JPWO2014189085A1 - シーケンサ前処理装置およびその方法 - Google Patents

Abstract

シーケンサ前処理装置及び方法に関し、大規模な塩基配列を解析するための信頼性の高い前処理を提供することを目的とする。吸引吐出機構、分注チップが着脱可能に装着されるノズルを有するノズルヘッド、磁性粒子懸濁液を含む各種液を収容する容器群、ノズルを容器群との間で相対的に移動可能とする移動機構、及び装着された分注チップ内に磁場を及ぼすことが可能な磁力部を有するシーケンサ前処理装置を用いて、容器群に収容された検体、抽出用試薬溶液および磁性粒子懸濁液を混合して、核酸を抽出する抽出工程と、シーケンサ前処理装置を用いて、核酸を容器群に収容された断片化溶液と混合して断片化し、断片化された核酸から磁性粒子懸濁液を用いてシーケンサに応じた塩基配列数の断片を作成する断片化作成工程と、シーケンサ前処理装置を用いて、作成した断片を含有する溶液の所定量を前記反応容器内に分注する増幅前処理工程と、を有するように構成する。

Description

本発明は、シーケンサ前処理装置およびその方法に関するものである。

核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ等）やその断片（オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド等）の塩基配列を決定するために、従来では、しばしばジデオキシ法によるキャピラリーシーケンシングが用いられていた。この方法では、4つの通常のＤＮＡ合成系を用意し、そこに低濃度の鎖停止ヌクレオチド（ターミネーター）を加えて反応させるようにしたものである。ターミネーターは4種のジデオキシヌクレオチド (ddATP・ddGTP・ddCTP・ddTTP) のうちそれぞれ1種類だけを用いる。ＤＮＡポリメラーゼは鋳型配列に対応するデオキシリボヌクレオチドを取り込みながらＤＮＡを合成していくが、ときどき対応するターミネーターを取り込んで反応がそこで止まってしまうことが起きる。結果的に使ったターミネーターの塩基に対応する様々な長さのＤＮＡ断片が生じることになる。例えばターミネーターとしてddATPを加えた系では、生じたＤＮＡ断片の 3'末端の塩基はアデニンになるという具合である。これによって、最初に単なるＤＮＡ合成をする必要がなく、4つの反応系だけできちんと配列が確定できる。この方法では、高い精度が得られるものの、１回の解析でできる解析数など、処理能力に限界があった。

現在、シーケンシングの解析処理能力の大幅な向上が図られ、塩基配列数が、メガまたはギガのオーダーの大規模な塩基配列をもつＤＮＡまたはその断片に対して解析処理を行なうことを可能にするＤＮＡシーケンサが登場している（イルミナ社、ロシュ社）。

この方法では、塩基配列を決定しようとする目的の抽出した核酸またはその断片について、所定の塩基配列数（例えば、数１０ｂから１０００ｂ程度）をもつようにほぼ均等な大きさに断片化することが必要となり、さらに、これらの多数の塩基からなる断片化された断片を、該核酸を鋳型ＤＮＡとして、種々の試薬、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド及び反応バッファ等とともに反応容器内に、収容して温度制御による増幅を行なうことが前提となる。

ところが、このような多数の塩基配列の解析を行なう場合には、解析の対象となる核酸について、高精度の増幅処理が求められることになる。特に、目的とする核酸以外の核酸が混じっていたために、増幅することによって誤った結論を導いたり、増幅処理を行なった後に、何回も最初から増幅までの処理を繰り返したり、目的とする核酸の塩基配列を解析するためには、特に核酸またはその断片についての所定塩基配列数に均等に分断させることが、大規模塩基配列の解析の成功に特に必要となる。

したがって、抽出し、断片化し、さらに増幅した目的核酸や断片が、処理目的に合致しているかどうかを見るには、抽出したり断片化した核酸やその断片から、人手を用いて一部抜き出して、蛍光等で標識化し、電気泳動法を用いて分子量のサイズを監視することは、手間がかかるとともに、クロスコンタミネーションのおそれがあり、また電気泳動の実施に高度の技術を要求されるために、核酸に関する専門の研究者や技術者を必要とするのが現状であり、この分野の専門外の医師等が簡単に臨床応用に用いることができるものではなかった。

このようなことが、大規模シーケンサを用いた遺伝子解析の汎用化や、病院等における臨床応用の拡大を妨げることになっている。そこで、臨床時等において、クロスコンタミネーションを防止しかつユーザの手間を軽減して、大規模シーケンサに適した増幅処理を可能とする、信頼性の高い高精度の核酸の増幅を行なうことができる高精度な前処理を提供することが重要である。さらに、核酸の抽出から増幅さらには測定までを一貫して自動化する全自動化が必要であるとともに、装置の小型化と、安価で高精度の装置を提供することが重要である。

特許第２６２２３２７号公報 特表２０００−５１１４３５公報 米国特許５,９５８,３４９号公報 特開２００２−１０７７７公報

そこで、本発明は以上の問題点を解決するためになされたものであり、第１の目的は、多数の塩基からなる核酸またはその断片の大規模な塩基配列を読み取ることができるシーケンサの前処理として、少なくとも核酸またはその断片の抽出から増幅前処理に至るまでを一貫して自動化し、ユーザの手を経ることなく迅速かつ効率的に処理を実行することができるシーケンサ前処理装置およびその方法を提供することである。

第２の目的は、少なくとも核酸の抽出を含むシーケンサの前処理を手動によらず、一貫して行なうことを可能にすることによって、外部から異物の進入、コンタミネーションを確実に防止し、信頼性が高くかつ高い品質の生成物を得ることができるシーケンサ前処理装置およびその方法を提供することである。

第３の目的は、分注装置を組み込んだ装置を用いることで、装置規模を拡大することなく安価に製造し使用することができるシーケンサ前処理装置およびその方法を提供することである。

第１の発明は、気体の吸引および吐出を行なう吸引吐出機構、該吸引吐出機構と連通し液体の吸引および吐出が可能な1または2以上の分注チップが着脱可能に装着されるノズルを有するノズルヘッド、磁性粒子懸濁液を含む各種液を収容する液収容部および反応容器を少なくとも有する容器群、前記ノズルを容器群との間で相対的に移動可能とする移動機構、および、前記ノズルに装着された分注チップ内に磁場を及ぼすことが可能な磁力部を有するシーケンサ前処理装置を用いて、前記容器群に収容された検体、抽出用試薬溶液および磁性粒子懸濁液を混合して、検体から核酸を抽出する抽出工程と、該シーケンサ前処理装置を用いて、抽出した前記核酸を前記容器群に収容された断片化溶液と混合して断片化し、断片化された前記核酸から磁性粒子懸濁液を用いてシーケンサに応じた所定範囲の塩基配列数をもつ断片を作成する断片化作成工程と、前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記作成した断片を含有する溶液の所定量を、増幅用溶液とともに前記反応容器内に分注する増幅前処理工程と、を有するシーケンサ前処理方法である。

ここで、前記容器群は、通常ステージ上に設け、前記反応容器、検体、試薬等の液体、を収容する複数の液収容部、および、前記分注チップの他、前記容器群の開口部を被覆するように設けられたフィルムを穿孔するための穿孔用チップ等のチップを収容するチップ収容部を設けることが好ましい。また、容器群には、複数の液収容部としてのウェルがマトリクス状または列（行）状に配列されたマイクロプレートや複数の液収容部としてのウェルが列状に配列されたカートリッジ状容器を含む。

前記容器群は、具体的には、少なくとも検体を収容する1または2以上の液収容部、前記検体から核酸を抽出するための抽出用試薬溶液を収容する1または2以上の液収容部、前記断片化溶液を収容する1または2以上の液収容部、各核酸またはその断片と結合可能な磁性粒子を懸濁する磁性粒子懸濁液を収容する1または2以上の液収容部、前記核酸またはその断片と磁性粒子との結合を促進する結合促進剤溶液を収容する1または2以上の液収容部、結合した前記核酸またはその断片と磁性粒子との間の乖離を行なう乖離液を収容する1または2以上の液収容部、増幅用溶液を収容する1または2以上の液収容部、1または2以上の温度制御可能な反応容器、および、1または2以上の分注チップを前記ノズルに装着可能に収容または保持する1または2以上のチップ収容部を有するのが好ましい。また、シーケンサ前処理として増幅までも要求される場合には、増幅工程を必要とし、分子量の合否を判定するには、後述する電気泳動用溶液を収容する1または2以上の液収容部を必要とする。

「磁性粒子懸濁液」とは、核酸またはその断片を捕獲可能となるように加工された磁性粒子を水に懸濁した液であって、例えば、物理的吸着、分子間力、静電気力等によって目的物を捕獲させる場合には、シリカ、ガラスの他、繊維物質のような多孔性物質で被覆したものがある。繊維物質には、例えば、セルロース、ナイロンの他、ポリビニルアルコールやポリエチレングリコール等の親水性高分子等がある。１の磁性粒子のサイズは、例えば、0.1μm〜10μmである。より好ましくは、0.5μm〜5μmである。

共有結合によって目的物を捕獲する場合には、前記磁性粒子の表面に、例えば、ナイロン等で被覆した被覆物質が有するペプチド結合を加水分解することで、生体物質の固定に用いる官能基を生成させる。この場合、生体物質と結合可能な官能基としては、カルボキシル基-COOH、アミノ基-NH₂、チオール基等またはその誘導基による同種官能基同士または異種官能基同士によるものがある。なお、共有結合を行う場合に、架橋剤としてEDCを用いるのが好ましい。

水素結合によって目的物を捕獲する場合には、水素原子より電気的に陰性な原子ＸとＹ（窒素、酸素、リン、硫黄、ハロゲン等）を有するような物質で磁性粒子の表面に被覆させて、水素原子を介して結合させる必要がある。また、静電的結合を行うには、イオン結晶物質で磁性粒子を被覆する必要がある。
その他、所定の目的核酸もしくはその断片またはそれらの一部と相補性を有する塩基配列をもつ核酸若しくはその断片を磁性粒子に結合させる場合もある。これらの内の少なくとも２種類の磁性粒子が、組み合わされて用いられることもある。

「増幅用溶液」とは、例えばＰＣＲ法による増幅を行なう場合には、増幅対象の鋳型ＤＮＡ溶液、プライマー溶液、ＤＮＡポリメラーゼ溶液、ヌクレオチド溶液、反応バッファ溶液等である。また、標識化のための溶液を含めることもある。

「抽出用試薬液」とは、検体に含有する細胞壁等を形成するタンパク質を分解または溶解して核酸またはその断片を細菌や細胞外に流出させて、磁性粒子への結合を促進する溶液であって、例えば、タンパク質分解酵素であるプロテアーゼ、カオトロピックイオン、例えば、グアニジンイオン溶液、尿素イオンまたはヨウ化イオン等、および／または、タンパク質の変性を促す界面活性剤を含有する水溶液と、前記磁性粒子への核酸またはその断片の捕獲を容易化するバッファ液、さらに前記磁性粒子への核酸または核酸の断片の捕獲を促進する結合促進剤との混合溶液である。なお、洗浄液をも含むことがある。

前記核酸の抽出を促進するためには、分注チップを用いて前記混合溶液の吸引吐出を繰り返して捕獲させ、さらに磁力部によって磁場を該分注チップ内に及ぼすことでその内壁に磁性粒子を吸着させることによって行なうのが好ましい。

核酸の断片化及び断片の作成には、以下に示すように「断片化溶液」の他、「結合促進剤」、および「乖離液」を必要とすることがある。なお、「シーケンサに応じた所定範囲の塩基配列数をもつ」は、ＤＮＡまたはその断片に対する遺伝子解析を行うシーケンサの内容に応じて指定された範囲の塩基配列数であって、例えば断片化された断片の全範囲の場合もありうる。塩基配列数の範囲の指定は、例えば、該シーケンサ前処理装置に設けられた後述するＣＰＵを有する情報処理を行う要素（ＣＰＵ＋プログラム）に対し、データの入力や指示を行う操作部を介して予め設定し又はユーザがその都度行う。「断片化溶液」とは、核酸に対してその切断を行なう化学物質であって、例えば、遷移金属誘導酸化的ＤＮＡ切断物質を含有する水溶液である。具体的には、遷移金属とは、例えば、銅イオン、鉄イオン、ニッケルイオン等であって、例えば、硫酸銅を用い、還元剤としては、例えば、アスコルビン酸、ＤＴＴ、メルカプトエタノール等であって、例えば、アスコルビン酸ナトリウムを含有する水溶液を用いる。前者の濃度は、1m mol/Ｌ（リットル）〜10m mol/Ｌであり、後者の濃度は、0.1m mol/Ｌ〜4 m mol/Ｌである。この水溶液によって、前記遷移金属、及び還元剤の濃度、数分から数秒の間のインキュベーション（温度の範囲は、4℃〜95℃の範囲であれば良い）の時間に応じて、50塩基対（ｂｐ）〜1000塩基対の範囲で断片化が可能である。すなわち、前記遷移金属または前記還元剤の濃度が高く、かつ、インキュベーション時間が長ければ、断片化が促進されることになる。核酸またはその断片の切断は、還元剤と遷移金属との反応によって、ラジカル（遊離基）を発生させることによって行なわれる。

該断片化溶液を用いた切断は、制限酵素を用いた切断に比較して、核酸の塩基配列の特異性を利用するのではないので、均等性が高く、超音波による切断に比較すると、余計なエネルギーがかからないので損傷が少ないことになる。

「結合促進剤」とは、磁性粒子への結合を促進する試薬であって、例えば、前記磁性粒子に物理的吸着で前記核酸またはその断片を捕獲させる場合には、例えば、イソプロピルアルコール等のアルコール類またはポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルアルコール等の高分子アルコールである。結合した物質の磁性粒子からの乖離や溶出を促進する「乖離液」または溶出液としては、前記磁性粒子に物理的吸着で磁性粒子に捕獲された前記核酸またはその断片を乖離させる場合には水である。なお、イオン結合により捕獲する磁性粒子の場合には、結合促進剤及び乖離液は、所定の塩の水溶液又は所定のpHを持つ水溶液である。

断片化された核酸の断片の作成を行なうには、一旦、その断片を、前記分注装置を用いて前記結合促進剤の下で前記シリカ、ガラスまたはセルロース等で被覆された磁性粒子に結合させて捕獲させる。次に、シーケンサに応じた所定範囲の分子量に応じて、前記乖離液である水を加えることによって前記結合促進剤の濃度を低下させることで、前記磁性粒子から前記断片を乖離させる。すると、分子量の小さい断片は、前記磁性粒子に対する結合力が弱いため、最初に乖離される。一方、分子量の大きい断片は、前記磁性粒子に対する結合力が大きいため、前記結合促進剤の濃度が相当下がった段階で乖離されることになる。このことを利用して、予め分子量の範囲と結合促進剤の濃度とを関係付けておけば、希望する範囲（シーケンサに応じた所定範囲）の分子量（塩基配列数）をもつ断片を作成することができることになる。こうして該当する分子量を持つ乖離した断片は前記磁性粒子の除去後、他の磁性粒子を投入して捕獲させ該磁性粒子を前記磁力部によって前記内壁に吸着させて回収することができることになる。なお、その分子量と濃度との関係例について図７に例示した。「作成」には、「選択」が含まれるが、「選択」を行なわずに分離または捕獲等により作成する場合も含まれる。

前記「増幅前処理工程」は、反応容器内に、所定の増幅用溶液とともに、前記断片化し、かつ作成された断片を有する溶液を分注する工程であって、これによって、前記作成された断片の両末端にアダプタ（およびプライマ）を結合させることになる。なお、増幅させる量は、ＰＣＲ用の反応容器内で操作できる量である10μＬ〜200μＬであり、この量を分注できるような小容量（例えば100μＬの容量）の増幅用の分注チップを用いることになる。そのためには、抽出等で用いた分注チップ（例えば、1mＬの容量）を除去して、新たに小容量の増幅用の分注チップを前記ノズルに装着することになる。

「着脱可能に装着する」ためには、例えば、前記分注チップを前記ノズルから脱着する脱着機構をノズルヘッドまたは容器群が設けられたステージに設けるのが好ましい。「脱着機構」としては、例えば、前記ノズルの外径よりも大きいが、前記分注チップの最も太い部分よりは小さい径をもつ孔、または切欠き部の開いたプレートをノズルヘッドまたはステージに設け、前記各孔を貫通するノズルの軸方向に沿って該プレートを相対的に下降または上昇させることによって、装着した分注チップを脱着させる機構がある。脱着は、例えば、前記プレートをノズルヘッドに設けた場合には、前記吸引吐出機構としてのシリンダ内を摺動するピストンの駆動機構と前記プレートとを連動させることによって行ない、前記プレートをステージに設けた場合には、上下移動機構によってプレートに対してノズルを相対的に上下方向に移動することによって行なう。

「ノズルと容器群との間を相対的に移動可能とする」のであるから、容器群を固定してノズルを移動させる場合と、ノズルを固定して容器群を移動させる場合、およびその双方を組み合わせた場合がある。
前記ノズルまたはノズルに装着された分注チップは、前記移動機構によってこれらの容器に到達して、液体の吸引および吐出、または、チップの装着や脱着が可能である。なお、ノズルは、後述する吸引吐出機構と連通し、気体の吸引および吐出がなされる。該「吸引吐出機構」は、例えば、シリンダと、該シリンダ内を摺動するピストンと、該ピストンと連結したナット部と、該ナット部が螺合するボール螺子と、該ボール螺子を正逆両方向に回転駆動するモータとを有するものや、ポンプ機構である。

前記反応容器を含む容器や蓋等の材料は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル等の樹脂、ガラス、金属、金属化合物等がある。容器のサイズは、例えば、数μＬ〜数100μＬの液体を収容可能であるとともに、分注チップの先端が挿入可能な大きさである。例えば、円筒状の場合には、例えば、１の容器の大きさの径が数mm〜数10mm、深さが数mm〜数10mmである。

「分注チップ」は、例えば、太管と、細管と、該太管と該細管とを連通する移行部とからなり、前記太管には、前記ノズルの下端が挿入されて前記ノズルに装着される装着用開口部を有し、前記細管には、前記吸引吐出機構による気体の吸引吐出によって液体が流入および流出可能な先端口部とを有する。分注チップおよびノズルは、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエステル、アクリル等の樹脂等の有機物、ガラス、セラミックス、ステンレススチール等の金属、金属化合物、半導体等の無機物によって製造される。

なお必要ならば、前記シーケンサ前処理装置には、「温度制御器」を設けることがある。該温度制御器は、温度制御の対象となる液体を収容する反応容器内の温度を、外部からの信号等に基づいて上昇または下降が可能な温度源を有するものであり、温度源としては、ブロック状部材に例えば、ペルチェ素子、ヒータ、冷却装置等を設けたものである。ＰＣＲ等の処理を行なうには、温度制御器としては、ペルチェ素子を用いたサーマルサイクラーが好ましい。

前記「移動機構」としては、例えば、前記反応容器、すなわち、該反応容器が設けられているステージとノズルとの間を相対的に、ノズルの軸方向および水平面内で移動可能とする機構があり、水平面内の移動としては、例えば、Ｘ軸およびＹ軸に沿ってステージまたはノズルについて、移動を行なうＸＹ軸移動機構またはＹ軸もしくはＸ軸のみに沿って移動を行うＹ（Ｘ）軸移動機構があり、ノズルの軸方向の移動としては、前記ノズルをその軸線方向（Ｚ軸方向）に移動させるノズルヘッドに設けた上下移動機構がある。

なお、シーケンサ前処理方法の前記断片化作成工程は、前記シーケンサに応じた所定範囲に基づいて、対応する結合促進剤の濃度の範囲を定め、少なくとも前記断片化された核酸、前記磁性粒子、前記容器群に収容された前記結合促進剤、および乖離液を混合して、該前記濃度の範囲を有する溶液を作成する選別工程を有することが好ましい。

すると、該選別工程において、前記濃度に応じた分子量の断片が前記溶液中の前記磁性粒子から乖離されることになる（それ以外の分子量の断片は磁性粒子に結合したままである）。該選別工程では、この乖離した断片を回収するために、さらに、前記ノズルに装着した分注チップ、および該分注チップ内に磁場を及ぼす磁力部を用いて、該磁力部で分注チップ内に磁場を及ぼした状態で、該溶液の吸引吐出を繰り返すことで、磁性粒子を分注チップの内壁に吸着させて除去し、残液内の前記所定範囲の塩基配列数の断片を得る。

ここで、塩基配列数の範囲と、結合促進剤の濃度の範囲との関係は、結合促進剤の濃度に応じて実験によって予め測定しておく。例えば、図７に、その一例が示されている。該関係に基づいて、少なくとも混合すべき前記断片化された核酸の溶液、前記磁性粒子懸濁液および前記結合促進剤溶液の量および濃度、並びに乖離液を前記濃度の範囲に合致するように、演算等で各混合比を定めて、その混合比に応じて、前記シーケンサ前処理装置の前記吸引吐出機構及びノズルを有するノズルヘッド、分注チップ、移動機構、温度制御器および／または磁力部を制御して混合させ、かつ乖離した前記所定範囲の断片を得る。

したがって、この場合には、断片の塩基配列数のシーケンサに応じた所定範囲を指定することで、結合促進剤の濃度の範囲を定め、該当する濃度の混合液を定量的な分注を行うことで達成し、該磁性粒子を磁力部によって前記分注チップの内壁に吸着させることで該磁性粒子を除去し、残液中に断片を乖離させることで、種々のシーケンサに応じて指定された範囲の塩基配列数を持つ断片の作成を、簡単な制御で確実かつ容易に実現することができ、汎用性が高い。

第２の発明は、前記反応容器内の温度制御が可能な温度制御器をさらに有する前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記シーケンサ前処理装置の該反応容器を温度制御することによって、前記作成した断片を増幅する増幅工程をさらに有するシーケンサ前処理方法である。

シーケンサの処理として、増幅工程を含まない場合には、作成した断片を増幅する増幅工程までがシーケンサの前処理に当たることになる。

「温度制御」とは、その対象となる液体または容器について、1または2以上の設定された所定温度に、設定された時間維持することを、定められた順序に従って、定められた回数実行することである。前記温度制御器への指示は、プログラムに基づいて該当する信号を送ることによってなされる。

「所定温度」とは、対象となる液体等の物が到達すべき目標とする温度であり、例えば、前記液体に含有するＤＮＡ等の核酸や核酸の断片であるオリゴヌクレオチド等をＰＣＲ法によって増幅する場合には、設定される所定温度としては、例えば、ＰＣＲ法で行なわれる温度サイクル、すなわち、ＤＮＡの変性、アニーリング若しくはハイブリダイゼーション、伸長に各々必要な各温度、約94℃、50℃〜60℃の間の温度、例えば、約50℃、および約72℃である。一方、ＳＰＩＡ法による場合には、一定温度、例えば、55℃等に設定されることになる。

第３の発明は、各種チップ内または前記反応容器内の光学的状態を測定する光測定器をさらに有する前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記各工程の少なくとも１において得られた生成物の品質評価を行なう品質評価工程をさらに有するシーケンサ前処理方法である。

「各種チップ」には、分注チップの他に、キャピラリー型電気泳動用チップをも含まれる。
「キャピラリー型電気泳動用チップ」とは、ゲルが封入された透光性のある細管と、該細管と連通する太管と、該細管の下端に設けられた流体が進入可能な口部と、前記太管の上端に設けられた開口部とを有するものである。前記太管の開口部は、後述するノズルヘッドの電極支持部材によって装着等によって解除可能に支持可能であるとともに、該開口部から電気泳動溶液（バッファ液）を導入可能である。該太管内に電気泳動溶液を挿入した後に、該チップを該電極支持部材に支持された場合には、該電極支持部材に設けられた第１の電極が前記太管内に挿入されて太管内に収容される電気泳動溶液と接触可能である。一方、前記細管の口部は、第２の電極が設けられ収容される測定対象液と接触可能に設けられた電極付液収容部に挿入されると、前記測定対象液が口部から進入されることになる。第１の電極と第２の電極の間に所定の電圧を印加することによって前記キャピラリー型電気泳動用チップ内に電場を及ぼし、電荷を帯びた核酸または断片が電場から力を受けてゲル中を移動することができる。なお、細管は、例えば、0.05mm〜0.5mm、好ましくは0.1mm〜0.3mmの内径をもつ細径管であることが好ましい。キャピラリー型電気泳動用チップの支持または装着は、例えば、容器群に収容されたキャピラリー型電気泳動用チップに対して前記ノズルヘッドを下降することによって前記電極支持部材またはキャップを前記開口部に嵌合して装着することによって行なう。分注チップの装着についても同様にしてノズルヘッドを下降することによって前記ノズルを前記分注チップの装着用開口部に嵌合することで装着させる。脱着についても、前記分注チップと同様の形状をもつチップ脱着部を用いて脱着することも可能である。なお、前記第１の電極と第２の電極の間に電圧を印加する電源装置が必要である。

「品質評価工程」とは、前記抽出工程、断片化作成工程、および増幅前処理工程、または増幅工程からなる基本的工程の各工程の結果生成された生成物の品質の評価を行うための工程であって、これによって、最終的に得られた結果が信頼性の高いものであることを保証し、または、どの工程での処理に誤りがあったかを確認することによって、その原因をより容易に突き止め、処理または工程の結果得られた生成物の品質の向上を図ることができる。

品質の評価は、得られた核酸またはその断片の分子量や濃度を評価するために前記シーケンサ前処理装置に備えた光測定器を利用して各種チップまたは反応容器内の光学的状態を測定することによって行なう。例えば、キャピラリー型電気泳動用チップ内で行なわれる電気泳動法による標識化された核酸またはその断片を光測定することによって分子量の範囲を解析し、または吸光度を光測定することでその核酸またはその断片の濃度を測定することである。

「光学的状態」には、発光、呈色、変色、変光を含み、「変光」には、光の反射、吸収、散乱を含む。

第４の発明は、前記各工程の少なくとも１において、前記シーケンサ前処理装置を用いて前記工程の結果得られた前記生成物を所定の磁性粒子懸濁液と混合し、前記ノズルに装着した分注チップを介して前記混合液の吸引吐出を繰り返すことで前記磁性粒子に捕獲させ、前記磁力部を用いて分注チップの内壁に吸着させることで各工程の処理目的に合致するように核酸またはその断片を精製する工程をさらに有するシーケンサ前処理方法である。

精製は、前記基本的工程を達成するためのシーケンサ前処理装置を利用して行われ単に前処理の各工程の繰り返しではなく、各工程とは異なる種類の溶液、異なる磁性粒子、または異なる器具を用いて行うのが好ましい。精製を行なうには、前記溶液は洗浄液、例えば、エタノール等のアルコール類を含有する水溶液が好ましい。

前記核酸若しくはその断片を分注チップの内壁に吸着させたまま、または液中に懸濁した状態で、液の吸引吐出を繰り返すことで、核酸若しくはその断片以外のタンパク質や夾雑物を除去することで行なう。また、増幅前処理工程や増幅工程において、核酸等に結合しなかったプライマー、アダプター等の夾雑物を除去することができる。

第５の発明は、前記品質評価工程として、前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記各工程の少なくとも１において、該工程の結果得られた生成物についてその分子量の評価を行うシーケンサ前処理方法である。

第６の発明によると、前記品質評価工程として、前記各工程の少なくとも１において、前記シーケンサ前処理装置を用いて前記核酸またはその断片の濃度の評価を行なうシーケンサ前処理方法である。

濃度の評価は、前記核酸またはその断片を含有する溶液の吸光度を測定することによって、該核酸またはその断片の濃度が該工程の処理目的に合致するか否かの評価を行う。このように、各工程を実施する該装置を用いて、各工程における不純物の存在について評価することができるので、処理を続行するか否かを早期に定めることによって、処理のやり直し、追加処理または中止を決めることができるので、信頼性の高い処理を高い効率性をもって行なうことが可能である。

本発明によると、抽出工程、断片化作成工程、および増幅前処理工程、または増幅工程の基本的工程を行なうシーケンサ前処理装置に組み込まれた装置を用いて、精製、または、分子量若しくは濃度の判定を簡単、かつ効率的に実行することができるので、品質の評価を処理に容易かつ効率的に反映させることができる。

第７の発明は、前記品質評価工程は、前記容器群にゲルが封入された細管および該細管と連通する太管からなる1または2以上の各キャピラリー型電気泳動用チップが収容され、前記ノズルヘッドには、前記キャピラリー型電気泳動用チップを前記太管側で支持可能であって前記太管に収容される電気泳動用溶液と接触可能な第１の電極が設けられ前記ノズル移動機構により前記容器群に対してノズルとともに相対的に移動可能な1または2以上の電極支持部材を有し、前記容器群には、収容した液と接触可能に設けられた第２の電極を有する1または2以上の電極付液収容部をさらに有する前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記容器群に設けられた電気泳動用溶液を収容する液収容部から電気泳動用溶液を前記太管内に分注し、該キャピラリー型電気泳動用チップを該太管側において前記電極支持部材に支持させて前記溶液と該電極とを接触させ、各工程の結果得られた生成物を抜き出して前記電極付液収容部に分注し、該生成物を標識化し、該電極付液収容部に前記細管の先端を挿入させ、前記電極を通して電場を前記チップ内に及ぼし、前記細管内を前記光測定器により測定することによって分子量の評価を行なうシーケンサ前処理方法である。

ここで、「電気泳動用溶液」とは、電気泳動に用いる、アガロースゲルおよび 1×TAEバッファ液または 1×TBEバッファ液である。また、標識化用試薬液をも含めることがある。「標識化」は、例えば、インターカレータにより、前記断片化された核酸またはその断片を蛍光で標識化する。インターカレータは、SYBR(登録商標)GREEN I、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が二本鎖ＤＮＡに入り込み蛍光を発する特性を利用したものである。
前記電極間に印加する電圧は、例えば数ボルトから数1000ボルト程度である。

各基本的工程を実施する前記シーケンサ前処理装置を用いて、該ノズルヘッドに設けた電極支持部材に、前記容器群に前記電極支持部材に装着可能であるように収容され、前記アガロースゲルが封入された前記キャピラリー型電気泳動用チップを、前記ノズルヘッドの下降移動によって、装着等によって支持して分子量の合否を判定することができるので、次の工程に直ちに適用することができ、効率的かつ迅速に高精度の処理を実行することができることになる。

第８の発明は、前記品質評価工程として、前記増幅工程において、前記シーケンサ前処理装置を用いて前記核酸またはその断片に含有させた前記インターナルコントロール用核酸若しくはその断片を測定するインターナルコントロール測定工程を有するシーケンサ前処理方法である。

ここで、「インターナルコントロール用核酸またはその断片」とは、ＰＣＲ反応自体の阻害の有無を判断するために添加される核酸またはその断片である。インターナルコントロール核酸またはその断片を添加した場合には、インターナルコントロール核酸またはその断片の増幅が認められればＰＣＲ反応が正常であったと判断され、ターゲットおよびインターナルコントロール核酸またはその断片がともに増幅が認められなかった場合には、ＰＣＲ反応自体に阻害があったものと判断される。

第９の発明は、気体の吸引および吐出を行う吸引吐出機構と、該吸引吐出機構と連通し液体の吸引および吐出が可能な分注チップが着脱可能に装着される1または2以上のノズルを有するノズルヘッドと、磁性粒子懸濁液を含む各種液を収容する液収容部および反応容器を少なくとも有する容器群と、前記ノズルと前記容器群との間を相対的に移動可能とする移動機構と、前記ノズルに装着された分注チップに外部から磁場を及ぼしかつ除去することが可能な磁力部とを有するとともに、少なくとも、前記吸引吐出機構、前記移動機構、および前記磁力部を外部信号に基づいて制御する制御部を有し、該制御部は、前記容器群に収容された検体、抽出用試薬液および磁性粒子懸濁液を混合攪拌して、核酸を抽出する抽出制御部と、抽出した前記核酸を前記容器群に収容された断片化溶液と混合して断片化し、断片化された前記核酸から磁性粒子懸濁液を用いてシーケンサに応じた所定範囲の塩基配列数を持つ断片を作成する断片化作成制御部と、前記作成した断片を含有する溶液の所定量を、増幅用溶液とともに前記反応容器内に所定の分注チップで分注して混合するように制御する増幅前処理制御部と、を有するシーケンサ前処理装置である。

ここで、必要ならば、前記反応容器内の温度制御が可能な温度制御器を設ける。
制御部は、前記シーケンサ前処理装置に内蔵したコンピュータ（ＣＰＵ）および該コンピュータを駆動するプログラムからなり、例えば、ＤＡ変換器およびＡＤ変換器を通して信号を前記吸引吐出機構、前記移動機構、および前記磁力部、または必要ならば温度制御器に対して制御が行われる。

抽出制御部は、具体的には、前記検体と前記抽出用試薬溶液と磁性粒子懸濁液とをノズルに装着した分注チップ、吸引吐出機構、移動機構を用いて反応容器内に吸引吐出して混合攪拌し、必要ならば温度制御器を用いて該磁性粒子に検体から得られた核酸を結合させ、前記分注チップ内に前記磁力部によって磁場を及ぼすことによってその内壁に吸着させることで抽出を行なうように制御する。

断片化作成制御部は、具体的には、前記抽出された核酸と断片化溶液とを、分注チップを通して吸引吐出機構によって吸引吐出を行なうことで反応容器内で混合させて、必要ならば温度制御器を用いて反応容器内で、所定インキュベーション時間反応させて断片化を行う。インキュベーション時間を長くしまたは断片化溶液の濃度を高くすると、切断箇所が増加し、断片化された分子量をより小さくする。次に、磁性粒子懸濁液と断片とを混合させ、さらに結合促進剤を混合させることで、磁性粒子に実質的に全断片を結合させた後、所定量の乖離液を分注してその結合促進剤の濃度を変化させると、その濃度に応じた塩基配列数の範囲の断片を乖離することができる。結合促進剤の濃度が低くなればなる程、塩基配列数の大きい断片が乖離されることになる。断片化成制御部は、前述したように、例えば、図７に相当する、結合促進剤の濃度の範囲と核酸の断片の分子量（塩基配列数に対応）の範囲との関係を示すテーブル等のデータを内蔵していることになる。

増幅前処理制御部は、前記作成した断片を含有する溶液の所定量、すなわち、ＰＣＲ反応容器で操作できる量、例えば、総量が10μＬ〜200μＬとなるように反応容器内に分注する。そのためには、いわゆる小容量（例えば、5μＬ〜500μＬ、好ましくは10μＬ〜100μＬ）の容量をもつ分注チップが、ノズルに装着されて用いられることになる。

前記容器群は、具体的には、少なくとも検体を収容する液収容部、前記検体から核酸を抽出するための抽出用試薬溶液を収容する液収容部、抽出した核酸を所定の塩基配列数の範囲となるように断片化するために必要な断片化溶液を収容する液収容部、各核酸またはその断片と結合可能な磁性粒子を懸濁する磁性粒子懸濁液を収容する液収容部、前記核酸またはその断片と磁性粒子との結合を促進する結合促進剤溶液および乖離液を各々収容する液収容部、増幅用溶液を収容する液収容部、温度制御可能な反応容器、および、分注チップを前記ノズルに装着可能に収容または保持するチップ収容部を有するのが好ましい。また、分子量の合否を判定するには、後述する電気泳動用溶液を収容する液収容部を必要とする。

2以上のノズルを用いる場合には、各ノズルに対応するように2以上の収容部を有する前記容器群が、１の前記ノズルが進入し他のノズルが進入しないよう各ノズルに対応した2以上の専用領域内に各々配列されることによって、各専用領域を、異なる検体毎に設定することで、クロスコンタミネーションを確実に防止することができる。

第１０の発明は、前記反応容器内の温度制御が可能な温度制御器をさらに有するとともに、前記制御部には、該反応容器を温度制御することによって、前記作成した断片を増幅する増幅制御部をさらに有するシーケンサ前処理装置である。

シーケンサの構成として、増幅制御部を含まない場合には、作成した断片を増幅する増幅工程までがシーケンサの前処理に当たることになる。

なお、前記シーケンサ前処理装置は、前記容器群には前記各種液として、結合促進剤溶液および乖離液が各々収容され、前記断片化作成制御部は、前記シーケンサに応じた塩基配列数の所定範囲に対応する結合促進剤の濃度の範囲に基づいて、前記断片化された核酸、前記磁性粒子、前記結合促進剤、及び乖離液を混合して溶液を作成するように前記吸引吐出機構、前記移動機構、温度制御器および／または前記磁力部を制御する選別制御部を有することが好ましい。

ここで、塩基配列数の範囲と、結合促進剤の濃度の範囲との関係は、結合促進剤の濃度に応じて実験によって予め測定しておく。例えば、図７に、その一例が示されている。該断片化作成制御部として、このようなテーブル等からなるデータを、該シーケンサ前処理装置の情報処理を行う要素（ＣＰＵ＋プログラム）が有するメモリ内に格納しておくことによって、結合促進剤の濃度の範囲が定められる）。すると、少なくとも混合すべき前記断片化された核酸の溶液、前記磁性粒子懸濁液および前記結合促進剤溶液の量および濃度、並びに乖離液を前記濃度の範囲に合致するように、演算等で各混合比を定めて、その混合比に応じて、前記シーケンサ前処理装置の前記吸引吐出機構及びノズルを有するノズルヘッド、移動機構、温度制御器および／または磁力部を制御して混合させ、かつ液中に乖離した前記所定範囲の断片を得る。したがって、種々のシーケンサに応じて指定された範囲の塩基配列数を持つ断片の作成を簡単な制御で確実かつ容易に実現することができ、汎用性が高い。

第１１の発明は、前記各種チップ内または前記反応容器内の光学的状態を測定する光測定器をさらに有するとともに、前記制御部は、該光測定器をも外部信号に基づいて制御するとともに、前記各制御部の少なくとも１について、前記制御部の制御の結果得られた生成物の品質の評価を行なう品質評価制御部をさらに有するシーケンサ前処理装置である。
「各種チップ」とは、各種分注チップ（0.5mＬ〜50mＬの通常容量の分注チップ、または前記小容量の分注チップ等を含む）または前述したようにキャピラリー型電気泳動用チップである。

第１２の発明は、前記制御部は、前記核酸またはその断片を含む溶液を前記磁性粒子懸濁液と吸引吐出によって混合攪拌して、前記磁性粒子に目的とする核酸またはその断片を捕獲させ、捕獲した磁性粒子を前記分注チップ内に磁場を及ぼして内壁に吸着させて前記核酸またはその断片を精製するように制御する精製制御部を有するシーケンサ前処理装置である。

この精製制御部が使用する磁性粒子は、前記抽出制御部、断片化作成制御部、増幅前処理制御部、または増幅制御部が用いる磁性粒子とは異なる磁性粒子であることが好ましい。その際、例えば、乖離液および結合促進剤の所定割合の溶液や、抽出用試薬溶液、断片化溶液、または洗浄液等とともに吸引吐出するように制御することがある。ここで、洗浄液は、例えば、エタノール等のアルコール類を含有する水溶液が好ましい。

第１３の発明は、前記容器群に、ゲルが封入された細管および該細管と連通する太管からなる1または2以上のキャピラリー型電気泳動用チップが収容され、前記ノズルヘッドには、前記キャピラリー型電気泳動用チップを前記太管側で支持可能であって前記太管に収容される電気泳動用溶液と接触可能な第１の電極が設けられ前記移動機構により前記容器群に対してノズルとともに相対的に移動可能な1または2以上の電極支持部材を有し、前記容器群には、収容した液と接触可能に設けられた第２の電極を有する1または2以上の電極付液収容部を有するシーケンサ前処理装置である。第１の電極と第２の電極の間には泳動用電源が接続されて、泳動用電圧を印加する。

第１４の発明は、前記光測定器は、前記容器群内に設けられ透光性を有する1または2以上の液収容部内の吸光度を測定可能に設けられ、前記品質評価制御部は、前記各制御部によって生成された生成物を含む溶液を前記各液収容部に収容して、前記光測定器によって各液収容部の吸光度を測定するシーケンサ前処理装置である。

第１５の発明は、前記品質評価制御部は、前記容器群に設けられた電気泳動用溶液を収容する液収容部から電気泳動用溶液を前記太管内に分注し、該キャピラリー型電気泳動用チップを該太管側において前記電極支持部材に支持させて前記溶液と該電極とを接触させ、各工程の結果得られた生成物を抜き出して前記電極付液収容部に分注し、該生成物を標識化し、該電極付液収容部に前記細管の先端を挿入させ、前記電極を通して電場を前記チップ内に及ぼし、前記細管内を前記光測定器により測定することによって分子量の評価を行なうように制御するシーケンサ前処理装置である。

第１６の発明は、前記第１の電極は、前記電極支持部材の電極取付部に電気伝導可能に取り付けられたシーケンサ前処理装置である。

第１７の発明は、前記電極支持部材には、該電極支持部材の先端を被覆するキャップを有し、該キャップには、前記電極支持部材の前記第１の電極が貫くように突出するとともに、前記キャピラリー型電気泳動用チップが取り付けられて該チップの開口部を閉塞するシーケンサ前処理装置である。

第１８の発明は、1または2以上の前記キャピラリー型電気泳動用チップの前記細管に近接または接触しかつ該細管に沿って移動可能に設けられ、または、1または2以上の透光性を有する反応容器の側面に近接または接触して設けられた1または2以上の先端および後端を有する可撓性のある導光路と、該後端が所定経路に沿って配列された配列体と、該配列体の前記所定経路に沿って相対的に移動可能であって、前記後端と順次光学的に接続可能な光測定器とを有するシーケンサ前処理装置である。

「相対的に移動可能」であるので、前記光測定器が、前記配列体に対して移動する場合と、前記配列体が、前記光測定器に対して移動する場合がある。また、光測定器および配列体が、ステージ上に設けられる場合と、光測定器及び前記配列体が前記ノズルヘッドに設けられる場合がある。

第１９の発明は、ゲルが封入された透光性のある細管および該細管と連通する太管からなる1または2以上のキャピラリー型電気泳動用チップと、前記キャピラリー型電気泳動用チップを前記太管側で支持可能であって前記太管に収容される電気泳動用溶液と接触可能な第１の電極が設けられて前記キャピラリー型電気泳動用チップに対して相対的に移動可能な1または2以上の電極支持部材と、収容した液と接触可能に設けられた第２の電極を有する1または2以上の電極付液収容部とを有する電気泳動装置である。
なお、前記細管内の光学的状態を測定する光測定器があることが好ましい。また、前記電極支持部材は、ノズルヘッドにノズルとともに設けられることが好ましい。この発明によれば、キャピラリー型電極泳動チップを前記電極支持部材に対して使い捨てとして用いることができるので、操作が容易であって、クロスコンタミネーションを防止して信頼性が高い。

第１の発明、第２の発明、第９の発明または第１０の発明によると、検体からの核酸の断片の抽出、該核酸の断片化およびシーケンサに応じた所定範囲の塩基配列数を持つ断片の作成、および増幅前処理、または増幅処理というシーケンサの前処理を、核酸またはその断片の結合性をもつ同種の磁性粒子、ノズルヘッド、吸引吐出機構、検体および必要な試薬を収容する容器群、移動機構、および磁力部、または温度制御器を用いることによって、装置規模を拡大することなく、効率的かつ容易にシーケンサの前処理を実行することができることになる。

第３の発明または第１１の発明によると、磁性粒子を含む前記組合せにさらに光測定器を含めるだけで、前処理の品質の評価の制御をも行うことができる。したがって、装置規模をむやみに拡大することなく、簡単な構成で、信頼性の高いシーケンサの前処理を実行することができることになる。

第４の発明または第１２の発明によると、シーケンサの前処理を、前記組み合わせを用いて、磁性粒子に目的の核酸やその断片を結合させた状態で吸引吐出を繰り返すことによって、夾雑物を除去する精製工程を各工程の少なくとも１において実行することによって、簡単かつ容易に前処理全体の信頼性を高めることができることになる。

第５の発明、第７の発明、第１３の発明、第１５の発明乃至第１８の発明によると、磁性粒子を含む前記組合せを用いて、シーケンサの前処理の各工程または制御部で処理された結果生成された核酸またはその断片について、その分子量の評価を行うことによって、その品質を容易かつ簡単に評価して信頼性を高めることができることになる。

第６の発明または第１４の発明によると、シーケンサ前処理に関する前記組合せを用いて、核酸またはその断片についての濃度の評価を行なうことによって、夾雑物の存在を各工程の少なくとも１において確認することによって、品質の向上を図り、信頼性を高めることができる。

第８の発明によると、シーケンサの前処理において、インターナルコントロールを測定することによって、ＰＣＲ反応自体に阻害が生じたか否かの判定を行うことができるので信頼性を高めることができる。

第１６の発明によると、検体や抽出された核酸またはその断片と接触する可能性のある電極を前記電極支持部材に対して除去可能に取り付けることによって、ノズルヘッド自体を付け替えることなく、電極だけの付け替えで、クロスコンタミネーションの防止や環境汚染を防止することができる。

第１７の発明によると、キャップによってキャピラリー型電気泳動用チップを閉塞して電極支持部材について、核酸やその断片との接触を防止して再利用を容易にし、かつクロスコンタミネーションや環境汚染を防止することができる。

第１８の発明によると、所定間隔に配列されたキャピラリー型電気泳動用チップまたは反応容器と配列体とを可撓性のある導光路を介して光学的に連結している。そのため、光測定器との間で相対的に移動する前記所定経路は、前記所定間隔よりも短い間隔に導光路の後端を集積化して配列することができて光測定器の相対的な移動距離を短縮化することができる。また、分子量の測定と、反応容器内の増幅反応の測定とを同一の光測定器を用いて実行することによって、装置規模を拡大することなく効率的に品質評価を行うことができることになる。

本発明の実施の形態に係るシーケンサ前処理装置を示すブロック図である。 本発明の実施の形態に係るシーケンサ前処理装置を示す全体斜視図である。 図２に示すシーケンサ前処理装置のノズルヘッドおよび光測定器の一部を示す部分拡大斜視図である。 本発明の実施の形態に係るキャピラリー型電気泳動用チップおよび使用状態を示す一部断面斜視図である。 本発明の実施の形態に係る図２の液収容部および吸光度測定用の光測定器の一部を示す斜視図である。 本発明の実施の形態に係るＰＣＲ用反応容器を示す断面図である。 本発明の実施の形態に係る断片化作成制御の内容を示す実験結果図である。 本発明の他の実施の形態に係るノズルヘッド及び光測定器の一部を示す斜視図である。

続いて、図面に基づいて本発明の実施の形態について説明する。なお、この実施の形態は特に指定のない限り本発明を制限するものと解釈してはならない。また、各実施の形態例において同一のものは同一の符号で表わし説明を省略した。

図１は、本発明の実施の形態に係るシーケンサ前処理装置１０を示すブロック図を示す。
本実施の形態に係るシーケンサ前処理装置１０は、気体の吸引および吐出を行なう吸引吐出機構４３によって液体の吸引および吐出が可能な複数（本例では、6本）の分注チップ４９をその装着用開口部に着脱可能に装着する複数（本例では、6個）のノズル４１_１〜４１_６を有するノズルヘッド４０と、磁性粒子懸濁液５３、６３を含む各種液を収容する液収容部および反応容器を含有する収容部群９０と、前記ノズルヘッド４０に設けられたノズル４１_１〜４１_６と前記収容部群９０との間を相対的に移動可能とするノズル移動機構８０と、前記反応容器内の温度制御が可能な温度制御器９１と、処理の結果得られた生成物の品質の評価を行なう品質評価エリア３０と、前記ノズルヘッド４０に設けられ、ノズル４１_１〜４１_６に装着された6本の分注チップ５４に外部から磁場を及ぼしかつ除去することが可能な磁力部４４と、前記吸引吐出機構、前記ノズル移動機構、および前記磁力部を外部信号によって制御するための情報処理を行うＣＰＵ及びプログラム２０と、該ＣＰＵ＋プログラム２０に対して指示を与え、データの入力を行なう操作部１１とを有する。前記ノズル移動機構は、前記移動機構に相当する。また、前記収容部群９０と品質評価エリア３０とを合わせたものが容器群に相当する。

前記ノズルヘッド４０は、複数の（この例では6本の）前記ノズル４１_１〜４１_６と、該ノズル４１_１〜４１_６が所定間隔で１列状に配列されたノズル配列基板４１と、前記磁力部４４と、前記吸引吐出機構４３と、前記ノズル４１_１〜４１_６の先端部に装着された分注ノズル４１_１〜４１_６を脱着するチップ脱着部４５と、後述するキャピラリー型電気泳動用チップ６４_１〜６４_６をその装着用開口部で装着されることで支持するとともに第１の電極４７_１〜４７_６が先端から突出するように設けられた電極支持部材４２_１〜４２_６と、該電極支持部材４２_１〜４２_６が前記所定間隔で一列状に配列された支持部材配列板４２と、前記第１の電極４７_１〜４７_６と、後述する電極付液収容部３４_１〜３４_６に設けられた第２の電極４８_１〜４８_６との間に所定の電圧を印加して電場を発生させるように制御する電極制御器４６を有する。

前記収容部群９０は、検体、検体から核酸を抽出するための抽出用試薬液、磁性粒子懸濁液、分注チップ等を収容する収容部及び反応容器の各々が、前記ノズルヘッド４０のノズル４１_１〜４１_６の配列方向（列方向）に沿って所定の列間隔で配列され、全体として行列状に配列されている抽出用エリア５０と、抽出された核酸を断片化しかつ断片を作成するための断片化溶液、磁性粒子懸濁液、結合促進剤、乖離液、電気泳動用溶液等、キャピラリー型電気泳動用チップを収容する収容部及び反応容器の各々が、前記ノズルヘッド４０の前記列間隔で配列方向に沿って配列され、全体として行列状に配列されている断片化作成エリア６０と、断片化された断片の増幅前処理および増幅処理を行なうための増幅用溶液、密閉液、分注チップを収容する収容部及び反応容器の各々が、前記ノズルヘッド４０の前記間隔で列方向に沿って配列され、全体として行列状に配列されているＰＣＲエリア７０とを有する。

前記品質評価エリア３０は、核酸またはその断片を含有する溶液の吸光度を測定するための吸光度測定エリア３５と、キャピラリー型電気泳動用チップを用いて電気泳動法により核酸またはその断片の分子量の評価を行なうための分子量評価エリア３６と、蛍光で標識化され増幅した断片中に含まれるインターナルコントロール断片の増幅量を測定するインターナルコントロール測定エリア３７とを有する。

前記ＣＰＵ＋プログラム２０及び操作部１１は、各々、情報処理装置の本体と、キーボード、タッチパネル、マウス、および液晶パネル等とに各々相当するものである。ＣＰＵ＋プログラム２０は、前記吸引吐出機構４３、前記ノズル移動機構８０、前記磁力部４４、及び温度制御器９１に、前記操作部１１からの指示によりＤＡ変換器およびＡＤ変換器を通して信号を送受することによって制御が行われるものである。

さらに、図１に基づいて、前述した抽出用エリア５０、断片化作成エリア６０、ＰＣＲエリア７０、吸光度測定エリア３５、分子量評価エリア３６、インターナルコントロール測定エリア３７、ＣＰＵ＋プログラム２０について具体的に説明する。

前記抽出用エリア５０は、前記ノズル４１_１〜４１_６の前記列方向に所定の前記列間隔で配列された6種類の検体５１を収容する検体収容部５１_１〜５１_６と、前記細胞を破壊して核酸を引き出すタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）、カオトロピックイオン溶液、ポリエチレングリコール等の磁性粒子に対する結合促進剤等からなる前記抽出用試薬液５２を収容する抽出用試薬収容部５２_１〜５２_６と、前記列方向に沿って前記列間隔で配列されたセルロースで被覆された磁性粒子が懸濁する磁性粒子懸濁液５３を収容する磁性粒子懸濁液収容部５３_１〜５３_６と、前記列方向に沿って前記列間隔で配列された前記ノズル４１_１〜４１_６に装着可能となるように装着用開口部を上側にして収容された1mＬの容量をもつ分注チップ５４及びプレパックされたウェルのシールを穿孔するための穿孔用チップを収容するチップ等収容部５４_１〜５４_６と、前記温度制御器９１により温度制御可能であって、前記列方向に沿って前記列間隔で配列された透光性を持つ反応容器５５_１〜５５_６とを有する。その他、エタノール等のアルコール類を有する洗浄液を同様に液収容部に収容して配列することが好ましい。前記抽出用試薬液５２は、酵素等の各成分を別々に液収容部に収容しておき使用直前に抽出用試薬収容部で混合することがある。

前記断片化作成エリア６０には、核酸を断片化するための、例えば、硫酸銅及びアスコルビン酸ナトリウム水溶液からなる前記断片化溶液６１を収容する断片化溶液収容部６１_１〜６１_６と、電気泳動用溶液６２を収容する電気泳動用溶液収容部６２_１〜６２_６と、核酸の断片の中からシーケンサに応じた所定範囲（いわば、ユーザの希望する範囲）の塩基配列数の断片と結合するために用いる磁性粒子懸濁液６３を収容する磁性粒子懸濁液収容部６３_１〜６３_６と、前記キャピラリー型電気泳動用チップ６４および分注チップ等を収容するチップ等収容部６４_１〜６４_６と、前記磁性粒子への結合を促進するための、例えば、ポリエチレングリコール等の結合促進剤溶液６５を収容する結合促進剤溶液収容部６５_１〜６５_６と、例えば、水からなる乖離液６６を収容する乖離液収容部６６_１〜６６_６と、反応容器６７_１〜６７_６とを有する。

前記ＰＣＲエリア７０には、プライマー溶液、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド溶液等からなる増幅用溶液７１を収容する増幅用溶液収容部７１_１〜７１_６と、反応容器密閉用の密閉液７２を収容する密閉液収容部７２_１〜７２_６と、小容量（例えば、100μＬ）の分注チップ７３を収容する分注チップ等収容部７３_１〜７３_６と、前記温度制御器９１によって温度制御がなされる10μＬ程度の容量を持つ反応容器７４_１〜７４_６とを有する。密閉液としては、例えば、ミネラルオイル、シリコーンオイル等であり、「ミネラルオイル」とは石油由来のオイルであり、「シリコーンオイル」とは、シロキサン結合が２０００以下の直鎖構造の分子からなるオイル状物質である。なお、抽出用エリア５０、断片化作成エリア６０、およびＰＣＲエリア７０の液収容部の容量は、200μＬ〜2mＬ程度が好ましい。

前記品質評価エリア３０の前記吸光度測定エリア３５は、透光性をもつ液収容部３３_１〜３３_６を有し、これらの液収容部３３_１〜３３_６が前記列方向に前記所定間隔で、例えば、配列基板３３上に配列され、各液収容部３３_１〜３３_６に収容された液体の吸光度（ＯＤ値）を測定するように前記各液収容部３３_１〜３３_６の側面近傍を通過するように移動可能な光測定器３９が設けられている。

前記分子量評価エリア３６には、前記第２の電極４８_１〜４８_６が各底部に収容された液体と接触可能となるように各々設けられた透光性のある電極付液収容部３４_１〜３４_６を有し、これらの電極付液収容部３４_１〜３４_６が前記所定間隔で前記列方向に沿って、例えば、配列基板３４に一列状に配列されている。

該電極付液収容部３４_１〜３４_６に前記キャピラリー型電気泳動用チップ６４の先端が挿入された使用状態において、該電気泳動チップ６４の軸方向に沿って、上下に移動可能に設けられた一端の測定端３２_１ａ〜３２_６ａ及び他端の接続端を有する光ファイバからなる導光路３２_１〜３２_６と、該測定端３２_１ａ〜３２_６ａを前記列方向に沿って前記所定間隔で配列し上下移動可能に支持する測定端配列体３２と、前記接続端が前記所定間隔よりも短い間隔で配列された接続端配列体３２０と、配列された該接続端と順次光学的に接続して受光及び発光を行うように該接続端配列体３２０に沿って移動可能に設けられた光測定器３１を有する。

前記インターナルコントロール測定エリア３７には、透光性のあるＰＣＲ増幅用の反応容器３８_１〜３８_６が前記温度制御器９１によって温度制御可能な温度制御ブロックによって囲まれ、該温度制御ブロックと接触するようにして前記列方向に沿って前記所定間隔で配列基板３８に一列状に配列されている。

また、前記反応容器３８_１〜３８_６に接触または近接して設けられた一端の測定端および他端の接続端を有する光ファイバからなる導光路３２_７〜３２_１２を有し、前記接続端は前記接続端配列体３２０に前述した複数（この例では6個）の接続端とともに、前記所定間隔よりも短い間隔で一列状に配列されて、合計12個の接続端は、前記光測定器３１によって、順次光学的に接続されている。

前記ＣＰＵ＋プログラム２０は、前記抽出用エリア５０に収容された検体５１、抽出用試薬液５２および磁性粒子懸濁液５３を混合攪拌して核酸を抽出する抽出制御部２１と、抽出した前記核酸を、前記断片化作成エリア６０に収容された断片化溶液６１と混合して断片化し、磁性粒子懸濁液６３を用いて、シーケンサに応じた所定範囲の塩基配列数をもつ断片を作成する断片化作成制御部２２と、前記作成した断片を含有する溶液の所定量を、ＰＣＲエリア７０に収容された増幅用溶液７１とともに前記反応容器７４_１〜７４_６に、前記ノズル４１_１〜４１_６に該当する小容量（例えば、10μＬのオーダー）の分注チップ７３に付け替えることで分注して混合するように制御する増幅前処理制御部２３と、前記反応容器７４_１〜７４_６内を前記温度制御器９１によって温度制御することによって増幅させる増幅制御部２４と、各制御部の制御によって得られた前記生成物を、所定の磁性粒子懸濁液５３，６３と混合し、前記ノズル４１_１〜４１_６に装着した新たな分注チップ５４を用いて分注チップの内壁に吸着させることで各処理目的に合致するように核酸またはその断片を精製する精製制御部２５と、前記キャピラリー型電気泳動用チップ内または前記反応容器内の光学的状態を測定する光測定器を用いて、前記各制御部の少なくとも１について、該制御部による制御の結果得られた生成物の品質の評価を行なう品質評価制御部２６とを有する。前記断片化作成制御部２２は、前記選別制御部を有する。

図２は、図１に示した本発明の実施の形態に係るシーケンサ前処理装置１０の全体斜視図である。
本実施の形態に係るシーケンサ前処理装置１０は、例えば、長さが600mm（Ｘ軸方向）、奥行きが600mm（Ｙ軸方向）、高さが500mm（Ｚ軸方向）程度の前面が取り外し可能な扉１３が取り付けられ上面が天板１４で覆われた筐体１２に囲まれている。該筐体１２内には、前述したように、該天板１４にノズル移動機構８０を介して吊り下げられるように設けられた前記ノズルヘッド４０、ステージ１５には、前記容器群としての品質評価エリア３０および収容部群９０にそれぞれ属する吸光度測定エリア３５、分子量評価エリア３６、インターナルコントロール測定エリア３７、および、前記収容部群９０に属する前記抽出用エリア５０、前記断片化作成エリア６０および前記ＰＣＲエリア７０が設けられている。なお、前記操作部１１およびＣＰＵ＋プログラム２０についても、該筐体１２の側壁及びその内部に組み込まれている。

前記抽出用エリア５０には、6本のカートリッジ容器５６をＹ軸方向に沿って並列に設けたものであって、隣接するカートリッジ容器５６間には、分注チップの吸引吐出や移動の際の液の飛散による混入を防止するための隔壁１６が設けられている。各カートリッジ容器５６の12個の各ウェルやホールは、前述した検体収容部、抽出用試薬収容部、磁性粒子懸濁液収容部、チップ等収容部、および反応容器等に対応するものである。

前記断片化作成エリア６０は、断片化エリア６０ａと、作成エリア６０ｂとからなり、断片化エリア６０ａには反応容器を含む6本のＹ軸方向に沿って並列に設けられたカートリッジ容器６８を有し、作成エリア６０ｂには、磁性粒子懸濁液収容部を含む6本のカートリッジ容器６９がＹ軸方向に沿って並列に設けられている。前記カートリッジ容器６８の各ウェルまたはホールは、前述した断片化溶液収容部、反応容器、キャピラリー型電気泳動用チップを収容するチップ等収容部、および電気泳動用溶液収容部に対応し、前記カートリッジ容器６９の各ウェルまたはホールは、結合促進剤溶液収容部、乖離液収容部、前記分注チップを収容するチップ等収容部、および磁性粒子懸濁液収容部に対応するものである。前記カートリッジ容器６８には、分子量評価のための断片を標識化する蛍光標識化溶液収容部をも有する。

抽出用エリア５０と同様に、隣接するカートリッジ容器６８間には隔壁１７が設けられ、隣接するカートリッジ容器６９間には、隔壁１８が設けられている。

前記ＰＣＲエリア７０は、6本の並列に設けられたカートリッジ容器７５が並列に設けられたものであって、該カートリッジ容器７５の各ウェルまたはホールは、前述した増幅用溶液収容部、密閉液収容部、小容量の分注チップを収容するチップ等収容部、ＰＣＲの増幅が可能な反応容器に対応するものである。また、隣接するカートリッジ容器７５間には隔壁１９が設けられている。

図２に示した本実施の形態に係るシーケンサ前処理装置１０では、前記ステージ１５上には、さらに、各患者から採取した親検体を収容する6本の親検体収容部５７と、最終的に生成された生成物を収容し、シーケンサに移送されるべき6本の最終生成物収容部７７と、分注チップ、穿孔用チップを収容するチップ収容部７６とを有する。

以上説明した前記カートリッジ容器５６，６８，６９，７５のウェルの容積は、例えば、200μＬ程度であり、反応容器は10μＬ〜1mＬ程度であり、親検体を収容する容器５６、最終生成物等を収容する容器５６，７７は2mＬ程度である。

図２において、前記ノズルヘッド４０の各ノズル４１_１〜４１_６には、細管５４ａ及び太管５４ｂからなる分注チップ５４が、太管５４ｂ側で装着されている。ノズル４１_１〜４１_６は、ノズル配列基板４１に一列状に配列されている。ノズル配列基板４１の上側には、前記吸引吐出機構４３としての6本のシリンダが設けられたシリンダ収納部を有している。該シリンダ内にはピストンが設けられ、ピストンを駆動するモータ、及び該モータによって回転可能に取り付けられたボール螺子が設けられている。符号４２は、チップ脱着部４５としての、ノズル４１_１〜４１_６に装着した分注チップ５４をノズル４１_１〜４１_６から脱着させるための前記ノズル４１_１〜４１_６の径よりも大きく前記チップの最も太い部分の外径よりも細いＵ字形の切り欠きが形成されたチップ脱着板である。該チップ脱着板は前記ピストンを駆動するモータによって駆動される。

該ノズルヘッド４０には、前記ノズル４１_１〜４１_６に装着された分注チップ５４の細管５４ａに対して磁力を及ぼしかつ除去することが可能となるように前記各細管５４ａに対して接離可能に設けた各磁石４４ａを有する磁力部４４が設けられている。

前記ノズルヘッド４０の、前記磁力部４４、吸引吐出機構４３、チップ脱着部４５、電極制御器は、Ｘ、Ｙ軸方向に移動可能なヘッド基部に能けられ、前記ノズル配列基板４１と支持部材配列板４２については前記ヘッド基部に対してＺ軸方向に移動可能とするＺ軸移動体に設けられている。

ノズル移動機構８０は、前記容器群に相当する前記抽出用エリア５０等の収容部群及び前記品質評価エリアに相当する吸光度測定エリア３５、分子量評価エリア３６、インターナルコントロール測定エリア３７に対して、前記ヘッド基部をＸ、Ｙ軸方向に移動可能とするＸ軸移動機構及びＹ軸移動機構を有し、かつ、前記Ｚ軸移動体をＺ軸方向に移動させる前記Ｚ軸移動機構を有する。

Ｘ軸移動機構およびＹ軸移動機構は、例えば、前記ステージと連結して設けられたＸ軸モータによって回転駆動されＸ軸方向に延びるボール螺子等によってＸ軸方向に移動可能なＸ軸移動体と、該Ｘ軸移動体と連結し、Ｘ軸移動体に設けられたＹ軸モータによって回転駆動するＹ軸方向に延びボール螺子等によってＹ軸方向に移動可能に設けられ前記ヘッド基部と連結したＹ軸移動体とを有する。Ｚ軸移動体は、前記ヘッド基部に設けられたＺ軸モータと、該Ｚ軸モータによって回転駆動されるボール螺子と、該ボール螺子と螺合し該ボール螺子の回転によって回転駆動されるナット部に連結して設けられている。

図３は、本発明の実施の形態に係る前記ノズルヘッド４０のノズル配列基板４１と支持部材配列板４２を示すものであり、各々ノズル４１_１〜４１_６と、電極支持部材４２_１〜４２_６がＸ軸方向に沿って、一列状に配列されている。該電極支持部材４２_１〜４２_６が前記分子量評価エリア３６の導光路３２_１〜３２_６の一端にある測定端３２_１ａから３２_６ａに近接するようにノズルヘッド４０が、前記ノズル移動機構８０によって移動した状態を示す。符号４２_１ａは、前記電極支持部材４２_１に取り付けられかつピン状の電極４７_１が下端を貫いているキャップを示す。キャップ４２_１ａ〜４２_６ａには、前記キャピラリー型電気泳動用チップ６４が装着されることになる。

前記導光路３２_１〜３２_６の一端は前記電極支持部材４２_１に取り付けられ他前記キャピラリー型電気泳動用チップ６４の細管に接近して位置するとともにＺ軸方向に移動可能に設けられた測定端３２_１ａ〜３２_６ａであり、該導光路３２_１〜３２_６は、２つの導光路３２０_１ｂ〜３２０_６ｂ、３２０_１ｃ〜３２０_６ｃからなっており、各導光路の他端の２つの接続端の組が前記接続端配列体３２０に前記電極支持部材４２_１〜４２_６の所定間隔よりも短い間隔で列状に配列される。この導光路３２０_１ｂは前記光測定器３１の発生する蛍光励起用のトリガーを前記キャピラリー型電気泳動用チップに照射させるためのものであり、導光路３２０_１ｃは前記キャピラリー型電気泳動用チップ内で発する蛍光を前記光測定器３１に組み込まれたフォトセンサに伝達して電気信号に変換するためのものである。

図４は、本発明の実施の形態に係る前記キャピラリー型電気泳動用チップ６４、及び前記電極支持部材を示すものである。
電極支持部材４２_１は、その先端部をキャップ４２_１ａが装着され、該キャップ４２_１ａの下端をピン状の第１の電極４７_１が貫いている。該第１の電極４７_１は、電極合体端子４２_１ｂを介して前記電極支持部材４２_１に着脱可能に取り付けられている。

前記キャピラリー型電気泳動用チップ６４は、細管６４ａと、該細管６４ａと連通し該細管６４ａよりも太く形成されている太管６４ｂとからなる。細管６４ａと太管６４ｂとは好ましくは別体に形成され、細管６４ａの上端は前記太管６４ｂの下端の嵌合部６４ｄにおいて、嵌合して取り付けられている。前記細管６４ａ内には、電気泳動のためのアガロースゲル６４ｃが封入され、前記太管６４ｂには、使用時には、電気泳動用溶液６２であるバッファ液が収容され、測定対象溶液、すなわち、測定対象の断片を含有する溶液、が前記電極付液収容部３４_１内に収容され、前記細管６４ａの下端の口部６４ｅが電極付液収容部３４_１内に挿入される。前記第１の電極４７_１は前記電気泳動用溶液６２に漬けられ、前記第２の電極４８_１は前記測定対象溶液に漬けられることになる。その後、前記第１の電極４７_１と第２の電極４８_１との間に所定の電圧を印加することで、電気泳動が行われることになる。

また、電気導光路３２_１〜３２_６の測定端３２_１ａ〜３２_６ａは、案内用シャフト３２_１ｄ〜３２_６ｄに沿って上下方向（Ｚ軸方向）に前記細管６４ａに沿って移動可能に設けられている。これによって、蛍光で標識化された断片の位置を測定することによって、対象溶液に含有される断片の分子量を測定することができる。

図５は、図２に示した前記抽出用エリア５０とは異なる実施の形態に係る抽出用エリア１５０を示すものである。但し、移動可能な光測定器３９と異なり、固定された光測定器１３９を用い、光測定器１３９と光学的に接続された導光路１３９ｂ、１３９ｃの先端の照射端１３９ａ及び受光端１３９ｄを間隔を空けて対向するように配置した測定端１３９eが前記透光性をもつ液収容部３３_１〜３３_６の側面を前記照射端と受光端が挟むように移動するものである。

図５の例では、前記液収容部３３_１〜３３_６は、前記抽出用エリア１５０の各検体収容部５１_１〜５１_６、５２_１〜５２_６、…と同一のカートリッジ容器１５６_１〜１５６_６内に設けられている点でも図２の場合とは相違する。

図６は、前記インターナルコントロール測定エリア３７の各反応容器３８_１〜３８_６内での蛍光を前記光測定器３１で測定する場合の導光路３２_７〜３２_１２の先端の測定端としての照射端３２_７ａと受光端３２_７ｄおよびこれらと前記光測定器３１とを光学的に連結する照射用導光路３２_７ｂ、受光用導光路３２_７ｃを示すものであり、図６（ａ）は、前記配列基板３８に前記温度制御器９１によって制御される温度制御ブロック９１ａが設けられている場合を示し、図６（ｂ）は、温度制御ブロックが設けられていない場合を示す。符号３８_１ａは該反応容器３８_１〜３８_６を密閉する密閉蓋を示す。符号９１ｂは前記温度制御ブロック９１ａを前記温度制御器９１と電気的に接続するための導線である。

続いて、本実施の形態に係るシーケンサ前処理装置または方法の動作について説明する。使用者により前記操作部１１により指示を与えることにより、前記容器群の内、抽出用エリア５０に収容された6人の患者から採取されて6個の親検体収容部５７に収容された痰等を希釈させた検体溶液を、前記チップ等収容部５４_１〜５４_６に収容された分注チップ５４を前記ノズルヘッド４０のノズルに装着させて、前記抽出用エリア５０の所定の反応容器５５_１〜５５_６に収容し、該分注チップを換えて、前記抽出用試薬収容部５２_１〜５２_６、磁性粒子懸濁液収容部５３_１〜５３_６から順次必要な試薬を所定量、例えば、磁性粒子懸濁液の量は0.5mＬ〜1mＬ程度を前記反応容器５５_１〜５５_６内に分注して、前記吸引吐出機構４３を用いて混合攪拌して反応させ、細胞を破壊して目的とする核酸を水溶液中に溶け出させ、前記磁性粒子に捕獲させる。次に磁力部により磁場を前記分注チップ内部に及ぼした状態で、吸引吐出を繰り返して、分注チップ５４の内壁に磁性粒子を吸着させ、残液を吐出し、該磁力部４４により分注チップ５４内部に磁場を及ぼした状態で、乖離液を吸引吐出することで、核酸の溶液を得ることで、核酸を抽出する。以上が抽出工程に相当する。

得られた前記核酸は、前記分注チップ５４内に吸引された状態で前記ノズルヘッド４０をＸ軸方向に移動することで、該断片化作成エリア６０の反応容器６７_１〜６７_６内に吐出する。

該反応容器６７_１〜６７_６には、該断片化作成エリア６０の前記断片化溶液収容部６１_１〜６１_６に収容されている断片化溶液６１が収容されており、前記分注チップを用いて前記反応容器６７_１〜６７_６内に分注して、前記核酸含有溶液と前記分注チップ５４を用いて吸引吐出を繰り返すことで反応させる。断片化の程度は、該反応容器６７_１〜６７_６内のインキュベーションの時間及び前記断片化溶液の濃度に依存するものである。なお、インキュベーションの温度は室温であり、大気圧中で行われる。シーケンサが要求する断片化の程度に応じて、インキュベーション時間（例えば、「分」のオーダ）及び前記断片化溶液６１の濃度を設定することになる。

前記インキュベーションの時間が終了した後、前記分注チップ５４をノズル４１_１〜４１_６に装着したノズルヘッド４０をＹ軸方向に移動することによって、前記断片化された核酸による各種断片を含有する該溶液が収容されている前記反応容器６７_１〜６７_６に対して、前記磁性粒子懸濁液６３を前記分注チップ５４内に吸引し、前記反応容器６７_１〜６７_６内に分注する。分注した後、前記吸引吐出機構４３によって吸引吐出を繰り返すことで、前記磁性粒子に前記核酸の断片化の結果得た各種断片を結合させて捕獲する。

次に、前記分注チップ５４内部に磁場を及ぼした状態で、前記断片を捕獲した前記磁性粒子が懸濁された液を吸引吐出を繰り返すことで、前記内壁に磁性粒子を吸着させた状態で反応容器６７_１〜６７_６内にまで移動して、該分注チップ５４の内部の磁場を除去して吸引吐出を繰り返すことで該磁性粒子懸濁液を吐出して収容する。次に、該分注チップ５４を用いて前記結合促進剤溶液収容部６５_１〜６５_６に収容された結合促進剤溶液６５の所定量と、前記乖離液収容部６６_１〜６６_６に収容されている乖離液６６を前記分注チップ５４を用いて前記反応容器６７_１〜６７_６内に前記ノズルヘッド４０を用いてＹ軸方向に移動させて、分注し、吸引吐出を繰り返すことでこれらの液を混合させる。

すると、図７の左側の表に示すように、結合促進剤の平均濃度が全溶液の例えば9.75％である場合には、152ｂｐの分子量をもつ断片が前記磁性粒子から乖離して得られることになり、以下、同様に結合促進剤の平均濃度が低くなると、次第に大きな分子量を持つ断片が磁性粒子から乖離して得られることになる。前記磁性粒子懸濁液の分注からここまでは選別工程に相当する。
右側のグラフは、蛍光で標識化された断片を、前記表に記載された10の濃度の場合について、電気泳動法により乖離した断片の量を測定した実験結果を示すものである（Series１では、結合促進剤濃度が10〜7.5％の場合の乖離液の量を順次変更して、乖離した断片を回収しながら順次得られた一連の実験結果であり、Series 2では、結合促進剤濃度が7.5〜5％となるように乖離液の量を順次変更して乖離した断片を回収しながら順次得られたSeries１とは異なる溶液を用いた一連の実験結果を表す） 。このグラフに示すように、前記表に記載された10の濃度の順（ａ〜ｊ）に対応する、10個の正規分布のグラフが得られ、各ピークの位置（ａ〜ｊ）が前記磁性粒子からの乖離によって得られる表に記載された各分子量に対応することが明瞭に示されている。なお、グラフの横軸は、泳動時間すなわち泳動距離を表すものであって、分子量の大きさに対応している。

次に、前記ノズルヘッド４０のノズル４１_１〜４１_６から、前記分注チップ５４を除去して、代わりに、小容量の分注チップ７３を装着し、前記ノズルヘッド４０を前記ＰＣＲエリア７０の前記チップ等収容部７３_１〜７３_６にまで移動させ、Ｚ軸方向に下降させることで前記小容量分注チップ７３をノズルに装着させる。前記抽出工程後、前記選別工程を含め、以上が断片化作成工程に相当する。

次に、該ノズルヘッド４０を断片化作成エリア６０の作成された前記断片が含有されている溶液の所定量が収容されている前記反応容器６７_１〜６７_６にまで移動させて、前記反応容器６７_１〜６７_６から、作成された前記断片が含有されている溶液を、前記ＰＣＲ用の反応容器７４_１〜７４_６の容量20μＬに収容可能な量を吸引して、該反応容器内に分注する。同様に前記分注チップ７３を用いて前記増幅用溶液を該反応容器に分注して混合させる。以上が増幅前工程に相当する。

シーケンサが断片の増幅工程を含む場合には、この得られた溶液が前処理としての最終生成物ということになり、前記最終生成物収容部７７に収容されることになる。一方、シーケンサが断片の増幅工程を含まない場合には、以下の増幅前工程によって得られた生成物が最終生成物ということになる。増幅工程は、前記反応容器７４_１〜７４_６内にさらに前記分注チップ７３を用いて、前記密閉液収容部７２_１〜７２_６から前記密閉液を前記反応容器７４_１〜７４_６内に分注した後、前記温度制御器９１により増幅に必要な所定の温度制御を行なう。

前記各工程の少なくとも１において、前記シーケンサ前処理装置１０の前記ノズル４１_１〜４１_６に装着した前記分注チップ５４を用いて、前記工程の結果得られた前記生成物を前記磁性粒子懸濁液５３と混合し、分注チップを介して前記混合液の吸引吐出を繰り返すことで前記磁性粒子に捕獲させ、前記磁力部４４を用いて分注チップ５４の内壁に吸着させることで各工程の処理目的に合致するように核酸またはその断片を精製する工程をさらに有することがある。

また、前記品質評価工程として、前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記各工程の少なくとも１において、該工程の結果得られた生成物についてその分子量の評価を行うことがある。

例えば、前記品質評価工程は、前記断片化作成エリア６０内に、アガロースゲルが封入された細管６４ａおよび該細管６４ａと連通する太管６４ｂからなる1または2以上のキャピラリー型電気泳動用チップ６４を有し、前記ノズルヘッド４０には、前記キャピラリー型電気泳動用チップ６４を前記太管６４ｂ側で装着することで支持可能であって第１の電極４７_１〜４７_６が設けられ前記ノズル移動機構８０により前記容器群の断片化作成エリア６０等に対してノズル４１_１〜４１_６とともに相対的に移動可能な1または2以上の電極支持部材４２_１〜４２_６を有する。

また、前記容器群の前記品質評価エリア３０の前記分子量評価エリア３６には、収容すべき液と接触可能に設けられた第２の電極４８_１〜４８_６を有する複数（この例では6個）の電極付液収容部３４_１〜３４_６を有する。操作部１１からの指示があると、前記ノズルヘッド４０は、前記ノズル４１_１〜４１_６に前記分注チップ５４を装着して、前記電極付液収容部３４_１〜３４_６内に、分子量の評価をしようとする前記断片を含有する溶液を前記反応容器６７_１〜６７_６から抜き出して分注する。前記溶液にインターカレータを分注して、前記断片を蛍光で標識化する。

次に、分注チップ５４を用いて前記断片化作成エリア６０の前記電気泳動用溶液収容部６２_１〜６２_６に収容されている電気泳動用溶液６２を吸引して、前記ノズルヘッド４０によって移動させて前記チップ等収容部６４_１〜６４_６に収容されている6本のキャピラリー型電気泳動用チップ６４の前記太管６４ｂ内に分注する。

次に、前記分注チップ５４を前記ノズルヘッド４０をＹ軸方向に移動させることで前記チップ等収容部６４_１〜６４_６の空き収容部において前記チップ脱着部４５を用いて脱着させる。その後、該ノズルヘッド４０を移動させて、前記キャピラリー型電気泳動用チップ６４の上方に位置させ、Ｚ軸方向に沿って下降させることで前記キャピラリー型電気泳動用チップ６４の太管６４ｂを前記電極支持部材４２_１〜４２_６の前記キャップ４２_１ａ〜４２_６ａの上側で装着により取り付けることで、前記電極４７_１〜４７_６は前記電気泳動用溶液６２と接触することになる。

キャピラリー型電気泳動用チップ６４が前記電極支持部材４２_１〜４２_６に装着されたノズルヘッド４０を前記分子量評価エリア３６にまで移動し、前記電極付液収容部３４_１から３４_６内の前記溶液内に前記キャピラリー型電気泳動用チップ６４の前記細管６４ａの先端の口部６４ｅを挿入させる。この状態で、所定の電圧を前記第１の電極４７_１〜４７_６と、前記第２の電極４８_１〜４８_６の間に印加して電場を及ぼすことで、前記断片の電気泳動を行なわせる。所定時間後に前記測定端３２_１ａ〜３２_６ａを前記細管６４ａに沿って上下方向に移動させることで走査して、標識化された断片の蛍光を測定することによって、断片の分子量を判断する。

本シーケンサ前処理装置１０は、前記品質評価制御部２６として、前記増幅工程において目的とする断片に挿入させた特定の塩基配列をもち、該塩基配列と結合する標識化したプライマーを用いて標識化される前記インターナルコントロール用断片を測定するインターナルコントロール測定制御部を有する。また、目的の断片については、標識化しないかまたは前記インターカレータによって標識化することで、該インターナルコントロール測定制御部は、前記インターナルコントロール断片、および、目的の断片の増幅結果の測定を行なう。

そのため、特定の塩基配列を有するインターナルコントロール用核酸またはその断片を挿入させた目的の核酸を前記断片化して得られた溶液から、前記磁性粒子懸濁液を用いて作成した断片を含有する溶液を前記断片化作成エリア６０の所定液収容部に収容しておく。前記ノズルヘッド４０の各ノズル４１_１〜４１_６に小容量の分注チップ７３を装着させて、前記液収容部から前記断片が含有された溶液を所定量（10μＬ）ＰＣＲ用の反応容器３８_１〜３８_６に分注し、前記インターナルコントロール用核酸の特定の塩基配列と結合可能なプライマーを予め標識化した溶液を含有する前記増幅用溶液７１を該反応容器３８_１〜３８_６に分注し、温度制御器９１を用いて温度制御により増幅を行なう。

そして、光測定器３１を前記接続端配列体３２０に沿って移動させ、前記導光路３２_７〜３２_１２を介して励起光を照射しかつ蛍光を受光することによって、インターナルコントロール断片の測定を行なうことになる。

シーケンサ前処理装置１０は、前記品質評価制御部２６として、前記抽出工程の結果得られた生成物の吸光度を測定することで、目的の核酸の濃度を測定する。
前記操作部１１より指示があると、前記ノズルヘッド４０が前記抽出用エリア５０の前記チップ等収容部５４_１〜５４_６から分注チップ５４をノズル４１_１〜４１_６に装着し、前記反応容器５５_１〜５５_６にまで移動して、抽出された核酸を含有する溶液の一部を吸引して、前記吸光度測定エリア３５の前記透光性のある液収容部３３_１〜３３_６に分注する。前記各液収容部３３_１〜３３_６に収容された溶液に対して特定の波長の光、例えば、260nm，280nm，または200nmから可視光の範囲の波長、さらには、190nm〜800nmの波長の光を照射してその吸光度を測定することで、断片の濃度を測定することができる。

図５には、照射端１３９ａと受光端１３９ｄを対向するように設けて、これらを移動させることで、該液収容部３３_１〜３３_６を順次該照射端１３９ａと受光端１３９ｄで挟むようにして、測定し導光路１３９ｂ、１３９ｃを通して得られたデータから前記ステージに固定された光測定器１３９によって該各液収容部を透過する光の量の強度を測定することで吸光度を測定する。

図８は、図３に対応する本発明の他の実施の形態に係る光測定器１３１ａを示すものである。３台の３種類の波長の異なる蛍光に対応する光測定器１３１ａをノズルヘッド１４０に固定して設けたものであり、励起光を照射する発光部１３１ｂと蛍光を受光する受光端１３１ｃとを有する。一方、導光路１３２_１〜１３２_６は、各々励起光照射用と蛍光受光用の２つの導光路１３２_１ｂ〜１３２_６ｂ、１３２_１ｃ〜１３２_６ｃを有し、励起光照射用導光路１３２_１ｂ〜１３２_６ｂの後端の接続端が前記発光部１３１ｂと光学的に接続可能であり、蛍光受光用導光路１３２_１ｃ〜１３２_６ｃの後端の接続端が前記受光端１３１ｃと光学的に接続可能となるように接続端配列体１３２０が前記光測定器１３１ａに対して移動可能に設けられている。なお、励起光照射用導光路１３２_１ｂ〜１３２_６ｂの先端（照射端）と蛍光受光用導光路１３２_１ｃ〜１３２_６ｃの先端（受光端）は、束ねられて測定端１３２_１ａ〜１３２_６ａとして、前記各電極支持部材の下方に近接するようにかつ上下方向に移動可能に設けられている。また、前記接続端配列体の導光路１３２_７〜１３２_１２については、各照射用導光路１３２_７ｂ〜１３２_１２ｂは前記反応容器３８_１〜３８_６の側面に先端（照射端１３２_７ａ〜１３２_１２ａ）が設けられ、各受光用導光路１３２_７ｃ〜１３２_１２ｃの先端（受光端１３２_７ｄ〜１３２_１２ｄ）は、前記反応容器３８_１〜３８_６の底面に接するように設けられている。

以上の実施の形態例は、本発明をより良く理解させるために具体的に説明したものであって、別形態を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範囲で変更可能である。例えば、ノズル、分注チップ、キャピラリー型電気泳動用チップ、容器群、収容部群、品質評価エリア、光測定器、測定端、吸引吐出機構、移動機構、磁力部、温度制御器、反応容器、密閉蓋、密閉液、抽出用試薬液、断片化溶液、結合促進剤、磁性粒子、増幅用溶液等の構成、形状、材料、配列、量、個数、および、使用した試薬、検体等についても実施の形態例に示した例に限られるものではない。また、ノズルをステージに対して移動させるようにしたが、ステージをノズルに対して移動させることも可能である。

また、本発明の各実施の形態例で説明した、前記部品またはこれらの部品を形成する部品は適当に選んで適当な変更を加えて相互に組み合わせることができる。

本発明は、例えば、主としてＤＮＡ，ＲＮＡ，ｍＲＮＡ，ｒＲＮＡ，ｔＲＮＡを含む核酸についての処理、検査、解析が要求される分野、例えば、工業分野、食品、農産、水産加工等の農業分野、薬品分野、製剤分野、衛生、保険、疾病、遺伝等の医療分野、生化学若しくは生物学等の理学分野等に関係するものである。本発明は、特に、大規模シーケンサの前処理に用いることができる。

１０ シーケンサ前処理装置
２０ ＣＰＵ＋プログラム
３０ 品質評価エリア
３１、１３１ 光測定器
３２_１〜３２_１２、１３２_１〜１３２_１２ 導光路
３２_１ｂ〜３２_１２ｂ、１３２_１ｂ〜１３２_１２ｂ、
３２_１ｃ〜３２_１２ｃ、１３２_１ｃ〜１３２_１２ｃ 導光路
３５ 吸光度測定エリア
３６ 分子量評価エリア
３７ インターナルコントロール測定エリア
４０、１４０ ノズルヘッド
４１ ノズル配列基板
４１_１〜４１_６ ノズル
４２ 電極支持部材配列板
４２_１〜４２_６ 電極支持部材
５０、１５０ 抽出用エリア
５３、６３ 磁性粒子懸濁液
５４ 分注チップ
５５_１〜５５_６、６７_１〜６７_６、７４_１〜７４_６ 反応容器
６０ 断片化作成エリア
６１ 断片化溶液
６１_１〜６１_６ 断片化溶液収容部
６４ キャピラリー型電気泳動用チップ
６５ 結合促進剤溶液
６５_１〜６５_６ 結合促進剤溶液収容部
７０ ＰＣＲエリア
７３ 小容量分注チップ
９０ 収容部群

Claims (19)

1. 気体の吸引および吐出を行なう吸引吐出機構、該吸引吐出機構と連通し液体の吸引および吐出が可能な1または2以上の分注チップが着脱可能に装着されるノズルを有するノズルヘッド、磁性粒子懸濁液を含む各種液を収容する液収容部および反応容器を少なくとも有する容器群、前記ノズルを容器群との間で相対的に移動可能とする移動機構、および、前記ノズルに装着された分注チップ内に磁場を及ぼすことが可能な磁力部を有するシーケンサ前処理装置を用いて、前記容器群に収容された検体、抽出用試薬溶液および磁性粒子懸濁液を混合して、検体から核酸を抽出する抽出工程と、
   該シーケンサ前処理装置を用いて、抽出した前記核酸を前記容器群に収容された断片化溶液と混合して断片化し、断片化された前記核酸から磁性粒子懸濁液を用いて、シーケンサに応じた所定範囲の塩基配列数をもつ断片を作成する断片化作成工程と、
   前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記作成した断片を含有する溶液の所定量を、増幅用溶液とともに前記反応容器内に分注する増幅前処理工程と、を有するシーケンサ前処理方法。
2. 前記反応容器内の温度制御が可能な温度制御器をさらに有する前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記シーケンサ前処理装置の該反応容器を温度制御することによって、前記作成した断片を増幅する増幅工程をさらに有する請求項１に記載のシーケンサ前処理方法。
3. 各種チップ内または前記反応容器内の光学的状態を測定する光測定器をさらに有する前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記各工程の少なくとも１において得られた生成物の品質評価を行なう品質評価工程をさらに有する請求項１または請求項２に記載のシーケンサ前処理方法。
4. 前記各工程の少なくとも１において、前記シーケンサ前処理装置を用いて前記工程の結果得られた前記生成物を所定の磁性粒子懸濁液と混合し、前記ノズルに装着した分注チップを介して前記混合液の吸引吐出を繰り返すことで前記磁性粒子に捕獲させ、前記磁力部を用いて分注チップの内壁に吸着させることで各工程の処理目的に合致するように核酸またはその断片を精製する工程をさらに有する請求項１乃至請求項２に記載のシーケンサ前処理方法。
5. 前記品質評価工程として、前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記各工程の少なくとも１において、該工程の結果得られた生成物についてその分子量の評価を行う請求項３に記載のシーケンサ前処理方法。
6. 前記品質評価工程として、前記各工程の少なくとも１において、前記シーケンサ前処理装置を用いて前記核酸またはその断片の濃度の評価を行なう請求項３乃至ないし請求項５に記載のシーケンサ前処理方法。
7. 前記品質評価工程は、前記容器群にゲルが封入された細管および該細管と連通する太管からなる1または2以上のキャピラリー型電気泳動用チップが収容され、前記ノズルヘッドには、前記キャピラリー型電気泳動用チップを前記太管側で支持可能であって前記太管に収容される電気泳動用溶液と接触可能な第１の電極が設けられ前記ノズル移動機構により前記容器群に対してノズルとともに相対的に移動可能な1または2以上の電極支持部材を有し、前記容器群には、収容した液と接触可能に設けられた第２の電極を有する1または2以上の電極付液収容部をさらに有する前記シーケンサ前処理装置を用いて、前記容器群に設けられた電気泳動用溶液を収容する液収容部から電気泳動用溶液を前記太管内に分注し、該キャピラリー型電気泳動用チップを該太管側において前記電極支持部材に支持させて前記電気泳動用溶液と該電極とを接触させ、各工程の結果得られた生成物を抜き出して前記電極付液収容部に分注し、該生成物を標識化し、該電極付液収容部に前記細管の先端を挿入させ、前記電極を通して電場を前記チップ内に及ぼし、前記細管内を前記光測定器により測定することによって分子量の評価を行なう請求項５に記載のシーケンサ前処理方法。
8. 前記品質評価工程として、前記増幅工程において、前記シーケンサ前処理装置を用いて前記核酸またはその断片に含有させた前記インターナルコントロール用核酸若しくはその断片を測定するインターナルコントロール測定工程を有する請求項２乃至請求項７のいずれかに記載のシーケンサ前処理方法。
9. 気体の吸引および吐出を行う吸引吐出機構と、該吸引吐出機構と連通し液体の吸引および吐出が可能な分注チップが着脱可能に装着される1または2以上のノズルを有するノズルヘッドと、磁性粒子懸濁液を含む各種液を収容する液収容部および反応容器を少なくとも有する容器群と、前記ノズルと前記容器群との間を相対的に移動可能とする移動機構と、前記ノズルに装着された分注チップに外部から磁場を及ぼしかつ除去することが可能な磁力部とを有するとともに、
   少なくとも、前記吸引吐出機構、前記移動機構、および前記磁力部を外部信号に基づいて制御する制御部を有し、該制御部は、前記容器群に収容された検体、抽出用試薬溶液および磁性粒子懸濁液を混合攪拌して、核酸を抽出する抽出制御部と、抽出した前記核酸を前記容器群に収容された断片化溶液と混合して断片化し、断片化された前記核酸から磁性粒子懸濁液を用いてシーケンサに応じた所定範囲の塩基配列数を持つ断片を作成する断片化作成制御部と、前記作成された断片を含有する溶液の所定量を、増幅用溶液とともに前記反応容器内に所定の分注チップで分注して混合するように制御する増幅前処理制御部と、を有するシーケンサ前処理装置。
10. 前記反応容器内の温度制御が可能な温度制御器をさらに有するとともに、前記制御部には、該反応容器を温度制御することによって、前記作成した断片を増幅する増幅制御部をさらに有する請求項９に記載のシーケンサ前処理装置。
11. 前記各種チップ内または前記反応容器内の光学的状態を測定する光測定器をさらに有するとともに、前記制御部は、該光測定器をも外部信号に基づいて制御するとともに、前記各制御部の少なくとも１について、前記制御部の制御の結果得られた生成物の品質の評価を行なう品質評価制御部をさらに有する請求項９又は請求項１０に記載のシーケンサ前処理装置。
12. 前記制御部は、前記核酸またはその断片を含む溶液を前記磁性粒子懸濁液と吸引吐出によって混合攪拌して、前記磁性粒子に目的とする核酸またはその断片を捕獲させ捕獲した磁性粒子を前記分注チップ内に磁場を及ぼして内壁に吸着させて前記核酸またはその断片を精製するように制御する精製制御部を有する請求項９又は請求項１０に記載のシーケンサ前処理装置。
13. 前記容器群に、ゲルが封入された透光性のある細管および該細管と連通する太管からなる1または2以上のキャピラリー型電気泳動用チップが収容され、前記ノズルヘッドには、前記キャピラリー型電気泳動用チップを前記太管側で支持可能であって前記太管に収容される電気泳動用溶液と接触可能な第１の電極が設けられ前記移動機構により前記容器群に対してノズルとともに相対的に移動可能な1または2以上の電極支持部材を有し、前記容器群には、収容した液と接触可能に設けられた第２の電極を有する1または2以上の電極付液収容部を有する請求項９又は請求項１２に記載の核酸シーケンサ前処理装置
14. 前記光測定器は、前記容器群内に設けられ透光性を有する1または2以上の液収容部内の吸光度を測定可能に設けられ、前記品質評価制御部は、前記各制御部によって生成された生成物を含む溶液を前記各液収容部に収容して、前記光測定器によって、各液収容部の吸光度を測定する請求項９乃至請求項１３のいずれかに記載の核酸シーケンサ前処理装置。
15. 前記品質評価制御部は、前記容器群に設けられた電気泳動用溶液を収容する液収容部から電気泳動用溶液を前記太管内に分注し、該キャピラリー型電気泳動用チップを該太管側において前記電極支持部材に支持させて前記溶液と該電極とを接触させ、各工程の結果得られた生成物を抜き出して前記電極付液収容部に分注し、該生成物を標識化し、該電極付液収容部に前記細管の先端を挿入させ、前記電極を通して電場を前記チップ内に及ぼし、前記細管内を前記光測定器により測定することによって分子量の評価を行なうように制御する請求項１３に記載のシーケンサ前処理装置。
16. 前記第１の電極は、前記電極支持部材の電極取付部に電気伝導可能に取り付けられた請求項１３又は請求項１５に記載のシーケンサ前処理装置
17. 前記電極支持部材には、該電極支持部材の先端を被覆するキャップを有し、該キャップには、前記電極支持部材の前記第１の電極が貫くように突出するとともに、前記キャピラリー型電気泳動用チップが取り付けられて該チップの開口部を閉塞する請求項１１乃至請求項１４いずれかに記載のシーケンサ前処理装置。
18. 1または2以上の前記キャピラリー型電気泳動用チップの前記細管に近接または接触しかつ該細管に沿って移動可能に設けられ、または、1または2以上の透光性を有する反応容器の側面に近接また接触して設けられた1または2以上の先端および後端を有する可撓性のある導光路と、該後端が所定経路に沿って配列された配列体と、該配列体の前記所定経路に沿って相対的に移動可能であって、前記後端と順次光学的に接続可能な光測定器とを有する請求項９乃至請求項１７のいずれかに記載のシーケンサ前処理装置。
19. ゲルが封入された透光性のある細管および該細管と連通する太管からなる1または2以上のキャピラリー型電気泳動用チップと、前記キャピラリー型電気泳動用チップを前記太管側で支持可能であって前記太管に収容される電気泳動用溶液と接触可能な第１の電極が設けられて前記キャピラリー型電気泳動用チップに対して相対的に移動可能な1または2以上の電極支持部材と、収容した液と接触可能に設けられた第２の電極を有する1または2以上の電極付液収容部とを有する電気泳動装置。

Images