JPWO2013046980A1 - 細胞選別器及び細胞選別方法 - Google Patents

Abstract

チップ２は例えば直径が約１ｍｍのウエル４を備えている。ウエル４の深さは例えば約３００μｍである。ウエル４の底面にコラーゲンゲルのコーティングからなるマトリックス８が配置されており、マトリックス８上に骨片１０が配置されている。マトリックス８と骨片１０との間に破骨細胞が配置されている。破骨細胞は、ウエル４内において骨髄細胞から分化させ、骨片１０の下に誘引したものである。

Description

本発明は、がん幹細胞を他の細胞から選別するために用いられる細胞選別器及びその細胞選別器を用いた細胞選別方法に関するものである。

最近、生体内の微小環境が注目を集めている。中でも、骨髄微小環境に破骨細胞が存在する系は、本来の骨の再構築の最前線としてだけでなく、他の細胞にとって居心地の良いニッチ（巣）を提供していると考えられている。そして、薬剤耐性をもち、がんの根治の妨げになっているがん幹細胞は、このニッチの存在と深く関わっていると考えられている。

がん幹細胞は多くのがん細胞の源となり、かつ薬剤耐性をもつため、がん根絶の妨げとなっていると考えられている。そのため、がん幹細胞を標的とした創薬ががんの根治に重要であると考えられる。がん幹細胞を標的とする薬の効果を調べるためには、がん幹細胞を他の細胞から選別する必要がある。しかし、これまで、がん幹細胞を他の細胞から選別する方法は確立されていない。

C. Lo Celso, H.E. Fleming, J.W. Wu, C.X. Zhao, S. Miake-Ｌye, J. Fujisaki, D. Cote, D.W. Rowe, C.P. Lin, D.T. Scadden, Live-animal tracking of individual haematopoietic stem／progenitor cells in their niche, Nature 457 (2008) 92-96. Weilbaecher, K.N., Guise, T.A. & McCauley, L.K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nature Reviews Cancer 11, 411-425 (2011). Mohamed Gad-el-Hak, The MEMS HANDBOOK, second edition, pp.10-6-pp.10-7(2009)

細胞機能には、例えば、細胞遊走・浸潤などの細胞の特性や、表面抗原、細胞周期、薬剤耐性などの特性があり、これらの機能は一般的に光学的な観測で評価することができる。しかし、がん幹細胞は周囲の微小環境（ニッチ）と相互作用しながら機能を発現していると考えられる。したがって、その相互作用を直接的に観察することは、骨髄微小環境ががん幹細胞へ与える影響を研究する上でシンプルかつ有効な方法であると考えられる。ところが、がん幹細胞と骨髄微小環境との相互作用を直接的に観察する上で、以下の２つの課題があった。

１つ目の課題は、対流の影響である。骨髄微小環境は数μｍ〜数百μｍという大きさであるため、流れや混合の影響を受けにくく、対流はほとんど発生しない。この環境では、液性因子の移動が拡散に支配されるという特殊な特徴がある。しかし、従来の細胞の培養において一般的に用いられてきたシャーレ、フラスコ又はウエルプレートなどの容器は容積が大きく、しかも熱源として炭酸ガスインキュベータ、顕微鏡照射ランプ、蛍光ランプ、その他の電気機器等が存在するので、これらの容器内部では熱の対流を主な原因とする液体の移動が起き、これらの容器は骨髄微小環境を正確に再現した環境とはいえない。

２つ目の課題は、リアルタイムでの観測が困難であることである。従来の観測法は、組織切片を用いたある時点の写真を組み合わせる例がほとんどである。非常に薄い切片を用いてリアルタイム観測を行なった例が非特許文献１に記載されているが、その例では、試料が大気に暴露され、本来の骨髄微小環境がもつ酸素濃度勾配などの状態が変化してしまうため、正確に生体内における細胞の活動に関する情報が得られるとは考えにくい。

そこで、本発明は、骨髄微小環境における細胞の特性を直接的に観測することができるようにするとともに、その観測結果に基づいて細胞の選別を行なうことができるようにすることを目的とするものである。

本発明にかかる細胞選別器は、液で満たされ代表的長さが１ｍｍ以下である微小空間をもち、その微小空間の内部の光学的観測を可能とする光透過性の材質からなる底面をもつウエルと、ウエル内の底面に配置されたマトリックスと、ウエル内のマトリックス上に配置された骨片と、マトリックスと骨片との間に配置された破骨細胞と、を備えたものである。
ここで、「代表的長さ」とは、流体力学におけるレイノルズ数を算出するために用いられる特徴的な長さ（Characteristic Length）のことであり、例えば、一般に矩形流路では、４×（断面積／断面周囲長）、円形管ではＤ(直径）が代表長さとなる（非特許文献参照３参照）。
また、「マトリックス」とは「骨マトリックス」のことであり、骨を構成する細胞外成分の骨基質であり、コラーゲン線維やハイドロキシアパタイトなどをいう。その構成タンパク質はＩ型コラーゲンが主たるもので、その他、オステオカルシン、オステオポンチン、骨形態形成タンパク質(bone morphogenetic proteins)などがある。以下、「骨マトリックス」を単に「マトリックス」と記載する。

本発明の細胞選別方法は上記の本発明にかかる細胞選別器を用いたものである。本発明の細胞選別器のウエル内の骨片の周辺に蛍光体により標識化したサンプル細胞を配置し、一定時間が経過した後、サンプル細胞の位置を光学的に観測することにより、ウエル底面のマトリックスと骨片との間へ遊走する細胞と遊走しない細胞とを選別する。

本発明者らは、破骨細胞が付着した骨片の周辺にサンプル細胞を配置すると、破骨細胞の付着している部分に引き寄せられるように遊走する細胞が存在することを発見した。本発明にかかる細胞選別方法は、この発見に基づいてなされたものである。

本発明者らの実験において、骨片に破骨細胞が付着している場合に細胞遊走が見られ、骨片に破骨細胞が付着していない場合に細胞遊走が見られなかった。このことから、細胞を誘引する物質は破骨細胞による骨吸収により骨又は破骨細胞から放出された物質であることが考えられる。非特許文献２によれば、破骨細胞の骨吸収により、カルシウム（Ｃａ²⁺）と様々なサイトカイン類（ＴＧＦ-β）や増殖因子（ＩＧＦｓ）が放出される。したがって、これらのいずれかの物質が誘引物質となって特定の細胞を遊走させると考えられる。

本発明の細胞選別器では、ウエル内を代表的長さ１ｍｍ以下の微小空間とすることで、ウエル内を満たす溶液の対流をなくし、その微小空間の底面にマトリックスを配置し、そのマトリックスの上に骨片を配置することで骨髄微小空間を再現している。そして、ウエルの底面を微小空間の内部の光学的観測を可能とする光透過性の材質により構成しているので、骨髄微小空間を再現した微小空間内の細胞の特性を底面側からリアルタイムで光学的に観測することができる。マトリックスと骨片の間に破骨細胞が入り込んだ状態となっているので、破骨細胞の骨吸収によってカルシウムやサイトカイン類などの物質が放出され、これらの物質に誘引されて遊走する細胞と遊走しない細胞とを選別することができる。

上記の細胞選別器を用いた本発明の細胞選別方法では、サンプル細胞を蛍光体により標識化しておくことで、その挙動を光学的観測により容易にリアルタイムで観測することができる。

細胞選別器の一実施例を示す図であり、（Ａ）は斜視図、（Ｂ）はウエル内を示す断面図である。 細胞選別器のウエルに骨片を配置した状態の画像である。 骨片の下に破骨細胞を誘導した細胞選別器のウエル内のＧＦＰ蛍光画像を蛍光顕微鏡を用いて取得した画像であり、（Ａ）は観測を開始した時、（Ｂ）は４．５時間が経過した後の画像である。 骨片の下に破骨細胞を誘導しなかった細胞選別器のウエル内のＧＦＰ蛍光画像を蛍光顕微鏡を用いて取得した画像であり、（Ａ）は観測を開始した時、（Ｂ）は４．５時間が経過した後の画像である。

本発明の細胞選別器の好ましい実施形態では、マトリックスとして組織培養用として開発されたブタ腱由来酸可溶性のType-Iコラーゲンと濃縮培地・再構成用緩衝液を混合して得られるコラーゲンゲルを使用し、そのコラーゲンゲルでウエルの底面をコーティングすることで、骨髄微小環境を再現する。
なお、マトリックスとしては、コラーゲンゲルに代えて、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むEngelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫から抽出した可溶性基底膜を調製したゲルやハイドロキシアパタイトなどを使用することもできる。

また、ウエルの代表的長さとしては、円筒状ウエルの場合は直径を挙げることができ、その場合、ウエルの深さを３００μｍ以下とすることが好ましい。そうすれば、溶液の対流の発生をなくすことができ、ウエル内の空間を骨髄微小環境に近い環境を再現することができる。

また、破骨細胞が配置されている位置の酸素濃度は約５％とすることが好ましい。骨髄微小環境における酸素濃度は約５％程度と考えられるので、破骨細胞が配置されている領域を骨髄微小環境に近い環境にすることができる。

本発明の細胞選別方法では、サンプル細胞を標識化するための蛍光剤として例えば緑色蛍光タンパク質を用いることができる。

細胞選別器の一実施例について図１を用いて説明する。
細胞選別器はチップ２として構成されている。チップ２は例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）や石英ガラス、シリコンなどの材質で構成され、ウエル４となる貫通穴が設けられた第１基板３ａと、第１基板３ａの一方の面に張り合わされた第２基板３ｂにより構成されている。ウエル４は、μＴＡＳ（micro Total Analysis system）又は微小流体制御技術（microfluidics）と呼ばれる微細加工技術を用いて形成されている。ウエル４内の空間は代表的長さが１ｍｍ以下の微小空間である。

この実施例ではウエル４の底面は円形であり、代表的長さである直径が１ｍｍ、深さが３００μｍである。ウエル４の底面６の厚みは０．１７ｍｍであり、底面６側からウエル４内を光学的に観測することができるようになっている。チップ２の上面側に、ウエル４への溶液の注入と排出を行なうための流路となる溝５ａ，５ｂが形成されている。図１において図示されていないが、チップ２の上面側は、ウエル４の上面を封止するためにＰＤＭＳ基板などの部材によって覆われ、そのときに溝５ａ，５ｂが流路を形成する。

ウエル４の底面にはコラーゲンゲルのコーティングからなるマトリックス８が配置されている。マトリックス８の上に骨片１０が配置されている。骨片１０の大きさは例えば直方体形状であれば２００μｍ□程度であり、骨髄微小環境のスケールと同等のスケールである。マトリックス８と骨片１０の間に破骨細胞１２が配置されている。破骨細胞１２は骨芽細胞から分化させたものである。図１では、上面が開放された状態となっているが、このチップ２を使用する際はウエル４内において、選別対象の多数の細胞と、（ａ）培地及び／又は（ｂ）水もしくはリン酸緩衝生理食塩水に代表される緩衝液などの液体との混合物である細胞懸濁液などで満たされ、ウエル４の上面は例えばＰＤＭＳなどの材質からなる封止部材により封止される。ここで、多数の細胞とは、本発明の選別対象の細胞であって、通常の実験条件で懸濁しうる程度の複数の細胞をいうが、単数であっても本件発明の効果は奏しうるので、単数も含むものとする。

ウエル４の容積は約２４０ｎＬと極めて小さいため、ウエル４を満たす溶液の見かけ上の粘性が上昇し、対流や攪拌の影響を受けない実験が可能である。ウエル内の溶液に対流が発生するか否かは、自然対流における熱対流の様子を特徴づける無次元数であるレイリー数Ｒａを考えると良い。レイリー数Ｒａは以下の式で表わされる。なお、Ｌはウエル４の代表的長さ、gは重力加速度、βは流体の熱膨張率、νは動粘性率、aは熱伝導率、ΔＴは代表的温度差である。
Ｒａ＝（Ｌ³・ｇ・β・ΔＴ）／νａ

自然対流の層流から乱流への遷移や対流時のベナールセル（対流構造の一つで、薄い層状流体を下面から均一に熱した際に生じる規則的に区切られたセル状構造をいう。）の発生などはレイリー数Ｒａの値で規定される。水平流体層においてベナールセルが発生し始める臨界レイリー数Ｒａ'は、流体層の厚さをＬとし、流体層の上下面の温度差をΔＴとすると、上下面が固体面の場合でＲａ'＝１７０８となる。なお、g＝９．８ ｍ／ｓ²、β＝０．２×１０^-3／℃、ν＝１×１０^-2ｃｍ²／ｓ、ａ＝１．４１×１０^-3ｃｍ²／ｓとする。

例えば、代表的長さＬ=１０ｃｍとしてレイリー数Ｒａを計算すると、
Ｒａ＝１０³×９８０×０．２×１０^-3×ΔＴ／（１×１０^-2×１．４１×１０^-3）
＝９８０×０．２／１．４１×ΔＴ×１０²×１０³
＝１３９×１０⁵×ΔＴ
≒１．４×１０⁷×ΔＴ
Ｒａ＝Ｒａ'（＝１７０８）のときの代表的温度差ΔＴ'は、
ΔＴ'＝１．２×１０^-4（℃）
となる。すなわち、代表的温度差が１．２×１０^-4℃以上になるとウエル内の溶液の対流が発生すると考えられる。

一方、ウエルの代表的長さＬを１ｍｍにしたときのＲａは、
Ｒａ＝１０^-3×９８０×０．２×１０^-3×ΔＴ／（１×１０^-2×１．４１×１０^-3）
＝１４×ΔＴ
Ｒａ＝Ｒａ'（＝１７０８）のときの代表的温度差ΔＴ'は、
ΔＴ'＝１２０（℃）
となる。すなわち、代表的温度差が１２０℃以上にならないとウエル内の溶液の対流が発生しないと考えられる。

ウエル４の実際の代表的温度差はせいぜい３７℃と室温２５℃の差１２℃程度であり、上記のΔＴ'（１２０℃）よりも大きくなることは考えられない。したがって、ウエル４の代表的長さを１ｍｍ以下にしておけば、ウエル４内の溶液の自然対流は発生しないと考えられる。

この実施例の細胞選別器の製造方法の一例について説明する。
この細胞選別器は、チップ２のウエル４内で、骨・骨芽細胞・骨髄細胞を共培養することにより、破骨細胞１２を骨片１０とマトリックス８との間に誘導し、骨髄微小環境を再構築し、特定のがん細胞が遊走するシステムを構築したものである。

チップ２は、第１基板３ａとして厚さ３００μｍのシリコン基板を使用する。微細加工技術を用いてシリコン基板３ａをエッチングし、直径１ｍｍの円形状の貫通穴を形成する。シリコン基板３ａの一方の面に、第２基板３ｂとして厚さ０．１７ｍｍの透明ガラス基板を陽極接合してウエル４の底面６を形成する。

次に、ウエル４内の底面６となっているガラス基板３ｂの表面にコラーゲンゲルをコーティングしてマトリックス８を形成する。そして、マトリックス８上に２００μｍ□程度の骨片１０を配置する。骨片１０の大きさは特に限定されるものではなく、ウエル４内に収容できる大きさであればよい。例えば直方体形状であれば、最大の寸法が２００μｍ程度である。

骨片１０をウエル４内に実際に配置した画像を図２に示す。骨片１０は、５〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃＡマウス大腿骨を採取し、骨髄部を培地でフラッシュアウト（洗浄）した後に、サージカルナイフで切断したものである。ウエル４内に培地を充填した後、ウエル４の上面を例えばＰＤＭＳ基板からなる部材によって封止し、ウエル４内に各種細胞や培地を供給する作業時や培地交換などの作業時以外はウエル４内の培地や細胞懸濁液が大気に暴露されないようにする。なお、このチップ２のウエル４内（培養室）の容積は２４０ｎＬである。

１〜２日齢ＢＡＬＢ／ｃＡマウスの頭頂骨から得た骨芽細胞を約２００セル／ウエルの濃度でウエル４に導入する。４〜６時間後、骨芽細胞がウエル４の底面に接着した後で、５〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃＡマウスの大腿骨の骨髄をフラッシュアウトして得た骨髄細胞を約８００セル／ウエルの濃度で導入する。ウエル４に、培地として１０％牛胎児血清を含むαＭＥＭに０．０２μＭビタミンＤ３と２μＭプロスタグランジンＥ２を加え、３７℃、５％ＣＯ₂、水蒸気飽和の条件下で共培養を行なう。何回かの培地交換を行ないながら７〜１０日間の共培養を経ることで、骨髄細胞を破骨細胞に分化させる。破骨細胞は骨片１０の下部に入り込む。この状態が図１の状態である。なお、図１では、骨芽細胞や骨髄細胞の図示は省略している。

この実施例の細胞選別器を用いて行なった細胞選別の一例について説明する。
サンプル細胞として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）により標識化した白血病細胞株（Ｂａ／Ｆ３ ｗｔ ｂｃｒ−ａｂｌ ＧＦＰ）を約１００個／ウエルの密度になるようにウエル４に導入した。ウエル４の上面をＰＤＭＳ基板によって封止した後、直ちに蛍光顕微鏡を使用してチップ２の裏面側（ウエル４の底面６側）からウエル４の底面６を介してＧＦＰ蛍光を一定時間ごとに撮像する、いわゆるタイムラプス観測を行なった。チップ２は、蛍光顕微鏡内に設置された混合器付の温度ＣＯ₂及び制御チャンバ内のステージの上に配置した。同ステージでは、３７℃水蒸気飽和、５％ＣＯ₂の環境を維持した。タイムラプス計測が終了したチップについてＴＲＡＰ（酒石酸耐性酸性フォスファダーゼ）染色を行い破骨細胞の位置を同定した。

図３は骨片の下に破骨細胞を誘導した細胞選別器のウエル４内のＧＦＰ蛍光画像を蛍光顕微鏡を用いて取得した画像である。
観察開始当初は、（Ａ）に示されているように、白血病細胞は骨片の下には存在せず、それ以外の場所にほぼ均等にばらついて存在していた。約２時間後、いくつかの白血病細胞が骨の下部に侵入し始めて、４．５時間が経過した後では、（Ｂ）に示されているように、骨片の下に留まる白血病細胞がいくつか見られた。

また、図４は骨片の下に破骨細胞を誘導していない細胞選別器のウエル内のＧＦＰ蛍光画像を蛍光顕微鏡を用いて取得した画像であるが、この細胞選別器では、４．５時間が経過した後でも骨片の下に侵入する白血病細胞は見られなかった。

以上のことから、破骨細胞が骨下部に存在することにより、骨片という障壁があるにもかかわらず、白血病細胞がその障壁を通って骨片の下に侵入したと考えられる。このように、ウエル４内において骨片の下に破骨細胞を配置しておくことで、がん細胞が遊走する微小環境を構築することができ、その遊走現象をリアルタイムで観測することができる。遊走した細胞と遊走しなかった細胞とではその特性が異なっており、このような環境下において遊走する特性をもつ細胞とそのような特性をもたない細胞との選別が可能である。

なお、本発明の細胞選別器及び細胞選別方法は上記実施例に限定されるものではない。細胞選別器として機能させるためには以下の要件を満たす必要があり、これらを満たすものであれば、構造は限定されない。
１．溶液の対流が発生しない代表長さが１ｍｍ以下の微小空間
２．骨髄微小空間に近い酸素濃度である低酸素濃度（最大で大気と同じ２１％、好ましくは５％以下）
３．骨片と破骨細胞の存在。なお、細胞遊走を直接的に誘引させる物質としては、破骨細胞の骨吸収により放出されるサイトカイン類(ＴＧＦ−β)や増殖因子（ＩＧＦｓ）、Ｃａ²⁺、ケモカインなどが考えられる。

上記実施例のように、細胞選別器を用いて生体内の微小環境を工学的に再現することで、以下の効果が得られる。
生態を用いた実験では、酸素濃度、栄養素、液性因子の濃度など、種々の条件を実験ごとに再現性良く一致させることは一般的に困難である。これに対し、本発明のように、チップを用いた実験系を構築することにより、実験の再現性が向上する。さらに、実験条件を自由に設定することが可能となるので、生体内では実現できないような特殊な条件を自由に設定し、そのような条件下での細胞の特性・挙動を観測することも可能である。

また、小動物を用いるような実験の代替となることは、動物愛護の精神からも重要な効果が見込まれる。さらに、対象がヒトである場合には、直接観察することが技術的にも倫理的にも困難な脳などの部位についての実験が可能となる。さらに、生物ではなく工学的に制御可能なチップで実験が可能であるため、実験の自動化を容易にする。チップは並列化が容易であるため、複数のチップにおいて同時に観測を行なうことも可能である。

また、チップのウエルの容量が極微量であるため、実験に必要な試薬や細胞の量を節約することができ、価格面と環境面からも利点がある。少量しか採取できない細胞や組織、貴重で高価な試薬を用いる際にもウエルの容量が小さいことは効果的である。

白血病幹細胞周辺の微小環境を調べることや白血病幹細胞を選別することは、幹細胞の態様解明に強く寄与し、がんの根治研究につながる。肺がんや乳がんなどの固形がんの腫瘍中心部周辺の微小環境を調べることや腫瘍細胞を選別することは、がん細胞の浸潤・転移の態様を解明することに寄与し、がんの本質の研究・転移の抑制などに応用することができる。このように、生体内の微小環境を本発明の細胞選別器において再現し、生体内の微小環境におけるがん細胞の特性や挙動のｉｎ ｖｉｔｒｏでの観察を可能にして細胞の選別を可能にすることで、基礎生物学としての研究対象としてだけでなく、治療、創薬に貢献する可能性を有する。

２ チップ
３ａ 第１基板
３ｂ 第２基板
４ ウエル
５ａ，５ｂ 溝
６ ウエル底面
８ マトリックス
１０ 骨片
１２ 破骨細胞

Claims (6)

1. 液で満たされ代表的長さが１ｍｍ以下である微小空間をもち、その微小空間の内部の光学的観測を可能とする光透過性の材質からなる底面をもつウエルと、
   前記ウエル内の底面に配置されたマトリックスと、
   前記ウエル内の前記マトリックス上に配置された骨片と、
   前記マトリックスと前記骨片との間に配置された破骨細胞と、を備えた細胞選別器。
2. 前記マトリックスはコラーゲンゲルである請求項１に記載の細胞選別器。
3. 前記ウエルは円筒形であり、その代表的長さは直径であり、前記ウエルの深さは３００μｍ以下である請求項１又は２に記載の細胞選別器。
4. 前記破骨細胞が配置されている位置の酸素濃度は約５％である請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞選別器。
5. 請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞選別器を準備する工程、
   前記細胞選別器のウエル内の前記骨片の周辺に蛍光体により標識化されたサンプル細胞を配置する工程、
   ある時間が経過した後、サンプル細胞の位置を光学的に観測することにより、前記ウエル底面のマトリックスと前記骨片との間へ遊走する細胞と遊走しない細胞とを選別する工程、を備えた細胞選別方法。
6. 前記蛍光体は緑色蛍光タンパク質である請求項５に記載の細胞選別方法。