ及び図３Ｄにおいて、ＤＮＢ３０４が固定されている領域の長さ３３２が４０ｍｍであるのに対して、長さ３３３は５ｍｍとなる。従って、フローチップのＹ方向の長さは、４０ｍｍ＋５ｍｍ×２＝５０ｍｍとなる。従って、流路接続部（チューブ３０１、３０２）と対物レンズ３０３との干渉を回避することにより、フローチップ１００の大きさを５０ｍｍ／８２ｍｍ≒６０％の大きさまで小型化することができる。これはフローチップ１００のコストを６０％まで低減できるという効果をもたらす。
次に、基板背面に流路穴を持つフローチップ１００を固定するヒートブロックの詳細形状について説明する。図４Ａは、フローチップ１００を固定する温調部の構成を示す図である。
図４Ａのフローチップカートリッジ２０１には、バーコードラベルが貼り付けられ、これにより、フローチップ１００の実験上の管理、在庫管理及び使用可能期間などの管理を行うことができる。なお、バーコードラベルはＲＦＩＤなどの電子タグとしてもよい。
フローチップ１００を保持したフローチップカートリッジ２０１は、温調部４０１に固定される。温調部４０１は、フローチップカートリッジ２０１を固定し、かつ、フローチップ１００の流路内の試薬の温度制御を行う役目を果たす。温調部４０１は、ヒートブロック４０２と、ペルチェ素子４０３と、ヒートシンク４０４とを少なくとも備える。フローチップカートリッジ２０１は、ヒートブロック４０２に固定される。ヒートブロック４０２の下には、ペルチェ素子４０３が配置されている。
温度センサ４０５、４０６は、ヒートブロック４０２内に挿入されており、ヒートブロック４０２の温度をモニタする。温度センサ４０５、４０６を所定の温度をＰＩＤ制御することでヒートブロック４０２の温度を所定の温度にすることができる。これらの構成により、１０−８０℃の範囲の所定の温度にフローチップ１００内に送液された試薬を温調することができる。
また、ペルチェ素子４０３より生成された熱を排出するため、ヒートシンク４０４が、ペルチェ素子４０３の下方に配置されている。ヒートシンク４０４に対して、図示しないファンを用いて送風することで、ヒートシンク４０４から排熱を行う。これにより、ペルチェ素子４０３で発生した熱を速やかに排出し、ペルチェ素子４０３の表裏の温度差ΔＴを小さくすることができる。これはペルチェ素子４０３が有する熱移動効率を向上させる効果があり、結果として高速なランプレートを実現することができる。なお、図４Ａに示すように、ペルチェ素子４０３とヒートシンク４０４との間には、ヒートブロック４０２、ペルチェ素子４０３、及びヒートシンク４０４を固定するための複数の部材が介在していてもよい。
図４Ｂは、ヒートブロックの構成を示す図である。基板１０３に試薬の注入口１０５及び排出口１０６を持つフローチップ１００を固定するヒートブロックについて説明する。ヒートブロック４０２は、フローチップ１００に対応する位置に、フローチップ１００の基板１０３を設置し、かつ基板１０３に密着する設置部４２１を備える。ヒートブロック４０２の設置部４２１の両端には、切り欠き部４１１、４１２が形成されている。切り欠き部４１１、４１２は、それぞれ、基板１０３の注入口１０５及び排出口１０６に対応する位置に設けられている。従って、チューブ３０１、３０２を、切り欠き部４１１、４１２の下方向から挿入し、フローチップ１００の基板１０３の注入口１０５及び排出口１０６に接続することが可能になる。これにより、フローチップ１００の上面側にある対物レンズ３０３とチューブ３０１、３０２とが機械的に干渉することはない。従って、先述したようにフローチップ１００の大きさを小型化し、消耗品であるフローチップ１００のコストを低減することが可能となる。また、ヒートブロック４０２と接触したフローチップ１００の基板１０３の面では温調が±０．５℃の精度で行われ、化学反応を正確に進行させることができる。
また、本実施例のヒートブロック４０２には、フローチップカートリッジ２０１の第１の穴２０９及び第２の穴２１０の位置に、固定ピン４２３、４２４が設けられている。固定ピン４２３、４２４は、ヒートブロック４０２に圧入などの方法により取付けられたものである。これにより、フローチップカートリッジ２０１をヒートブロック４０２に固定する際に、固定ピン４２３、４２４によってフローチップカートリッジ２０１の位置合わせが容易になる。なお、本実施例では、フローチップ１００を保持するフローチップカートリッジ２０１を温調部４０１に固定する構成を示したが、この例に限定されない。例えば、試薬の種類によっては温調部が必要ない場合もある。したがって、このような場合、温調部４０１に代えて、フローチップカートリッジ２０１を固定するための固定部材を設けてもよい。この固定部材は、上述と同様に、固定ピンなどを有してもよい。
次に、基板１０３に試薬の注入口１０５及び排出口１０６を持つフローチップ１００のヒートブロックへの固定方法について説明する。図５Ａは、フローチップカートリッジ２０１を温調部へ固定する構成を示した断面図である。フローチップ１００はフローチップカートリッジ２０１に保持された状態で、ヒートブロック４０２と接触している。フローチップカートリッジ２０１が、フローチップ１００を保持するために必要となる長さは１ｍｍであり、フローチップカートリッジ２０１の接触部２０７、２０８（図２Ｃ参照）は、フローチップ１００の外周から１ｍｍ分の縁領域を保持する。フローチップ１００の下面であるシリコンの基板１０３には、ＤＮＡの増幅産物であるＤＮＢが格子状に規則的に配置されている。
ヒートブロック４０２の直下にはペルチェ素子４０３が設置されており、さらに、ペルチェ素子４０３の下方にヒートシンク４０４が設置されている。図５Ａの例では、ヒートブロック４０２の切り欠き部（図４Ｂの４１１、４１２）の位置には、樹脂部材５０１、５０２が配置されている。樹脂部材５０１、５０２には、それぞれ、流路が設けられており、樹脂部材５０１、５０２の流路は、それぞれ、基板１０３の注入口１０５及び排出口１０６に接続されている。樹脂部材５０１、５０２の流路には、それぞれ、チューブ３０１、３０２が接続されている。
フローチップカートリッジ２０１は、フローチップクランプ５０３、５０４によって下方向に加圧されており、フローチップ１００はヒートブロック４０２に対して密着した状態となっている。これにより、フローチップ１００がヒートブロック４０２に密着し、温調部４０１によって良好な温度制御を行うことが可能となる。図５Ａが断面図であるため、フローチップクランプ５０３、５０４は２個しか描かれてないが、後述で説明するように、フローチップカートリッジ２０１の４隅を下方に押し付けるために、４本存在してもよい。フローチップクランプ５０３、５０４は、フローチップ１００を保持するフローチップカートリッジ２０１を加圧することにより、間接的にフローチップ１００をヒートブロック４０２に対して密着させることができる。
図５Ｂは、フローチップカートリッジ２０１を温調部へ固定する別の構成を示した断面図である。この例では、フローチップクランプ５０５、５０６が、フローチップ１００の４隅を直接押さえ付け、フローチップ１００をヒートブロック４０２に密着させることができる。この例では、図５Ａの構成に比べて、より確実にフローチップ１００をヒートブロック４０２に押し付けることができるため、流路からの液漏れリスクを低減し、かつ温調性能をより確実に行うという利点がある。図５Ａ及び図５Ｂの構成ともにフローチップ１００の片面に対物レンズ３０３、もう片面に流路接続部を配置することにより、両者の機械的干渉を回避することができるという効果をもたらす。さらに、フローチップ１００を小型化し、フローチップ１００のコストを低減するという効果をもたらす。なお、フローチップ１００あるいはフローチップカートリッジ２０１の長手方向の両端部を２個のフローチップクランプで押さえ付ける構成にしてもよい。従って、フローチップ１００あるいはフローチップカートリッジ２０１を押さえ付けるために、少なくとも２つのフローチップクランプが設けられていればよい。
次に、フローチップカバーを用いたフローチップの固定方法について説明する。図６Ａ〜図６Ｃは、本実施例のフローチップカバーの構成を示す図である。フローチップクランプカバー６０１は、回転軸６０２を介して、フローチップカートリッジ２０１が設置される構造６０３に取付けられている。フローチップクランプカバー６０１は、開口部６０４を有し、開口部６０４の４隅には、フローチップクランプ６０５、６０６、６０７、６０８が設けられている。フローチップクランプ６０５、６０６、６０７、６０８は、開口部６０４の外周から内側に突出するように形成されており、先細形状となっている。
ヒートブロック４０２の切欠き部には、流路が形成された樹脂部材５０１、５０２が配置されている。基板１０３に注入口１０５及び排出口１０６を有するフローチップ１００をヒートブロック４０２に設置することにより、流路が形成される。樹脂部材５０１、５０２の注入口及び排出口には、Ｏ−リングが配置され、上部よりフローチップ１００を加圧することにより液漏れが発生しない流路を形成することが可能となる。また、上述したように、ヒートブロック４０２には固定ピン４２３、４２４が設けられている。図６Ｂに示すように、フローチップカートリッジ２０１の第１の穴２０９及び第２の穴２１０を固定ピン４２３、４２４に挿入することにより、フローチップカートリッジ２０１をヒートブロック４０２に固定する。この構成により、フローチップ１００の設置方向を間違えることなく、フローチップ１００を精度よくヒートブロック４０２上に設置することが可能となる。
図６Ｃに示すように、フローチップカートリッジ２０１をヒートブロック４０２に設置した後、フローチップクランプカバー６０１を回転軸６０２を介して回転させる。フローチップクランプカバー６０１の回転が完了すると、フローチップクランプ６０５、６０６、６０７、６０８がフローチップカートリッジ２０１の４隅を押さえ付けた状態となる。また、フローチップクランプカバー６０１が開口部６０４を有するため、開口部６０４を介してフローチップ１００の上部の対物レンズ３０３からフローチップ１００の基板１０３上の微小反応場に励起光を照射することができる。
図７は、本実施例のフローチップカバーを用いたフローチップの別の固定構造を説明する図である。図７の例では、フローチップクランプカバー６０１のフローチップクランプ６０５、６０６、６０７、６０８が、フローチップ１００の４隅を加圧することによりフローチップ１００を保持している。フローチップ１００の大きさは、５０ｍｍ×１０ｍｍである。これにより、フローチップ１００がヒートブロック４０２に密着することになり、良好な温度調節および漏れのない流路部を形成することが可能となる。
図８は、図７のＡ−Ａ線断面図である。焦点があった状態で対物レンズはフローチップ１００上面のカバーガラス１０１に０．６ｍｍの距離で近接する。また、図８の８０１は、図示しないＸＹステージがフローチップ１００上の蛍光検出領域３５ｍｍ×４ｍｍの位置出しを行った場合における、対物レンズの相対的な駆動可能領域を示す。また、ヒートブロック４０２の切欠き部には樹脂部材５０１、５０２が配置されており、その中に流路が形成されている。ここで採用する樹脂は、断熱効果が高く、かつ流路を形成するために加工性が高いＰＥＥＫを用いるのが理想的である。
図８において、フローチップ１００は、フローチップクランプ６０５、６０６、６０７、６０８により下方に加圧され、ヒートブロック４０２に密着している。ペルチェ素子４０３はヒートブロック４０２を介してフローチップ１００の温調を行う。ＰＥＥＫより形成される樹脂部材５０１、５０２には流路が形成されており、樹脂部材５０１、５０２の流路には、それぞれ、チューブ３０１、３０２が接続されている。フローチップ１００と樹脂部材５０１、５０２の流路との間には、Ｏ−リングが配置されており、フローチップクランプ６０５、６０６、６０７、６０８による加圧時には、Ｏ−リングが変形して流路を密閉することで流路からの液体漏れを防止する。
上述したように、対物レンズの駆動可能領域８０１は、ＸＹステージ駆動時にフローチップ１００に対して対物レンズが相対的に移動する範囲を模式的に示したものである。フローチップ１００の周辺部について説明すると、フローチップ１００の上面にフローチップクランプ６０５、６０６、６０７、６０８があり、フローチップ１００の下面にヒートブロック４０２及び流路接続部（チューブ３０１、３０２との接続部）がある。図８に示されるように、フローチップ１００周辺には、フローチップの固定構造、温調部、送液構造、光学計測系、フローチップの駆動構造の部品が密集しており、これらの部品の密集を考慮した上でフローチップ１００の小型化及びスループットの向上が課題となる。本実施・BR>痰ノよれば、このような密集した部品の構造において、従来よりもフローチップ１００を小型化し、コストを低減することができる。また、本実施例のフローチップによれば、計測可能な領域が拡大し、スループットを増大することができるという効果ももたらす。
図９は、本実施例のフローチップを用いたシーケンス方法を説明する図である。まず、フローチップカートリッジ２０１をフローチップクランプ９０９で加圧することにより、フローチップ１００がヒートブロック４０２上に固定される。ヒートブロック４０２の下面にはペルチェ素子４０３が配置されており、フローチップ１００の温度調節が行われる。温度制御範囲は１０−８０℃である。温度制御は、フローセルで酵素反応による塩基伸長、伸長の足場となるプライマの解離などに必要となる。ヒートブロック４０２の内部には温度センサとして測温抵抗体（図示せず）が配置され、温度制御のフィードバックに使用される。ヒートシンク４０４は、ペルチェ素子４０３に密着し、ペルチェ素子４０３の駆動に伴って発生した熱を放熱する。ヒートシンク４０４からの放熱は、ヒートシンク４０４に対してファン（図示せず）を用いて空気を送風することにより達成される。
フローチップ１００及びフローチップ１００を保持する構造（フローチップカートリッジ２０１など）は、ＸＹステージ（駆動機構）９１０に保持されている。ＸＹステージ９１０により、フローチップ１００を対物レンズ９３０に対して水平（ＸＹ方向）に移動することができる。対物レンズ９３０は、Ｚステージ９１９に固定されており、フローチップ１００に固定された微小反応場にフォーカスを合わせるために上下に移動することができる。対物レンズ９３０は通常エアーギャップであるが、フローチップ１００と対物レンズ９３０との間に純水を満たす方式を採用することも可能である。
酵素、４種類の蛍光試薬、バッファ、ヌクレオチド、洗浄液などの試薬は試薬カートリッジ９０２に設置される。試薬カートリッジ９０２は試薬ラック９０１に設置され、４℃に冷却される。ペルチェ素子９０５はヒートブロック９０４を冷却し、ファン９０６は試薬ラック９０１庫内の空気をヒートブロック９０４に送風する。冷却された空気は試薬ラック９０１庫内を循環し、間接的に試薬９０３を４℃に冷却する。
次に、試薬カートリッジ９０２に保持された試薬をフローチップ１００の注入口１０５へ送り、排出口１０６から排出させるための流体送液手段について説明する。流体送液手段は、少なくとも１つのシリンジと、複数の弁とを備える。試薬カートリッジ９０２に保持された試薬は、切り替えバルブ９０７により、流路を切り替えることができる。これにより、任意の試薬を流路に導入することができる。流路が形成された後、試薬は流路９０８を経て、微小反応場を保持するフローチップ１００に送液される。吸引は、下流の流路９１１に配置されたシリンジ９１４の駆動により行う。流路９１１には２個の２方弁９１２、９１３が設置されている。試薬の吸引を行うときは、２方弁９１２を開状態にし、かつ２方弁９１３を閉状態にした状態で、シリンジ９１４を駆動させる。また、試薬を廃液タンク９４１に送液する場合は、２方弁９１２を閉状態にし、かつ２方弁９１３を開状態にした状態で、シリンジ９１４を駆動させる。この動作により、複数の試薬の送液を１つのシリンジ９１４で行うことが可能となる。
廃液となった試薬は廃液タンク９４１に送られる。廃液タンク９４１がない場合は、装置庫内に廃液がこぼれ、電気感電、装置の錆び、異臭の発生といった問題が発生する。これを回避するためには廃液タンク９４１を必ず装置内に配置することが必要であり、このために廃液タンク９４１の有無を監視するマイクロフォトセンサ９４２を設置する。また、廃液が漏れた場合のために廃液タンク９４１の下に液受けトレイ９４３が設置される。
ＤＮＡ鎖の伸長反応は、それぞれ異なる蛍光色素でラベルされた４種類のヌクレオチドおよびポリメラーゼをフローチップで反応させることで行う。各ヌクレオチドは、それぞれ、ＦＡＭ−ｄＣＴＰ、 Ｃｙ３−ｄＡＴＰ、 Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ −ｄＧＴＰ、 Ｃｙ５−ｄＴｓＴＰである。各ヌクレオチドの濃度は２００ｎＭである。また、反応液は伸張反応が効率よく行なわれるように塩濃度、マグネシウム濃度およびｐＨが最適化されている。反応溶液中にはポリメラーゼが含まれており、ＤＮＡ断片に相補的な蛍光ヌクレオチドが１塩基だけ取り込まれる。２塩基目の伸長が発生しないのは、１塩基目の蛍光色素に２塩基目の色素の伸長を阻害する物質が結合しているからである。１塩基が取り込まれた後、浮遊する蛍光ヌクレオチドを洗浄により除去した後、蛍光計測を行う。なお、以降の最小ユニットの反応を行うために、蛍光計測後、解離溶液により塩基から蛍光色素を切断する工程および伸長阻害物質を切断する工程が必須である。この工程により、次の塩基伸長反応の逐次的継続が可能となる。再び蛍光ヌクレオチドをフローセル内に送液し、反応を繰り返すことにより、逐次的なシーケンスが可能となる。本実施例で採用している反応方式はシーケンス・バイ・シーケンス（ＳＢＳ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）と呼ばれる。
フローチップ１００のカバーガラス１０１側には、光学検出系が配置される。以下の実施例では、光学検出系が、落射蛍光顕微鏡であり、ＬＥＤと、光学フィルタと、２次元カメラとを備える構成として説明する。２つのＬＥＤ９１６、９１７は蛍光色素を励起するための光源である。ＬＥＤ９１６および９１７の中央波長は、それぞれ、４９０ｎｍ、５９５ｎｍである。ＬＥＤ９１６は、ＦＡＭ−ｄＣＴＰ、 Ｃｙ３−ｄＡＴＰの励起光の照射に用い、ＬＥＤ９１７は、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ −ｄＧＴＰ、 Ｃｙ５−ｄＴｓＴＰの励起光の照射に用いる。ダイクロイックミラー９５１は、ＬＥＤ９１６、９１７からの光を同一光軸上に揃える。更に、ダイクロイックミラー９５２により励起光は対物レンズ９３０の瞳面に入射させられる。励起光は対物レンズ９３０を介してフローチップ１００内の微小反応場内に取り込まれた蛍光色素に照射され、蛍光色素は蛍光を発する。等方的に発光した蛍光の一部分は対物レンズ９３０に回収される。
対物レンズ９３０を経た光は平行光となり、ダイクロイックミラー９５３まで直進し、分割される。ダイクロイックミラー９５３は４色の蛍光波長領域について緩やかな反射特性を持つ。このため、ＣＭＯＳカメラ９２２、９２４の受光面では、フローチップ１００上の反応場から発光した輝点の蛍光強度比をそれぞれ算出することができる。２つのＣＭＯＳカメラ９２２、９２４の結像面上での比をとることによって、この発光点が４色のいずれに帰属するかを判定することが可能となる。なおダイクロイックミラー９５３で分割された平行光は、それぞれ、エミッションフィルタ９２０、９２５を経た後に、チューブレンズ９２１、９２３で集光され、ＣＭＯＳカメラ９２２、９２４の受光面に結像する。
上述した構成で試薬をフローチップ１００内に送液し、温調により微小反応場上で１塩基ずつ蛍光ヌクレオチドをポリメラーゼにより取り込ませ、伸長反応を行う。取り込まれた蛍光色素の検出を画像として捉え、これを隣接したパネルに対して行うことで大量の塩基配列情報を取得することができる。その後、蛍光色素を切断試薬で切断し、洗浄液でフローチップ１００内を洗浄した後、再度、蛍光ヌクレオチドおよびポリメラーゼを含んだ試薬をフローチップ１００内に送液する。これらの動作を必要な塩基長分行うことでＤＮＡの塩基配列解析を取得することが可能となる。
また、本装置では、フローチップ１００内で反応試薬を流路前方向および後方向にシリンジ９１４を駆動することにより自在に送液することができる。このとき、切り替えバルブ９０７により流路は空気を満たした試薬チューブに接続されている。つまり、フローチップ１００内で試薬を流路内で前後に揺することができる。これにより、フローチップ１００内の基板面に固定されたＤＮＢと試薬分子の衝突反応頻度を上昇させることが可能となり、反応効率を向上させることが可能となる。従って、反応時間を短縮することができる。さらに、本装置ではサンプルであるＤＮＢを直接装置内でフローチップ１００に送液し、固定することもできる。これにより、従来前処理として装置外部で行っていたＤＮＢのフローチップへの固定処理も短縮することができる。
なお、上記ではＳＢＳの反応方式について説明したが、別の反応方式を採用してもよい。例えば、送液される試薬が、複数の蛍光色素で修飾されたオリゴマーと、オリゴマーをＤＮＡ塩基に付加するリガーゼと、洗浄試薬と、画像取得用試薬と、保護基解離試薬を含み、反応方式が、シーケンス・バイ・ライゲーション（ＳＢＬ）であってもよい。
以上で説明した本発明の実施例によれば、フローチップ１００に対して対物レンズ３０３を配置した面と反対側のフローチップ１００の面（基板１０３）において、フローチップ１００の試薬の注入口１０５及び排出口１０６が設けられている。また、フローチップ１００の温調を行うヒートブロック４０２の形状を最適化し、フローチップ１００を温調する面の方向から試薬の注入及び排出が可能なようなヒートブロック形状に最適化されている。これにより、対物レンズ３０３とフローチップ１００の流路接続部との間における機械的干渉を回避できる。結果として、フローチップ１００を小型化し、コスト低減を図ることができる。
本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。上記実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることもできる。また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることもできる。また、各実施例の構成の一部について、他の構成を追加・削除・置換することもできる。
１００ ：フローチップ
１０１ ：カバーガラス
１０２ ：スペーサ
１０３ ：基板
１０５ ：注入口
１０６ ：排出口
２０１ ：フローチップカートリッジ
２０２ ：チップ保持部
２０３ ：カートリッジ固定部
２０４ ：開口部
２０５ ：挿入口
２０６ ：爪部
２０７、２０８ ：接触部
２０９ ：第１の穴
２１０ ：第２の穴
３０１、３０２ ：チューブ
３０３ ：対物レンズ
４０１ ：温調部
４０２ ：ヒートブロック
４０３ ：ペルチェ素子
４０４ ：ヒートシンク
４０５、４０６ ：温度センサ
４０６ ：温度センサ
４１１、４１２ ：切り欠き部
４２１ ：設置部
４２３、４２４ ：固定ピン
５０１、５０２ ：樹脂部材
５０３、５０４、５０５、５０６ ：フローチップクランプ
６０１ ：フローチップクランプカバー
６０２ ：回転軸
６０３ ：構造
６０４ ：開口部
６０５、６０６、６０７、６０８ ：フローチップクランプ
９０１ ：試薬ラック
９０２ ：試薬カートリッジ
９０３ ：試薬
９０４ ：ヒートブロック
９０５ ：ペルチェ素子
９０６ ：ファン
９０７ ：切り替えバルブ
９０８ ：流路
９０９ ：フローチップクランプ
９１０ ：ＸＹステージ
９１１ ：流路
９１２、９１３ ：２方弁
９１４ ：シリンジ
９１６、９１７ ：ＬＥＤ
９１９ ：Ｚステージ
９２０、９２５ ：エミッションフィルタ
９２１、９２３ ：チューブレンズ
９２２、９２４ ：ＣＭＯＳカメラ
９３０ ：対物レンズ
９４１ ：廃液タンク
９４２ ：マイクロフォトセンサ
９４３ ：液受けトレイ
９５１、９５２、９５３ ：ダイクロイックミラー
１０１ ：カバーガラス
１０２ ：スペーサ
１０３ ：基板
１０５ ：注入口
１０６ ：排出口
２０１ ：フローチップカートリッジ
２０２ ：チップ保持部
２０３ ：カートリッジ固定部
２０４ ：開口部
２０５ ：挿入口
２０６ ：爪部
２０７、２０８ ：接触部
２０９ ：第１の穴
２１０ ：第２の穴
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４０１ ：温調部
４０２ ：ヒートブロック
４０３ ：ペルチェ素子
４０４ ：ヒートシンク
４０５、４０６ ：温度センサ
４０６ ：温度センサ
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４２１ ：設置部
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９１４ ：シリンジ
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９３０ ：対物レンズ
９４１ ：廃液タンク
９４２ ：マイクロフォトセンサ
９４３ ：液受けトレイ
９５１、９５２、９５３ ：ダイクロイックミラー
Claims (15)
- 光透過性を有する第１の基板と、流体の注入口と排出口を有する第２の基板とを少なくとも備えるフローチップと、
前記フローチップを保持する保持部材と、
前記保持部材が設置される固定部材であって、前記フローチップの前記第２の基板と接触する固定部材と、
前記流体を前記注入口へ送り、前記排出口から排出させる流体送液部と、
前記フローチップの前記第１の基板側に配置された光学検出部と、
前記保持部材をＸＹ方向に駆動する駆動部と、
を備える分析装置。 - 請求項１の分析装置において、
前記保持部材または前記フローチップを前記固定部材に対して加圧するための加圧部をさらに備えることを特徴とする分析装置。 - 請求項２の分析装置において、
前記加圧部が、前記保持部材または前記フローチップの少なくとも２か所を力学的に加圧するクランプ部を備えることを特徴とする分析装置。 - 請求項３の分析装置において、
前記加圧部が、前記固定部材に回転可能に取付けられた、開口部を有するカバーであり、前記クランプ部が、前記開口部の外周から内側に突出するように形成されていることを特徴とする分析装置。 - 請求項１の分析装置において、
前記固定部材が、前記フローチップの温度調節を行う温度調整部であることを特徴とする分析装置。 - 請求項５の分析装置において、
前記温度調整部が、前記第２の基板に接触するヒートブロックと、前記ヒートブロックの下方に配置されたペルチェ素子と、前記ペルチェ素子の下方に配置されたヒートシンクとを備えることを特徴とする分析装置。 - 請求項６の分析装置において、
前記ヒートブロックが、前記注入口及び前記排出口のそれぞれに対応する位置に切欠き部を備え、前記切欠き部が、前記注入口への流路及び前記排出口からの流路を備えることを特徴とする分析装置。 - 請求項７の分析装置において、
前記注入口への前記流路及び前記排出口からの前記流路が樹脂部材により形成されていることを特徴とする分析装置。 - 請求項１の分析装置において、
前記保持部材は、開口部を有するチップ保持部と、カートリッジ固定部とを備え、前記フローチップが、前記開口部の位置に配置されることを特徴とする分析装置。 - 請求項９の分析装置において、
前記固定部材は、固定ピンを備え、前記保持部材の前記カートリッジ固定部は、前記固定ピンに対応する位置に穴を備え、前記保持部材は、前記穴に前記固定ピンを挿入することにより、前記固定部材に設置されていることを特徴とする分析装置。 - 請求項１の分析装置において、
前記光学検出部が、落射蛍光顕微鏡であり、前記光学検出部が、ＬＥＤと、光学フィルタと、２次元カメラとを備えることを特徴とする分析装置。 - 請求項１の分析装置において、
前記第２の基板が、半導体光リソグラフィー工程により、格子状かつ規則的に一定間隔で反応部位を有することを特徴とする分析装置。 - 請求項１の分析装置において、
前記流体は、複数の蛍光色素で修飾されたヌクレオチドと、塩基伸長を行うポリメラーゼと、洗浄試薬と、画像取得用試薬と、保護基解離試薬とを含み、反応方式がシーケンス・バイ・シーケンス（ＳＢＳ）であることを特徴とする分析装置。 - 請求項１の分析装置において、
前記流体は、複数の蛍光色素で修飾されたオリゴマーと、オリゴマーをＤＮＡ塩基に付加するリガーゼと、洗浄試薬と、画像取得用試薬と、保護基解離試薬を含み、反応がシーケンス・バイ・ライゲーション（ＳＢＬ）であることを特徴とする分析装置。 - 請求項１の分析装置において、
前記流体送液部が、少なくとも１つのシリンジと、複数の弁とを備えることを特徴とする分析装置。
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