JPWO2015006290A5

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Publication number: JPWO2015006290A5
Application number: JP2016525411A
Authority: JP
Publication date: 2022-02-07
Anticipated expiration: 2034-07-08

Description

ある態様によれば、上記繰り返し方法により相同組換え率を上昇させる方法が提供される。ある実施形態によれば、Ｃａｓ９依存性ゲノムＤＮＡ切断により、相同組換え率が劇的に上昇して外来性ＤＮＡが刺激される。別の態様によれば、外来性ドナー核酸には、切断部位の両側に隣接（flank）する相同配列またはアームが含まれる。別の態様によれば、外来性ドナー核酸には、切断配列を除去するための配列が含まれる。別の態様によれば、外来性ドナー核酸には、切断部位の両側に隣接（flank）する相同配列またはアーム、および切断部位を除去するための配列が含まれる。このようにして、外来性ドナーＤＮＡを取り込まない細胞に対する負の選択（negative selection）としてＣａｓ９を用いることができる。したがって、組換え頻度が高い細胞を同定するための負の選択方法が提供される。 According to one embodiment, a method for increasing the homologous recombination rate is provided by the above-mentioned repeating method. According to one embodiment, Cas9-dependent genomic DNA cleavage dramatically increases the rate of homologous recombination and stimulates exogenous DNA. According to another aspect, the exogenous donor nucleic acid comprises a homologous sequence or arm flanked on either side of the cleavage site. According to another aspect, the exogenous donor nucleic acid comprises a sequence for removing the cleavage sequence. According to another aspect, the exogenous donor nucleic acid comprises a homologous sequence or arm flanked on either side of the cleavage site and a sequence for removing the cleavage site. In this way, Cas9 can be used as a negative selection for cells that do not take up foreign donor DNA. Therefore, a negative selection method for identifying cells with high recombination frequency is provided.

実施例Ｉ
酵母におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いた多重遺伝子編集の一般的プロセス
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のＣＲＩＳＰＲ免疫系由来のＣａｓ９を用いて、相同組換えを促進し、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において形質転換ＤＮＡを組み換えない細胞以外を選択する。Ｃａｓ９を用いたＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断の一般的な方法を図１に示す。Ｃａｓ９、ガイドＲＮＡ、および標的ＤＮＡの間で共局在複合体が形成される。Ｃａｓ９により標的ＤＮＡ中に二本鎖切断が生じる。次に、相同組換えによりドナーＤＮＡがＤＮＡに挿入される。ドナーＤＮＡには、切断部位の両側に隣接配列、およびＣａｓ９切断部位を除去する配列が含まれる。その結果、ドナーＤＮＡが、ゲノムＤＮＡであってもよいＤＮＡ中に組み込まれる。 Example I
General Process of Multiple Gene Editing with CRISPR-Cas9 in Yeast Using Cas9 from the CRISPR immune system of Streptococcus pyogenes to promote homologous recombination and transformation in Saccharomyces cerevisiae Select cells other than cells that do not recombinate DNA. A general method of RNA-induced DNA cleavage using Cas9 is shown in FIG. A colocalization complex is formed between Cas9, guide RNA, and target DNA. Cas9 causes double-strand breaks in the target DNA. Next, the donor DNA is inserted into the DNA by homologous recombination. Donor DNA contains sequences flanking both sides of the cleavage site and sequences that remove the Cas9 cleavage site. As a result, the donor DNA is integrated into the DNA, which may be genomic DNA.

図２に示されるように、選択マーカーを用いて１種類または複数種類のガイドＲＮＡについて細胞を選択する。選択された細胞は、１種類または複数種類のガイドＲＮＡを発現する。ガイドＲＮＡと、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ９と、ＤＮＡとの１種類または複数種類の共局在複合体が細胞中で形成される。エンドヌクレアーゼによりＤＮＡが切断され、ドナー核酸が相同組換えなどの組換えによって細胞に挿入される。次に、細胞のプラスミドを除去（cure）した後、細胞について必要に応じて上記ステップを１回またはさらに繰り返す。複数のサイクルを行ってもよい。複数のサイクルを経た細胞は、高い組換え頻度を示す。または、細胞をプラスミドの維持について非選択（deselect）とするか、あるいはプラスミドを有する細胞以外を選択するための培地中に細胞を入れる。その後、細胞成長ステップで始まるプロセスを繰り返す。したがって、方法は、前のサイクルで既に改変された細胞を繰り返すか、または前のサイクルから改変されなかった細胞を選択し、この非改変細胞をさらに繰り返して本明細書に記載されるＤＮＡの改変を行うことを含む。 As shown in FIG. 2, cells are selected for one or more guide RNAs using selectable markers. Selected cells express one or more guide RNAs. One or more colocalization complexes of guide RNA, RNA-induced endonuclease Cas9, and DNA are formed in cells. DNA is cleaved by endonucleases and donor nucleic acids are inserted into cells by recombination such as homologous recombination. The cell plasmid is then cured and then the above steps are repeated once or further for the cells as needed. Multiple cycles may be performed. Cells that have undergone multiple cycles show a high recombination frequency. Alternatively , the cells are deselected for plasmid maintenance , or the cells are placed in a medium for selection other than those carrying the plasmid. After that, the process starting with the cell growth step is repeated. Thus, the method repeats cells that have already been modified in the previous cycle, or selects cells that have not been modified from the previous cycle and repeats these unmodified cells further to modify the DNA described herein. Including doing.

実施例ＩＩ
詳細な繰り返しプロトコール
（ウラシル栄養要求株、構成的Ｃａｓ９発現）細胞を、５ｍｌのＳＣ酵母培地またはＳＣ＋ＦＯＡ（１００μｇ／ｍｌ）中で、光学密度０．８～１．０まで成長させる。細胞を２２５０×ｇで３分間スピンし、１０ｍｌの水で１回洗浄する。細胞をスピンし、１ｍｌの１００ｍＭ酢酸リチウムに再懸濁する。細胞をペレット化し、５００μｌの１００ｍＭ酢酸リチウムに再懸濁する。５０μｌの細胞；１ｎｍｏｌの二本鎖オリゴヌクレオチドプール、各５μｇのガイドＲＮＡ（ウラシルマーカーを有するｐ４２６ベクター）を含み、７０μｌまで水を加えて所望の最終体積にしたＤＮＡ混合物；２４０μｌの５０％ＰＥＧ３３５０；および３６μｌの１Ｍ酢酸リチウムをこの順番で添加することにより、形質転換混合物を調製する。混合物を３０℃で３０分間インキュベートする。次に、混合物をボルテックスし、混合物を４２℃で２０分間インキュベートすることにより細胞に熱ショックを与える。次に、細胞をペレット化し、上清を除去する。細胞を５ｍｌのＳＣ－ウラシルに播種して、ウラシル遺伝子を含むｇＲＮＡプラスミドを選択する。細胞を２日間回復させる。２日後、１００μｌの細胞培養物を５ｍｌの新たに調製したＳＣに播種し、１２時間成長させてプラスミド維持について非選択とする。次に、１００μｌのＳＣ培養細胞を５ｍｌのＳＣ＋ＦＯＡ（１００μｇ／ｍＬ）培地に播種して、プラスミドを有する細胞以外を選択する。これにより、プロセスの１サイクルが完了する。このプロセスを、所望のサイクル回数分、反復する。プロセス全体は、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１５サイクル、２０サイクル、２５サイクルなどを含んでいてもよい。 Example II
Detailed repeat protocol (uracil auxotrophy, constitutive Cas9 expression) cells are grown to an optical density of 0.8-1.0 in 5 ml SC yeast medium or SC + FOA (100 μg / ml). The cells are spun at 2250 xg for 3 minutes and washed once with 10 ml of water. The cells are spun and resuspended in 1 ml of 100 mM lithium acetate. Cells are pelleted and resuspended in 500 μl 100 mM lithium acetate. 50 μl of cells; 1 nmol double-stranded oligonucleotide pool, each containing 5 μg of guide RNA (p426 vector with uracil marker), water to 70 μl to the desired final volume DNA mixture; 240 μl of 50% PEG3350; And 36 μl of 1M lithium acetate are added in this order to prepare a transformation mixture. Incubate the mixture at 30 ° C. for 30 minutes. The mixture is then vortexed and the cells are heat shocked by incubating the mixture at 42 ° C. for 20 minutes. The cells are then pelleted and the supernatant removed. Cells are seeded in 5 ml SC-uracil and a gRNA plasmid containing the uracil gene is selected. Allow cells to recover for 2 days. After 2 days, 100 μl of cell culture is seeded in 5 ml of freshly prepared SC and grown for 12 hours to be non-selective for plasmid maintenance. Next, 100 μl of cultured SC cells are seeded in 5 ml of SC + FOA (100 μg / mL) medium to select cells other than those having the plasmid. This completes one cycle of the process. This process is repeated for the desired number of cycles. The entire process may include 1 cycle, 2 cycles, 3 cycles, 4 cycles, 5 cycles, 6 cycles, 7 cycles, 8 cycles, 9 cycles, 10 cycles, 15 cycles, 20 cycles, 25 cycles and the like.

Claims

It is a method of multiple-inserting an exogenous nucleic acid sequence into DNA in a cell expressing Cas9 enzyme that forms a colocalization complex with a guide RNA complementary to the target DNA and cleaves the target DNA in a site-specific manner. ,
(A) Introducing a plurality of types of guide RNAs and a plurality of types of foreign donor nucleic acid sequences into the cells, wherein each of the plurality of types of guide RNAs co-localizes with the Cas9 enzyme at a specific site of the DNA. Form an existing complex,
The DNA is cleaved by the Cas9 enzyme to form a cleavage site, and one of the plurality of foreign donor nucleic acid sequences is inserted into the cleavage site , and
(B) The step (a) is repeated a plurality of times to cause a plurality of changes in the DNA in the cell.
A method in which the cell is a eukaryotic cell.

The method of claim 1, wherein the cell is a yeast cell, a plant cell, or an animal cell.

The method of claim 1, wherein the guide RNA is a tracrRNA-crRNA fusion.

The method according to claim 1, wherein the target DNA is genomic DNA, mitochondrial DNA, viral DNA, or exogenous DNA.

The method of claim 1, wherein the foreign donor nucleic acid sequence is recombinantly inserted.

The method of claim 1, wherein the foreign donor nucleic acid sequence is inserted by homologous recombination.

The method of claim 1, wherein the guide RNA is present on a plasmid.

The method of claim 1, wherein the exogenous donor nucleic acid sequence comprises a homologous sequence or arm flanked on either side of the cleavage site.

The method of claim 1, wherein the foreign donor nucleic acid sequence comprises a sequence for removing the cleavage site.